CN103933559B - 志贺氏菌多价结合疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种志贺氏菌多价结合疫苗，包括痢疾志贺氏Ⅰ型、福氏志贺氏2a型、福氏志贺氏3a型、福氏志贺氏6型、宋内志贺氏菌5种血清型，分别采用上述细菌的特异性多糖，与载体蛋白质制备结合物原液，将5种结合物原液以适当比例混合，获得针对志贺氏菌的多价结合疫苗，本发明制备的结合疫苗用于志贺氏菌感染的免疫预防。

Description

志贺氏菌多价结合疫苗

一、技术领域

本发明涉及一种多价志贺氏菌多糖蛋白质结合疫苗制剂，特别是含有痢疾志贺氏Ⅰ型、福氏志贺氏2a型、福氏志贺氏3a型、福氏志贺氏6型、宋内志贺氏菌5种血清型的志贺氏菌多价结合疫苗。

二、背景技术

志贺氏菌是导致人体发生细菌性痢疾的病原菌，是一种常见病和多发病，每年全球的患者达到1.6亿，造成110万死亡，其中约80％的病例发生于亚洲。我国属于细菌性痢疾发病状况较严重地区，据疫情监测资料统计，在法定甲、乙类传染病中，细菌性痢疾的发病率位于第四位，每年发病人数超过20万。由于检测手段限制及漏报严重，实质的发病数远高于报告病例，如河南某地2003年细菌性痢疾的漏报率达到98.92％，河北正定2002年的一项调查发现监测病例是报告病例的10倍，河南某县2010年的调查显示实际病例是报告病例的18倍。近年来，随着人民生活水平的提高和卫生条件的改善，菌痢的发病率大幅下降，但暴发疫情仍层出不穷，在2008－2011年期间，国内报告的暴发疫情就达到82起，发病数3805例，暴发原因以食源性污染为主，多集中于学校和农村。

志贺菌属分四个血清群，A群痢疾志贺菌，B群福氏志贺菌，C群鲍氏志贺菌和D群宋内氏志贺菌，其中A群又可分为15个血清型，B群16个血清型，C群20个血清型，D群1个血清型。由痢疾志贺1型引起的菌痢最为严重，常常引起爆发流行，有部分患者还能发展为致命的溶血尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)；福氏志贺菌和宋内志贺菌是引起菌痢的最常见菌型，占分离菌的90％左右，其中发达国家以D群为主，发展中国家以B群为主；鲍氏志贺菌和其它痢疾志贺菌引起的病例相对较少。我国菌痢的优势血清群一直是B群，二十世纪以福氏2a型为主，可占到绝大多数，自二十世纪末，血清型呈现多样化趋势，福氏4c、1a、2b、X变种等血清型大幅上升。除了B群内部血清型的变化外，D群也上升迅速，尤其是2005年以后，在一些地区D群甚至成为引起菌痢的优势菌群。由于志贺氏菌的优势血清型是B群和D群，B群虽有多个血清型，但因共同O抗原骨架的存在，一些血清型间有交叉，因此，数个血清型就能交叉保护到基本所有B群的血清型别，再加上常引起爆发流行的痢疾志贺1型，包括痢疾志贺Ⅰ型、福氏2a、福氏3a、福氏6型和宋内志贺菌的志贺氏疫苗，就基本可以涵盖所有流行的志贺菌血清型。

目前还没有针对志贺菌感染的免疫预防制剂，研发中的候选物有多个，主要包括减毒 活疫苗和灭活疫苗两种途径，灭活疫苗包括全菌体疫苗、组分疫苗和结合疫苗。本发明是一种志贺氏菌结合疫苗制剂，是以志贺菌的O-特异性多糖与载体蛋白质共价偶联制备而成。国内外都曾报道过对痢疾志贺1型、福氏2a型、宋内志贺氏菌制备的单价结合疫苗的研制情况，也有福氏宋内氏双价痢疾结合疫苗研制的报导，有些甚至开展了人体效果观察，证明都能诱导产生高效价的特异性抗体应答。在以色列的临床试验证明，宋内志贺氏结合疫苗能产生74％的对型保护。

细菌的O-特异性多糖是来源于革兰氏阴性细菌脂多糖的抗原成分。革兰氏阴性细菌的脂多糖是一种毒性成分，也是细菌的保护性抗原，它的抗原决定簇位于脂多糖的O-特异性多糖侧链部分。通过化学方法可将志贺氏菌的O-特异性多糖从菌体中分离出来，但O-特异性多糖分子量一般在1万道尔顿左右，是半抗原，而且它的结构也是单元重复类型，属于典型的T细胞非依赖型抗原，可以采用氨还原、氰化物活化或其他适宜的方法，将O-特异性多糖成分与载体蛋白质共价偶联，使其转化为T细胞依赖性抗原，制备出不同型的细菌性痢疾单价结合物，用以研制细菌性痢疾的预防制剂。但志贺氏菌属有四十多个血清型，常见的流行型也有数种，志贺氏疫苗的研制必须要考虑如何最大限度的覆盖流行血清型，以保证研制疫苗的适用性和有效性。多价疫苗是扩大疫苗血清型别覆盖率的最直接、最有效手段，如4价流脑多糖疫苗、13价肺炎球菌结合疫苗、23价肺炎球菌多糖疫苗等就是多价疫苗的典型代表。但由于细菌的血清型别众多，多价疫苗也不可能覆盖所有血清型，如肺炎球菌血清型有90个以上，因此，都通过选择菌型间更常见的优势型别，确保以尽量少的价次提供最广泛的保护效果，如23价肺炎球菌多糖疫苗包括的血清型可对90％肺炎链球菌侵袭性感染提供预防保护。志贺氏菌属分为四个血清群，四十多种血清型，但分离到的流行菌多属于B群和D群，占90％左右，因此，只要预防了志贺氏菌属的B群和D群，就可以预防90％的志贺氏菌感染。D群仅一个血清型，B群虽有多个血清型，但因共同O抗原骨架的存在，血清型间有交叉，仅需选择O抗原骨架不同的几个代表型，就基本覆盖了B血清群。鉴于此，选择D群的宋内氏志贺氏菌，B群的福氏志贺氏2a、福氏3a和福氏6型组成了志贺氏疫苗的基本型别。再加上虽不常见，但会引起爆发流行的痢疾志贺1型。这种包括痢疾志贺Ⅰ型、福氏2a、福氏3a、福氏6型和宋内志贺菌的志贺氏疫苗，就基本可以涵盖所有流行的志贺菌血清型。

研制多价疫苗最大的问题是抗原间是否存在免疫干扰，有报导称一个含6组分金黄色葡萄球菌疫苗的抗原间就存在免疫干扰。本发明制备的多价疫苗所含5种血清型结合物在小鼠中免疫原性良好，各抗原都能诱导相应的免疫应答，抗原间无干扰。

三、发明内容

本发明提供一种志贺氏菌多价结合疫苗组合物，所述疫苗为多价疫苗，即包括多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗。

本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分：

其中每一种疫苗均为蛋白多糖结合疫苗，即单价结合物。

优选的，本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分：

更优选的，本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分：

最优选的，本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分：

以上每一种疫苗可使用血清型相应的菌种制备，其中宋内氏志贺氏菌的菌种也可用类志贺氏邻单胞菌替代。

每一种疫苗的制备采用相应菌种培养，培养可采用固体培养基或液体培养基发酵，优选液体培养基发酵罐深层发酵培养，培养物经杀菌后，收集菌体，直接提取多糖或-20℃以下保存备用。

其中所述培养，是将细菌培养至对数生长期、稳定期或衰亡期，优选对数生长末期和稳定期，采用适当的方法杀菌，杀菌可采用物理方法或化学方法，物理方法包括温度和渗透压，可同时使用，也可单独使用，以提高温度杀灭细菌为最佳，化学方法包括添加杀菌剂，常用的杀菌剂包括有机试剂、重金属、表面活性剂，常用有机试剂包括醛类、醇类、酚类，最常用甲醛、苯酚。

培养物经杀菌后，采用常规方法分离菌体，分离方法包括离心、过滤，可单独使用，也可联合使用，获得一定浓度的菌体后，保存或直接提取并纯化多糖。

提取并纯化多糖可先纯化脂多糖，再水解获得O-特异性多糖，也可以菌体直接水解获得O-特异性多糖。脂多糖的提取纯化采用常规方法，如三氯醋酸法、热酚法和酚氯仿法等，最优选热酚法，纯化好的脂多糖经酸解离O-特异性多糖部分。菌体也可以直接经酸处理解离O-特异性多糖部分。解离的O-特异性多糖部分再经适当手段纯化，纯化手段包括中空纤维过滤、超滤、层析等，可联合使用，也可以单独使用。

本发明制备的O-特异性多糖，其中残余核酸和残余蛋白质含量都低于5％，最佳低于2％，更佳低于1％。内毒素含量低于100EU/μg多糖，优选低于50EU/μg多糖，最佳低于10EU/μg多糖。制备的O-特异性多糖成分能与特异性血清形成免疫沉淀线。

本发明根据志贺氏菌各O-特异性多糖结构的特征，制备单价结合物。优选O-特异性多糖经溴化氰活化后，与己二酰二肼(ADH)反应，形成交联臂，再通过碳二亚胺(EDAC)介导的缩合作用与载体蛋白质共价结合，制备出各单价结合物，纯化并除菌后备用。也可以用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)活化O-特异性多糖，与ADH反应，再与载体蛋白质偶联形成结合物，纯化并除菌后备用。也可以用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)活化O-特异性多糖，直接与载体蛋白质偶联形成结合物，纯化并除菌后备用。还可以采用还原胺法制备结合物，用高碘酸钠氧化O-特异性多糖，与载体蛋白质直接偶联，再用硼***还原，纯化并除菌后备用，也可以将高碘酸钠氧化O-特异性多糖与ADH反应，硼***还原制备衍生物，再通过EDAC介导的缩合作用与载体蛋白质共价结合。还可以利用O-特异性多糖上固有的羧基或氨基，在EDAC介导的缩合作用下，直接与载体蛋白质反应。

本发明可以采用的载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、突变白喉毒素中的交叉反应物质(CRM9，CRM197)、百日咳类毒素(PT)、B群流脑外膜蛋白质复合物(OMP)、流脑64K外膜蛋白、流感嗜血杆菌P1、P2、P4、P5、P6外膜蛋白、重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)、大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素B亚单位中的任何一种或数种。

本发明的结合物纯化方法优选凝胶层析，所用填料可以选择葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)。结合物纯化也可以采用超滤膜过滤，选择超滤膜孔径(截留分子量)10-50万道尔顿，优选20-40万道尔顿，最优选30万道尔顿。结合物纯化还可以采用离心交换层析或/和疏水层析。

通过以上方法得到的经过纯化的单价结合物，按照确定的比例混合，根据制剂学常规技术即可制备成本发明的多价结合疫苗组合物。

本发明的多价结合疫苗组合物中，还可包含佐剂和/或缓冲液，所述的佐剂选自铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等。水包油或细菌细胞壁成份，如MF59、SAE、RAS等。或者皂角类佐剂，如Quil A、QS-21。或者细菌脂多糖或合成类脂A佐剂。细胞因子，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、共刺激分子B7-1、B7-2等。或者毒素亚单位类佐剂，如霍乱毒素及亚单位、百日咳毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)等。所述的缓冲液选自磷酸缓冲液或Tris缓冲液，也可以是生理氯化钠溶液。缓冲液浓度可以是0.01－0.05M，优选0.01－0.02M，最优选0.01M。

本发明的多价结合疫苗组合物还可包含稳定剂和/或分散剂，稳定剂选自氨基酸，氨基酸可以是组氨酸，优选L-组氨酸，使用浓度1-100mM，优选2-50mM，更优选3-10mM，最优选5mM。组氨酸可以组氨酸缓冲液的形式出现。分散剂选自多聚山梨醇酯，优选Tween80，使用浓度0.01-1％，优选0.01-0.1％，更优选0.02-0.05％。

本发明的多价结合疫苗组合物，可以制成供临床用的各种制剂形式，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型，更优选液体剂型和冻干剂型，最优选液体剂型。

本发明的多价结合疫苗组合物，其接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服，还包括口腔、鼻腔、***、***黏膜途径。

本发明针对细菌性痢疾血清型分布特点，采用多糖蛋白质结合技术，研制一种多价志贺氏菌疫苗，旨在提供一种安全性高、免疫原性好、并基本覆盖志贺氏菌流行菌型的多价疫苗。

本发明的志贺氏菌多价结合疫苗包含A群的痢疾志贺氏Ⅰ型、B群的福氏志贺氏2a、福氏3a和福氏6型、D群的宋内氏志贺氏菌，组成了一个5价的志贺氏菌结合疫苗，可以预 防绝大多数志贺氏菌流行血清型。而且，本发明的独到之处还在于发现这五种志贺氏菌血清型的结合物成分以适当比例混合到一起，并不影响各自的免疫原性，结合物之间也没有其他物理和化学的变化，而且有相互协同增效作用，为多价疫苗的开发奠定了基础。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

志贺氏菌多价结合疫苗小鼠免疫力实验

选用NIH小鼠，分为7组。组1：志贺氏菌多价结合疫苗免疫组；组2：痢疾志贺氏Ⅰ型结合物免疫组；组3：福氏志贺氏2a结合物免疫组；组4：福氏志贺氏3a结合物免疫组；组5：福氏志贺氏6结合物免疫组；组6：宋内氏结合物免疫组；组7：PBS阴性对照组。每组10只小鼠，分别皮下免疫两针，间隔2周，剂量0.1ml，含各型结合物1μg。分别于免前、第一针免疫和第二针免疫后2周取血，进行血清特异性抗体测定。

血清测定采用间接ELISA，以相应的血清型脂多糖包被酶标板，包被浓度1μg/孔。测定结果见表1。

表1.志贺氏菌多价结合疫苗免疫原性研究

四、具体实施方式

本发明可通过如下实施例进一步了解，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅为了更好展示本发明，而非对发明内容进行限制。

本发明实施例中，各菌种来源如下：

A群的痢疾志贺氏Ⅰ型菌种可来源于各菌种保藏中心，也可分离自病人。

B群的福氏志贺氏2a型菌种可来源于各菌种保藏中心，也可分离自病人。

B群的福氏志贺氏3a型菌种可来源于各菌种保藏中心，也可分离自病人。

B群的福氏志贺氏6型菌种可来源于各菌种保藏中心，也可分离自病人。

D群的宋内氏志贺氏菌种可来源于各菌种保藏中心，也可分离自病人，所述宋内氏志贺氏菌种也可由类志贺氏邻单胞菌替代。

本发明实施例中，使用不同的菌种制备各单价结合物，但其制备方法均可采用实施例中的方法。

实施例1

志贺氏菌的发酵培养

开启志贺氏菌菌种，接种于2支大豆胨斜面，35-37℃培养12-24小时，扩种于2个500ml液体培养基中，35-37℃培养摇床培养6-12小时，扩种于10-20L液体培养基中，35-37℃培养摇床培养4-8小时，接种含300-500L液体培养基的发酵罐中，35-37℃培养到生长至对数生长末期或稳定期，其间维持pH在中性，革兰氏染色镜检和纯菌实验。无污染的培养物加终浓度0.5-2％的甲醛灭菌，连续流离心机分离菌体。

实施例2

脂多糖提取

用纯化水将菌体悬浮为10％的菌悬液，按1：1加入95％酚水溶液中，68℃充分搅拌1小时，离心，分离并收获水相，酚相再补充水至原体积，68℃抽提30分钟，离心，分离水相。两次水相合并，加乙醇至浓度25％，补充部分盐离子，离心，去沉淀。上清加乙醇至浓度75％，离心收集沉淀。无水乙醇、丙酮洗涤后抽干。

实施例3

O-特异性多糖提取

脂多糖以1％的浓度溶解于1％冰醋酸溶液中，沸水浴60-90分钟，60,000-80,000g离心4小时，收集上清，冻干后，以纯化水溶解，离心收集上清。离心上清以纯化水为流动相，经Sephadex G-25凝胶层析，收集V₀附近的多糖部分，冻干后即为O-特异性多糖。

实施例4

菌体直接提取O-特异性多糖

培养灭活的培养物用0.22-0.45μ的超滤膜(或中空纤维)浓缩至1/10-1/20体积，5倍生理盐水洗涤后，加脱氧胆酸钠至0.5％，35-40℃搅拌1小时，加冰醋酸至1％浓度，沸水浴60-90分钟，伴随搅拌悬浮，离心收集上清。上清液经30K超滤洗涤，收集滤过液，经3K超滤浓缩，置换缓冲液为低浓度PBS，羟基磷灰石层析纯化，收取O-特异性多糖部分，冻干后即为O-特异性多糖。

实施例5

溴化氰活化法制备结合物

O-特异性多糖溶解为10mg/ml，调pH至10-11，等重量加入溴化氰，反应5-10分钟，维持pH在10-11。等体积加入0.5M ADH溶液，维持pH在8.5，反应至pH相对稳定，置2-8℃过夜。

超滤洗涤去除未反应的ADH，调整O-特异性多糖浓度至20mg/ml，调pH至5-6，等体积加入20mg/ml浓度的载体蛋白质，加入EDAC至0.01-0.05M，维持pH5-6反应3-6小时，制备结合物。

实施例6

还原胺法制备结合物

O-特异性多糖溶解为10mg/ml，加入高碘酸钠至5-10mM，4℃暗中反应过夜，甘油终止反应。超滤洗涤去除未反应的化学物质，调整O-特异性多糖浓度至5-10mg/ml，按质量比1：1加入破伤风类毒素，加硼***至2mg/ml，室温反应24-72小时，制备结合物。

实施例7

层析纯化结合物

选择Sepharose CL-4B凝胶填料装层析柱，0.01M磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡后，制备的结合物上样，缓冲液洗脱，收集V₀附近的吸收峰，除菌过滤后保存。

实施例8

超滤纯化结合物

选择截留分子量(MWCO)300K超滤膜，用含硫酸铵的生理盐水超滤洗涤结合物反应液，再用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，依次用1.2、0.8、0.45、0.22微米的滤膜逐级过滤后保存。

实施例9

志贺氏菌多价结合疫苗配制

在配制罐中加入适量0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)，依次加入L-组氨酸、Tween80、各志贺氏血清型结合物单价原液，使终浓度分别为：L-组氨酸5mM，Tween800.025％，各型志贺氏结合物O-特异性多糖含量10μg/ml。若需铝佐剂，可加入至铝离子含量终浓度为0.44mg/ml。

实施例10

不同比例的志贺氏菌多价结合疫苗配制

请按照以下比例对疫苗进行配制，并制备成不同的剂型。

其中每一种疫苗均为蛋白多糖结合疫苗，即单价结合物。

优选的，本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分：

更优选的，本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分：

。

Claims (10)

1.一种志贺氏菌多价结合疫苗组合物，包括以下组分：

其中每一种疫苗均为蛋白多糖结合疫苗。

2.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，包括以下组分：

3.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，包括以下组分：

4.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，包括以下组分：

5.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，其特征在于，所述蛋白多糖结合疫苗，其中所用载体蛋白质选自破伤风类毒素、白喉类毒素、大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素亚单位、重组绿脓杆菌外毒素A或B群流脑外膜蛋白及其复合物。

6.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，其特征在于，还包含佐剂和/或缓冲液。

7.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，其特征在于，还包含稳定剂和/或分散剂。

8.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，其特征在于，制成供临床用的各种制剂形式，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种。

9.根据权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物，其特征在于，不同剂型采用不同的免疫途径，接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服，还包括口腔、鼻腔、***、***黏膜途径。

10.权利要求1的志贺氏菌多价结合疫苗组合物在制备用于志贺氏菌感染的免疫预防的疫苗中的应用。