CN108613976A - 直接胆红素检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种直接胆红素检测试剂盒，该试剂盒由第一试剂和第二试剂组成，并且第一试剂的体积与第二试剂的体积相同，第一试剂包括乙二胺四乙酸钠和表面活性剂，第二试剂包括缓冲液、2,4‑二硝基苯肼试液、氯化钠和稳定剂，该试剂盒中，2,4‑二硝基苯肼试液为显色剂，2,4‑二硝基苯肼在酸性介质中与血清中的直接胆红素反应生成2,4‑二硝基苯腙，2,4‑二硝基苯腙在碱性缓冲溶液中显暗红色，该物质的显色程度与直接胆红素的含量成正比，该物质在445nm波长处有最大吸收，可用比色法定量测定直接胆红素的含量，试验结果表明，本发明直接胆红素检测试剂盒线性范围较宽、准确度和精密度较高，并且抗干扰能力较强。

Description

直接胆红素检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，具体是一种直接胆红素检测试剂盒。

背景技术

直接胆红素又称结合胆红素，是由间接胆红素进入肝后受肝内葡萄糖醛酸基转移酶的作用与葡萄糖醛酸结合生成的。胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。胆红素总量增高、间接胆红素增高表明：溶血性贫血、血型不合输血、恶性疾病、新生儿黄疸等；直接与间接胆红素均增高表明：急性黄疸型肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬变、中毒性肝炎；胆红素总量增高、直接胆红素增高表明：肝内及肝外阻塞性黄疸、胰腺癌、毛细胆管型肝炎及其他胆汁瘀滞综合症；因此，对人体的血清、血浆或尿液中直接胆红素的测定，是医学检验最常规的项目之一。

目前测定直接胆红素的方法主要有重氮法、酶法和化学氧化法。重氮法测定直接胆红素的历史悠久、测值较准，但其试剂稳定性差、反应特异性差等，虽经过了无数次的改良，至今仍无满意结果。

酶法测定直接胆红素具有简单、特异的特点，但由于其试剂中酶的热稳定性差、保存时间短、价格昂贵，不利于推广应用，目前虽然已能进入临床应用，但还非常不完善，还需继续研究。

化学氧化法测定直接胆红素与重氮法和酶法相比，具有操作简单、试剂稳定、保存时间长、价格低廉等优点，但该法测定低浓度样品时，副反应较明显，影响测定结果；在自动生化仪上测定时对其他项目的测定具有严重干扰；有一定毒性，尤其是废弃物可能被还原成剧毒的偏钒酸盐而污染环境，因此该方法还有待改进和创新。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直接胆红素检测试剂盒，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一种直接胆红素检测试剂盒，该试剂盒包括第一试剂和第二试剂，

(1)第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 0.5-3.0mmol/L

表面活性剂 0.1-2g/L

(2)第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

作为优化，2,4-二硝基苯肼试液由取1.5g 2,4-二硝基苯肼溶于20ml硫酸(2mol/L)中，加水定容至100ml制得。

作为优化，缓冲溶液为酒石酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的一种。

作为优化，缓冲液的pH为10-12。

作为优化，表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇酯-35、三乙醇胺和甜菜碱中的一种或多种。

作为优化，表面活性剂由十二烷基苯磺酸钠:脂肪醇酯-35: 三乙醇胺:甜菜碱＝1:1:1:1的体积比配制而成的。

作为优化，稳定剂为D-吡喃葡萄糖苷、D-吡喃葡萄糖、羟基乙叉二磷酸和葡聚糖中的一种或几种。

作为优化，稳定剂由D-吡喃葡萄糖苷、D-吡喃葡萄糖、羟基乙叉二磷酸和葡聚糖四种按照一定比例配制而成的。

作为优化，第一试剂与第二试剂的体积之比为1:1。

本发明一种直接胆红素检测试剂盒中第一试剂和第二试剂的原料选择依据是：

乙二胺四乙酸钠是一种离子螯合剂，能有效鳌合金属离子，防止一些杂质离子对直接胆红素的检测引起不必要的干扰。

表面活性剂能够去除血清样品中的干扰物质，同时消除间接胆红素的影响。

缓冲液保证反应pH值不会受到较大波动，提供一种碱性环境，稳定显色反应方向。

2,4-二硝基苯肼试液为显色剂，该试液与血清中的直接胆红素反应生成暗红色物质，该物质的显色程度与直接胆红素的含量成正比。

氯化钠用于模拟人体内血液环境，保证反应的进行是与体内相同条件下进行的，从而保证检测的真实性和可靠性。

稳定剂保证反应外部环境的稳定性，使检测结果不会受到影响和波动。

本发明试剂盒试剂制备采用常规方法混合搅匀即可。

应用本发明试剂盒测定直接胆红素含量的方法如下：往样品中加第一试剂后混匀，在35-45℃下反应1-2min后读取吸光度A1，再加入第二试剂后混匀，在35-45℃下反应5-10min后读取吸光度A2，根据公式：直接胆红素＝样品相对吸光度 (A2-A1)×标准液浓度/标准液相对吸光度(A2-A1)，计算得出直接胆红素的含量。其中，样品用量10μL，第一试剂用量为 200-400μL，第二试剂用量为50-100μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明一种直接胆红素检测试剂盒，第一试剂中，乙二胺四乙酸钠是一种离子螯合剂，能够有效鳌合金属离子，防止一些杂质离子对直接胆红素的检测引起不必要的干扰，表面活性剂去除血清样品中的干扰物质，同时消除间接胆红素的影响；第二试剂中，2,4-二硝基苯肼试液为显色剂，2,4-二硝基苯肼在酸性介质中与血清中的直接胆红素反应生成2,4-二硝基苯腙，2,4-二硝基苯腙在碱性缓冲溶液中显暗红色，该物质的显色程度与直接胆红素的含量成正比，该物质在445nm波长处有最大吸收，可用比色法定量测定直接胆红素的含量，2,4-二硝基苯肼与直接胆红素发生反应，该反应在30秒内完成，该反应较迅速，并且反应灵敏，反应充分，无副反应发生，使测定结果更加的准确；该试剂盒组方科学，易配制，性能稳定，能够长期保存，各个组分药品价格便宜，成本低，对环境无污染，该试剂盒适用于全自动生化分析仪，具有较大的临床使用价值。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明一种直接胆红素检测试剂盒，该试剂盒由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂与第二试剂的体积比为1:1。

实施例1：

(1)第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 0.5mmol/L

表面活性剂 0.1g/L

(2)第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

实施例2：

(1)第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 1.0mmol/L

表面活性剂 0.5g/L

(2)第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

实施例3：

(1)第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 1.5mmol/L

表面活性剂 1g/L

(2)第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

实施例4：

(1)第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 2mmol/L

表面活性剂 1.5g/L

(2)第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

实施例5：

(1)第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 3.0mmol/L

表面活性剂 2g/L

(2)第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

对比例：

对比例试剂盒为一种国内市售的直接胆红素检测试剂盒，其组分及各组分浓度为：

试剂R1

本发明直接胆红素检测试剂盒的性能测试如下：

测试1：线性范围试验

配制0，50，100，200，400，600，800，1000μmol/L直接胆红素标准溶液，分别用本发明直接胆红素检测试剂盒和对比例试剂盒来测定其浓度，结果见表1。

本发明直接胆红素检测试剂盒和对比例试剂盒测定样本中直接胆红素的方法如下：往样品中加第一试剂后混匀，在35～ 45℃下反应1-2min后读取吸光度A1；再加入第二试剂后混匀，在35～45℃下反应1-2min后读取吸光度A2；根据公式：直接胆红素的含量＝样品相对吸光度(A2-A1)×校准液浓度/校准液相对吸光度(A2-A1)，计算得出直接胆红素的含量。其中，样品用量10μL，第一试剂用量用量200～400μL，第二试剂用量50～ 100μL。

表1本发明直接胆红素检测试剂盒和对比例试剂盒测定线性范围对比

从表1中可以看出，当直接胆红素的浓度大于600μmol/L 时，对比例试剂盒不能检出，线性范围过小，而本发明试剂盒可以检出，本发明试剂盒具有较大的线性测试范围。

测试2：精密度和准确度试验

以罗氏校准样品作为质控，分别用本发明试剂盒和对比例试剂盒测定高浓度质控样品(800mmol/L)和低浓度质控样品 (200mmol/L)重复测定10次，计算其CV％值，测定方法同试验1，结果见表2和表3。

表2本发明试剂盒批内测定结果

表3对比例试剂盒批内测定结果

从表2中可以看出，本发明试剂盒测得高浓度值样品的平均值为800mmol/L、标准偏差为2.22、变异系数为0.28％，低浓度值样品的平均值为201mmol/L、标准偏差为2.26、变异系数为1.1％；从表3中可以看出，对比试剂盒测得高浓度值样品的平均值为761mmol/L、标准偏差为21.1、变异系数为2.8％，低浓度值样品的平均值为199mmol/L、标准偏差为3.6、变异系数为1.8％；本发明试剂盒测得的样品浓度值比对比试剂盒更接近真实值，所以本发明试剂盒准确度更高；本发明试剂盒测得的样品标准偏差和变异系数均小于对比试剂盒，标准偏差和变异系数越小，测得值偏离平均值就越少，所以本发明试剂盒批内精密度高于对比例试剂盒。

测试3：干扰性能试验

在3份相同浓度的罗氏质控样品(53.9μmol/L)中分别加入肝素、脂肪乳和VitC三种干扰物，再分别用本发明直接胆红素检测试剂盒和对比例试剂盒对其进行直接胆红素的浓度测定，结果见表4，测定样品中直接胆红素的方法同试验1。

表4本发明直接胆红素检测试剂盒和对比例试剂盒测定抗干扰性能对比

从表4中可以看出，加入三种干扰物后，用本发明试剂盒测得的相对偏差分别为：0.19％、0.19％和0.09％，用对比例试剂盒测得的相对偏差分别为1.7％、0.92％和0.75％，本发明试剂盒测得的相对偏差均小于对比例试剂盒，所以在干扰物存在的情况下，利用本发明试剂盒测得的结果比对比试剂盒测得的结果更接近真实值，本发明试剂盒比对比例试剂盒的抗干扰性能好。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (9)

1.一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一试剂和第二试剂，

(1)所述第一试剂包含的组分及各组分的浓度为：

乙二胺四乙酸钠 0.5-3.0mmol/L

表面活性剂 0.1-2g/L

(2)所述第二试剂包含的组分及各组分的浓度为：

2.根据权利要求1所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述2,4-二硝基苯肼试液由取1.5g 2,4-二硝基苯肼溶于20ml硫酸(2mol/L)中，加水定容至100ml制得。

3.根据权利要求2所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲溶液为酒石酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的一种。

4.根据权利要求3所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的pH为10-12。

5.根据权利要求4所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇酯-35、三乙醇胺和甜菜碱中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂由十二烷基苯磺酸钠:脂肪醇酯-35:三乙醇胺:甜菜碱＝1:1:1:1的体积比配制而成的。

7.根据权利要求6所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为D-吡喃葡萄糖苷、D-吡喃葡萄糖、羟基乙叉二磷酸和葡聚糖中的一种或几种。

8.根据群里要求7所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂由D-吡喃葡萄糖苷、D-吡喃葡萄糖、羟基乙叉二磷酸和葡聚糖四种按照一定比例配制而成的。

9.根据群里要求1-8中任一项所述的一种直接胆红素检测试剂盒，其特征在于：所述第一试剂与第二试剂的体积之比为1:1。