CN111154692B

CN111154692B - 一株降解亚硝酸盐并对ace具有抑制能力的植物乳杆菌属菌株

Info

Publication number: CN111154692B
Application number: CN202010069052.XA
Authority: CN
Inventors: 朱英莲; 杨庆利
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Weifang Yihao Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111154692A

Abstract

本发明提供一株具有降解亚硝酸盐活性及ACE抑制活性的植物乳杆菌属菌株及其应用，其对亚硝酸盐有的降解作用，可在发酵食品及发酵饲料中广泛应用。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus sp.)FJS 002，保藏编号为CGMCC No 18378。本发明所提供的植物乳杆菌应用在食品加工或饲料加工领域中。本发明通过筛选获得对亚硝酸盐具有高效降解作用同时对ACE具有抑制作用的优良菌株，为解决食品尤其是发酵食品中亚硝酸盐残留问题及困扰人类健康的高血压问题能提供理论基础和科学手段。

Description

一株降解亚硝酸盐并对ACE具有抑制能力的植物乳杆菌属菌株

技术领域

本发明属于食品微生物筛选技术领域，具体涉及一株具有降解亚硝酸盐活性及ACE抑制活性的植物乳杆菌属菌株。

背景技术

亚硝酸盐问题是当今食品工业的热点问题，土壤、水体、动植物体内均存在亚硝酸盐，农业中氮肥的使用过量，N、P、K肥比重失调，是引起蔬菜中含有大量的亚硝酸盐的原因之一，工业中废水的排放，也是引起农产品加工食品中亚硝酸盐含量超标严重的原因之一。亚硝酸盐对植物本身无害，但是对人类、动物健康危害巨大，摄入大量亚硝酸盐容易使机体中毒和致癌。人类属于食物链顶端，会通过食物链富集。亚硝酸盐分布比较广泛，大多数发酵食品中都含有亚硝酸盐，在食品腌渍的过程中，亚硝酸盐含量会增加。亚硝酸盐还被用于火腿、香肠等肉制品加工中，它能使肉制品呈现较好的色泽，抑制有害菌的生长。因此，如何控制食品中亚硝酸盐的残留量是一个亟待解决的问题。

目前去除亚硝酸盐的方法有化学降解法、物理吸附法及生物降解法。化学方法降解效率高、速度快，但是维持时间短，容易反弹和产生二次污染。物理方法试剂用量大，且应用范围窄。生物降解法养殖工业上一般除采用硝化细菌和反硝化细菌，但是不适合在食品工业中应用。

而乳酸菌是目前食品行业广泛应用的生物添加剂，乳酸菌可以增加食物的营养价值并减少食物腐败，延长食物储藏的保质期。食用乳酸菌对于机体健康具有重要意义，如调节肠道菌群、防癌及增强免疫力等。今年，有研究表明乳酸菌具有降血压的作用，乳酸菌能抑制血管紧张素转换酶(ACE)的活性，减少HHL(马脲酰胺组胺酰亮氨酸)在ACE的催化下生成引起高血压的物质(马尿酸)的含量，因此，降血压功能在医学领域也有很大的发展潜力。

但是目前还没有筛选出高效降解亚硝酸盐降解亚硝酸盐、同时能抑制ACE活性的乳酸菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有降解亚硝酸盐活性及ACE抑制活性的植物乳杆菌属菌株及其应用，其对亚硝酸盐有的降解作用，可在发酵食品及发酵饲料中广泛应用。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus sp.)FJS 002，于2019年08月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 18378。

本发明所提供的植物乳杆菌应用在食品加工或饲料加工领域中。

本发明再一个方面提供一种包含活菌的菌剂，是将所筛选的菌株FJS002的发酵液冷冻干燥后获得。

所述的发酵液，其制备方法如下：

无菌操作将菌株FJS002接种到MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h～72h后得到乳酸菌发酵液；该发酵液浓缩后直接冷藏或冷冻干燥获得含活菌的菌剂。

所述的菌剂作为亚硝酸盐降解剂或ACE抑制剂的应用。

本发明还提供一种降解亚硝酸盐的方法，是使用上述菌株FJS002来降解亚硝酸盐；

所述的方法，其中降解温度为35℃，pH为6.0条件性降解亚硝酸盐；

本发明还提供植物乳杆菌FJS 002在抑制血管紧张素转换酶中的应用。

本发明通过筛选获得对亚硝酸盐具有高效降解作用同时对ACE具有抑制作用的优良菌株，为解决食品尤其是发酵食品中亚硝酸盐残留问题及困扰人类健康的高血压问题能提供理论基础和科学手段。

附图说明

图1：七株分离菌株的培养特征图；

图2：各菌株对亚硝酸盐的降解率图；

图3：菌株d的***发育树图；

图4：菌株d的生长曲线图；

图5：菌株d的产酸能力图；

图6：菌株d耐胆酸盐能力图；

图7：不同温度对降解亚硝酸盐的影响图；

图8：不同初始pH对降解亚硝酸盐的影响图；

图9：不同培养基浓度对降解亚硝酸盐的影响图；

图10：不同接种量对降解亚硝酸盐的影响图；

图11：不同亚硝酸盐浓度对降解亚硝酸盐的影响图；

图12：菌株在模拟胃肠液中的存活情况图；

图13：菌株抑制ACE的能力图。

具体实施方式

本发明筛选获得了对具有降解亚硝酸盐活性及ACE抑制活性的乳酸菌株，进一步应用可将其添加到食品中用于降解亚硝酸盐，同时提高食品的保健功能。下面结合附图和实施例对本发明进行详细的阐述。

实施例1菌株的分离筛选、鉴定

1)乳酸菌的分离、筛选

从多家企业采集发酵食品包括火腿、风味发酵乳、酸奶、泡菜等。选择质量稳定、颜色好、保存时间长的批次，然后对该批样品进行菌株的筛选。固体样品取25g，液体样品取25mL，加入225mL无菌稀释液中，制备1:10样品匀液。继续进行10倍梯度稀释，选择2～3个适宜稀释度样品匀液涂布含碳酸钙的MRS培养基，培养后选出有溶钙圈的菌落为初筛乳酸菌菌株。

2)对亚硝酸盐具有降解作用的菌株筛选

将a、b、c、d、e、f及g七株菌株于MRS培养基中活化(图1)。培养到稳定期之后，按照1％的接种量接种于100ml含0.12g/LNaNO₂，pH6.0的MRS液体培养基中，35℃培养48h，于528nm下测吸光值。

表1：七株分离菌株的形态特征表

含碳酸钙的MRS培养基上乳酸菌的形态特征：乳白色菌落，大小、形状各异，温润，有溶钙圈，有透明圈。从MRS碳酸钙培养基的27株菌中挑选出7株菌透明圈较大的形态不同的典型菌落如图1所示，各菌株的形态特征如表1所示。对7株菌进行进一步的纯化，把所有菌株转接斜面-4℃保存，同时用甘油保存法封存于冻存盒中-20℃保存以备再次活化备用。

根据国标法绘制亚硝酸盐标准曲线，根据标准曲线计算亚硝酸盐的残留量，结果如图2示。结果表明这七种菌株中，降解亚硝酸盐最好的是菌株d，降解率达到了将近90％，其它菌株降解率很低。所以，筛选出菌株d作为优良菌株。

3)菌株的16SrDNA鉴定

取菌液1.5mL置于无菌离心管中，以10000r/min离心5min，去除上清收获菌体，采用CTAB法提取模板DNA，以提取的菌株FJS004基因组DNA为模板，使用细菌通用引物27f(5′：-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′)和1495r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行PCR扩增。

PCR扩增产物利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行测序。测定的序列在NCBI网站GenBank数据库进行同源性比较。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序分析，经测序后获得菌株的16S rDNA序列，长度为1468kb(SEQ ID NO:1)，测序结果通过NCBI上的BLAST进行查找，将基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对及同源性比较，***发育树如图3所示，将这株菌归为植物乳杆菌属Plant Lactobacillus。

将菌株d命名为FJS002，于2019年07月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 18378。

实施例2菌株的特性

1)生长曲线的测定

将菌株活化后取稳定期的种子按1％接种量接入MRS中置于35℃培养，定时取一定量的菌液，稀释到适宜倍数，测OD600吸光值，记录结果，并绘制生长曲线，生长曲线测定结果表明植物乳杆菌在0-6小时属于菌株生长的潜伏期，6-18小时属于菌株生长的对数期，18小时以后属于菌株生长的稳定期。由此可以看出菌株在MRS液体培养基中生长速率较快(图4)。

2)菌株的产酸能力

挑取单菌落于MRS液体培养基中35℃培养，分别于培养2h、4h、6h、8h、10h及12h后测上清液pH。结果表明植物乳杆菌在MRS液体培养基中的产酸能力较强，0-4小时产酸比较快，4小时pH已经降到了3.8，以后趋于稳定，最后稳定在3.8左右(图5)。

3)耐胆汁盐的测定

将菌株活化后取18小时种龄的种子按1％接种量接入分别含1％、2％、3％胆汁盐的MRS液体培养基中，每隔一段时间测OD600吸光值。根据图6可知，随着时间的推移，优良菌株在胆酸盐中的生长整体呈上升趋势，该菌株能在0.1％-0.3％的胆酸盐中生长良好，并且还有较强的耐受能力。

实施例3环境因素对降解亚硝酸盐的影响

1)温度对亚硝酸盐降解率的影响

将菌株活化后取18小时种龄的种子按1％接种量接入含0.12g/LNaNO₂的MRS中分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、42℃培养箱中培养18小时，再取一定量的菌液，稀释到适宜倍数，测吸光值，并记录结果。研究结果表明植物乳杆菌降解亚硝酸盐有一定的温度要求，在10℃，15℃基本不降解，15℃-30℃亚硝酸盐降解率快速上升，在35℃降解率最大，可达到93％。35℃以后降解亚硝酸盐能力减弱，可能是因为该菌最适生长温度是35℃，35℃菌体浓度最大，所以降解能力最强。也可能是因为35℃是菌株FJS002产生的降解亚硝酸盐的酶系比较适合的温度(图7)。

2)培养基初始pH对亚硝酸盐降解率的影响

将菌株活化后取18小时种龄的种子按1％接种量接入含0.12g/L NaNO₂的MRS培养基，各培养基初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0于35℃培养，定时取一定量的菌液，稀释到适宜倍数，测吸光值，并记录结果。结果表明pH在6.0的时候降解率最大，pH较低的时候亚硝酸盐基本不降解，可能是因为该菌株生长最适pH是6.0，在pH6.0的时候菌体浓度最大，降解率最大。由此可见，pH对菌株FJS002降解亚硝酸盐降解速率影响较大(图8)。

3)培养基浓度对亚硝酸盐降解率的影响

将菌株活化后取18小时种龄的种子按1％接种量接入含0.12g/LNaNO₂的MRS培养基中，调节MRS培养基浓度为20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L，定时取一定量的菌液，稀释到适宜倍数，测吸光值，并记录结果。结果表明培养基浓度在20-60g/L时植物乳杆菌对亚硝酸盐降解率逐渐上升，60g/L以后降解率下降，培养基对该菌降解亚硝酸盐影响较大，最适培养基浓度是60g/L。可能是培养基浓度低于60g/L，营养物质较少，菌体生长的营养达不到，菌的浓度低，降解亚硝酸盐的速率慢，培养基浓度大于60g/L时，渗透压过大，菌体无法正常生长，导致降解率下降(图9)。

4)接种量对亚硝酸盐降解率的影响

将菌株活化后取18小时种龄的种子按2％、4％、6％、8％、10％接入含0.12g/LNaNO₂的MRS液体培养基中，定时取一定量的菌液，稀释到适宜倍数，测吸光值，并记录结果。结果表明随着植物乳杆菌随着接种量的增大，降解率逐渐增大再减小。2％-8％降解率增大，8％-10％接种量降解率减小，8％时降解率最大。可能是低于8％时菌体浓度比较小，产生的酶较少，降解率小；高于8％时，植物乳杆菌菌体浓度过大，培养基的营养物质消耗快，满足不了菌株的生长及代谢，产生的酶较少，亚硝酸盐降解率下降。因此，接种量对菌株FJS002降解亚硝酸盐速率影响较大(图10)。

5)亚硝酸盐浓度对亚硝酸盐降解率的影响

将菌株活后取18小时种龄的种子按1％接种量接入分别含0g/L、0.3g/L、0.6g/L、0.9g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2.0g/L NaNO₂的MRS液体培养基中，37℃培养18h，稀释到适宜倍数，测吸光值，并记录结果。

结果表明，0.1-0.4g/L亚硝酸盐降解率增大，0.4g/L-0.6g/L降解率下降，在低于0.4g/L的低浓度状态下，可能是由于诱导菌体产酶的浓度没有达到，所以，菌体的产酶量低，降解亚硝酸盐的速率低，在0.4g/L达到高峰期；当亚硝酸盐含量大于0.4g/L后，可能是过高的亚硝酸盐浓度对菌体有毒害作用，抑制该菌的生长，菌体产生的酶少，从而导致亚硝酸盐降解率低(图11)。

实施例4菌株对胃肠液的耐受及抑制ACE的能力

1)优良菌株对胃肠液的耐受力

根据中国药典配制模拟肠液、胃液。将菌株活化后，接种于5ml液体MRS液体培养基中，37℃培养18h，8000r离心10min，弃去上清液，然后悬浮于10ml无菌生理盐水中，取1mL菌悬液于人工胃液中，培养3h，计算活菌数。之后，取1mL放入肠液中，培养8小时，计算活菌数。存活率(％)＝(培养后的活菌数)/(0h的活菌数)×100％。结果如图12所示。

由图12可知，胃肠液对菌体生长有一定的抑制作用，但该菌株对胃肠液耐受力较强。在胃液中的存活率达到46.51％，在肠液中的存活率达到54.5％。在肠液8小时内中的存活率大于在胃液中3小时的存活率。说明优良菌株对胃肠液耐受力较强，存活力较高。

2)菌株对抑制ACE的能力

HPLC法：配制马尿酸标液(0.01mol/L)。将240μlHHL(5mmol/L)与0.36mL菌液37℃混合3min，然后加入30μL ACE反应30min，最后加入0.6mL1mol/LHCL停止反应。同时做空白对照。冷却后用0.22μm滤膜过滤，取马尿酸标液、样品和空白上样。(对照的马尿酸峰面积-样品的马尿酸峰面积)/对照的马尿酸峰面积×100％。结果如图13所示，空白对照中，ACE催化HHL全部转换为马尿酸，在7.22min出现马尿酸的峰，未检测到HHL峰。而样品中除了检测到马尿酸的峰，还检测到了HHL峰，说明植物乳杆菌发酵产物能抑制ACE活性，仅使部分HHL转换为马尿酸，所以样品中还有部分HHL存在。对照中马尿酸面积的大小为1311472，样品中马尿酸峰面积的大小为436539，计算出该菌株对ACE活性的抑制率为66.71％。

实施例5：亚硝酸盐生物降解剂及ACE生物抑制剂的制备

菌株30～37℃活化24～72h，在4℃下以10000r/min离心15min，菌体充分洗涤加入冷冻保护剂，冷冻干燥获得亚硝酸盐生物降解剂及ACE生物抑制剂。

亚硝酸盐生物降解剂对亚硝酸盐降解的作用条件是：接种后的浓度要达到10³～10⁷CFU/mL，初始pH5～6，30～37℃作用48～72h，对亚硝酸盐的降解率可达85％～93％。

ACE生物抑制剂对ACE的抑制作用条件是：35～37℃作用30～60min，对ACE的抑制率可达65％以上。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株降解亚硝酸盐并对ACE具有抑制能力的植物乳杆菌属菌株

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgtgcggt gctatacatg caagtcgtac gaactctggt attgattggt gcttgcatca 60

tgatttacat ttgagtgaga ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag 120

cgggggatga cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac cgcatggacc 180

gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggta ccgcggcgta ttagctagat 240

ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cgtgagaggg taatcggcca 300

cattgggact gagacacggc cctaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360

atggacgaaa gtctgatcga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa 420

ctctgttgtt aatgaagaac atatctgaaa gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac 480

caaaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagagttg 540

tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagactgat gtgaaagcct 600

tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg 660

gaactccatg tgtagcggtg aaatgcctag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720

gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat 780

accctgatag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca 840

gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc 900

aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatct ggtttaattc gaagctacgc 960

gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg 1020

gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc attaagttgg gcactctggt 1140

gaaactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200

tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttccgaac tcgcgagagt 1260

aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa 1320

gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcacca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380

acacaccgcc cgtcccacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt 1440

aggaaccagc cgcctaagtg acagaatt 1468

Claims

1.一种乳杆菌，其特征在于，所述的乳杆菌（Lactobacillus sp.）的保藏编号为CGMCCNo 18378。

2.权利要求1所述的乳杆菌在食品加工或饲料加工领域中的应用。

3.一种活菌菌剂，其特征在于，所述的活菌菌剂是将权利要求1所述的乳杆菌的发酵液冷冻干燥后获得。

4.如权利要求3所述的活菌菌剂，其特征在于，所述的发酵液，其制备方法如下：

无菌操作将权利要求1所述的乳杆菌接种到MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24 h~72h后得到乳杆菌发酵液。

5.一种降解亚硝酸盐的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的乳杆菌来降解亚硝酸盐。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法，其中降解温度为35℃，pH为6.0。