CN112120140A - 一种鳀鱼抗菌物质及其制备与其在食品防腐中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鳀鱼制备抗菌物质的方法。本发明以鳀鱼为原料,利用微生物发酵法制备抗菌物质,鳀鱼抗菌物质对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)均具有较强的抑菌效果,因此可用于制备食品防腐剂,在食品领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及利用鳀鱼制备抗菌物质,具体地说是一种利用鳀鱼制备抗菌活性成份的方法及其在食品防腐中的应用。
背景技术
食品运输及保存过程中为防止微生物污染必须使用防腐剂,然而长期过量食用化学防腐剂会对人体健康产生危害。来源于动植物的天然抗菌物质具有抗菌性高、安全无毒、稳定性好的特点,是未来食品防腐的发展方向。
鳀鱼我国是生产在我国渤海、黄海、东海的小型鱼,鳀鱼口感差、体型小、加工困难,因此经济价值不高,常用作经济鱼类的饵料。本发明利用鳀鱼制备抗菌物质,可用作天然食品防腐剂,在食品领域具有良好的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种鳀鱼制备抗菌物质的方法;本发明的方法是提取鳀鱼有效成分,利用微生物发酵法制备抗菌物质,所制备的抗菌物质具有抗菌性强、安全无毒的特点,可应用作天然食品防腐剂,具有良好的应用前景。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种鳀鱼制备抗菌物质的方法,利用发酵法将鳀鱼提取物制备具有抗菌功能的活性组分。
鳀鱼抗菌物质的制备方法:
将鳀鱼冷冻干燥后粉碎,加入2~10倍体积的有机溶剂,于温度20~80℃、转速80~200rpm搅拌提取0.5~5小时;提取结束后过滤,滤渣收集备用。
鯷鱼滤渣用去离子水清洗两遍,加入5~20倍(w/v)去离子水,用1~5M盐酸调节pH至4.5~7.5,加入微生物菌种,使发酵液中菌含量为1*106~2*108CFU/ml,于30~50℃发酵1~5天;发酵结束后于5000~15000rpm离心5~20min,取上清液冷冻干燥,得到鯷鱼发酵粗提取物。
鯷鱼发酵粗提取物中加入2~10倍体积(w/v)的0.01~0.1M的盐酸,在0~20℃匀浆5~20min后,于5000~15000rpm离心10~30min,取上清液加入三氯乙酸至最终浓度为5~20%(v/v),0~20℃静置4~8小时,于5000~15000rpm离心10~30min,取上清冷冻干燥,得到鯷鱼抗菌物质。
所用有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯、石油醚中一种或者几种溶剂混合物。
发酵所用的微生物菌种为枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌中的一种。
所制备的鳀鱼抗菌物质单独或者作为配料制备成为食品防腐剂或食品防腐包装材料。
本发明具有如下优点:
天然防腐剂具有安全无毒的特点,是未来食品行业的发展方向。本发明所使用原料鳀鱼价格低廉,而产出是价值较高的天然食品防腐剂;本发明所建立的工艺具有收率高、过程环保的特点,而鳀鱼抗菌物质又具有抗菌性好、安全无毒的特点,因此本发明无论工艺还是产品均具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1
将鳀鱼冷冻干燥后粉碎取1kg,加入2L的石油醚,于温度20℃、转速100rpm搅拌提取0.5小时;提取结束后过滤,得到鯷鱼滤渣0.5kg。
0.5kg鯷鱼滤渣用去离子水清洗两遍,加入5L去离子水,用1M盐酸调节pH至7.5,加入枯草芽孢杆菌,使发酵液中菌含量为2*108CFU/ml,于35℃发酵1天;发酵结束后于15000rpm离心5min,取上清液冷冻干燥,得到鯷鱼发酵粗提取物0.3kg。
鯷鱼发酵粗提取物中加入2L的0.01M的盐酸,在4℃匀浆5min后,于15000rpm离心10min,取上清液加入三氯乙酸至最终浓度为5%(v/v),20℃静置4小时,于15000rpm离心10min,取上清冷冻干燥,得到抗菌物质0.1kg,收率为10%。
实施例2
将鳀鱼冷冻干燥后粉碎取10kg,加入100L的正己烷,于温度20℃、转速200rpm搅拌提取5小时;提取结束后过滤,得到鯷鱼滤渣8kg。
8kg鯷鱼滤渣用去离子水清洗两遍,加入10L去离子水,用5M盐酸调节pH至4.5,加入乳酸杆菌,使发酵液中菌含量为1*106CFU/ml,于40℃发酵3天;发酵结束后于5000rpm离心20min,取上清液冷冻干燥,得到鯷鱼发酵粗提取物6kg。
鯷鱼发酵粗提取物中加入50L的0.1M的盐酸,在4℃匀浆20min后,于5000rpm离心30min,取上清液加入三氯乙酸至最终浓度为10%(v/v),0℃静置4小时,于5000rpm离心30min,取上清冷冻干燥,得到抗菌物质3kg,收率为30%。
实施例3
将鳀鱼冷冻干燥后粉碎取1kg,加入5L的乙酸乙酯,于温度30℃、转速200rpm搅拌提取3小时;提取结束后过滤,得到鯷鱼滤渣0.7kg。
0.7kg鯷鱼滤渣用去离子水清洗两遍,加入10L去离子水,用3M盐酸调节pH至7.5,加入嗜热链球菌,使发酵液中菌含量为1*107CFU/ml,于50℃发酵5天;发酵结束后于10000rpm离心20min,取上清液冷冻干燥,得到鯷鱼发酵粗提取物0.5kg。
鯷鱼发酵粗提取物中加入5L的0.1M的盐酸,在4℃匀浆20min后,于5000rpm离心30min,取上清液加入三氯乙酸至最终浓度为20%(v/v),4℃静置4小时,于10000rpm离心30min,取上清冷冻干燥,得到抗菌物质0.2kg,收率为20%。
实施例4
使用鯷鱼抗菌物质对大肠杆菌(Escherichia coli,革兰氏阴性菌)进行抑菌实验。将冻存的大肠杆菌接种至5mL LB液体培养基中,37℃摇菌8h后,转接至5mL LB液体培养基中,按上述方法重复两次,得到实验用的菌液。使用超微量分光光度计(NanoDrop)测定菌液的菌落数。加入菌液使LB培养基中的菌浓度为1×105CFU/mL,制备直径6cm的LB琼脂平板5个,用100μL枪头制作加样孔。鯷鱼抗菌物质按125mg/mL,250mg/mL和500mg/mL梯度稀释,加样体积均为50μL,每个浓度平行三次。以蒸馏水作为空白对照。加样后将平板放置4℃冰箱过夜吸收,待样液全部吸收后取出平板倒置于37℃摇床,静置培养,观察。
以抑菌圈直径作为抑菌效果的考察指标,在相同样品量的情况下抑菌圈越大说明样品的抑菌活性越强,本研究将抑菌圈直径>1.5cm,用“+++”表示;1.0cm≤抑菌圈直径<1.5cm,用“++”表示;小于1.0cm的抑菌圈不明显,用“+”表示;没有抑菌圈,用“—”表示。
表1鯷鱼中抗菌物质对大肠杆菌的抑制作用
实施例5
使用鯷鱼抗菌物质对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,革兰氏阳性菌)进行抑菌实验。将冻存的金黄色葡萄球菌接种至5mL TSB液体培养基中,37℃摇菌8h后,转接至5mL TSB液体培养基中,按上述方法重复两次,得到实验用的菌液。使用超微量分光光度计(NanoDrop)测定菌液的菌落数。加入菌液使TSB培养基中的菌浓度为1×105CFU/mL,制备直径6cm的TSB琼脂平板5个,用100μL枪头制作加样孔。鯷鱼抗菌物质按125mg/mL,250mg/mL和500mg/mL梯度稀释,加样体积均为50μL,每个浓度平行三次。以蒸馏水作为空白对照。加样后将平板放置4℃冰箱过夜吸收,待样液全部吸收后取出平板倒置于37℃摇床,静置培养,观察。
以抑菌圈直径作为抑菌效果的考察指标,在相同样品量的情况下抑菌圈越大说明样品的抑菌活性越强,本研究将抑菌圈直径>1.5cm,用“+++”表示;1.0cm≤抑菌圈直径<1.5cm,用“++”表示;小于1.0cm的抑菌圈不明显,用“+”表示;没有抑菌圈,用“—”表示。
表2鯷鱼中抗菌物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用
Claims (7)
1.一种鳀鱼抗菌物质的制备方法,其特征在于:
1)将鳀鱼冷冻干燥后粉碎,加入2~10倍(w/v,kg鳀鱼/L溶剂)体积的有机溶剂,于温度20~80℃、转速80~200rpm搅拌提取0.5~5小时;提取结束后过滤,滤渣收集备用;
2)鯷鱼滤渣用去离子水清洗,加入5~20倍(w/v,kg/L水)去离子水,用1~5M盐酸调节pH至4.5~7.5,加入微生物菌种,使发酵液中菌含量为1*106~2*108CFU/ml,于30~50℃发酵1~5天;发酵结束后于5000~15000rpm离心5~20min,取上清液冷冻干燥,得到鯷鱼发酵粗提取物;
3)鯷鱼发酵粗提取物中加入2~10倍体积(w/v,kg/L)的0.01~0.1M的盐酸,在0~20℃匀浆5~20min后,于5000~15000rpm离心10~30min,取上清液加入三氯乙酸至最终浓度为5~20%(v/v),0~20℃静置4~8小时,于5000~15000rpm离心10~30min,取上清冷冻干燥,得到抗菌物质。
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所用有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯、石油醚中一种或者几种溶剂混合物。
3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
发酵所用的微生物菌种为枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌中的一种或二种以上。
4.一种权利要求1、2或3所述的制备方法制备获得的鳀鱼抗菌物质。
5.一种权利要求4所述的鳀鱼抗菌物质在食品防腐中的应用,其特征在于:所述的鳀鱼抗菌物质作为抗菌活性成份用于食品防腐剂或食品防腐包装材料中。
6.按照权利要求5所述的鳀鱼抗菌物质在食品防腐中的应用,其特征在于:权利要求4所述鳀鱼抗菌物质对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)均具有较强的抑菌效果。
7.一种食品防腐剂或食品防腐包装材料,采用权利要求4所述的鳀鱼抗菌物质为活性成份,其可单独或者作为配料或抗菌添加剂制备成为食品防腐剂或食品防腐包装材料。
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