CN108602857A

CN108602857A - 重组IgG Fc多聚体

Info

Publication number: CN108602857A
Application number: CN201780008312.9A
Authority: CN
Inventors: R·施皮里格; F·凯瑟曼; A·祖尔切尔; C·潘诺希思; A·柏兹摩瑞丽; 陈朝广
Original assignee: Jeter Behring Biological Products Reorganization Equipment Co Ltd
Current assignee: Kangnobel Linnau Co Ltd
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2018-09-28
Also published as: HK1258166A1; EP3408279A1; MX2018008339A; JP2019511458A; CA3012037A1; WO2017129737A1; AU2017213117A1; RU2018130525A; KR20180100701A; BR112018014668A2; SG11201805579SA; US20190119377A1; RU2018130525A3; SG10201911561SA

Abstract

本公开提供了重组IgG Fc多聚体和通过施用这样的多聚体治疗自身免疫疾病和炎性疾病的方法。

Description

重组IgG Fc多聚体

领域

本公开内容提供了重组IgG Fc多聚体和通过施用这种多聚体治疗自身免疫疾病和炎性疾病的方法。

背景

血浆来源的免疫球蛋白G(IgG)在临床中用于治疗原发性和继发性免疫缺陷。在这种情况下，IgG通过静脉内(IVIG)或皮下(SCIG)施用。两者均由超过10,000个供体的大型血浆库制备，确保了多样化的抗体库。

然而，IVIG的高剂量(1-2g/kg/剂量)施用已越来越多地用于治疗患有慢性或急性自身免疫疾病和炎性疾病的患者，例如免疫性血细胞减少症(ITP)，格林-巴利综合征，川崎疾病，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)，重症肌无力(MG)和其他几种罕见疾病。另外，目前正在探索用于若干其他适应症的IVIG的标签外使用，例如用于治疗类风湿性关节炎(RA)。

已经提出了许多作用机制用于高剂量IVIG的抗炎作用。这些包括阻断Fcγ受体(FcγR)，新生FcR(FcRn)的饱和以增强自身抗体清除，抑制性FcγRIIB(CD32B)的上调，补体蛋白片段的清除和补体片段沉积的抑制，IVIG中的抗独特型抗体(Ab)，免疫介质(例如细胞因子)的结合或中和，或免疫细胞的调节(例如调节性T细胞、B细胞或致耐受性树突细胞的诱导)。有趣的是，几种上述性质可以仅用IgG的Fc部分概括。已经显示Fc在几种疾病动物模型例如ITP以及炎性关节炎中是治疗性的。此外，已经证明Fc在患有急性ITP的儿童中具有治疗活性，表明FcγR的关键性参与。

最近的几项研究调查了基于重组Fc蛋白的治疗剂的功效。具体地，已经研究了Fc的多聚化，其导致对FcγR具有高亲合力的多价分子。

包含多个顺序连接的Fc结构域的前瞻性IVIG替代蛋白描述于WO 2008/151088中。连续Fc结构域被描述为进一步与IgM尾部区连接，并且掺入J链以产生Fc五聚体结构。然而，没有提供关于所设想的多聚体蛋白的制备或功效的工作实施例。

等(1996)J Immunol 156：2858-2856描述了几种IgG多聚体构建体，其包含与IgM尾部区融合的CH1、CH2和CH3IgG结构域。其他构建体具有取代一个或多个IgG重链结构域的IgM结构域。该研究集中于确定J链对各种尾部区构建体的多聚化的影响，并发现主要包含IgG重链结构域的构建体聚合而不掺入J链。该研究还显示IgG Fc结构域中的L309C残基变化导致更高级的多聚体，主要是六聚体。

WO 2015/132364和WO 2015/132365公开了几种Fc多聚体构建体，其包含5个氨基酸的铰链区，衍生自IgG1、IgG4或IgG1和IgG4 CH2和CH3结构域的杂合体的Fc区，以及IgM或IgA尾部区。公开内容涉及通过引入融合肽的Fc区中的氨基酸变化来改善IgG Fc多聚体的安全性和功效。优选的突变改善了与FcRn的结合，增加了Fc融合单体的多聚化，并且减少了Fc多聚体与补体途径组分C1q的结合。Fc多聚体也被改造成具有突变以减少细胞因子释放和血小板活化的刺激。

WO2014/060712公开了Fc多聚体构建体，其包含IgG1 Fc区，四个氨基酸的接头和IgM尾部区，其多聚化为主要为六聚体的结构。引入Fc残基309和310(L309C和H310L)的突变以模拟IgM的序列。如所预期的，由于缺乏Fab区域，突变Fc六聚体与C1q结合不良并且未能活化补体***，如C5b-9末端复合物的检测的缺乏所示。所公开的Fc多聚体在ITP小鼠模型中有效恢复血小板计数。

发明人已经发现本发明的优化的六聚体Fc-μTP构建体具有优于先前描述的那些的几个益处：

●令人惊讶的是，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C结合C1q，但不诱导补体蛋白C2的切割，因此没有形成C3转化酶(C4b2a)。

●Fc-μTP和Fc-μTP-L309C选择性地抑制完整经典途径的活化。

●未观察到对旁路途径的干扰，因此该补体途径仍然完好无损，可用于防御传染病。没有发生补体***的***性阻塞。

●Fc-μTP和Fc-μTP-L309C可能在自身抗体介导的疾病和/或其中发生补体***的抗体介导的经典途径活化的疾病中特别有益。

概述

本公开内容提供了Fc多聚体蛋白，其包含2至6个IgG Fc融合单体。每个IgG Fc融合单体包含两条Fc融合多肽链，每条Fc融合多肽链包含IgG Fc多肽和IgM尾部区。在优选的实施方案中，Fc多聚体是Fc六聚体，其包含六个IgG Fc融合单体。

在优选的实施方案中，Fc融合多肽链还包含IgG铰链区，并且Fc融合多肽链不包含Fab多肽。

例如，在本发明的一个实施方案中，本发明的Fc融合多肽链包含IgG1铰链区、IgG1Fc结构域和IgM尾部区，并且不包含Fab多肽。在优选的实施方案中，Fc融合多肽链是SEQ IDNO：1并且具有最多5个保守氨基酸变化。在一个实施方案中，Fc融合多肽链是SEQ ID NO：7。

在优选的实施方案中，Fc融合多肽链包含IgG1铰链区、IgG1 Fc结构域和IgM尾部区，其中IgG1 Fc结构域在309位(根据EU编号)具有半胱氨酸而不是亮氨酸，和其中Fc融合多肽不包含Fab多肽，Fc融合多肽链是SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，Fc融合多肽链是SEQ ID NO：2，具有至多5个保守氨基酸变化。在一个实施方案中，Fc融合多肽链是SEQ IDNO：8。

在宿主细胞内合成的Fc融合多肽链还将包含信号肽，例如具有SEQ ID NO：4所示序列的信号肽。然而，信号肽在分泌期间被切除，因此通常不再存在于所得的成熟Fc六聚体中。

本发明的另一个实施方案是编码Fc融合多肽链的多核苷酸，优选地，多核苷酸还编码与Fc融合多肽链连接的信号肽。

在优选的实施方案中，Fc六聚体结合补体成分C1q。在一个实施方案中，与C1q结合的Fc六聚体不诱导完整的经典补体途径的活化。

在优选的实施方案中，与C1q结合的Fc六聚体不诱导大多数补体途径组分C2的切割。

在优选的实施方案中，Fc六聚体不诱导C2的切割。

在优选的实施方案中，与C1q结合的Fc六聚体不会导致补体途径组分C3转化酶的形成。

在优选的实施方案中，Fc六聚体不诱导补体途径组分可溶性C5b-9的形成。在一个实施方案中，与通过用全血孵育的热聚集IgG诱导的可溶性C5b-9产生相比，用全血孵育的1mg/ml Fc六聚体诱导小于20％的可溶性C5b-9产生。在一个实施方案中，与通过用全血孵育的热聚集IgG诱导的可溶性C5b-9产生相比，用全血孵育的Fc六聚体诱导小于10％的可溶性C5b-9产生。

在优选的实施方案中，Fc六聚体抑制C5b-9的产生。在一个实施方案中，Fc六聚体抑制由用全血孵育的热聚集IgG诱导的C5b-9产生。

在一个优选的实施方案中，与未治疗的关节炎小鼠相比，在小鼠关节炎模型中施用Fc六聚体诱导临床评分、关节浸润细胞数或组织学评分的减少。在一个实施方案中，与未治疗的关节炎小鼠相比，在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg的Fc六聚体诱导第7-14天中任何一天的临床评分减少；从第7天到第14天计算的平均临床评分减少；在第8天从膝关节回收的CD45+细胞数量减少；在第8天或第14天踝关节的组织学评分减少。在一个优选的实施方案中，与未治疗的关节炎小鼠相比，在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg的Fc六聚体诱导在第7至14天的任何一天中临床评分减少超过50％；从第7天到第14天计算的平均临床评分减少超过50％；在第8天从膝关节回收的CD45+细胞数量减少超过50％；或者在第8天踝关节的组织学评分减少超过25％和/或在第14天踝关节的组织学评分减少超过50％。

在一个优选的实施方案中，与重组单体Fc片段相比，Fc六聚体在经典补体途径的溶血测定中抑制调理的红细胞的裂解。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：3的重组Fc单体相比，Fc六聚体在经典补体途径的溶血测定中抑制调理的绵羊红细胞的裂解。在一个实施方案中，与包含SEQ ID NO：3的两个多肽的重组Fc单体相比，浓度为0.5mg/ml的Fc六聚体在经典补体途径的溶血测定中抑制调理的绵羊红细胞裂解超过70％。

在优选的实施方案中，Fc六聚体诱导嗜中性粒细胞或单核细胞上Fcγ受体II表达或Fcγ受体III表达的减少。在一个实施方案中，与未治疗的关节炎小鼠相比，在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg Fc六聚体诱导在第8天中性粒细胞或单核细胞上Fcγ受体II或Fcγ受体III水平减少超过50％。

在优选的实施方案中，Fc六聚体抑制单核细胞上C5a受体(CD88)的上调。

在优选的实施方案中，Fc六聚体诱导单核细胞上Fcγ受体I(CD64)水平的减少。在一个实施方案中，与未治疗的关节炎小鼠相比，在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg的Fc六聚体诱导第8天的单核细胞上的Fcγ受体I(CD64)减少。

在优选的实施方案中，Fc六聚体在体内功能性地阻断新生儿Fc受体(FcRn)。在一个实施方案中，施用200mg/kg的Fc六聚体显著增加表达人FcRn的转基因小鼠中示踪抗体的清除。在优选的实施方案中，施用200mg/kg的Fc六聚体使示踪抗体的半衰期减少至少20％，更优选至少30％、40％、50％甚至更优选至少60％。

在一个优选的实施方案中，Fc六聚体抑制THP-1细胞对人IgG包被的珠的吞噬作用，表明抑制受体介导的吞噬作用，比同等浓度的IVIG更有效。在一个优选的实施方案中，与IVIG浓度相比10倍更低浓度的Fc六聚体能够达到与使用的IVIG浓度达到的至少相同的抑制水平，优选30倍更低浓度的Fc六聚体，甚至更优选100倍更低浓度的Fc六聚体，甚至更优选300倍更低浓度的Fc六聚体，最优选1000倍更低浓度的Fc六聚体能够达到与使用的IVIG浓度至少相同的抑制水平。

在一个优选的实施方案中，Fc六聚体在体外不活化人嗜中性粒细胞，如通过响应于高达3mg/ml的浓度的钙动员的缺乏所示的。在一个优选的实施方案中，Fc六聚体在人嗜中性粒细胞中的钙动员小于热聚集IgG观察到的钙动员的50％，更优选小于40％，小于30％，甚至更优选小于20％，最优选小于10％。

在一个优选的实施方案中，Fc六聚体通过热聚集IgG抑制活化测量的嗜中性粒细胞的钙动员，模拟免疫复合物，并比IVIG更有效。使用与IVIG相比2倍更低浓度的Fc六聚体，优选使用4倍更低的浓度，甚至更优选使用与IVIG相比8倍更低浓度的Fc六聚体。

在一个优选的实施方案中，通过Fc六聚体实现IgG包被的RBC诱导的呼吸爆发的等效抑制水平，其中使用比单体Fc低2倍浓度的Fc六聚体，优选使用低4倍的浓度，甚至更优选使用的Fc六聚体浓度比单体Fc低8倍。

在优选的实施方案中，在存在高正常人血清浓度(即>20％)的情况下，通过Fc六聚体引起的人单核细胞中的钙动员是用实现最大刺激的热聚集IgG浓度观察到的钙动员的小于40％，优选小于30％，更优选小于20％，甚至更优选小于10％。

本公开内容还提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的Fc六聚体的药物组合物来治疗受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法。

在优选的实施方案中，静脉内或非静脉内施用Fc六聚体。在一个实施方案中，皮下施用Fc六聚体。在一个实施方案中，口服、或鞘内或通过喷雾肺内施用Fc六聚体。

在优选的实施方案中，自身免疫或炎性疾病选自免疫性血细胞减少症，格林-巴利综合征，川崎病，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，重症肌无力，炎性神经病，视神经脊髓炎，其他自身免疫性通道病，自身免疫性癫痫，皮肌炎或多发性肌炎，天疱疮。或类天疱疮，硬皮病，***性红斑狼疮和类风湿性关节炎。在一个实施方案中，自身免疫疾病是自身抗体介导的。在一个实施方案中，炎性疾病与移植有关。在一个实施方案中，炎性疾病是由于再灌注损伤或炎症是由于脊髓损伤引起的。

在优选的实施方案中，Fc六聚体的施用量为约10mg/kg至约200mg/kg。在一个实施方案中，Fc六聚体的施用量为约25mg/kg至约500mg/kg。所有剂量均为施用Fc六聚体的受试者的每千克体重。

应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述仅是示例性和说明性的，并且旨在提供对本公开内容的进一步的非限制性说明。

附图说明

图1A显示Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体结构的示意图。

图1B显示了Fc-μTP(左)和Fc-μTP-L309C(右)Fc蛋白的SDSPAGE。显示了kDa为单位的分子量标记。

图1C显示Fc-μTP(左)和Fc-μTP-L309C(右)的尺寸排阻色谱(SEC)。色谱图显示标准化的280nm处的U.V.吸光度信号(A280)和粗线显示在所示时间洗脱的材料的分子量(以kDa计)，通过多角度光散射(MALS)测定。

图1D显示了Fc-μTP(左)和Fc-μTP-L309C(右)的不对称流场流分级(AF4)。色谱图显示标准化的A280信号，粗线显示在所示时间洗脱的材料的分子量(以kDa计)，由MALS测定。

图2显示了LPS但非Fc蛋白Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对NFκB的活化，显示内毒素污染的缺乏。

图3A显示Fc蛋白Fc-μTP和Fc-μTP-L309C与FcγR组分CD16a、CD32a、CD32b/c和CD64的结合的Biacore分析。

图3B显示IVIG、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C与人单核细胞系THP1的结合。

图3C显示IVIG、Fc、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C与原代人嗜中性粒细胞的结合。

图3D显示免疫荧光图像，表明IVIG、Fc、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C与原代人M1和M2巨噬细胞的结合。

图3E显示了IgG1、Fc、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C与CD16转染的NFAT-bla Jurkat细胞的结合。Ki值(平均值±SEM，n＝4次实验)以nM表示。

图4A显示代表性流式细胞术直方图，显示THP1细胞上(左至右)CD64(FcγRI)、CD32(FcγRII)和CD16(FcγRIII)的染色(灰色阴影)。未填充的直方图显示同种型对照Ab染色。

图4B显示THP-1细胞上(左至右)CD64、CD32和CD16的流式细胞术平均荧光强度(MFI)值(平均值±范围，n＝2)。

图5A显示了在pH6.0下Fc、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C(各自为25μg/ml)与FcRn结合的Octet分析。

图5B显示人IgG1、Fc、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C在pH5.5与FcRn转染的FreeStyle ^TM293-F细胞的结合。Ki值(平均值±SEM，n＝3次实验)以nM表示。

图6A显示了在单次静脉注射后在FcRn转基因小鼠的血液中测量的IVIG、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的药代动力学。在时间0注射。所有剂量均为100mg/kg。

图6B显示了在单次静脉注射后在野生型大鼠的血液中测量的IVIG、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的药代动力学。剂量为：IVIG(250mg/kg)，Fc-μTP(25mg/kg)和Fc-μTP-L309C(25mg/kg)。虚线水平线表示测定中的检测下限。

图7A显示了用于评估Fc蛋白在关节炎的CAbIA模型中的治疗效果的方案。

图7B显示了在关节炎的CAbIA模型中第6天对IVIG、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的治疗性施用的临床反应。显示了响应动力学(左)和第7-14天的平均临床评分(右)。所有数据均为平均值±SEM，汇总自2次实验。

图7C显示在关节炎的CAbIA模型中在疾病的第8天从小鼠的膝关节回收的CD45+细胞。所有数据均为平均值±SEM，汇总自2次实验。与PBS对照相比，*P<0.05，**P<0.01，*＊*P<0.001。

图7D显示了关节炎的CAbIA模型中关节炎关节的组织病理学。来自在第6天用PBS、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理的关节炎小鼠在第8天的跗关节的代表性H&E染色切片。还显示了首次用于实验的非关节炎小鼠的关节。原始放大倍数x40。

图7E显示关节炎的CAbIA模型中关节的组织学分析。数据显示了在第6天用PBS、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理的关节炎小鼠在第8天和第14天的关节的平均(±SEM)组织学评分。所有数据均为平均值±SEM，汇总自2次实验。与PBS对照相比，*P<0.05，**P<0.01，*＊*P<0.001。

图8显示关节炎CAbIA模型第8天的关节组织洗液中细胞因子/趋化因子水平(以pg/ml计)。所有数据均为平均值±SEM，汇总自2次实验。与PBS对照相比，*P<0.05，**P<0.01，*＊*P<0.001。

图9显示了在关节炎的CAbIA模型的第8天取得的关节炎小鼠关节洗液中的补体成分C1q、C3和C5a。在第6天用PBS、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理关节炎小鼠。还包括非关节炎的首次用于实验的小鼠关节洗液。数据(从2个实验合并)显示通过ELISA测定的补体组分浓度(平均值±SEM)，单位为pg/ml。与PBS对照相比，*P<0.05，**P<0.01，*＊*P<0.001。

图10显示了Fc蛋白Fc-μTP和Fc-μTP-L309C在溶血补体测定中的作用。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C抑制经典途径(调理的绵羊RBC的裂解；左图)而不是旁路途径(兔RBC的裂解；右图)。

图11A显示在体外Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对特定补体途径(CP，经典；LP，凝集素；AP，替代)的使用“非优化的”缓冲条件的抑制。使用ELISA补体***筛选试剂盒。数据显示正常人血清(NHS)值的百分比。

图11B显示通过ELISA测定的C1q与Fc、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C的结合。

图11C显示IVIG、Fc、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对人全血中C4a(左)和sC5b-9(右)的产生的影响。热聚集的丙种球蛋白(HAGG)用作阳性对照。

图11D显示响应于人全血中的HAGG的sC5b-9产生的Fc-μTP和Fc-μTP-L309C抑制。

图11E显示了在存在和不存在HAGG的情况下Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对C2切割的影响，通过SDS-PAGE和Western印迹显示C2。C2的位置用箭头表示，分子量标记以kDa在左边显示。

图11F显示了Fc-μTP和Fc-μTP-L309C、而不是Fc单体对HUVEC上C3b沉积的剂量依赖性抑制。

图12显示了Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对HAGG活化的人血清中C4a和C5a的产生的影响。

图13A显示在于第6天用PBS、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理的关节炎CAbIA模型的第8天从关节炎小鼠的关节和血液获得的嗜中性粒细胞和单核细胞上的FcR(CD64，CD16/32)表达。数据显示通过流式细胞术测定的平均荧光强度(MFI)(平均值±SEM)。与PBS对照相比，*P<0.05，**P<0.01，*＊*P<0.001。N/A，未评估。

图13B显示Fc-μTP和Fc-μTP-L309C不能活化人嗜中性粒细胞中的呼吸爆发。左和右柱分别为1.5和0.4mg/ml剂量。

图13C显示Fc-μTP和Fc-μTP-L309C响应于人嗜中性粒细胞中IgG包被的兔RBC而抑制呼吸爆发的活化。左和右柱分别为1.5mg/ml和0.4mg/ml剂量。

图13D显示Fc-μTP和Fc-μTP-L309C抑制抗D-处理的O+人红细胞的Ab-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(平均值±SEM，n＝3)。

图13E显示Fc-μTP和Fc-μTP-L309C在关节炎的CAbIA模型的第8天抑制外周血单核细胞上的C5aR(CD88)的上调。

图14显示Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对人血小板的活化的缺乏。数据显示通过流式细胞术测量的作为血小板活化的标志物的在人血小板上的P-选择蛋白(CD62P)的表达(MFI)。ADP或Convulxin作为血小板活化的阳性对照。数据显示通过流式细胞术确定的中值荧光强度(MFI)(平均值±SEM；n＝3)。与未活化相比，*＊*P<0.001。

图15显示了与s.c相比i.p.施用的关节炎的CAbIA模型的第6天对IVIG、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的治疗性施用的临床反应。显示了第7-14天的平均临床评分。*P<0.05，**P<0.01，参见PBS对照；Kruskal-Wallis与Dunn的多重比较测试。

图16显示了Fc-μTP-L309C、IVIG或PBS对人FcRn转基因小鼠体内示踪mAb清除的影响。数据显示小鼠血清中示踪剂mAb的绝对信号(平均值±SEM；n＝3)，通过基于MSD的免疫测定以1/500稀释度测定。

图17显示了Fc-μTP-L309C对THP1细胞的吞噬活性的影响。将THP1细胞与IgG包被的FITC标记的乳胶珠和IVIG、Fc单体或Fc-μTP-L309C在37℃孵育3小时。然后，通过流式细胞术分析珠子的摄取。将所示数据标准化，即仅用IgG包被的FITC标记的乳胶珠培养的THP1细胞和培养基被认为具有100％的吞噬活性(平均值±SD，n＝3)。

图18A显示了Fc-μTP-L309C对原代嗜中性粒细胞中Ca²⁺通量的影响。显示了代表性数据。

图18B显示用IVIG[2500μg/mL]、Fc-μTP[311μg/mL]和Fc-μTP-L309C[274μg/mL]抑制HAGG诱导的Ca²⁺动员。显示了代表性数据。

图19显示了i.v.相对于s.c.给予的Fc-μTP-L309C的生物利用度。

图20显示了优化的预孵育方法对补体和C4切割的凝集素途径的抑制的影响。

图21A显示了在体外Fc-μTP-L309C对特定补体途径(CP，经典；LP，凝集素；AP，替代)的使用“优化的”缓冲条件的抑制。ELISA补体***试剂盒(平均值±SD，n＝3)。

图21B显示了Fc-μTP-L309C在正常人血清中的C4a的产生和不存在C5a产生。作为阳性对照，使用热聚集IgG(HAGG)。(平均值±SD，n＝3)。

图21C显示了ELISA补体***试剂盒的特异性，其使用了耗尽指定补体因子的血清。用相应的纯化蛋白重建耗尽的血清以证明所用血清的补体活性。

详细描述

以下详细描述和实施例说明了本公开内容的某些实施方案。本领域技术人员将认识到，本公开内容的许多变化和修改都包含在其范围内。因此，某些实施方案的描述不应视为是限制性的。

如本文所用，术语“Fc单体”定义为含有IgG的重链CH2和CH3结构域的免疫球蛋白G(IgG)重链恒定区的一部分或其变体或片段。IgG CH2和CH3结构域也分别称为Cγ2和Cγ3结构域。

Fc单体可以包含两个相同的Fc肽，其通过肽的N-末端部分中的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。针对IgG描述的二硫键的排列涉及天然人抗体。来自其他脊椎动物物种的抗体之间可能存在一些差异，尽管这些抗体可能适合于本发明的上下文。Fc肽可以通过重组表达技术产生，并通过天然抗体中存在的二硫键缔合。或者，可以将一个或多个新的半胱氨酸残基引入Fc肽中的适当位置以使二硫键形成。或者，Fc单体可以由两种形成异二聚体Fc单体的不同Fc肽组成。在一种可能的方法中，进行氨基酸(aa)改变以形成两个互补的Fc肽。将较小的aa替换为较大的aa以在一个Fc肽中形成“旋钮”，并将较大的aa替换为较小的aa以在另一个Fc肽的相同区域(例如CH3结构域)中形成“孔”。利用这种“旋钮入孔”技术，可以增强两种Fc肽的自组装以形成异二聚体Fc单体(Ridgway等(1996)Protein Engineering 9：617-621)。

在一个实施方案中，Fc单体包含两条相同的肽链，其包含人IgG1CH2和CH3结构域。

在另一个实施方案中，Fc单体包括完整的CH2和CH3结构域，并分别在CH2的N-末端或CH3的C-末端截短。通常，Fc单体缺乏免疫球蛋白的Fab多肽。Fab多肽由CH1结构域和重链可变区结构域组成。

Fc单体可以包含多于免疫球蛋白的CH2和CH3部分。例如，在一个实施方案中，单体包括免疫球蛋白的铰链区，其片段或变体，或修饰的铰链区。天然铰链区是免疫球蛋白的区域，其存在于天然免疫球蛋白中的CH1和CH2结构域之间。变体或修饰的铰链区是长度和/或组成与天然铰链区不同的任何铰链。这种铰链可包括来自其他物种的铰链区域。其他修饰的铰链区包含完整的铰链区，其衍生自与Fc部分的抗体不同的类或亚类的抗体。或者，修饰的铰链区包含天然铰链或重复单元的一部分，其中重复中的每个单元衍生自天然铰链区。在另一个替代方案中，通过增加或减少半胱氨酸残基的数量来改变天然铰链区。其他修饰的铰链区完全是非天然的，并且设计成具有所需的性质，例如长度、半胱氨酸组成和柔韧性。

已经描述了许多修饰的铰链区，例如在US 5677425、WO 1999/15549、WO 2005/003170、WO 2005/003169、WO 2005/003170、WO 1998/25971和WO 2005/003171中，并且这些通过引用并入本文。

在一个实施方案中，Fc肽在其N-末端具有人IgG1铰链区。在一个实施方案中，铰链区是SEQ ID NO：5。

在一些实施方案中，Fc多肽链包含信号肽。信号肽指导Fc多肽链的分泌，然后从Fc多肽链的其余部分切割。

在一个实施方案中，Fc肽包括与铰链区的N末端融合的信号肽。在一个实施方案中，信号肽是SEQ ID NO：4。

为了改善两个或更多个Fc单体的多聚体结构的形成，将Fc肽融合到尾部区，使得单体单元组装成多聚体。Fc肽与尾部区融合的产物是本文所用的“Fc融合肽”。当Fc肽二聚化形成Fc单体时，Fc融合肽同样二聚化形成Fc融合单体。

因此，如本文所用的“Fc融合单体”包含两条Fc融合多肽链，并且每条Fc融合多肽链包含IgG Fc多肽和IgM尾部区。

合适的尾部区衍生自IgM或IgA。IgM和IgA在人类中天然存在，作为常见H₂L₂抗体单元的共价多聚体。当IgM掺入了J链时，IgM以五聚体形式出现，或当缺乏J链时，IgM以六聚体形式出现。IgA作为单体出现并形成二聚体。IgM和IgA的重链各自具有延伸至C-末端恒定结构域的相应18个氨基酸，称为尾部区。该尾部区包括半胱氨酸残基，其在聚合物中的重链之间形成二硫键，并且被认为在聚合中具有重要作用。尾部区还含有糖基化位点。

本公开内容的尾部区包含任何合适的氨基酸序列。尾部区是在天然存在的抗体中发现的尾部区，或者，它是修饰的尾部区，其长度和/或组成与天然尾部区不同。其他改进的尾部区完全是非天然的，并且设计成具有多聚化所需的性质，例如长度、柔韧性和半胱氨酸组成。

在一个实施方案中，尾部区包含来自人IgM的18个氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的全部或部分。在另一个实施方案中，尾部区是人IgM尾部区的片段或变体。

在一个实施方案中，尾部区直接融合至Fc肽的C末端以形成Fc融合肽。或者，通过***的氨基酸序列间接融合尾部区。例如，在一个实施方案中，在尾部区和Fc肽之间提供短接头序列。接头序列的长度可以在1至20个氨基酸之间。

通过将Fc融合肽的Fc部分的亮氨酸309突变为半胱氨酸，可以进一步改善多聚体结构的形成。L309C突变允许Fc融合单体之间形成另外的二硫键，这进一步促进Fc融合单体的多聚化。根据针对IgG的EU编号***，对IgG Fc部分的残基进行编号，如Edelman GM等(1969)，Proc Natl Acad Sci 63,78-85中描述的；还参见Kabat等，1983，Sequences ofproteins of immunological interest,US Department of Health and HumanServices,National Institutes of Health,Washington,DC。根据序列同源性IgG的Leu309对应于IgM的Cμ3结构域中的Cys 414和IgA的Cα2结构域中的Cys 309。

另外或替代地，在Fc融合肽中引入其他突变以实现期望的效果。如本文所用，术语“突变”包括一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失。在一些实施方案中，Fc融合肽包含最多20个、最多10个、最多5个或最多2个氨基酸突变。

在一些实施方案中，突变是保守氨基酸变化。如本文所用，术语“保守氨基酸变化”是指氨基酸改变为具有相似生物化学性质的不同氨基酸，例如电荷、疏水性、结构和/或大小。在一些实施方案中，Fc融合肽包含最多20个，最多10个，最多5个或最多2个保守氨基酸变化。在一个实施方案中，Fc融合肽包含至多5个保守氨基酸变化。

保守氨基酸变化包括以下残基组之间的变化：Val，Ile，Leu，Ala，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr，Gly，Ala；Lys，Arg，His；和Phe，Tyr，Trp。

当在本文中用于描述肽、蛋白或其片段时，“变体”可具有修饰的氨基酸。合适的修饰包括乙酰化，糖基化，羟基化，甲基化，核苷酸化，磷酸化，ADP-核糖基化和本领域已知的其他修饰。这种修饰可以在翻译后发生，其中肽是通过重组技术制备的。另外，可以使用本领域已知的技术对合成肽进行修饰。在将氨基酸掺入肽之前可以包括修饰。羧酸基团可以被酯化或可以转化成酰胺，氨基可以被烷基化，例如甲基化。还可以在翻译后修饰变体，例如以去除或添加碳水化合物侧链或单个糖部分。

如本文所用的术语“Fc多聚体”描述了两个或更多个聚合的Fc融合单体。Fc多聚体包含2至6个Fc融合单体，产生Fc二聚体、Fc三聚体、Fc四聚体、Fc五聚体和Fc六聚体。Fc融合单体天然地缔合成具有不同数量的单体单元的聚合物中。

在一个实施方案中，大多数Fc多聚体是Fc六聚体。如本文所用，术语“大多数”是指大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。在一个实施方案中，大于80％的Fc多聚体是Fc六聚体。

如果需要含有特定数目单体的Fc多聚体，可以根据分子大小分离Fc多聚体，例如通过凝胶过滤(尺寸排阻色谱法)。

多核苷酸

本公开内容进一步涉及编码Fc多聚体的Fc融合肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。多核苷酸可以是单链或双链DNA，单链或双链RNA。如本文所用，术语“多核苷酸”还包括含有一种或多种修饰碱基和/或不常见碱基的DNA或RNA，例如肌苷。应当理解，可以对DNA和RNA进行各种修饰，其用于本领域技术人员已知的许多有用目的。本文使用的术语“多核苷酸”包括多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂的细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。

本领域技术人员将理解，由于遗传密码子的简并性，给定的多肽可以由不同的多核苷酸编码。这些“变体”包含在本文公开的Fc多聚体中。

Fc多聚体的多核苷酸可以是分离的多核苷酸。术语“分离的”多核苷酸是指基本上不含其他核酸序列的多核苷酸，例如但不限于其他染色体和染色体外DNA和RNA。在一个实施方案中，从宿主细胞中纯化分离的多核苷酸。本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

本公开内容的另一方面是包含根据本公开内容的多核苷酸的质粒或载体。在一个实施方案中，质粒或载体包含表达载体。在一个实施方案中，载体是用于人基因治疗的转移载体。本公开内容的另一方面是宿主细胞，其包含本公开内容的多核苷酸、质粒或载体。

在一个实施方案中，本公开内容的宿主细胞用于产生Fc多聚体的方法中。该方法包括：

(a)在表达所需***蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞；和

(b)任选地从宿主细胞或培养基中回收所需的***蛋白。

在一个实施方案中，相对于污染的大分子，例如其他蛋白和核酸，将Fc多聚体纯化至≥80％纯度，≥90％纯度，≥95％纯度，≥99％纯度或≥99.9％纯度，和不含传染性和致热剂。本公开内容的分离的Fc多聚体可以基本上不含其他非相关多肽。

本公开内容的各种产物可用作药物。因此，本公开内容涉及包含Fc多聚体、本公开内容的多核苷酸或本公开内容的质粒或载体的药物组合物。

本公开内容还涉及在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病或炎性疾病的方法。该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Fc多聚体。在另一个实施方案中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的多核苷酸或本公开内容的质粒或载体。

所提出的Fc多聚体的表达

在合适的宿主细胞中高水平生产重组蛋白需要将上述修饰的cDNA与适当的调节元件一起组装成有效的转录单元，所述重组表达载体可以根据本领域技术人员已知的方法在各种表达***中繁殖。有效的转录调节元件可以源自以动物细胞作为其天然宿主的病毒或来自动物细胞的染色体DNA。例如，可以使用来自猿猴病毒40、腺病毒、BK多瘤病毒、人巨细胞病毒或劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列的启动子-增强子组合，或动物细胞中包含强组成型转录基因如β-肌动蛋白或者GRP78的启动子-增强子组合。为了获得从cDNA转录的稳定的高水平mRNA，转录单元应在其3'近端部分含有编码转录终止-多腺苷酸化序列的DNA区。例如，该序列可以源自猿猴病毒40早期转录区、兔β珠蛋白基因或人组织纤溶酶原活化物基因。

然后可以将cDNA整合到合适的宿主细胞系的基因组中以表达Fc多聚体。在一些实施方案中，该细胞系应该是脊椎动物来源的动物细胞系，以确保正确的折叠、二硫键形成、天冬酰胺连接的糖基化和其他翻译后修饰以及分泌到培养基中。其他翻译后修饰的实例是酪氨酸O-硫酸化和新生多肽链的蛋白水解加工。可以使用的细胞系的实例是猴COS细胞、小鼠L细胞、小鼠C127细胞、仓鼠BHK-21细胞、人胚肾293细胞和仓鼠CHO细胞。

编码相应cDNA的重组表达载体可以以几种不同方式引入动物细胞系。例如，可以从基于不同动物病毒的载体产生重组表达载体。这些的实例是基于杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和牛***瘤病毒的载体。

编码相应DNA的转录单元也可以与另一种重组基因一起引入动物细胞中，所述重组基因可以在这些细胞中起显性选择标记的作用，以便于分离已将重组DNA整合到其基因组中的特定细胞克隆。这种类型的显性选择标记基因的实例是TN4氨基糖苷磷酸转移酶(赋予对遗传霉素(G418)的抗性)、潮霉素磷酸转移酶(赋予对潮霉素的抗性)和嘌呤霉素乙酰转移酶(赋予对嘌呤霉素的抗性)。编码这种选择标记的重组表达载体可以存在于与编码所需蛋白的cDNA相同的载体上，或者可以在单独的载体上编码，该载体同时导入并整合到宿主细胞的基因组中，经常导致不同转录单元之间的紧密物理连接。

可以与所需蛋白的cDNA一起使用的其他类型的选择标记基因基于编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的各种转录单元。在将这种类型的基因导入缺乏内源性dhfr活性的细胞后，例如CHO细胞(DUKX-B11，DG-44)，它将使这些基因能够在缺乏核苷的培养基中生长。这种培养基的一个例子是没有次黄嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham's F12。这些dhfr基因可以与编码IgG Fc融合单体的cDNA一起(连接在不同载体上或在相同载体上)导入上述类型的CHO细胞中，从而生成产生重组蛋白的dhfr阳性细胞系。

如果上述细胞系在细胞毒性dhfr抑制剂甲氨蝶呤的存在下生长，则会出现对甲氨蝶呤具有抗性的新细胞系。由于连接的dhfr和所需蛋白的转录单元的扩增数目，这些细胞系可以以增加的速率产生重组蛋白。当以增加浓度的甲氨蝶呤(1-10,000nM)繁殖这些细胞系时，可以获得以非常高的速率产生所需蛋白的新细胞系。

产生所需蛋白的上述细胞系可以在悬浮培养中或在各种固体支持物上大规模生长。这些载体的实例是基于葡聚糖或胶原基质的微载体，或中空纤维或各种陶瓷材料形式的固体载体。当在细胞悬浮培养物或微载体上生长时，上述细胞系的培养可以作为浴培养物或作为灌注培养物进行，并在延长的时间段内连续生产条件培养基。因此，根据本发明，上述细胞系非常适合于开发用于生产所需重组蛋白的工业方法。

纯化和配制

重组蛋白可以通过各种生化和色谱方法浓缩和纯化，包括利用所需蛋白与宿主细胞或细胞培养中的其他物质之间的大小、电荷、疏水性、溶解度、特异性亲和力等差异的方法。

这种纯化的一个例子是将重组蛋白吸附到针对例如Fc多聚体的Fc部分的单克隆抗体或另一种Fc结合配体(例如蛋白A或蛋白G)，其固定在固体支持物上。在将Fc多聚体吸附到支持物上、洗涤和解吸后，可以基于上述性质通过各种色谱技术进一步纯化蛋白。例如，根据步骤的容量和选择性、支持物的稳定性或其他方面来选择纯化步骤的顺序。纯化步骤例如可以是但不限于离子交换色谱步骤、免疫亲和色谱步骤、亲和色谱步骤、染料色谱步骤和尺寸排阻色谱步骤。

为了最小化病毒污染的理论风险，可以在该过程中包括允许有效灭活或消除病毒的额外步骤。例如，这些步骤可包括液态或固态的热处理，溶剂和/或洗涤剂的处理，可见光或UV光谱的辐射，γ-辐射，纯化过程中的分配，或病毒过滤(纳米过滤)。

本文描述的Fc多聚体可以配制成用于治疗用途的药物制剂。可以将药物制剂的组分重新悬浮或溶解在常规生理学相容的水性缓冲溶液中，任选地，可以向其中加入药物赋形剂以提供药物制剂。药物制剂的组分可能已经含有所有必需的药学、生理学相容的赋形剂，并且可以溶解在注射用水中以提供药物制剂。

此类药物载体和赋形剂以及合适的药物制剂的制备是本领域熟知的(参见例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”，Frokjaer等，Taylor&Francis(2000)或“Handbook of Pharmaceutical Excipients，“3rd edition，Kibbe等，Pharmaceutical Press(2000)”。在某些实施方案中，药物组合物可包含至少一种添加剂，例如填充剂，缓冲剂或稳定剂。标准药物制剂技术是本领域技术人员公知的(参见，例如，2005，Physicians'Desk Reference，Thomson Healthcare：Monvale，NJ，2004；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th ed.，Gennaro等，Eds.Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2000)。合适的药物添加剂包括例如甘露醇，山梨糖醇，乳糖，蔗糖，海藻糖等糖类，氨基酸如组氨酸，精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，苯丙氨酸，脯氨酸或其他，用于实现等渗条件的添加剂如氯化钠或其他盐，稳定剂如聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，聚乙二醇，丙二醇，氯化钙等，生理pH缓冲剂如三(羟甲基氨基甲烷)(Tris(hydroxymethylaminomethan))，等等。在某些实施方案中，药物组合物可含有pH缓冲试剂和润湿剂或乳化剂。在进一步的实施方案中，组合物可含有防腐剂或稳定剂。特别地，包含本文所述Fc多聚体的药物制剂可以配制成冻干或稳定的可溶形式。可以通过本领域已知的多种方法冻干Fc多聚体因子。冻干制剂在使用前通过加入一种或多种药学上可接受的稀释剂如无菌注射用水或无菌生理盐水溶液或合适的缓冲溶液重建。

Fc多聚体的药物制剂的组合物可以通过任何药学上合适的方式递送给个体。各种递送***是已知的，并且可用于通过任何方便的途径施用组合物。根据常规方法，Fc多聚体的药物制剂的组合物可以配制用于静脉内或非静脉内注射或用于肠内(例如口服，***或直肠)递送。对于非静脉内施用，可以配制Fc多聚体的组合物用于皮下、肌肉内、关节内、腹膜内、脑内、鞘内、肺内(例如雾化)、鼻内、皮内、经口或透皮施用。在一个实施方案中，配制Fc多聚体的组合物用于静脉内注射。在其他实施方案中，配制Fc多聚体的组合物用于皮下，肌肉内或透皮施用，优选用于皮下施用。制剂可以通过输注或推注连续施用。一些配方可包括缓释***。

将Fc多聚体的药物制剂的组合物以治疗有效剂量施用至患者。如本文所用，术语“治疗有效”描述了足以产生所需效果、预防或减轻所治疗病症或适应症的严重性或扩散、或表现出可检测的治疗或预防效果的剂量，而无需教导产生无法忍受的不良副作用的剂量。确切剂量取决于许多因素，例如，适应症、制剂和施用方式。治疗有效量可以最初在细胞培养测定中或在动物模型中估计，例如啮齿动物，兔，狗，猪或灵长类动物模型。然后，这些信息可用于确定人体施用的有用剂量和途径。

在一个实施方案中，用于一次静脉注射或一次非静脉内注射的Fc多聚体的剂量小于1,000mg/kg体重，小于800mg/kg体重，小于600mg/kg体重，小于400mg/kg体重，小于200mg/kg体重，或小于100mg/kg体重。例如，在一个实施方案中，Fc多聚体的剂量为约1mg/kg体重至约1,000mg/kg体重，约10mg/kg体重至约800mg/kg体重，约20mg/kg体重至约700mg/kg体重，约30mg/kg体重至约600mg/kg体重，约40mg/kg体重至约500mg/kg体重，约50mg/kg体重至约400mg/kg体重，约75mg/kg体重至约300mg/kg体重，或约100mg/kg体重至约200mg/kg体重。在一个实施方案中，Fc多聚体的剂量为约25mg/kg体重至约1,000mg/kg体重，约25mg/kg体重至约800mg/kg体重，约25mg/kg体重至约600mg/kg体重，约25mg/kg体重至约500mg/kg体重，约25mg/kg体重至约400mg/kg体重，约25mg/kg体重至约300mg/kg体重，约25mg/kg体重至约200mg/kg体重，或约25mg/kg体重至约100mg/kg体重。

在一个实施方案中，Fc多聚体的药物组合物单独施用或与其他治疗剂联合施用。在一个实施方案中，这些药剂作为相同药物的一部分掺入。在一个实施方案中，Fc多聚体与免疫抑制剂疗法(例如类固醇)联合施用。在另一个实施方案中，Fc多聚体与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起施用。

Fc多聚体的施用频率取决于许多因素，例如适应症、制剂、剂量和施用方式。在一个实施方案中，每天多次施用Fc多聚体剂量，每天一次，每隔一天一次，每三天一次，每周两次，每周一次，每两周一次，每三周一次，或每月一次。

在一个实施方案中，本公开内容的Fc多聚体用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病。如本文所用，“自身免疫疾病”包括免疫***攻击身体自身组织的任何疾病。如本文所用，“炎性疾病”包括以破坏性炎症为特征的任何疾病，其可以是复发性的或慢性的并且与正常组织修复无关。这些疾病特别包括“自身炎症性疾病”，其中先天免疫***由于可能未知的原因引起炎症。在一个实施方案中，本公开内容的Fc多聚体用于治疗自身抗体介导的自身免疫疾病。在一个实施方案中，本公开内容的Fc多聚体用于治疗移植中的补体介导的炎症。在一个实施方案中，本公开内容的Fc多聚体用于治疗再灌注损伤中的补体介导的炎症。在一个实施方案中，本公开内容的Fc多聚体用于治疗脊髓损伤中的补体介导的炎症。

适用于治疗的自身免疫性或炎性疾病包括自身免疫性血细胞减少症，特发性血小板减少性紫癜/免疫性血细胞减少症(ITP)，类风湿性关节炎，***性红斑狼疮，哮喘，川崎病，格林-巴利综合征，史蒂文斯-约翰逊综合征，克罗恩氏结肠炎，糖尿病，慢性炎症脱髓鞘性多发性神经病，炎性神经病，视神经脊髓炎，其他自身免疫性通道病，自身免疫性癫痫，重症肌无力，抗因子VIII自身免疫性疾病，皮肌炎，多发性肌炎，硬皮病，血管炎，葡萄膜炎，天疱疮，类天疱疮，脊髓损伤或阿尔茨海默病。

治疗效果

在一些实施方案中，Fc多聚体提供治疗效果。如本文所用，术语“治疗效果”描述了表征疾病或病症的参数的改进。例如，可以通过施用一定剂量的Fc多聚体在疾病或病症的动物模型中确定治疗效果。Fc多聚体的剂量可以是10至1000mg/kg，例如200mg/kg。Fc多聚体可通过静脉内或非静脉内注射或静脉内输注施用。可以在预定时间进行动物的临床评估，直到施用Fc多聚体后的最后时间点。临床评估可包括基于特定疾病或病症的临床表现的评分。生物样品也可以在预定时间从动物中取出，直到施用Fc多聚体后的最后时间点。如本文所用，术语“生物样品”是指例如组织，血液和尿液。然后可以评估生物样品中特定疾病或病症的标志物或指标的改善。可以确定治疗效果的疾病或病症包括自身免疫疾病或炎性疾病。

在一个实施方案中，疾病的动物模型是关节炎的模型。例如，疾病的动物模型可以是小鼠中的抗胶原抗体诱导的关节炎(CAbIA)模型。在该模型中，通过在第0天腹膜内注射小鼠单克隆抗II型胶原5克隆抗体，然后在第3天注射脂多糖，可以在小鼠中诱导关节炎。可以评估小鼠关节炎的临床症状并在每一天评分。例如，可以使用以下临床评分：0-正常；0.5-肿胀局限于指头；1-轻微的爪肿；2-显著的爪肿；3-严重的爪肿和/或关节强直。可以将个体动物的每只爪的得分相加以得到总的临床评分。然后可以通过在第6天给临床评分为1或更高的小鼠施用一剂Fc多聚体，在预定时间确定小鼠的临床评分，并比较临床评分与未经治疗或施用媒介物对照(例如PBS)的小鼠的临床评分来评估Fc多聚体的治疗效果。例如，可以在第7天至第14天确定临床评分。可以通过平均第7天至第14天的临床评分来确定平均临床评分。Fc多聚体的剂量可以是25至1000mg/kg。在一个实施方案中，Fc多聚体的剂量为200mg/kg。例如，组织学评分可如实施例5中所述测定。

如本文所用的术语“小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型”是指Campbell，IK等人，(2014)J Immunol.192(11)：5031-8所述的小鼠关节炎模型。

本文在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中使用的术语“第6天”是指如Campbell，IK等人，(2014)J Immunol.192(11)：5031-8所述，在注射诱导关节炎的单克隆抗体后第6天。

如本文所用的术语“关节炎小鼠”是指如Campbell，IK等人，(2014)J Immunol.192(11)：5031-8所述的经受节炎诱导单克隆抗体的小鼠。

如本文所用，术语“诱导”定义为引起、生产、影响、生成、产生、导致或促进。

与施用媒介物对照的小鼠或未治疗小鼠相比，施用Fc多聚体的小鼠的临床评分减少可表明Fc多聚体的治疗效果。在一些实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体诱导在第7至14天的任何一天的临床评分或在第7至14天的平均临床评分的减少。在一个实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体诱导在第7至14天的任何一天中临床评分减少超过50％或第7至14天的平均临床评分减少超过50％。

Fc多聚体在上述胶原抗体诱导的关节炎(CAbIA)小鼠模型中的治疗效果也可以通过在施用Fc多聚体后在预定时间评估小鼠关节中的浸润细胞的数量来确定。例如，在第8天，可以移除和处理关节炎小鼠的关节。例如，除去脂肪的髌骨和周围软组织可以被移除并置于冰上的标准培养基中60分钟。然后可以将培养基取出并离心，并且可以储存上清液或关节洗液用于以后的分析。可将髌骨和细胞沉淀物合并并用胶原酶和DNA酶消化，然后以70μm截留进行过滤、洗涤并重悬于缓冲液中。然后可以用标记的抗体染色重悬的细胞。例如，细胞可以用标记的抗CD45抗体染色。CD45+细胞指示浸润的白细胞。然后可以使用流式细胞术计数小鼠中CD45+细胞的数量。例如，可以如实施例5中所述测定浸润的CD45+细胞的数量。

治疗效果可以通过来自施用Fc多聚体的小鼠关节的CD45+细胞数量减少来表明，与来自未治疗小鼠或施用媒介物对照例如PBS的小鼠的关节的CD45+细胞数量相比较。在一些实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体诱导从膝关节回收的CD45+细胞数量的减少。在一个实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体诱导在第8天从膝关节回收的CD45+细胞数量减少超过50％。

还可以通过在施用Fc多聚体后在预定时间评估小鼠关节的组织学评分来确定Fc多聚体在上述胶原抗体诱导的关节炎(CAbIA)小鼠模型中的治疗效果。预定时间可以是例如第8天或第14天。例如，可以取出关节炎小鼠的爪子，用***固定、脱钙，并包埋在石蜡中。然后可以用苏木精和曙红(H&E)染色组织切片，并且可以对组织病理学进行评分。例如，可以对以下组织病理学特征进行评分：渗出物-关节间隙内存在炎性细胞；滑膜炎-滑膜增厚程度和炎症细胞浸润；组织破坏-软骨和骨侵蚀和侵袭。然后可以根据以下等级对每个特征进行评分：0-正常，1-最小，2-轻度，3-中等，4-标记，5-严重。然后可以计算三种组织病理学特征的累积分数。例如，组织学评分可如实施例5中所述测定。

与施用媒介物对照的小鼠或未治疗小鼠相比，施用Fc多聚体的小鼠的组织学评分减少可表明Fc多聚体的治疗效果。在一些实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体诱导第8天、第14天或第8天和第14天的组织学评分减少。在一个实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体在第8天诱导组织学评分减少大于25％。在另一个实施方案中，与未治疗的小鼠或施用PBS的对照小鼠相比，Fc多聚体在第14天诱导组织学评分减少大于50％。

FcγR的表达的减少

存在三类人Fcγ受体(Gessner等(1998)Ann Hematol76：231-48；Raghavan和Bjorkman(1996)Ann Rev Cell Dev Biol 12：181-220)。FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG。由于其对IgG1的亲和力>>IgG2/IgG3/IgG4(～10^-8)以及血清中这些IgG的总浓度(～10mg/ml)，通常认为细胞上的人FcγRI被正常血清条件下的单体IgG“占据”。因此，在其表面上携带FcγRI的细胞被认为能够通过结合的多特异性IgG替代地“筛选”或“取样”其抗原环境。FCγII(CD32)和FcγRIII(CD16)是低亲和力受体(在～10^-5–10^-7M范围内)并且通常被认为是“未被占据的”。因此低亲和力受体本身就是对涉及免疫复合物的抗体的检测和活化敏感。

许多细胞类型表达多种类型的FcγR，因此IgG或抗体免疫复合物与携带FcγR的细胞的结合可以具有多种复杂的结果，这取决于生物学背景。例如，细胞可以接收活化、抑制或混合信号。这可导致诸如吞噬作用(例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)、抗原加工(例如树突细胞)、减少的IgG产生(例如B细胞)或脱粒(例如嗜中性粒细胞和肥大细胞)之类的事件。

在一些实施方案中，Fc多聚体减少患有疾病或病症(例如自身免疫疾病或炎性疾病)的受试者中嗜中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞上FcγR的表达。可以在疾病的动物模型例如上述胶原抗体诱导的关节炎(CAbIA)小鼠模型中研究Fc多聚体减少FcγR表达的能力。可以在施用Fc多聚体后的预定时间在小鼠的关节和血液中测定FcγR在嗜中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞上的表达。例如，在第8天，可以如上所述移除和处理关节炎小鼠的关节。也可以从小鼠获得外周血样品。可以将关节消化物和外周血重新悬浮在缓冲液中，然后用针对特定FcγR例如FcγRII/FcγRIII(CD32/16)或FcγRI(CD64)的标记抗体染色，并且染色的细胞可以通过流式细胞术评估FcγR表达。可以将施用Fc多聚体的小鼠的关节和外周血中的单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞上的FcγR表达与未治疗小鼠(例如施用PBS的小鼠)的单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞上的FcγR进行比较。例如，可以如实施例9中所述测定单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞上的相对FcγR表达。

在一些实施方案中，Fc多聚体在CAbIA模型的第8天减少FcγRII/FcγRIII(CD32/16)在关节嗜中性粒细胞、血液中性粒细胞、关节单核细胞/巨噬细胞和/或血液单核细胞/巨噬细胞上的表达，与未经治疗的或PBS施用的关节炎小鼠相比。在一个实施方案中，与施用PBS的小鼠相比，Fc多聚体将FcγRII/FcγRIII(CD32/16)在关节中性粒细胞、血液中性粒细胞和关节单核细胞/巨噬细胞上的表达减少超过50％，并使血液单核细胞/巨噬细胞上FcγRII/FcγRIII(CD32/16)的表达减少超过25％。在一些实施方案中，Fc多聚体减少FcγRI(CD64)在关节嗜中性粒细胞和血液单核细胞/巨噬细胞上的表达。在一个实施方案中，与施用PBS的关节炎小鼠相比，Fc多聚体使关节嗜中性粒细胞上的FcγRI(CD64)表达减少超过50％并且使血液单核细胞/巨噬细胞上FcγRI(CD64)的表达减少超过75％。

经典补体途径的活化

经典补体途径介导特异性抗体反应，并由补体成分的级联介导。级联主要由抗原-抗体复合物活化。该途径的初始组分是蛋白复合物C1，其由C1r2s2的一个C1q和两个亚基组成。免疫球蛋白与C1q的结合通过将C1r2s2活化为催化活性亚基而实现活化经典补体途径的第一步。活化的C1s将C4裂解成C4a和C4b，和将C2裂解成C2a和C2b。然后C2a与C4b结合形成C4b2a，C4b2a也称为C3转化酶。C3转化酶催化C3裂解成C3a和C3b。然后C3b可以与活化的C4b2a结合形成C4b2a3b，C4b2a3b也称为C5转化酶。C5转化酶将C5转化为片段C5a和C5b。C5b与C6、C7、C8和C9组分一起形成称为C5b-9复合物的复合物。该复合物也称为膜攻击复合物(MAC)或末端补体复合物(TCC)，并在靶细胞中形成跨膜通道，导致细胞裂解。

如本文所用，“完整经典补体途径的活化”定义为如上所述的整个经典补体途径的每个步骤的活化。完整经典补体途径的活化可以通过研究Fc多聚体与C1q的结合(这是活化经典补体途径的第一步)以及C4a、C5a或可溶性或膜结合的C5b-9复合物(在经典补体途径中最终的效应物)的形成来确定。例如，如果蛋白结合C1q但是基本上不形成可溶性C5b-9，则Fc多聚体不诱导经典补体途径的完全活化，即仅形成相应阳性对照的小于50％，优选小于40％，优选小于30％，优选小于20％，优选小于10％，更优选小于5％。确定Fc多聚体与C1q的结合和诱导C5b-9的形成可以如下文和实施例7中所述进行评估。经典补体途径的活化也可以通过评估C4a的产生、C2的裂解或C3转化酶形成来确定。例如，如果Fc多聚体诱导C4a的产生但不诱导C2的切割或不诱导C3转化酶的形成，则Fc多聚体不诱导完整的经典补体途径的活化。“不诱导”是指形成相应阳性对照的小于50％，优选小于40％，优选小于30％，优选小于20％，优选小于10％，更优选小于5％。确定C4a的产生、C2的裂解和C3转化酶的形成可以如下文和实施例7中所述进行评估。

Fc多聚体结合C1q的能力可以通过体外结合测定法确定，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。例如，可以用人C1q预先涂覆96孔板的孔，然后加入Fc多聚体。可以加入纯化的过氧化物酶标记的抗人IgG缀合物，并且可以通过使用产生颜色的过氧化物酶底物(例如3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB))使结合的缀合物可视化。例如，Fc多聚体结合C1q的能力可以如实施例7中所示测定。

Fc多聚体对经典补体途径的活化可以通过体外测定来确定，并通过产生C4a和可溶性C5b-9来指示。例如，不同浓度的Fc多聚体可以在全血或血清中孵育预定的一段时间，并且任何产生的C4a或可溶性C5b-9(sC5b-9)的产生可以通过免疫检测例如ELISA来确定。使用的Fc多聚体的浓度可以是0.01mg/ml至2mg/ml，例如0.04mg/ml，0.2mg/ml或1.0mg/ml。例如，可以如实施例7中所示测定经典补体途径的活化。

可以相对于由热聚集的丙种球蛋白(HAGG)诱导的这些组分的产生比较由Fc多聚体诱导的C4a和sC5b-9的产生，HAGG是经典补体途径的有效活化剂。例如，该测定可以在全血中进行。根据一些实施方案，与HAGG诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体诱导小于50％的sC5b-9产生，小于40％的sC5b-9产生，小于30％的sC5b-9产生，小于20％的sC5b-9产生，或小于10％的sC5b-9产生。在一个实施方案中，与全血中HAGG诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体诱导全血中少于20％的sC5b-9产生。在另一个实施方案中，与全血中HAGG诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体在全血中诱导少于10％的sC5b-9产生。在另一个实施方案中，Fc多聚体不诱导产生sC5b-9。例如，可以如实施例7中所示测定sC5b-9产生的诱导。

如本文所用的术语“用热聚集IgG活化的正常人血清”是指正常人血清样品，其中几乎所有C4的切割已经用热聚集IgG诱导。

Fc多聚体对经典补体途径的活化也可以通过检测C2蛋白来确定。如果C2蛋白被切割成C2a和C2b，则C2蛋白的水平减少，表明经典补体途径的活化。可以将不同浓度的Fc多聚体在全血或血清中孵育预定的一段时间，例如2小时，之后可以通过免疫检测(例如免疫印迹)测定C2蛋白水平。经典补体途径的活化通过C2蛋白的切割来指示。可以将正常人血清中C2蛋白的水平与在与Fc多聚体预孵育后产生的C2蛋白水平进行比较，以确定C2切割的量，并因此确定经典补体途径的活化。已知的经典补体途径的活化剂，例如HAGG，可用作阳性对照，用于诱导正常人血清中大多数C2蛋白的切割。如本文所用，术语“大多数”定义为包含大于50％，大于60％，大于70％，大于80％或大于90％。在一些实施方案中，Fc多聚体不诱导大多数C2蛋白的切割。例如，可以如实施例7中那样测定C2蛋白的切割。

Fc多聚体对经典补体途径的活化也可以通过评估C3转化酶的形成来确定。如上所述，C3转化酶由C2a和C4b亚基(C4b2a)组成。如果C2蛋白未被切割成C2a和C2b，则不能形成C3转化酶。因此，可以如上所述评估C3转化酶的形成以确定C2蛋白切割。在一些实施方案中，Fc多聚体不诱导C3转化酶的形成。

经典补体途径的抑制

Fc多聚体对经典补体途径的抑制可以通过测定C5a和sC5b-9产生的抑制或通过测定C2蛋白的切割抑制来确定。不同浓度的Fc多聚体可以在全血或血清中与已知的经典补体途径的活化剂一起孵育。然后可以将在Fc多聚体和已知的经典补体途径活化剂存在下产生的sC5b-9水平与仅用经典补体途径的已知活化剂产生的sC5b-9水平进行比较。产生的sC5b-9的水平可以如上所述确定。所用Fc多聚体的浓度可以是0.01mg/ml至2mg/ml，例如0.04mg/ml，0.2mg/ml或1.0mg/ml。已知的经典补体途径的活化剂可以是HAGG。与仅在经典补体途径的活化剂存在下产生的sC5b-9的水平相比，在存在Fc多聚体和经典补体途径的活化剂时产生的sC5b-9水平越低，Fc多聚体对sC5b-9的产生的抑制越强。例如，可以如实施例7中那样测定sC5b-9产生的抑制。在一些实施方案中，与HAGG诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体抑制大于50％的sC5b-9产生，大于60％的sC5b-9产生，大于70％的sC5b-9产生，大于80％的sC5b-9产生或大于90％的sC5b-9产生。在一个实施方案中，Fc多聚体抑制由HAGG诱导的大于80％的sC5b-9产生。

如本文所用，术语“抑制”定义为抑制、限制、防止、干扰、停止或阻断。

可以类似地确定抑制C2蛋白的切割。不同浓度的Fc多聚体可以在全血或血清中与已知的经典补体途径的活化剂一起孵育。在存在Fc多聚体和已知的经典补体途径活化剂的情况下C2蛋白水平与单独的经典补体途径的已知活化剂存在下C2蛋白水平相比越大，抑制作用越大。通过Fc多聚体进行C2切割。可以如上所述测定C2蛋白的水平。所用Fc多聚体的浓度可以是0.01mg/ml至2mg/ml，例如0.04mg/ml，0.2mg/ml或1.0mg/ml。已知的经典补体途径的活化剂可以是HAGG。例如，可以如实施例7中那样测定C2切割的抑制。在一些实施方案中，Fc多聚体抑制HAGG切割大多数C2蛋白。

还可以使用针对经典补体途径的溶血测定法使用抗体致敏或调理的红细胞来确定对经典补体途径的抑制。例如，绵羊红细胞或血红细胞可以用兔抗羊抗体调理。正常人血清(NHS)将诱导调理的红细胞裂解。Fc蛋白可以与NHS预孵育，然后加入红细胞中并在37℃孵育1小时。Fc构建体的浓度可以是1-1000μg/ml，例如2.5、25、50、125、250或500μg/ml。或者，Fc单体也可以与NHS以与Fc构建体所示相同的浓度预孵育。孵育后，可以将混合物离心，并且可以通过测量上清液在412nm处释放的血红蛋白的吸光度来确定裂解程度。例如，可以如实施例7中所述测定经典补体途径的溶血测定中的红细胞裂解。

Fc多聚体对经典补体途径的抑制可以通过与含有NHS而非Fc多聚体的混合物相比，含有Fc多聚体的混合物中红细胞的裂解减少来指示。还可以将Fc多聚体对调理的红细胞裂解的抑制与在Fc单体存在下调理的红细胞的裂解相比较。在一些实施方案中，与Fc单体相比，Fc多聚体抑制调理的绵羊红细胞的裂解。在一个实施方案中，与Fc单体相比，Fc多聚体抑制调理的绵羊红细胞的裂解超过70％。

Fc多聚体的其他效应证明了它们的治疗益处：

Fc多聚体在治疗自身抗体介导的自身免疫疾病中的治疗益处还通过对表达人FcRn的小鼠中示踪抗体清除的影响来说明。这表明Fc多聚体能够在体内阻断FcRn，并且表明它在减少自身免疫疾病中的自身抗体水平方面是有效的。

Fc多聚体在治疗某些自身免疫疾病中的治疗益处也通过人单核细胞系(THP-1)对IgG包被的珠的吞噬作用的证实来证明。这表明Fc多聚体在体外功能性地阻断FCγ受体。这表明Fc多聚体将能够抑制慢性炎症，这应该有益于治疗某些自身免疫疾病。

Fc多聚体的安全性和治疗益处通过Fc多聚体证实的嗜中性粒细胞的活化缺乏和活化抑制来证明。

Fc多聚体的安全性也表现为对肝功能缺乏影响。

实施例

实施例1：IgG1 Fc多聚体的制备

Fc-μTP(图1A，左图)通过将人IgM尾部区的18个氨基酸残基(PTLYNVSLVMSDTAGTCY)融合到人IgG1 Fc片段恒定区(氨基酸残基216-447，EU编号；UniProtKB-P01857)的C-末端来产生。通过将Fc-μTP的309(EU编号)位的Leu残基突变为Cys，产生Fc-μTP-L309C(图1A，右图)。合成编码Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的DNA片段，并通过ThermoFisher Scientific(MA，USA)对人细胞表达进行密码子优化。使用InTag阳性选择方法将DNA片段克隆到pRhG4哺乳动物细胞表达载体的ApaLI和XbaI位点(Chen，CG等，(2014).Nucleic Acids Res 42(4)：e26；Jostock T等(2004)J.Immunol.Methods.289：65-80)。简而言之，通过ApaLI和AscI消化分离Fc-μTP和Fc-μTP-L309C片段。还通过AscI和SpeI消化(Chen，CG等，(2014).Nucleic Acids Res 42(4)：e26)分离包含BGH polyA添加位点(BGHpA)和氯霉素抗性基因(CmR)的CmR InTag衔接子。使用T4 DNA连接酶将Fc分子和CmRInTag衔接子共克隆到pRhG4载体的ApaLI和XbaI位点。在含有34μg/ml氯霉素的琼脂平板上选择阳性克隆。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)纯化Miniprep质粒DNA，并通过DNA测序分析确认序列。限制酶和T4 DNA连接酶购自New EnglandBioLabs(MA，USA)。

使用Expi293TM表达***(Life Technologies，NY，USA)的瞬时转染根据制造商的说明进行。简言之，将质粒DNA(0.8μg)稀释于0.4ml Opti-MEM中并轻轻混合。将Expifectamine 293试剂(21.6μL)在0.4ml Opti-MEM中稀释，轻轻混合并在室温下孵育5分钟。然后将稀释的Expifectamine加入到稀释的DNA中，轻轻混合并在室温下孵育20-30分钟以使DNA-Expifectamine复合物形成。然后将DNA-Expifectamine复合物加入到含有6.8mlExpi293细胞(2x10⁷个细胞)的50ml生物反应器管中。将细胞在8％CO₂的37℃培养箱中以250rpm振荡培养约16-18小时。制备由40μl增强剂1(Life Technologies，NY，USA)、400μl增强剂2(Life Technologies，NY，USA)和200μl LucraTone^TMLupin组成的主混合物并添加到每个生物反应器管中。将细胞在8％CO₂的37℃培养箱中以250rpm振荡再培养4天。从上清液中以4000rpm离心20分钟收获蛋白，并在HPLC定量和纯化之前使用0.22μm过滤器过滤到干净的管中。

为了产生IgG1Fc多聚体，将重组人IgG1 Fc的N-末端与IgM的18个氨基酸尾部区融合。IgM尾部区(μTP)促进五聚体和六聚体的形成。用野生型(WT)人IgG1 Fc肽(Fc-μTP)或其变体(Fc-μTP-L309C)产生Fc融合蛋白，所述变体在残基309具有亮氨酸至半胱氨酸的点突变。由于在Fc分子之间形成共价键，预期亮氨酸309至半胱氨酸点突变(Fc-μTP-L309C)提供比WT(Fc-μTP)更稳定的结构。

Fc-μTP和Fc-μTP-L309C融合单体亚基由包含以下区域的两种肽产生：

Fc-μTP和Fc-μTP-L309C肽的氨基酸序列分别作为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2提供。核酸编码序列分别作为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10提供。

在表达过程中，切割信号肽以形成成熟Fc-μTP和Fc-μTP-L309C融合肽。

多聚体Fc蛋白的SDS-PAGE显示每种制剂的梯状图案，对应于Fc构建体的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。Fc-μTP-L309C，但不是Fc-μTP，在预期的六聚***置具有主要条带，这与在破坏性电泳缓冲条件下更稳定的结构一致(图1B)。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体的预期结构的图示于图1A中。对于Fc-μTP-L309C，高级结构(最可能是六聚体的二聚体)也是明显的。

还用Fc多聚体制剂的尺寸排阻色谱(SEC)(图1C)和不对称流场-流动分级(A4F)(图1D)随后是通过紫外线280nm处的吸光度测量(A280，薄色谱图)和多角度光散射(MALS，粗线)检查了Fc-μTP-L309C和Fc-μTP的多聚化。对于每种方法，对于每种Fc多聚体制剂观察到具有主要六聚体峰(约85％材料)的类似分布模式(表1)。这与SDS-PAGE(图1B)的不同谱相反，表明Fc-μTP制剂中存在非共价六聚体。剩余物质主要是Fc-μTP的低级(单体，二聚体，三聚体)和Fc-μTP-L309C的更高级(六聚体的二聚体)。

表1

还产生重组人IgG1 Fc单体(SEQ ID NO：3)并用作对照。

Fc蛋白(Fc，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C)被认为是无内毒素的，因为它们不能刺激THP1细胞中的NF-κB活化(图2)。人单核细胞系THP1在含有10％胎牛血清(FCS)、1％(100U/ml)青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中培养。大约每3天更换细胞培养基。THP1XBlue细胞通过用在转录因子NF-κB可诱导的启动子的控制下表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)基因的报告质粒稳定转染THP1细胞而得到。刺激后，THP1XBlue细胞活化NF-κB，随后使用QUANTI-blue可以很容易地检测到SEAP的分泌，因为培养基在其存在时变成紫色/蓝色。如通过PCR确定的，THP1XBlue细胞表达所有TLR，但仅响应TLR2、TLR2/1、TLR2/6、TLR4、TLR5和TLR8。THP1XBlue细胞对选择标记Zeocin具有抗性。将细胞在含有10％FCS、0.5％(100U/ml)青霉素/链霉素、100μg/ml Normocin(Invivogen，SanDiego，CA)和200μg/ml Zeocin(Invivogen)的RPMI 1640培养基中培养。大约每3天更换细胞培养基。脂多糖(LPS)用作NF-κB活化的阳性对照。

实施例2：Fc多聚体与FcγR和原代人骨髓细胞的结合

Fc介导的作用通过Fc与白细胞表面上的特异性受体的结合而起始。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体均结合FCγ受体(FcγRs)CD16a(FcγRIIIa)、CD32a(FcγRIIa)、CD32b/c(FcγRIIb/c)和CD64(FcγRI)，如由Biacore测定。此外，与重组Fc单体相比，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体均显示出快速的结合速率和缓慢的解离速率，这与通过它们与多个固定的FcγR分子结合的亲合力效应一致(图3A)。在两种重组Fc分子之间没有观察到结合反应的主要差异。

通过流式细胞术和免疫荧光(IF)评估Fc六聚体与人髓细胞系和原代细胞的结合，使用识别Fc部分的荧光标记的抗-IgG Ab进行检测。将细胞与Fc蛋白在4℃孵育2小时，用含有0.1％BSA(Sigma)和0.01％NaN₃(Sigma)的PBS洗涤4次，并用针对人IgG或相应同种型对照Ab的FITC标记的mAb(BD)在4℃下染色45分钟。将染色的细胞再洗涤四次，然后用BDFACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences AG，Allschwil，Switzerland)通过流式细胞术分析，并使用FlowJo评估数据。

人单核细胞系THP1在其表面上表达FcγR CD64和CD32但不表达CD16(图4)，因此它用于评估全细胞***中Fc构建体的结合。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C以相似程度与THP1细胞结合，各自显示出比IVIG更大的结合信号(图3B)。鉴于检测方法，与IVIG相比，最大响应的差异可以反映多聚体Fc分子上存在的更多Fc表位。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C也比IVIG或重组Fc单体显著更大程度地结合原代人嗜中性粒细胞，WT构建体显示出最高水平的结合(图3C)。

对于原代人巨噬细胞，外周血单核细胞首先在体外分化成M1(炎症)和M2(抗炎)谱系巨噬细胞，然后与Fc蛋白一起孵育并通过IF染色检测IgG1 Fc。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C各自与两种原代人巨噬细胞谱系细胞共染色，而Fc单体染色较弱(特别是对于M1巨噬细胞)，IVIG是中等的(图3D)。

在AF488标记的IgG1存在下，在CD16转染的NFAT-bla Jurkat细胞的全细胞***中定量Fc蛋白与FcγR的结合。将测定培养基(PBS+2％FCS)中的Jurkat NFAT-bla CD16细胞(1x 10⁵/孔)铺板于96孔板的U形底孔中，所述96孔板含有AF488标记的人IgG1(3.75μg/ml；25nM)和增加浓度的含Fc的测试分子。将测定混合物在室温下孵育2小时并持续摇动，然后在冰冷的培养基中快速洗涤细胞，然后在冰上固定15分钟(BD Cytofix)。将细胞重悬于培养基中，并在Fortessa流式细胞仪上读取每个孔中的细胞结合荧光。测定Ki值，其表示从转染细胞中置换50％标记的IgG1所需的测试样品的浓度(以纳摩尔[nM]计)。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C均将IgG1从与Jurkat细胞的结合移位至相似程度(Ki分别为1.47nM和1.43nM)，并且各自的Ki比IgG1或其重组Fc组分的Ki(Ki分别为225nM和240nM)低>100倍。(图3E)。

实施例3：Fc多聚体与新生儿FcR的结合

上皮细胞中的新生儿FcR(FcRn)在酸性pH下结合胞吞的IgG并将其重新引导离开溶酶体降解途径以在细胞外释放，从而延长IgG的血清半衰期。为了确定携带多个IgG1 Fc部分的Fc多聚体是否也可以与FcRn结合，首先使用pH6.0的固定化人FcRn通过Octet分析检查它们。如前所述(Neuber，T等人(2014)MAbs 6(4)928-942)进行Octet测定，并在OctetQKe装置(FortéBio Inc.，Menlo Park，CA，USA)上以96孔格式测量。分析测定并使用Octet软件7.0.1.1(FortéBio Inc.)进行拟合。与重组IgG1 Fc相比，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C均与FcRn结合并显示较慢的解离速率(图5A)，表明亲合力效应。

为了证实在全细胞***中可以发生结合，在无血清测定培养基(pH为5.5的PBS)中评估Fc蛋白与人FcRn转染的293FS细胞系(293FS+FcRn+β2m(克隆#2))的结合。将细胞接种(2x 10⁵个/孔)并与AF488标记的IgG1(0.5μg/ml；3.33nM)和递增浓度的Fc蛋白共孵育。将测定混合物在室温下孵育1-2小时，同时持续摇动。孵育后，在Fortessa流式细胞仪上读取每个孔中的细胞结合荧光，并测定Ki值。有趣的是，在WT和突变Fc多聚体之间获得了差异响应，其中Fc-μTP比Fc-μTP-L309C更容易从FcRn置换IgG1(图5B)。Fc-μTP-L309C显示与IgG1相似的平均Ki(约200nM)。

通过增强体内示踪单克隆抗体(mAb)的清除证明了对内源免疫球蛋白半衰期的功能影响。i.p.施用IVIG[2g/kg]、Fc-μTP-L309C[200mg/kg]或PBS进入人FcRn转基因小鼠。5分钟后，静脉注射5mg/kg特异于人IL-3受体(CSL360)的人单克隆IgG1。通过基于MSD的免疫测定，在指定时间点测量血清中示踪剂mAb的水平(图17)。在恒定的血清稀释度下。通过IVIG和Fc-μTP-L309C加速示踪剂mAb的清除，这表明这些分子对FcRn的饱和。

实施例4：Fc多聚体的药代动力学

为了检查Fc-μTP和Fc-μTP-L309C与FcRn的差异结合是否将反映在血清半衰期的差异中，在单次i.v.注入人FcRn转基因小鼠和WT大鼠后，将Fc蛋白的药代动力学与单次静脉注射后的IVIG的药代动力学进行比较。在小鼠中，所有剂量均为100mg/kg。在大鼠中，IVIG以250mg/kg的剂量施用，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C以25mg/kg的剂量施用。在小鼠和大鼠中，两种Fc蛋白均显示出比IVIG更快速的血清清除，表明血清半衰期更短(分别为图6A和图6B)。WT和突变体构建体之间没有差异。

已评估了两种施用途径之间的差异，即i.v.相对于s.c.。s.c.的生物利用度与i.v相比约为25％。

实施例5：Fc多聚体在急性炎性Ab诱导的关节炎中提供治疗效果

A.Fc多聚体诱导临床评分减少

检查Fc蛋白在小鼠的胶原Ab诱导的关节炎(CAbIA)模型中的治疗效果。CAbIA是依赖于FcR参与和补体***的模型(Banda，NK等，(2007)J Immunol 179(6)，4101-9；Kagari T等(2003)，J Immunol 170(8)4318-4324)。如图7A所示，在WT Balb/c小鼠中诱导疾病。小鼠单克隆抗II型胶原5克隆mAb混合试剂盒购自Chondrex Inc.(Redmond，WA)。在第0天，用2mgmAb混合物i.p.注射然后在第3天用50μg LPS i.p.注射，监测小鼠关节炎的临床症状长达14天。临床评分分配如下：0-正常；0.5-肿胀局限于指头；1-轻微的爪肿；2-显著的爪肿；3-严重的爪肿和/或关节强直。对于治疗性处理，将在第6天显示关节炎迹象的小鼠(即临床评分为1或更高)随机化并施用单次腹膜内(i.p.)注射Fc-μTP、Fc-μTP-L309C、IVIG或PBS。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C以200mg/kg的剂量施用，IVIG以2g/kg施用。对于每只小鼠，临床评分表示从第6天开始到第14天每天每只爪的累积临床评分。通过平均第7天至第14天中每一天的临床评分来计算平均临床评分。施用PBS的小鼠作为未经治疗的对照。评价s.c.施用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的治疗效果(图15)。s.c.给予的Fc-μTP和Fc-μTP-L309C表现出与i.p.施用时相似的治疗效果。

Fc-μTP和Fc-μTP-L309C均迅速减少疾病的临床症状，其效果在24小时内(第7天)明显并持续至第14天(图7B)。在用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理后24小时(第7天)，与施用PBS(未治疗)的小鼠相比，临床评分减少了50％。在第14天，施用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C的小鼠的临床评分比未治疗的小鼠低超过50％。在第7天至第14天，得到的平均临床评分在Fc-μTP-和Fc-μTP-L309C处理的小鼠中比未治疗的小鼠低超过50％。相反，与未治疗的小鼠相比，施用IVIG的小鼠直到第14天没有显示出临床评分的显著减少，并且来自IVIG治疗的小鼠的第7-14天的平均临床评分与未治疗的小鼠没有显著差异。

B.Fc蛋白诱导关节浸润细胞的减少

处理关节炎小鼠的关节以进一步评估炎症标志物。从两个后肢取出髌骨和周围软组织(不包括脂肪)，并置于冰上RPMI+5％FCS中60分钟。然后取出培养基，离心并将上清液(关节洗液)储存在-30℃以等待随后的分析。将洗过的髌骨和细胞沉淀物合并用于每只小鼠，并在37℃下在振荡培养箱(140周/分钟)中用1mg/ml胶原酶(CLS-1,250U/mg；Worthington Biochemical Corp，Lakewood，NJ)和0.1mg/ml DNAse 1(来自牛胰腺的IV型，2100kU/mg；Sigma)消化30分钟。将消化物过滤(70μm截留)，洗涤并重悬于PBS+2％FCS中用于细胞计数、细胞离心涂片和流式细胞术。

将外周血和关节消化物的单细胞悬浮液重悬于含有2％(v/v)FCS的PBS中。细胞用以下mAb染色：FITC缀合的抗小鼠Ly6G(1A8；BioLegend)，eFluor450-缀合的抗小鼠CD11b(M1/70；eBioscience)，APC.Cy7-缀合的抗小鼠CD45(30-F11，BD Pharmingen)，PE缀合的抗小鼠CXCR2(242216，R&D Systems)，APC缀合的抗小鼠CXCR4(2B11，eBioscience)，PE.Cy7-缀合的抗小鼠CD62L(MEL-14，eBioscience)。使用7AAD(BD Pharmingen)排除死细胞，并使用FlowJo软件在BD Fortessa上分析活细胞。与未治疗的(PBS)对照小鼠相比，用Fc-μTP-和Fc-μTP-L309C处理的小鼠在疾病的第8天从膝关节回收的浸润(CD45+)细胞减少超过50％(图7C)。

C.Fc蛋白诱导组织学评分的减少

还评估了关节炎关节的组织病理学。在第8天和第14天，杀死小鼠并将左后爪固定在10％中性缓冲***中，脱钙并包埋在石蜡中。将矢状组织切片用H&E染色，并对治疗组进行不知情的评分。踝关节就三个特征(渗出物-关节间隙内炎症细胞的存在；滑膜炎-滑膜增厚和炎性细胞浸润的程度；组织破坏-软骨和骨侵蚀和侵袭)、每五个中的一个(0-正常，1-最小，2-轻度，3-中等，4-显著，5-严重)进行全局评分，并就十五的总得分将这些相加。

关节炎关节的组织病理学证实早在第8天，具有减少的炎性细胞浸润、滑膜炎和软骨和骨破坏的临床评估和关节细胞评估在Fc-μTP-和Fc-μTP-L309C处理的小鼠中是明显的(图7D和图7E)。在第8天，与施用PBS的小鼠相比，Fc蛋白诱导组织学评分减少超过25％。到第14天，用Fc-μTP-和Fc-μTP-L309C处理的小鼠的组织学评分比施用PBS的未治疗小鼠低50％(图7E)。相反，施用IVIG的小鼠的组织学评分与未治疗的小鼠没有显著差异。

D.Fc蛋白减少关节炎关节中细胞因子和趋化因子的水平

通过评估细胞因子和趋化因子水平进一步评估关节炎关节中的局部炎症反应。使用商业试剂盒通过蛋白阵列评估上述第8天的关节洗液，并根据制造商方案(来自Millipore的Kit MCYTOMAG-70K)进行分析。两种Fc蛋白均减少炎性细胞因子IL-6、LIF和G-CSF的水平，但不减少IL-9的水平(图8)。趋化因子IP-10(CXCL10)，MCP-1(CCL2)，KC(CXCL1)和MIP-2(CXCL2)均显著减少，而MIG(CXCL9)、嗜酸性粒细胞趋化因子(CCL11)和RANTES(CCL5)均未显著减少。相反，IVIG在第8天对细胞因子/趋化因子水平的影响最小，其中仅MIP-2水平显著减少。这可以反映IVIG反应的较慢动力学，其先前在该模型中报道过(Campbell IK等，Journal of Immunology.2014；192(11)：5031-5038)。

实施例6：Fc多聚体对关节炎小鼠关节中补体级联的影响

为了确定Fc蛋白是否可以通过对补体***的作用来减轻疾病，在来自上述关节炎小鼠的第8天关节洗液中测定补体途径的组分水平。通过ELISA测定C1q、C3和C5a的水平。与首次用于实验的小鼠相比，在关节炎小鼠的关节洗液中测试的所有三种补体成分均升高(图9)。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C各自减少了在关节洗液中可检测到的C1q、C3和C5a的水平至相似程度。IVIG治疗导致C1q明显升高并且C3略有减少，而C5a水平未受影响。

实施例7：Fc多聚体抑制人血清和全血中的经典补体途径

A.Fc蛋白对补体***的影响

使用人体外模型研究Fc蛋白对补体***的影响。在补体***筛选(Euro-Diagnostica，Sweden)(其是用于特异性检测三种途径的酶免疫测定，其中C5b-9的沉积作为共同的读数)中检测Fc蛋白对经典(CP)、凝集素(LP)和替代途径(AP)的功能的影响。根据说明书进行进一步稀释，即经典和凝集素途径为1：100，替代途径为1:18。将结果与正常人血清(NHS)中的活化进行比较。

Fc-μTP和Fc-μTP-L309C均抑制经典补体途径的完全活化，但证明对凝集素或旁路途径没有显著影响(图11A)。相反，Fc单体对任何补体途径没有影响。使用10％正常人血清进行预孵育，加入含有测试样品的90％PBS(例如Fc-μTP-L309C或对照样品)，并在37℃孵育5-15分钟。然后用补体试剂盒(Lectin Pathway)提供的测定稀释缓冲液以1:10稀释样品。随后根据制造商的说明书进行测定。

然而，令人惊讶的是，没有观察到对凝集素途径的影响。因此，我们继续优化上述条件如下。使用20％正常人血清、含有测试样品的10％PBS(例如Fc-μTP-L309C或对照样品)和70％明胶Veronal缓冲液(GVB^2+,0.15mM CaCl₂,0.5mM MgCl₂)在37度1小时实现最佳C4切割。然后用补体试剂盒(Lectin Pathway)提供的测定稀释缓冲液以1:20稀释样品。随后根据制造商的说明书进行测定。如图20A和B所示，优化的预孵育导致切割的C4的水平(如通过产生C4a所示)高于先前描述的非优化条件(即10％NHS和90％PBS)，但是孵育了一个小时(而不是5-15分钟)。随后，由于C4耗竭，观察到对凝集素途径的有效抑制作用。然而，已经使用“非优化的”缓冲条件观察到经典途径的抑制，因为存在与C1q的非常强的结合(在实施例7C中描述)，其对于经典途径的活化是必需的。

如图21A所示，Fc-μTP-L309C对经典和凝集素途径的活化显示出有效的抑制作用，而未观察到对旁路途径的抑制。在试剂盒中测试的相同样品中，测量了C4a和C5a。优化的预孵育条件诱导C4的最佳切割，而未观察到C5a的产生(图21B)。使用针对指定补体蛋白耗尽的血清证明了的特异性(图21C)。如图21C所示，C4的耗尽导致经典和凝集素途径的抑制(或无功能性)，而旁路途径仍然是具有活性的。

B.Fc蛋白通过经典补体途径抑制溶血

为了研究Fc蛋白对经典途径的影响，用兔抗绵羊抗体(Ambozeptor 6000；Siemens)使绵羊红细胞(Siemens)致敏并稀释至4x10⁸细胞/mL GVB²⁺(GVB，0.15mM CaCl₂,0.5mM MgCl₂)。为了评估Fc单体、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对溶血的抑制，将重组蛋白在1/40稀释的NHS中预孵育(在室温下30分钟)，随后以1/1(v/v)比率加入红细胞中，并在微量滴定板振荡装置中于37℃孵育1小时。使用的Fc单体、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的浓度为2.5、25、50、125、250和500μg/ml。加入冰冷的GVBE(GVB，10mM EDTA)并离心(在1250xg，4℃下5分钟)后，通过测量释放的血红蛋白在412nm处的吸光度测定上清液中的溶血并与NHS诱导的溶血相比较。

为了研究Fc构建体对旁路途径的影响，洗涤兔红细胞(Jackson Laboratories)并稀释至2x10⁸个细胞/mL GVB/MgEGTA(GVB，5mM MgEGTA)。为了评估Fc单体、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对溶血的抑制，将重组蛋白在1/6稀释的NHS中预孵育(在室温下30分钟)，随后以2/1(v/v)比率加入红细胞中，并在微量滴定板振荡装置中于37℃孵育1小时。使用的Fc单体、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的浓度为250、500和1000μg/ml。加入冰冷的GVBE并离心(1250×g 10分钟)后，通过测量释放的血红蛋白在412nm处的吸光度测定上清液中的溶血并与NHS诱导的溶血相比较。

Fc单体对绵羊红细胞通过经典补体途径的溶血没有影响，并且裂解水平等于单独使用NHS的水平。相反，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C都极大地抑制了NHS诱导的裂解(图10A)。当浓度等于或高于2.5μg/ml时，与在相同浓度的Fc单体存在下发生的裂解量相比，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C均抑制裂解超过70％(如表2所示)。Fc单体和Fc蛋白中的任一种都不抑制兔红细胞中的替代补体途径(图10B)。

表2

表2.CH50

结果表达为平均值±标准偏差(SD)

C.Fc多聚体与C1q的结合

通过评估与C1q的结合来检查Fc蛋白对经典补体途径的影响。通过ELISA(InovaDiagnostics，San Diego，CA)分析Fc蛋白与C1q的结合。将孔用人C1q预涂覆并加入Fc蛋白(<16μg/mL)以允许结合。洗涤孔以除去所有未结合的蛋白后，加入纯化的过氧化物酶标记的山羊抗人IgG缀合物。通过进一步的洗涤步骤除去未结合的蛋白，并用3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB)底物显现结合的缀合物。与Fc单体相比，Fc多聚体表现出与C1q的高度结合(图11B)。

D.Fc多聚体对经典补体途径的影响

在人全血和人血清中评估Fc构建体对补体的作用。对于该测定，用GVB²⁺缓冲液(Complement Tech)将整个NHS以1：5稀释。使用ELISA(Quidel，San Diego，CA)通过C3a、C4a和C5a的产生来分析血清中人补体的活化。人全血中补体活化的分析基于使用重组水蛭素的抗凝作用，水蛭素是一种高度特异性的凝血酶抑制剂，不影响补体活化。与NHS一样，全血在GVB²⁺缓冲液中以1：5稀释。使用ELISA(Quidel)通过C4a和sC5b-9的产生来分析补体活化。

用不同浓度的Fc-μTP或Fc-μTP-L309C孵育人全血2小时诱导补体蛋白C4裂解成C4a，但未观察到sC5b-9的增加(图11C)。在人血清中发现了类似的结果(图12A)。Fc单体和IVIG都不诱导C4的裂解或sC5b-9的形成(图11C)。

E.Fc多聚体抑制完整经典补体途径的活化

热聚集IgG(HAGG)是经典补体途径的已知活化剂。用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C预孵育人血清或全血不影响HAGG产生C4a(未显示)，但完全阻止经典补体途径的进一步下游活化，如减少所示sC5b-9(图11D)和C5a(图12B)的水平。Fc多聚体抑制人全血中HAGG诱导的sC5b-9产生超过80％。相反，Fc单体和IVIG对HAGG诱导sC5b-9水平没有影响(图11D)。这些结果表明六聚体Fc通过与C1q结合诱导经典途径的活化、C1复合物的活化和C4的裂解，但显然没有形成C3转化酶(C4b2a)，因为没有检测到下游补体活化。

为了形成C3转化酶，C4和C2需要被C1s切割。如图11C所示，通过将人全血与Fc蛋白一起孵育来切割C4。为了研究C2切割，通过Western印迹在与Fc单体、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C孵育2小时的人血清中测量C2水平。加载等量的人血清(每泳道1μl血清)并通过4-12％SDS-PAGE(Invitrogen)分离。通过用GelCode Blue Stain Reagent(ThermoScientific)染色提取的凝胶来验证相等的加载。然后将凝胶转移至PVDF膜(Invitrogen)。然后，用Superblock(ThermoScientific)封闭膜(在4℃开启)，并与针对补体蛋白C2的原代小鼠抗体(R&D Systems，在Superblock中1：1000稀释)孵育(在室温下2小时)，洗涤膜(PBS+0.05％Tween20)并与辣根过氧化物酶偶联的山羊多克隆抗小鼠IgG(Dako，在Superblock中1：1,000稀释)孵育(在室温下2小时)。最后，用化学发光检测试剂盒(SuperSignal West Pico chemiluminescent，ThermoScientific)对膜显影。

在用HAGG孵育人血清后，活化经典途径并切割C2，如约100kD(未切割的C2的分子量)的C2带的消失所示(图11E)。Fc多聚体和Fc单体均未诱导C2的明显裂解。当血清与HAGG和Fc-μTP或Fc-μTP-L309C一起孵育时，C2切割被抑制(图11E)。相反，添加Fc单体对HAGG诱导的C2的裂解没有影响。这些数据表明，在流体相中，Fc多聚体抑制C2切割，从而阻止C3转化酶的形成和随后的经典补体途径的活化步骤。

实施例8：Fc多聚体抑制内皮细胞上的补体沉积

为了研究Fc多聚体是否阻止细胞上的补体沉积，使用测定来测试补体片段在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的沉积。HUVEC购自Lonza(Lonza，Visp，Switzerland)并根据制造商的描述进行培养。为了分析C3b沉积，在与在veronal缓冲盐水(1：5)中稀释的正常人血清(Quidel)在37℃下孵育30-60分钟之前，用抗CD105(Endoglin)mAb(Abcam)调理HUVEC。洗涤细胞并使用FITC缀合的抗C3c mAb(Dako)检测C3b沉积并通过流式细胞术定量。

将调理的HUVEC与含有Fc-μTP或Fc-μTP-L309C的血清一起孵育导致C3b沉积的剂量依赖性抑制，而单体Fc不阻止C3b的沉积(图11F)。总之，这些数据表明抑制经典补体途径的完全活化可能是Fc-μTP和Fc-μTP-L309C减轻炎症的效应机制之一。

实施例9：Fc多聚体在体内抑制FcγR表达

研究了Fc蛋白在上述CAbIA关节炎模型中对FcγR表达的影响。如上所述，在第6天用PBS(未治疗对照)、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理具有CAbIA的小鼠(图7A)。在第8天从关节和血液中获得中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞。流式细胞术显示与未治疗的(PBS)关节炎小鼠相比，来自用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C施用的小鼠的关节和血液的嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的CD16/32(FcγRIII/FcγRII)表面表达显著减少(图13A)。与施用PBS的关节炎小鼠相比，用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C治疗的关节炎小鼠中CD16/32(FcγRIII/FcγRII)在关节中性粒细胞、关节单核细胞/巨噬细胞和血液中性粒细胞上的表达低超过50％。与施用PBS的关节炎小鼠相比，用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理的小鼠中血液单核细胞上的CD16/32(FcγRIII/FcγRII)表达低超过25％。

与未治疗的关节炎小鼠相比，在用Fc-μTP或Fc-μTP-L309C处理的小鼠中，高亲和力FcγR、CD64(FcγRI)在关节中性粒细胞(大于50％)和血液单核细胞/巨噬细胞(大于75％)上也显著减少(图13A)。这些数据可能表明FcγR表达的下调，或Fc-μTP或Fc-μTP-L309C导致的FcR阻断。

实施例10：Fc多聚体在体外抑制FcγR功能

人体外***用于检查Fc蛋白对FcγR功能的影响。通过葡聚糖沉降(MW 450-650kD)然后进行Ficoll梯度离心从获自健康志愿者(Regional Red Cross BloodDonation Center，Bern，Switzerland)的抗凝血样品的血沉棕黄层部分分离人嗜中性粒细胞。在对剩余的红细胞进行低渗裂解后从沉积物中获得嗜中性粒细胞。通过将测试物一式三份移液到微量滴定板的孔中，然后将先前加入至鲁米诺溶液(Sigma)中的纯化的嗜中性粒细胞来测量呼吸爆发。在37℃下记录化学发光90分钟，计算信号-时间曲线下的面积，结果表示为RLU(相对光单位)。作为阳性对照，使用预先与人IgG(CSL Behring)孵育的兔红细胞(Charles River)。抗兔红细胞特异性人IgG抗体特异性结合红细胞，因此红细胞以FcγR特异性方式活化人嗜中性粒细胞。

为了测量由人IgG处理的兔红细胞活化的中性粒细胞的呼吸爆发的抑制，将嗜中性粒细胞与抑制剂(Fc单体，Fc-μTP或Fc-μTP-L309C)在37℃预孵育15分钟，随后将鲁米诺溶液和IgG处理的兔红细胞加入，并如上所述记录化学发光。

在存在和不存在IgG包被的兔RBC的情况下，将人嗜中性粒细胞与Fc-μTP或Fc-μTP-L309C一起孵育，并使用呼吸爆发作为中性粒细胞活化的量度。在IgG包被的兔RBC存在的条件下，Fc蛋白不能刺激呼吸爆发(图13B)。此外，两种Fc多聚体均响应于IgG包被的兔RBC而抑制呼吸爆发的活化(图13C)。

其次，使用调理的(抗D-处理的O+)人红细胞的Ab依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作为读数来评估Fc蛋白对FcγR功能的影响。通过Ficoll梯度离心从获自血型为O的健康志愿者(Regional Red Cross Blood Donation Center，Bern，Switzerland)的血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。随后，PBMC通过粘附在聚苯乙烯上而耗尽单核细胞。得到的淋巴细胞被认为是效应细胞。作为靶细胞，使用血型O志愿者(Regional Red CrossBlood Donation Center，Bern，Switzerland)的纯化的人Rh(D)+红细胞(RBC)。用CFSE(Molecular Probes)细胞内标记RBC，然后用抗-D(Rhophylac CSL Behring AG)调理。

为了评估对ADCC的抑制，将淋巴细胞与抑制剂(IVIG、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C)在37℃预孵育30分钟，然后将等分试样的混合物一式三份加入到靶细胞加载的微量滴定板的孔中，效应物:靶比例为1：1。将微量滴定板在37℃和5％CO₂下孵育过夜，然后离心并弃去上清液。在用1％TritonX100裂解沉淀物之前，用0.9％NaCl洗涤RBC一次。将等份的裂解物移液到微量滴定板的孔中并测定荧光(激发480nm/发射535nm)。使用对照样品(未与抗-D孵育的标记的红细胞)而和100％裂解样品(用TritonX100处理的红细胞)计算ADCC。

Fc-μTP和Fc-μTP-L309C有效抑制ADCC，而IVIG具有最小的作用(图13D)。总之，数据表明阻断FcγR是Fc-μTP或Fc-μTP-L309C的另一种可能的抗炎效应机制。

如流式细胞术所示，Fc-μTP或Fc-μTP-L309C以200mg/kg的推注施用，在第8天阻止CAbIA关节炎模型中外周单核细胞上的C5aR(CD88)的上调(图13E)。

已经评估了对FcγR介导的吞噬作用的功能影响。在IVIG或Fc-μTP-L309C存在下，将THP1细胞与IgG包被的FITC标记的乳胶珠孵育3小时。然后通过流式细胞术分析珠子的摄取。如图17所示，Fc-μTP-L309C在阻断IgG包被的乳胶珠的吞噬作用方面比IVIG更有效。

实施例11：Fc蛋白对纯化的白细胞和人全血的体外影响

根据制造商的说明书(Invitrogen)，使用Luminex阵列在存在和不存在HAGG的情况下培养6小时后评估Fc蛋白对纯化的人白细胞(血沉棕黄层)分泌细胞因子的影响。根据制造商的说明，使用商业人细胞因子磁性30-plex板(Invitrogen Life Technologies，Paisley，UK)测量培养上清液或血浆(用于人全血测定)中的细胞因子/趋化因子水平。该小组由以下分析物组成：GM-CSF，IL-2，IL-1β，TNF-α，IL-4，IL-6，MIP-1α，MIP-1β，嗜酸性粒细胞趋化因子，RANTES，MIG，VEGF，HGF，EGF，IL-8，IL-17，IL-1RA，IL-12(p40/p70)IL-13，FGF-Basic，IFN-γ，G-CSF，MCP-1，IL-7，IL-15，IFN-α，IL-2R，IP-10，IL-10，IL-5。在30种细胞因子/趋化因子中，25种不是由HAGG诱导的。随后，分析由HAGG诱导的5种细胞因子/趋化因子(IL-1RA，MCP-1，MIP-1β，RANTES和IL-8)。Fc蛋白诱导IL-1RA、MCP-1、MIP-1β、RANTES和IL-8的分泌，但其量远低于HAGG。

使用人全血分析对Fc单体、Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的细胞因子和趋化因子分泌的影响。水蛭素是一种特异性凝血酶抑制剂，不会干扰补体***，可用作抗凝血剂。将人全血与Fc-μTP和Fc-μTP-L309C一起孵育过夜。根据制造商的说明书(Invitrogen)，通过luminex测量以下分析物：GM-CSF，IL-2，IL-1β，TNF-α，IL-4，IL-6，MIP-1α，MIP-1β，嗜酸性粒细胞趋化因子，RANTES，MIG，VEGF，HGF，EGF，IL-8，IL-17，IL-1RA，IL-12(p40/p70)IL-13，FGF-Basic，IFN-γ，G-CSF，MCP-1，IL-7，IL-15，IFN-α，IL-2R，IP-10，IL-10和IL-5。Fc-μTP或Fc-μTP-L309C诱导可检测水平的IL-1β，TNF-α，IL-6，MIP-1α，MIP-1β，嗜酸性粒细胞趋化因子，RANTES，MIG，HGF，IL-8，IL-1RA，IL-12(p40/p70)，IL-13，IFN-α，G-CSF，MCP-1，IL-15，IFN-α，IL-2R，IP-10和IL-10。与LPS(100ng/mL；Sigma，E.coli 0111：B4，γ-照射；目录号L4391)相比使用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C(使用最高浓度1mg/mL)将以下分析物诱导至显著较低的量：IL-1β，TNF-α，MIP-1α，MIP-1β，IL-1RA，IL-12(p40/p70)，G-CSF和IL-10。

该反应不太可能是由于污染性血小板(其在人中表达FcγRIIA(CD32A))引起的，因为没有Fc蛋白活化血小板，通过使用流式细胞术对P-选择蛋白(CD62P)的上调来测量(图17)。通过流式细胞术(BD FACSCanto II)测量血小板表面上的P-选择蛋白(CD62P)表达来分析血小板活化。简而言之，通过在22℃以300xg离心10分钟从柠檬酸盐稳定的人血液中获得PRP。将2.5μg/ml(终浓度)的Aggrastat加入PRP中以避免血小板聚集。将PRP与Fc单体、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C一起孵育15分钟。作为阳性对照，使用ADP(16μM)和/或Convulxin(20ng/ml)。

已经使用纯化的人白细胞在FACS测定中评估了对Ca²⁺通量或钙动员的影响。向细胞中加载钙指示剂染料，其允许通过荧光检测细胞内钙动员。简言之，将细胞与钙指示剂染料Cal-520在37℃孵育60分钟，洗涤并重悬于5ml HBSA/Hepes中。在加入Fc-μTP和Fc-μTP-L309C或加热聚集IgG(对照)之前平衡样品，并在室温下记录指定时间的荧光。使用前向(FSC)和侧向散射(SSC)区分细胞亚群。如图18所示，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C不诱导嗜中性粒细胞中的钙动员。

实施例12：Fc蛋白对体内细胞因子和肝毒性的影响

在野生型大鼠(CD株)中研究了Fc蛋白对细胞因子和肝毒性的体内作用。给大鼠施用25mg/kg剂量的Fc-μTP或Fc-μTP-L309C、250mg/kg剂量的IVIG或0.9％NaCl。根据制造商的说明，使用商业大鼠细胞因子磁性24-plex板(BioRad)测量大鼠血浆中的细胞因子/趋化因子水平。该小组由以下分析物组成：EPO，G-CSF，GM-CSF，GRO/KC，IFN-α，IL-1α，L-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12p70，IL-13，IL-17A，IL-18，M-CSF，MCP-1，MIP-1α，MIP-3α，RANTES，TNF-α，VEGF。根据制造商的说明书，使用商业大鼠5-plex板(MerckMillipore)测量肝毒性标志物。该小组包括以下分析物：肝型精氨酸酶1(ARG1)，天冬氨酸转氨酶1(GOT1)，α-谷胱甘肽S-转移酶(GSTα)，山梨糖醇脱氢酶(SDH)，5'-核苷酸酶/CD73(5'-NT)，并根据制造商(Merck Millipore)的说明进行分析。如表3中所示，在静脉内施用25mg/kg的使用剂量时，没有测量到Fc多聚体对24种细胞因子的显著上调。此外，仅检测到天冬氨酸转氨酶1(GOT1)和5'-核苷酸酶/CD73(5'-NT)，但其水平非常低，与IVIG相当(如表4所示)。

此外，在i.v.接受100mg/kg IVIG、Fc-μTP或Fc-μTP-L309C的FcRn^-/-、hFcRN^tg/+小鼠中评估细胞因子和肝毒性标志物。使用商业小鼠细胞因子luminex试剂盒(MerckMillipore)根据制造商的说明书测量小鼠血浆中的细胞因子/趋化因子水平。该小组由以下分析物组成：G-CSF，GM-CSF，IFNγ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-9，IL12p70，LIX/CXCL5，IL-15，IL-17，IP-10/CXCL10，KC/CXCL1，M-CSF，MIP-2/CXCL2/3，MIG/CXCL9，Rantes/CCL5，VEGF。为了评估肝毒性，使用COBAS评估以下标志物：ALT，AST，LDH，胆红素，C-反应蛋白。对于所有测量的标志物，检测到的水平与IVIG施用后观察到的水平相当。

表3.大鼠中体内细胞因子

结果表达为平均值±标准偏差(SD)；n.d.：不可检测，n.a.：不可用

表3续

*一式两份中仅一个值可测量

n.a.：不可用

n.d.：不可检测

结果表达为平均值±标准偏差(SD)

实施例13：Fc多聚体在重症肌无力的小鼠模型中提供治疗效果

在重症肌无力的小鼠模型中测试Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的保护功效。通过用乙酰胆碱受体(ACHR)(例如通过亲和层析从Torpedo californica的电器官中纯化，在完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvans s.c.)中乳化)在第1天s.c.免疫小鼠来诱导小鼠中的实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)，随后在第一次免疫后第26天，在不完全弗氏佐剂中用AChR加强免疫。预防性或治疗性地应用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C。对EAMG的临床体征进行评分，例如如M.Thiruppathi等人，J.Autoimmunity 2013中所述。对于临床检查在平台上观察小鼠总共2分钟。然后，当它们试图抓住网格时，通过轻轻拖动它们将尾基部悬挂在笼顶格栅上(20-30次)来锻炼它们。然后将它们放置在平台上2分钟并再次观察EAMG的迹象。临床肌肉无力评分如下：0级-具有正常姿势、肌肉力量和基线和运动后的活动性的小鼠；1级-休息时正常，但肌肉无力，特征是驼背姿势，活动受限以及运动后抬头困难；2级-观察期间无运动的1级症状；3级-脱水和垂死，2级无力；和4级-死亡。

用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C治疗显著改善了EAMG的临床过程。自身抗体和炎症标志物被下调。在抑制EAMG方面，治疗至少与IVIg一样有效。

实施例14：Fc多聚体在硬皮病的小鼠模型中提供治疗效果

在硬皮病的小鼠模型中测试Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的保护功效。例如，如Ruzek等，2004:50；4；1319-31中所述诱导小鼠中的实验性硬皮病。从B10.D2收获脾脏，并通过适当的方法将组织解离成单个细胞。裂解红细胞并将2-5x107 B10.D2(用于诱导GVH)静脉内注射到受体BALB/c RAG-2 KO小鼠中。在5-9周的过程中出现令人联想到人类硬皮病的症状和组织病理学改变，例如皮肤增厚，特别是四肢、内脏器官的进行性纤维化，血管收缩和皮肤和内脏器官中血管标志物的表达改变，皮肤和内脏器官中的炎症，以及自身抗体的产生。预防性或治疗性地应用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C。

用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C治疗显著减轻/改善皮肤和内部器官的组织学修饰并改善血管和炎症修饰。

实施例15：Fc多聚体在自身免疫肾病的小鼠模型中提供治疗效果(由抗肾小球基膜自身抗体诱导)

在补体介导的疾病(例如由抗肾小球基膜自身抗体介导的肾病)的小鼠模型中测试Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的保护功效。从用小鼠肾小球免疫的兔的血浆中纯化抗肾小球抗体。在第0天用兔抗肾小球抗体静脉内注射小鼠，在第6天注射抗兔IgG以交联抗肾小球抗体。分别在第7天和第30天评估急性和慢性白蛋白尿作为肾病的量度。预防性或治疗性地应用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C。

用Fc-μTP和Fc-μTP-L309C治疗显著减少白蛋白尿。

序列表

<110> 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司

<120> 重组IgG Fc多聚体

<130> 2016_L001_A257

<150> EP2016152867

<151> 2016-01-27

<150> EP2016162166

<151> 2016-03-24

<150> EP2016195116

<151> 2016-10-21

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thrs Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu

225 230 235 240

Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr

245 250

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu

225 230 235 240

Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr

245 250

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr

1 5 10 15

Cys Tyr

<210> 7

<211> 269

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

20 25 30

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

35 40 45

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

50 55 60

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

65 70 75 80

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

85 90 95

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

100 105 110

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

115 120 125

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

130 135 140

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

145 150 155 160

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

165 170 175

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

180 185 190

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

195 200 205

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

210 215 220

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

225 230 235 240

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn

245 250 255

Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr

260 265

<210> 8

<211> 269

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

20 25 30

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

35 40 45

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

50 55 60

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

65 70 75 80

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

85 90 95

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

100 105 110

Cys His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

115 120 125

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

130 135 140

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

145 150 155 160

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

165 170 175

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

180 185 190

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

195 200 205

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

210 215 220

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

225 230 235 240

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn

245 250 255

Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr

260 265

<210> 9

<211> 750

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 60

ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 120

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttt 180

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag 240

tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc 360

atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg 420

gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctaccccagc 480

gacattgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540

cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc 600

cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660

tacacccaga agtcactgag cctgagcccc ggcaagccca ccctgtacaa tgtgtccctc 720

gtgatgagcg acaccgccgg cacctgttac 750

<210> 10

<211> 750

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 60

ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 120

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttt 180

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag 240

tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgt gccaccagga ctggctgaac 300

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc 360

atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg 420

gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctaccccagc 480

gacattgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540

cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc 600

cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660

tacacccaga agtcactgag cctgagcccc ggcaagccca ccctgtacaa tgtgtccctc 720

gtgatgagcg acaccgccgg cacctgttac 750

Claims

1.一种六聚体蛋白，其包含六个Fc融合单体，其中每个Fc融合单体包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的变体的两条多肽链，所述变体具有至多5个保守氨基酸改变，其中所述蛋白不包括Fab多肽。

2.权利要求1的六聚体蛋白，其中所述蛋白结合补体成分C1q，并且其中与C1q结合的蛋白不诱导经典补体途径的完整级联的活化。

3.权利要求2的六聚体蛋白，其中与C1q结合的蛋白切割C4但不诱导大多数C2的切割。

4.权利要求2或3的六聚体蛋白，其中所述蛋白不诱导C2的切割。

5.权利要求2至4中任一项的六聚体蛋白，其中所述蛋白抑制由用正常人血清孵育的热聚集IgG诱导的大多数C2的切割。

6.权利要求2的六聚体蛋白，其中与C1q结合的蛋白不导致C3转化酶的形成。

7.权利要求2至6中任一项的六聚体蛋白，其中与通过用全血孵育的热聚集IgG诱导的可溶性C5b-9产生相比，用全血孵育的1mg/ml蛋白诱导小于20％的可溶性C5b-9产生。

8.权利要求2至7中任一项的六聚体蛋白，其中与通过用全血孵育的热聚集IgG诱导的可溶性C5b-9产生相比，用全血孵育的1mg/ml蛋白诱导小于10％的可溶性C5b-9产生。

9.权利要求2至8中任一项的六聚体蛋白，其中所述蛋白抑制C5b-9的产生。

10.权利要求2至9中任一项的六聚体蛋白，其中所述蛋白抑制由用全血孵育的热聚集IgG诱导的C5b-9产生。

11.权利要求2至9中任一项的六聚体蛋白，其中与用热聚集IgG活化的正常人血清相比，所述蛋白使经典补体途径活化少于20％。

12.权利要求1-11中任一项的六聚体蛋白，其中在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg蛋白诱导：

a)在第7至14天中任何一天的临床评分减少；

b)从第7天到第14天计算的平均临床评分减少；

c)在第8天从膝关节回收的CD45+细胞数量减少；或

d)在第8天或第14天踝关节的组织学评分减少，其中将施用六聚体蛋白的小鼠与未治疗的关节炎小鼠进行比较。

13.权利要求1至12中任一项的六聚体蛋白，其中在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg蛋白诱导：

a)在第7至14天中任何一天的临床评分减少超过50％；

b)从第7天到第14天计算的平均临床评分减少超过50％；

c)在第8天从膝关节回收的CD45+细胞数量减少超过50％；或

d)在第8天踝关节的组织学评分的大于25％的减少和/或在第14天踝关节的组织学评分的大于50％的减少，其中将施用六聚体蛋白的小鼠与未治疗的关节炎小鼠进行比较。

14.权利要求1-13的六聚体蛋白，其中与包含SEQ ID NO：3的两个多肽的重组Fc单体相比，所述蛋白在经典补体途径的溶血测定中抑制调理的绵羊红细胞的裂解。

15.权利要求1-14的六聚体蛋白，其中浓度为0.5mg/ml时，与包含SEQ ID NO：3的两个多肽的重组Fc单体相比，该蛋白在经典补体途径的溶血测定中抑制调理的绵羊红细胞的裂解超过70％。

16.权利要求1-15中任一项的六聚体蛋白，其中所述蛋白诱导嗜中性粒细胞或单核细胞上FcγRII表达或FcγRIII表达的减少。

17.权利要求1至16中任一项的六聚体蛋白，其中在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg蛋白诱导第8天嗜中性粒细胞或单核细胞上FcγRII水平或FcγRIII水平大于50％的减少，其中将施用六聚体蛋白的小鼠与未治疗的关节炎小鼠进行比较。

18.权利要求1-17中任一项的六聚体蛋白，其中所述蛋白抑制单核细胞上C5aR(CD88)的上调。

19.权利要求1-18中任一项的六聚体蛋白，其中在小鼠抗胶原抗体诱导的关节炎模型中在第6天施用200mg/kg蛋白诱导第8天单核细胞上CD64水平的减少，其中将施用六聚体蛋白的小鼠与未治疗的关节炎小鼠进行比较。

20.一种治疗有需要的受试者的自身免疫疾病或炎性疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-19的六聚体蛋白的药物组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述药物组合物静脉内或非静脉内施用。

22.权利要求21的方法，其中所述药物组合物皮下施用。

23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病选自：免疫性血细胞减少症、格林-巴利综合征、川崎病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力、炎性神经病、视神经脊髓炎、其他自身免疫性疾病通道病、自身免疫性癫痫、皮肌炎、脊髓炎、天疱疮、类天疱疮、***性红斑狼疮、移植、再灌注损伤和类风湿性关节炎。

24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述药物组合物以10mg/kg至1000mg/kg的剂量施用。