CN104870055A - 免疫调节蛋白 - Google Patents

Abstract

一种用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多肽单体单元；其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含2个免疫球蛋白G重链恒定区；其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；其中所述多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当施用到哺乳动物受试者时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分。

Description

免疫调节蛋白

发明领域

本发明涉及具有免疫调节功能的工程化蛋白，及其用于治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的医疗用途。特别地，所述工程化蛋白可用作静脉内免疫球蛋白(IVIG)的替代物。

发明背景

自身免疫性疾病和炎性疾病是高发病率和死亡率的原因。在2003年，自身免疫性疾病是75岁以下的全部年龄组中第6位最常见死亡的根本原因。一种重要的治疗方式为静脉内免疫球蛋白(IVIG)或IgG。最初，开发了来自人血浆的免疫球蛋白产品以治疗免疫缺陷。然而，目前使用了70％处方IVIG用于治疗自身免疫状况或炎性状况。全世界消耗的IVIG从1980年的每年300kg增加到2010年的每年100公吨。根据漫长和昂贵的制造工艺，从约3,000匿名捐赠者汇集的血浆中衍生得到IVIG。对于捐赠者和捐赠血浆的病毒的广泛筛选的需求产生了高成本。考虑到增加的需求，以及IVIG生产的严格调控，可能发生IVIG的短缺。IVIG制品可受制于不充分无菌度、杂质的存在和批次间的变化。它们在其免疫球蛋白A含量方面可极大地变化，并且IgA可在IgA缺陷的接受者中引起***反应或过敏反应。使它们不适合某些患者。不得不向患者给予非常大剂量的IVIG，典型地2克每公斤体重，且这可在一些患者中引起不良反应。鉴于这些限制，需要用于IVIG的界定的替代物。

尽管IVIG作用的机制还不清楚，源自IVIG的Fc片段可治愈罹患特发性血栓性紫癜(ITP)的儿童(Debre M等，1993)。尽管所涉及的确切受体被激烈争论(Samuelsson A等,2001；Bazin R等,2006；Crow.A.R等,2003；Leontyev D等,2012；Siragam.V等,2006)且可因为疾病(对该疾病使用了IVIG)而变化(Araujo L.M等,2011；Anthony R.M.等,2011)，认为IgG的Fc部分与在单核细胞和巨噬细胞上发现的抑制性和活化型FcγR两者之间的相互作用是重要的。已证明抑制性Fc受体FcγRIIb对于IVIG在ITP小鼠模型中的保护性作用是必需的(Samuelsson等,2001)。还已经证明在多种疾病中活化型Fc受体FcγRIIIa的作用(Mekhaiel等,2011b综述)。尽管近期工作已证明在小鼠模型中FcRn不参与改善ITP(Crow等,2011)，还已经假设FcRn负责维持Fc在血浆中的长半衰期(Roopenian和Akilesh,2007)。Fc部分不仅与Fc受体相互作用，而且与某些凝集素相互作用。已知IVIG通过Fc-聚糖的末端唾液酸与B淋巴细胞上的CD22凝集素结合(Siglec-2)(SeiteJ.F等，2010)，且最近研究证明，由于唾液酸化Fc与DC上的人凝集素受体DC-SIGN相互作用，唾液酸化Fc是小鼠关节炎模型中IVIG抗炎作用的原因(Anthony R.M等，2011)。

IVIG还可通过在其中注射的IVIG首先在患者中形成一类免疫复合物的多步模型起作用(Clynes等,2005；Siragam等,2005,2006；Machino等,2012)。形成了这些免疫复合物之后，它们与这些受体相互作用以介导有助于减少自身免疫性疾病或炎性状态严重性的抗炎性作用(Siragam等,2006)。通过抗独特型相互作用(Machino等,2010；Machino等,2012；Roux和Tankersley,1990；Teeling等,2001)或通过Fc的共价相互作用(Yoo等,2003)在IVIG中形成了Fc的多聚体。假定IgG多聚体显示了与以上受体结合的更高的总亲和力(avidity)并通过交联所述受体的性质诱导了不能被Fc单体所诱导的保护性信号。这通过免疫复合物(IC)在小鼠中逆转ITP(Bazin等,2006)并通过观察IC通过FcγRIIb增强不成熟树突细胞的致耐受性来促进狼疮的减轻(Zhang等,2011)所支持。可市购获得的IVIG中多聚体IgG和/或唾液酸化IgG的比例极其低(分别<1％和5％)，其可以是需要施用很大量的原因(Nimmerjahn和Ravetch,2007)。

其他提出的IVIG作用机制为独特型-抗独特型网络的修复；由IVIG中的特异性抗体抑制或中和细胞因子；阻断在白细胞上的粘附分子与血管内皮的结合；抑制补体在靶组织中的摄入；中和微生物毒素；由IVIG中的抗Fas抗体阻断Fas配体介导的细胞凋亡；在高浓度IVIG下抗Fas抗体诱导细胞凋亡；由IVIG中的抗Siglec-9抗体的嗜中性粒细胞的细胞凋亡；使FcRn受体饱和以增强自身抗体的消除；在效应物巨噬细胞上诱导抑制性FcγRIIb受体；中和B细胞的生长因子，诸如B细胞活化因子；抑制T细胞增殖反应；Treg细胞群的扩增、活化或两者；抑制树突细胞的分化和成熟；增强“致敏”树突细胞的分化和成熟(在Ballow,2011；Mekhaiel等,2011b中综述)。

已经提出了用于在治疗自身免疫性疾病中使用和/或作为IVIG替代化合物的重组蛋白。US 2011/0081345(Moore)公开了在治疗自身免疫性疾病中可以是有用的单链Fc(scFc)蛋白，所述单链Fc蛋白的每分子具有一个Fc单元，包含两个连接的Fc结构域氨基酸链。US 2004/0062763(TempleUniversity；Mosser)公开了使用多价Ab或其部分以连接FcγRI来上调IL-10的产生，以治疗自身免疫紊乱。剂可以是偶联在一起的或提供于单个重组肽中的两种或更多种Fc片段。US 2008/0206246(The Rockefeller University；Ravetch)公开了包含至少一个唾液酸化的IgG Fc区域的多肽，和其用作IVIG替代化合物的用途。尽管在这些文献中公开的化合物可靶向Fc受体，包含Fc单体或二聚体的化合物可不以有效地或完全有效地作为IVIG替代化合物的足够的总亲和力来结合Fc受体。因此，它们不是IVIG的多聚体级分的适合仿生物。在这些文献中没有公开更高等级多聚体。也没有公开工程化作为IVIG替代化合物是有活性的更高等级多聚体的任何方式。

US 2010/0239633(University of Maryland,Baltimore；Strome)公开了包含多个连接的Fc部分的IVIG替代化合物。设想使用了IgM的Cμ4结构域和J链的星形排列以实现聚合。然而，没有描述工作实例，且在此处报道的计算机模拟表明，示例性分子将不会有效地聚合和/或Fc部分将不会被排列用于有效结合Fc或其他受体。此外，包含多于一个的不同多肽链的生物复合物可更难以均匀地制造，因为不是所有的多肽亚单位可以以稳定地并可预测的方式相互作用。例如，产生包含正确比例的轻链和重链的活性完整抗体的表达抗体重链和轻链的细胞系，还可产生不含轻链连接物的治疗上无活性重链二聚体或半聚体(halfmer)分子。

US 2010/0239633中还提出了线性结构，其中通过相同的Fc结构域氨基酸链之间的配对使单个氨基酸链二聚化，因此生成了Fc区域。例如，铰链区可在两个单个氨基酸链之间形成链间二硫键。然而，如在US2010/0239633的图11和图12中图解的，在多个Fc氨基酸链串联地连接的情况下，可存在多个不同方式，其中这些链可以配对。因此，将不能预期具有可靠和可预测的性质的一致产品。提出了包括来自IgE的末端重链结构域以防止此“拉链”效应。然而，分子与IgE受体的结合可具有不希望的结果，包括过敏性休克或其他***反应的风险。

US 2010/0239633还提出制造簇分子，其中多聚化区域诸如IgG2a铰链或异亮氨酸拉链，引起氨基酸链二聚化或多聚化，因此使Fc结构域氨基酸链的对联合在一起以形成功能性Fc单元。在后续的研究中，Jain等(2012)描述了重组蛋白的制备，其中人IgG2铰链序列或异亮氨酸拉链融合到小鼠IgG2a。作者报道了，多聚化区域中的任一个引起了同源二聚体(即此处称为单体的单个功能Fc单元)和多聚体的形成。这些蛋白的多聚级分在治疗ITP小鼠模型或胶原诱导关节炎小鼠模型中具有一些功效。然而，大多数包含IgG2铰链的制备的蛋白为单体或作为二聚体或三聚体存在。具有未知四级结构的更高等级寡聚体仅占小部分。在包含异亮氨酸拉链的蛋白中，更高等级多聚体的比例更低。更高等级多聚体在大小上表现不均一，且其结构、包括附接在N297的聚糖的性质是未知的。考虑到这些多聚体的一些或全部在产生的蛋白中的低比例，分离它们用于治疗用途将使得大量的浪费不可避免，且表现出不太可能在商业上可行。

为了治疗自身免疫性疾病和炎性疾病，对于确定结构的化合物存在需求，所述化合物有效靶向IVIG的生物活性潜在的适合机制。

该说明书中的在先公布文献的列表或讨论将不被认为承认该文献为本领域的状态的一部分或为公知常识。

发明概述

本发明的第一方面提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：

向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多肽单体单元；

其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含2个免疫球蛋白G重链恒定区；

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；

其中多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当施用到哺乳动物受试者时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分。

本发明的第二方面提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：

向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单元组成；

其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分组成，所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头(linker)组成；且

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。

本发明的第三方面提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：

向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单元组成；

其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分和尾片段区(tailpiece region)组成；

其中Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；

其中每个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；且

其中尾片段区融合到多肽单体单元的两个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的每个并促进单体单元组装成聚合体。

本发明的第四方面提供了多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多肽单体单元；

其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区；

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；

其中，多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分；

其中每个多肽单体单元不包含融合到两个免疫球蛋白G重链恒定区的每个的尾片段区。

本发明的第五方面提供了多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单元组成；

其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分组成，所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；且

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。

本发明的第六方面提供了核酸分子，所述核酸分子包含编码如根据本发明第四或第五方面定义的多聚蛋白的多肽单体单元的编码部分。

本发明的另外方面为包含本发明第六方面的核酸分子的表达载体、包含表达载体的宿主细胞、和包含本发明第四或第五方面的多聚蛋白的治疗组合物。

还设想了相应于本发明第一方面至第三方面的治疗方法的医疗用途。

附图简述

图1：六聚体Fc和结构表征。A.显示了一个单体和其毗邻单体之间形成的Cys309和Cys360(尾片段)二硫键(disulphide linkage)的六聚体Fc模型(左图)。轻敲模式原子力显微术图像(右手图)揭示了与六聚体相一致的桶形、六倍对称复合物。在更小的扫描尺寸下(两幅右手图的下图)，显示这些复合物直径为约20nm(在下图中的比例尺为50nm)。B.从哺乳动物细胞系产生的六聚体Fc可通过体积排阻色谱法作为约312kDa的分子被检测到(高亮的痕迹为六聚体)。还检测到了小比例的二聚体。

图2：六聚体Fc与人和小鼠Fcγ受体(FcγR)的结合。将滴定量(50-0.3nM)的Fc蛋白包被到ELISA孔上。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗GST抗体可视化被如所示的由人或小鼠谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-融合的FcγR的结合。值代表一式三份的确定值。误差线为在平均值附近的标准误差(SE)。如在Mekhaiel等，2011a中所描述的，抗原融合的Fc蛋白几乎不与Fc受体结合。

图3：六聚体Fc与人CD19+人B淋巴细胞的结合。特征化流式细胞术图显示了通过其前向角和侧向角散射的图形(左图)所代表的人白细胞的不同群体。对以抗人CD19-FITC染色的单个CD19+B淋巴细胞(加框的，中间图片)门控并调查了与六聚体Fc的结合(右图)。通过右边最远的标记线(箭头所指的六-Fc)表示50μg六-Fc与CD19+B细胞的结合。用FcRL5特异性单克隆抗体509F6(箭头所指的六-Fc+阻断FcRL5的mAb 509F6)对细胞的在先孵育使六聚体Fc的结合脱落，表明FcRL5是六聚体Fc结合B细胞的部分原因。

图4：对Fc蛋白的补体结合分析。通过ELISA确定的C1q(左图)和C5-9(右图)对Fc融合物的沉积。每个点代表对在给定组内的每个小鼠双重孔的平均光密度(+/-SD)。显示了来自三个重复实验中的一个实验的数据。

图5：六聚体Fc蛋白在ITP的小鼠模型中保护免受血小板损失。用六-Fc、IVIG(GammaGard)或PBS腹腔(i.p.)注射了Balb/C小鼠。一小时以后，在所有小鼠中诱导了ITP。在处理之后示出的时间点计算了血小板。

本发明的优选实施方案的详述

根据本发明的第一方面，提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法。通过施用包含5个、6个或7个多肽单体单元的多聚蛋白治疗受试者；其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区。

术语“免疫球蛋白G重链恒定区”意指天然免疫球蛋白G重链区或其变体或片段。Fc受体结合部分典型地包含免疫球蛋白G的Fc部分、或其片段或变体。术语“Fc部分”包括通过酶木瓜蛋白酶的有限蛋白水解获得的IgG分子的片段，所述木瓜蛋白酶在IgG的铰链区起作用。以此方式获得Fc部分包含两个相同的二硫键连接的肽，所述肽包含IgG的重链CH2和CH3结构域，也被分别称为Cγ2和Cγ3结构域。两个肽通过在肽的N端部分中半胱氨酸残基之间的两个二硫键连接。对于IgG，描述的二硫键的排列属于天然人抗体。尽管在本发明的上下文中此类抗体可以是适合的，一些变化可存在于其他哺乳动物物种的抗体之间。在鸟类、爬行动物和两栖动物中也发现了抗体，且它们同样地可以是合适的。在例如Ellison等(1982)NUCLEIC ACIDS RES.10:4071-4079中公开了人Fc IgG的核苷酸序列和氨基酸序列。在例如Bourgois等(1974)EUR.J.BIOCHEM.43:423-435中公开了小鼠Fc IgG2a的核苷酸序列和氨基酸序列。免疫球蛋白G重链恒定区可典型地通过重组表达技术产生，且如在天然抗体中发生的，作为单体单元通过二硫键相缔合。可选地，两个恒定区可产生作为具有中间接头区的单氨基酸链，即作为典型地还通过重组表达技术产生的单链Fc(scFc)。在US 2011/0081345中描述了scFc分子，包括具有以下从N端到C端的一般结构的实例：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。

典型地，每个免疫球蛋白G重链恒定区包含哺乳动物重链恒定区，优选地人重链恒定区的氨基酸序列、或其变体。适合的人IgG亚型是IgG1。

Fc受体结合部分可包含多于免疫球蛋白的Fc部分。例如，它可包括在天然免疫球蛋白中的CH1与CH2结构域之间出现的免疫球蛋白的铰链区。对于某些免疫球蛋白，铰链区对于与Fc受体的结合是必需的。优选地，Fc受体结合部分缺少CH1结构域和重链可变区结构域(VH)。与相应的免疫球蛋白的Fc部分相比，可在C端和/N端截短Fc受体结合部分。因此，此Fc受体结合部分是Fc部分的“片段”。

凭借包含半胱氨酸残基的各个免疫球蛋白G重链恒定区形成了多聚蛋白，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。由于IgM和IgA天然是聚合体，而IgG天然是单体，基于IgG重链恒定区的单体单元形成聚合体的能力可通过修饰IgG重链恒定区的部分使其更加类似于IgM或IgA的相应部分来提高。适合地，每个免疫球蛋白重链恒定区或其变体是包含含有根据EU编号***在309位置上的半胱氨酸残基、并优选地还包含在310位置上的亮氨酸残基的氨基酸序列的IgG重链恒定区。在Kabat EA等，1983Sequences ofproteins of immunological interest.US Department of Health and HumanServices,National Institutes of Health,Washington DC中描述了用于IgG的EU编号***。Sorensen等(1996)J Immunol 156:2858-2865中描述了在包含IgM尾片段的人IgG分子中Leu 309突变为Cys 309，以促进聚合体形成。Leu 309通过序列同源性相应于在IgM的Cμ3结构域的Cys 414和在IgA的Cα2结构域中的Cys 309。(注意，在IgM和IgA或IgG类别之间氨基酸残基的编号不同。)其他的突变也可以是有利的。

适合地，每个多肽单体单元包含融合到两个免疫球蛋白G重链恒定区中每个的尾片段区；其中每个多肽单体单元的尾片段区有助于单体单元组装成聚合体。典型地，尾片段区融合到两个免疫球蛋白重链恒定区中每个的C端。适合地，尾片段区是IgM或IgA尾片段、或其片段或变体。这些尾片段分别是IgM的Cμ4结构域或IgA的Cα3结构域的最末的部分。

在描述一个区域为融合到另一个区域的C端的情况下，前面的区域可直接地融合到后面区域的C端，或它可融合到中间的氨基酸序列，所述中间的氨基酸序列本身融合到后面区域的C端。N端融合可类似地理解。

中间的氨基酸序列可提供于重链恒定区和尾片段之间，或尾片段可直接融合到重链恒定区的C端。例如，短接头序列可提供于尾片段区和免疫球蛋白重链恒定区之间。典型接头序列是1个到20个氨基酸长度之间，典型地2个、3个、4个、5个、6个或多达8个、10个、12个、或16个氨基酸长度。包括在重链区和尾片段区之间的适合接头编码Leu-Val-Leu-Gly。

优选的尾片段区是人IgM的尾片段区，其为PTLYNVSLVMSDTAGTCY(Rabbitts TH等,1981.Nucleic Acids Res.9(18),4509-4524；Smith等(1995)J Immunol 154:2226-2236)。适合地，此尾片段可在N端通过取代初始Thr为Pro来修饰，因此产生序列PPLYNVSLVMSDTAGTCY。这没有影响尾片段促进单体聚合的能力。在Sorensen等(1996)J Immunol 156:2858-2865中描述了人IgM尾片段的另外适合变体。另外的IgM尾片段序列是来自啮齿动物的GKFTLYNVSLIMSDTGGTCY(Abbas和Lichtman,Cellular and MolecularImmunology,Elsevier Saunders,第5版,2005)。可选的优选的尾片段区是人IgA的尾片段区，其为PTHVNVSVVMAQVDGTCY(Putnam FW等,1979,J.Biol.Chem 254:2865-2874)。可使用来自其他物种的IgM或IgA的其他适合尾片段、或甚至促进单体单元组装成聚合体的合成的序列。使用来自免疫球蛋白重链恒定区源自的相同物种的免疫球蛋白尾片段不是必需的，尽管这样做是优选的。

“变体”和“片段”与重链恒定区相关地定义。IgM尾片段的变体典型地具有与PPLYNVSLVMSDTAGTCY的18个氨基酸位置的8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个相同的氨基酸序列。IgA尾片段的变体典型地具有与PTHVNVSVVMAQVDGTCY的18个氨基酸位置的8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个相同的氨基酸序列。这些IgM或IgA尾片段的片段典型地包含8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个氨基酸。还设想了变体的片段。典型地，IgM或IgA尾片段的片段和变体保留了倒数第二个半胱氨酸残基，因为认为其在多聚蛋白中两个单体单元之间形成了二硫键。

给定尾片段区促进单体单元组装成聚合体的能力可通过比较在从缺少尾片段的单体单元形成时具有高分子大小的蛋白的比例与在从包含尾片段的单体单元形成时具有高分子大小的蛋白的比例来测试。在天然条件下后者可形成更高比例的高分子大小聚合体。天然分子量可通过体积排阻色谱法确定，例如在AKTA FPLC(Amersham)的Sephadex-200柱。可选地，如在Smith等(同上)或Sorensen等(同上)所述的，可使用非还原性凝胶电泳。

当单体单元已组装成聚合体时，Fc受体结合部分以其空间朝向以允许每个Fc受体结合部分与Fc受体结合的平面聚合结构来排列。IgM天然地为五聚体或六聚体，且IgA天然形成二聚体、三聚体或四聚体。这些性质表现为至少部分地通过尾片段引起单体连接成聚合体的能力来确定。当IgM与J链连接时形成了五聚体IgM，尽管在缺少J链的情况下它典型地为六聚体。J链可以或不可以被包括作为本发明的聚合体融合蛋白的另外组分。制备通过省略J链多肽而简化，其在任何情况下对于IgG的聚合不是需要的(Ghumra等,2008)。发现于粘膜表面的分泌IgM或IgA包含分泌组分(SC)，部分聚合体Ig受体被用于改变它们从血液到分泌物的位置。SC可以或不可以被包括作为本发明的多聚蛋白的另外组分。制备通过省略SC而简化，其在任何情况下不是聚合需要的。

根据本发明的第一方面使用了包含5个、6个或7个多肽单体单元的多聚蛋白。本文描述的包含人IgG1重链恒定区和人IgM尾片段的示例性Fc蛋白形成了六聚体和二聚体。包括不同尾片段或不包括尾片段的基于其他IgG重链恒定区的变体，可形成具有不同数量的单体的聚合体。特别地，它们可为五聚体或七聚体而不是六聚体。在Fc蛋白天然地连接为具有不同数量的单体单元的聚合体的情况下，具有所需数量的单体单元的聚合体可根据分子大小分离，例如通过凝胶过滤。还可使用其中至少一定比例的蛋白为五聚体、六聚体和/或七聚体形式的混合物。在缺少具有其他数量的单体单元的蛋白的情况下，适合地使用五聚体、六聚体和/或七聚体。

在根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白中，每个单体单元的Fc受体结合部分能够与Fc受体结合。将理解，包含特定免疫球蛋白的Fc部分的Fc受体结合部分，取决于特定免疫球蛋白的结合特异性将与不同Fc受体结合。典型地，Fc受体结合部分将对给定Fc受体的具有亲和力(affinity)，其至少比得上天然单体免疫球蛋白分子的亲和力。然而，更低的亲和力可以是可接受的，因为多聚蛋白包含多个此类Fc受体结合部分，并将因此以更高的总亲和力结合Fc受体。因此，Fc受体结合部分将典型地具有与给定Fc受体结合的相应天然单体免疫球蛋白分子的亲和力的至少十分之一、适合地至少五分之一并且最适合地至少二分之一的亲和力。

亲和常数可容易地通过表面等离子体共振分析(Biacore)确定。Fc受体结合部分可经过来自胺偶联的CM5传感器芯片的流动小室(flow cell)传到Fc受体。可在每个Fc受体上注入等摩尔浓度的Fc受体结合部分或完整单体抗体并实时观察连接与解离。可使用BIAevaluation 3.0软件分析来自BIAcore X或3000仪器的数据来确定准确的亲和常数。

存在三类人Fcγ受体(Gessner等(1998)Ann Hematol 76:231-48；Raghavan和Bjorkman(1996)Ann Rev Cell Dev Biol 12:181-220)。FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG。FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)为Fc的低亲和力受体，且仅可以高亲和力与递呈到免疫***作为免疫复合物(IC)的抗体相互作用。尽管更大的(>350kDa)多聚IgG和循环IC在IVIG的制品中几乎全部地被去除，在健康个体中这些是常见的，在那里它们可贡献总血浆Ab浓度的10％之多，表明在这些健康个体中维持免疫内稳态的生理角色(Nezlin R(2009)Immunol Lett 122,141-4)。

FcγRII和FcγRIII与它们配体结合结构域的结构方面紧密相关。在人的三种单独基因FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC中，两种产生了编码FcγRII的可变剪接的变体。FcγRIIa传递了活化信号，而FcγRIIb传递了抑制信号。不同信号的功能性基础从位于受体的细胞质尾部内的信号转导基序产生。位于FcγRIIb的细胞质尾部的免疫受体酪氨酸基抑制子基序(ITIM)参与负性受体信号传导。ITIM基序为FcγRIIb受体的独特特征，因为它并不明显地出现在其他任何Fcγ受体类别中。相反地，活化性免疫受体酪氨酸基活化基序或ITAM位于FcγRIIa的细胞质尾部。ITAM基序转换活化信号。它们还可见于FcRy链中，其与高亲和力IgE受体(FcεRI)的γ链相同。尽管髓细胞和一些T细胞亚群中广泛表达FcγRIIa和FcγRIIb，它们在NK细胞中显著地不存在。在人中存在FcγRIIa受体的两种等位基因，称为His131(H131)和Arg131(R131)。FcγRIIa-Arg131等位基因与对被有荚膜的细菌诸如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neiserria meningitidis)感染增强的易感性相关，所述感染引发了IgG2应答(Pleass RJ和Woof JM,2001)。由这一等位基因编码的Fc受体不能结合IgG2且因此不能引发对包被IgG2的细菌的清除。然而，两种变体都结合人IgG1。

人FcγRIII还以源自两种不同基因(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的多个亚型存在。FcγRIIIb在其通过糖基磷脂酰锚附着到细胞膜中是独特的。FcγRIIIb的表达受限于中性粒细胞，而FcγRIIIa通过巨噬细胞和NK细胞表达。FcγRIIIa还通过一些T细胞亚群和某些单核细胞表达。FcγRIIIa需要FcRγ链或CD3ζ链的存在用于细胞表面表达和信号传导。FcRγ链或CD3ζ链为二聚体并拥有ITAM基序。FcγRIIIa与这些亚单位形成了多聚复合物且通过它们转导了信号传导。因此，存在相当大的FcγR受体异质性和多种表达。

FcγRII和FcγRIII的结合位点定位在IgG的CH2结构域的铰链和近端区的位置，该区域起初被鉴定用于FcγRI(Duncan等(1988)Nature 332:563-4；Morgan等(1995)Immunol 86:319-324；Lund等(1991)J Immunol 147:2657-2662)。

Fcγ受体(FcγR)触发了设置细胞活化的阀值并以良好平衡免疫应答结束的活化性和/或抑制性信号传导途径(Nimmerjahn F和Ravetch JV(2008)Nat.Rev.Immunol.8:34-47)。活化FcR和抑制性FcR广泛地表达于造血***中，但特别地在专职抗原递呈细胞(APC)上表达(Nimmerjahn F和RavetchJV(2008)同上)。例如在人中，FcγRI通过血液骨髓树突细胞(DC)组成型地表达且至今已经在检查的每个DC亚群中探测到FcγRII，而FcγRI、FcγRIIB和FcγRIII的表达主要在小鼠DC上(Ravetch JV(2003)于FundamentalImmunology(Paul WE编)685-700中(Lippincott-Raven,Philidelphia)；Bajtay Z等(2006)Immunol.Lett.104:46-52)。FcγR还在抗原递呈和免疫复合物介导的树突细胞(DC)的成熟，以及在B细胞活化的调节和血浆细胞的存活中扮演重要角色(Ravetch JV(2003)同上；Bajtay Z等,(2006)同上)。此外，通过调节DC活性，FcγR调控在识别DC表面上递呈的抗原肽到细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和调节T细胞之后引发免疫原性还是耐受原性应答。FcγR还与Toll样受体(TLR)协作以控制重要调节细胞因子IL-12和IL-10的水平(Polumuri SK,2007,J.Immunol 179:236-246)。因此，FcγR参与调节先天和获得性免疫应答，其使得它们成为用于开发新颖的免疫治疗方法的有吸引力的靶标(Nimmerjahn F和Ravetch JV(2008)同上)。

已知抑制性FcγRIIB控制免疫应答的强度，因为源自FcγRIIB敲除小鼠的DC在体外和在体内产生了更强并持续更长的免疫应答(Bergtold A,Desai DD等(2005)Immunity 23:503-514；Kalergis A M和Ravetch JV.(2002)J.Exp.Med.195:1653-1659)。更重要地，FcγIIB缺乏型DC或用阻断免疫复合物与FcγRIIB结合的mAb孵育的DC显示了自发成熟(Boruchov AM,等(2005)J.Clin.Invest.115:2914-2923；Dhodapkar KM,等(2005)Proc.NatlAcad.Sci.USA 102:2910-2915)。这表明，抑制性FcγR不仅调节细胞活化的强度而且在非炎性稳态性条件下积极地防止自发性DC成熟。事实上，低水平的免疫复合物可在健康捐赠者的血清中见到，强调了防止不希望的DC活化的调节机制的重要性(Dhodapkar KM,等(2005)Proc.Natl Acad.Sci.USA 102:2910-2915)。FcγRIIB的损失还导致了引发更多的抗原特异性T细胞(Kalergis A M和Ravetch JV.(2002)J.Exp.Med.195:1653-1659)。因此，聚合体Fc蛋白与多拷贝的FcγRIIB的结合可诱导来自表达此受体的细胞的负应答。

FcRL5为近来描述的能够抑制信号传导的Fc受体，其在B细胞上表达并结合聚合的IgG但不结合单体IgG(Wilson等,2012)。这些作者提出，IgG可与共表达于B细胞上的FcRL5和FcγRIIb协同结合(bindcooperatively)。如在实施例3中所述的，示例性六聚体蛋白可不依赖FcγRIIb地结合FcRL5。

在Fc受体结合部分包含人IgG同种型或其变体的免疫球蛋白重链恒定区的情况下，它将典型地与人Fcγ受体(FcγRI、FcγRII和FcγRIII)和/或人FcRL5结合。如上所述的表面等离子体共振分析可用于确定亲和常数。人IgG1或IgG3与FcγRI结合的典型亲和常数为约10^-9M；对于FcγRII为约0.6-2.5x10^-6M；对于FcγRIIIA为约5x10^-5M；对于FcγRIIIB为约0.6-2.5x10^-6M。尽管FcRL5事实上以高的总亲和力与聚合的IgG结合，单体IgG未显著地与FcRL5结合，表明FcRL5对于单体IgG是低到中等亲和力受体，亲和常数为约10^-5-10^-6M(获得自Wilson等,2012)。可选地，可基本如实施例3中所述的使用ELISA以获得结合性质的半定量指示。

Fc受体结合部分还典型地与凝集素也被称为聚糖受体结合，所述凝集素特别是与唾液酸结合的凝集素。示例性凝集素为人DC-SIGN(或小鼠同源物SIGN-R1)和CD22，其有助于IVIG的治疗性质(在Mekhaiel,2011b中综述)。如在实施例3中解释的，预测多聚蛋白与这些受体相互作用。SIGN-R1结合可通过表面等离子体共振确定，如在Jain等,2012中所述的。可使用类似方法以确定与CD22或DC-SIGN的结合。人2,6唾液酸化Fc分别以2.7x10^-6M和3.6x10^-6M的亲和常数结合SIGN-R1和人DC-SIGN(Anthony等,2008,PNAS 105:19571-19578)。唾液酸化Fc未明显地结合。已知相比于以10^-2M结合的单体，聚合体唾液蛋白例如血凝素以大约10^-8M等级的亲和力与唾液酸受体结合(Mammen M,Choi SK,Whitesides GM(1998)Angew Chem Int Edit 37:2755-2794.)。因此，由于总亲和力的增加可增强固有的微弱底物亲和力，预期将末端唾液酸残基递呈在多聚蛋白上将同样地显著地增强与唾液酸受体的结合。

如以上描述了，包含天然免疫球蛋白重链恒定区的变体的Fc受体结合部分或Fc部分的片段的亲和常数的适当的限值和确定。

“变体”是指在一个或更多个位置上已存在保守或非保守的氨基酸***、缺失或取代的蛋白。

“变体”可具有修饰的氨基酸。适合的修饰包含乙酰化、糖基化、羟基化、甲基化、核苷酸化、磷酸化、ADP-核糖基化、和本领域中已知的其他修饰。此类修饰可在肽通过重组技术制备的情况下在转录后出现。否则，可使用本领域已知的技术对合成肽进行修饰。

在将氨基酸掺入到肽之前可包括修饰。羧酸基团可被酯化或可转化为酰胺，氨基基团可烷基化，例如甲基化。变体还可在转录后修饰，例如去除碳水化合物侧链或单个糖部分例如唾液酸基团或加入唾液酸基团。

“保守取代”是指诸如Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；和Phe、Tyr、Trp的组合。优选的保守取代包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。

免疫球蛋白G重链恒定区的典型变体将具有与天然免疫球蛋白的相应免疫球蛋白G重链恒定区至少70％、典型地至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。适合地，变体是人免疫球蛋白G1重链恒定区的变体并具有与后者至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

“片段”是指其中一个或更多个位置存在缺失的蛋白。典型地Fc部分的片段包含Fc部分的完整序列的至少60％、更典型地至少70％、80％、90％、95％或多达99％。也包含变体的片段。

两个多肽之间的序列同一性百分比可使用适合的计算机程序确定，例如University of Wisconsin遗传计算组的GAP程序且将理解同一性百分比为关于其序列已经最优地比对的多肽来计算。

可选地，可使用Clustal W程序进行比对(Thompson等,(1994)NucleicAcids Res.,22(22),4673-80)。可使用的参数如下：

·快速成对比对参数：K元组(K-tuple)(字符)大小，1；窗口大小，5；间隔罚分，3；上对角线的数目，5；评分方法：x百分比。

·多个比对参数：间隔开口罚分，10；间隔延伸罚分，0.05。

·评分矩阵：BLOSUM。

变体可以是天然的或使用本领域公知的蛋白工程化方法和定点诱变方法制备。

“肽”一般包含多达10个、20个、50个或100个氨基酸。肽和多肽可方便地在N端或C端被封闭使得有助于减少对外蛋白水解消化的易感性。可通过重组蛋白表达或体外翻译***来产生肽和多肽(Sambrook等,"Molecular cloning:A laboratory manual",2001,3^rd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。可通过如由Lu等(1981)J.Org.Chem.46,3433以及其中的参考文献公开的Fmoc聚酰胺模式的固相肽合成来合成肽。

适合地，在根据本发明的第一方面使用的Fc蛋白中，每个免疫球蛋白G重链恒定区包含与天然免疫球蛋白G重链恒定区的氨基酸序列相比修饰的氨基酸序列，以修饰Fc受体结合部分对至少一种Fc受体的亲和力。典型地可增加Fc受体结合部分对低亲和力抑制性和/或活化性Fcγ受体的亲和力。

已经在生化研究和结构研究中使用野生型和突变Fc分析了IgG和Fc受体之间的相互作用。一个共识表明，用于结合Fc受体的一些区域位于铰链区最接近CH2结构域的部分并位于毗邻铰链的CH2结构域的氨基端，包括例如残基233至残基239(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser)。在这个区域内的突变可导致与Fc受体的改变的结合。此区域表现为负责与Fc受体的直接相互作用的一些(Woof JM和Burton D,Nature Reviews Immunology2004,4:89-99)。进一步进入CH2结构域并远离铰链的为可至少在某些环境下有助于Fc受体结合的其他残基，包括例如其表现为参与与Fc受体直接接触的人IgG1的Pro-329(EU编号)和表现为在人IgG1的Fc区内的N连接糖基化的唯一位点的Asn-297。在此残基处碳水化合物的存在可有助于与Fc受体的结合。

活化性Fcγ受体为如上描述的；在人中，低亲和力活化性Fcγ受体为FcγRIIA/C和FcγRIIIA。FcγRI为高亲和力活化性受体。FcγRIIB为抑制性人Fc受体。由于FcγRIIB和FcγRIIA/C的配体结合性质相同，增加对FcγRIIA/C的亲和力而同时减少对FcγRIIB的亲和力是不可能的。Lazar等(2006)PNAS 103:4005-10描述了在人IgG的Fc部分中的突变，其影响了与不同Fc受体的结合亲和力。与FcγRIIIa结合的野生型IgG具有252nM的K_D；I332E突变体的K_D为30nM且S239D/I332E突变体的K_D为2nM。A330L突变与S239D/I332E的组合增加了FcγRIIIa亲和力并降低了FcγRIIb亲和力。Shields RL等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604描述了在人IgG1的Fc部分中的突变，其影响了与不同Fc受体的结合亲和力。S298A突变增加了对FcγRIIIa的亲和力并减少了对FcγRIIA的亲和力；E333A突变增加了对FcγRIIIa的亲和力并减少了对FcγRIIA的亲和力；突变K334A增加了对FcγRIIIa的亲和力。可单独地使用或组合使用以上突变的任何或全部。可通过常规方法鉴定其他适合的突变。

Fc受体结合部分对CD22或DC-SIGN/SIGN-R1的亲和力可通过增加Fc受体结合部分上结合的唾液酸的量来增加。典型地，这通过增加N297聚糖上末端唾液酸残基的量或比例来实现，其可在翻译之后被添加到内质网中的Fc肽。

可适合地进行其他突变以提高Fc受体结合部分的效力。适合地，每个免疫球蛋白G重链恒定区包含与天然免疫球蛋白G重链恒定区的氨基酸序列相比修饰的氨基酸序列，以通过增加Fc受体结合部分对于新生Fc受体的亲和力来适合地增加多聚蛋白的体内半衰期。增加血清持续性允许更高循环水平、更少施用频率和减少的剂量。这可通过增强Fc区与新生FcR(FcRn)的结合来实现。表达在内皮细胞表面上的FcRn以pH依赖性的方式结合Fc并阻止其降解。尽管在实施例中描述的六聚体Fc不能结合人FcRn，它与小鼠FcRn结合非常良好。氨基酸取代M252Y/S254T/T256E和/或H433K/N434F可被引入到Fc受体结合部分以增加IgG的体内半衰期而不过度地影响FcγR相互作用(Vaccaro C,等(2005)Nat.Biotech.23:1283-1288)。另外地或可选地，可重新引入H310。

与单个Fc受体被单体Fc蛋白或IgG结合相比，多个Fc受体被聚合体Fc蛋白结合可引起不同细胞内信号传导现象。多个Fc受体被多聚蛋白结合可在阻断Fc受体对其他配体结合方面更为有效，特别是在低亲和力Fc受体的情况下。多聚蛋白的效力可对不形成聚合体的单体单元的效力以许多方式来比较。在此类测试中，聚合体Fc蛋白的单体单元对于给定Fc受体单独地具有相同的亲和力是典型的，因为单体单元不形成聚合体。

多聚蛋白将对低亲和力受体包括Fc受体具有比对照单体单元更大的总亲和力。它们还可对于FcRL、FcRn、CD22、DC-SIGN或其他Fc受体具有更大的总亲和力。总亲和力是多价相互作用的整体结合力。在Fc结合区和Fc受体之间的相互作用具有特征性亲和力，而对于每个相互作用，相互作用的总亲和力几乎按几何级数地增加。对于低亲和力Fc受体，结合力的增加可允许与多聚蛋白的生物学相关的相互作用，其不可以通过单体单元或二聚体单元实现。与对照单体蛋白的结合相比，通过多聚蛋白的多价结合导致了如通过平衡常数(L/mol)测量的在稳定性上的可观增加。例如，在Fc部分和Fc受体之间的典型单价相互作用可具有约10⁴L/mol的平衡常数。六价相互作用可提供约10¹¹L/mol的平衡常数。平衡常数可基于Fc部分和Fc受体而变化。然而，六聚体蛋白将典型地展示在结合能中的增加，与对照单体蛋白相比增加多达约10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍或甚至大于10⁶倍。对于与FcRL5、FcRn、CD22或DC-SIGN的多价相互作用，可预计结合能和平衡常数的类似增加。为了描述总亲和力和亲和力，参见教科书Roitt,Brostoff和Male的Immunology,2^nd edition 1989。

如以上描述的，可通过表面等离子体共振分析(Biacore)将多聚蛋白的Fc受体的总亲和力与不形成聚合体的单体单元的总亲和力比较。

已发现，将体积大的抗原(bulky antigen)融合到多聚蛋白可减少多聚蛋白与Fc受体结合的能力(Mekhaiel等,2011a)。适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白不包含(例如通过融合或缀合)减少与FcγRII的结合总亲和力的部分。可通过比较包含被测试部分的多聚蛋白的给定受体的结合总亲和力与通过缺少该部分的多聚蛋白取得的总亲和力来确定对总亲和力的影响。典型地，如果亲和力减少多于10倍、或多于5倍或多于2倍，包含该部分的多聚蛋白可以是不适合的。与FcγRII减少的结合总亲和力也将指示与其他Fc受体包括FcγRI或FcγRIII的减少的结合总亲和力。可选地，可测试这些其他受体的任一个或两个的结合总亲和力。

如在实施例3中所述的，多聚蛋白对低亲和力受体的增加的总亲和力可使用IVIG疗法潜在的生物学机制，特别是由低亲和力受体FcγRIIB、FcγRIIIA、CD22和DC-SIGN所介导的那些机制。对于示例性六聚体蛋白还观察到了对高亲和力IgG受体FcγRI的增加的总亲和力。FcγRI牵涉在炎性自身免疫性疾病中(Hussein OA等,Immunol Invest 2010,39:699-712)且FcγRI定向免疫毒素抑制关节炎(Van Vuuren AJ等,J.Immunol 2006176:5833-8)。而且微小RNA-127通过靶向FcγRI抑制肺部炎症(Xie T等,J.Immunol 2012188,2437-44)。此外，在US 2004/0062763(Temple Univeristy；Mosser)中已经提出了在巨噬细胞上FcγRI的连接以诱导抗炎性细胞因子IL-10的产生。因此，尽管FcγRI不被认为是IVIG效果的基础，在本发明的上下文中FcγRI的连接也可具有有益效果。

多聚蛋白的免疫调节性质由在Fc受体结合部分与Fc受体和/或免疫***的与Fc部分相互作用的其他受体和组分之间的相互作用产生。根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分,或当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分。与提供免疫抑制剂诸如TNF受体的治疗方法不同，本文所述的多聚蛋白依赖于不同治疗机制，其可使得它们更广泛地可用于治疗。多聚蛋白都不依赖于抗原特异性免疫抑制作用，其限制了将其他治疗方法应用于特定疾病。

“免疫调节部分”是当共价连接到本文所述的多聚蛋白时，或当在缺少所述多聚蛋白情况下存在时，在健康或患病哺乳动物受试者中具有免疫调节活性的剂。

“免疫调节活性”是指在受试者中改变免疫应答以增加或减少免疫***组分诸如细胞因子或抗体；或增加或减少免疫功能诸如抗原递呈。“调节”部分可以是例如趋化因子或趋化因子受体、细胞因子或细胞因子受体、Toll样受体(TLR)、急性期蛋白(acute phase protein)、补体成分、免疫受体、CD分子或信号传导分子。已知此类剂在缺少多聚蛋白时在健康或患病哺乳动物受试者中拥有免疫调节活性。此类剂的实例描述于免疫学教科书诸如(Abbas和Lichtman,Cellular and Molecular Immunology,Elsevier Saunders,5^th Edn,2005)，且技术人员可在相关文献中发现另外实例。因此，本发明排除了包含任何这些剂的缀合物或融合蛋白和多聚蛋白。特别地，排除了发现于称为依那西普、alefacept、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普、阿塞西普、briobacept、利纳西普或阿柏西普的单体Fc融合蛋白中的免疫调节部分。诸如Fab或scFv的抗体片段也可被认为是“免疫调节部分”。此类片段可与免疫***的组分结合，因此具有免疫调节活性。当融合或缀合到聚合体蛋白的单体单元时，抗体片段可重现完整抗体结构，即Fc和抗原结合区。当共价地连接到多聚蛋白时，此类剂可以比当孤立地存在时具有更加显著的免疫调节活性。特别地排除了在治疗性抗体中发现的免疫调节部分，所述治疗性抗体诸如结合TNFα的称为Remicade的抗体。适合地，除了免疫球蛋白G重链恒定区和任选地铰链区之外，多聚蛋白不包含任何抗体部分，无论其是否是免疫调节性的。

如以上所提到的，多聚蛋白的免疫调节性质由Fc受体结合部分和Fc受体和/或免疫***的与Fc部分相互作用的其他受体和组分之间的相互作用引起。Fc受体结合部分的修饰诸如修饰的糖基化，不被认为是另外的免疫调节部分，而是作为Fc受体结合部分的组分，所述Fc受体结合部分的修饰修饰与Fc受体、凝集素或其他免疫***组分的结合。因此，它们没有从本发明中排除。

用于免疫调节部分的适合的实验测试为提供缺少假定的免疫调节部分的多聚蛋白和包含假定的免疫调节部分的多聚蛋白并在实施例4中所述在ITP小鼠模型中测试任一个蛋白的效力。如果假定的免疫调节部分拥有免疫调节活性，其可改变应答的参数。例如，它可改变血小板回收的比率或程度。

“抗原”是与抗体或TCR特异性结合的分子。与抗体结合的抗原包括所有类别的分子，且被称为B细胞抗原。分子的示例性类型包括肽类、多肽类、糖蛋白类、多糖类、神经节苷脂类、脂类、磷脂类、DNA、RNA、其片段、其部分和其组合。TCR仅结合与MHC分子复合的蛋白的肽片段；其源自的肽配体和天然蛋白被称为T细胞抗原。“表位”是指B细胞或T细胞抗原的抗原决定簇。当B细胞表位是肽或多肽的情况下，它典型地包含三个或更多个氨基酸，一般至少5个且更通常至少8个到10个氨基酸。氨基酸可以在多肽的一级结构中是毗邻的氨基酸残基，或可在折叠蛋白中成为空间并列的。T细胞表位可与MHC I类或MHC II类分子结合。典型地，MHC I类结合T细胞表位为8个到10个氨基酸长。II类分子结合可为10个到30个残基长或更长的肽，最佳长度为12个到16个残基。与MHC分子的特定等位形式结合的肽包含允许肽与等位MHC分子之间互补的相互作用的氨基酸残基。假定的T细胞表位与MHC分子结合的能力可被预测并实验性地确认(Dimitrov I等,Bioinformatics.2010 Aug15；26(16):2066-8)。

根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白不包含当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分。通过“包含”，我们包括了共价连接到至少一种肽单体单元的抗原，诸如通过化学缀合或重组融合。典型地，多聚蛋白不包含当向哺乳动物受试者施用时无论通过引起免疫抑制或免疫刺激的用作抗原的部分。

通过“抗原特异性免疫抑制”，我们包括了抗体应答的抑制和/或T细胞应答的抑制。T细胞应答可通过抗原反应性T细胞的克隆缺失、无反应性或抑制，诸如通过调节性T细胞的诱导来抑制。T细胞应答还可从较为侵袭性的形式偏离为较不侵袭性的形式，例如从Th1类型应答到Th2类型应答。

对引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分的适当测试为提供缺少抗原部分的多聚蛋白和包含抗原部分的多聚蛋白并在待治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的哺乳动物受试者中测试任一蛋白。可在相同哺乳动物受试者中顺序地施用缺少或包含抗原的多聚蛋白，且在用任一蛋白治疗之后，监测了受试者对抗原的免疫应答。可选地，类似受试者的组可用缺少抗原的多聚蛋白或包含抗原的多聚蛋白治疗。可使用常规技术以鉴定并监测对抗原的免疫应答，无论是B细胞应答或T细胞应答。如果与包含抗原的多聚蛋白相比，在受试者中施用缺少抗原的多聚蛋白之后，对抗原的免疫应答的程度或类型没有区别，那么当向哺乳动物受试者施用时抗原不引起抗原特异性免疫抑制。因此，排除了多聚蛋白的抗原部分引起的免疫抑制的抗原特异性手段。这不意味着，对特定抗原的免疫应答可以不响应于治疗降低。对自身免疫性疾病中涉及的自身抗原的免疫应答可响应于治疗降低，然而这可通过缺少抗原的多聚蛋白以及同样地通过包含抗原的多聚蛋白来实现。可使用类似测试以鉴定多聚蛋白是否包含向哺乳动物受试者施用时作为抗原的部分。在此类测试中，多聚蛋白施用的剂量、制剂和特征是相同的以允许有意义的比较。

可选地，可在健康哺乳动物受试者中测试多聚蛋白以确定是否存在作为抗原的部分。此类测试在鉴定抗原特异性免疫刺激中特别有用。适合地，抗原特异性免疫刺激不出现。此类测试可以在确认多聚蛋白的非免疫原性中是有用的。可以测试并非天然地发现于哺乳动物受试者中的多聚蛋白的组分诸如接头肽的免疫原性和选择的非免疫原性组分，所述哺乳动物受试者将被施用该多聚蛋白。在此类测试中，施用了多聚蛋白且，在一段适当的时间例如两周之后以允许针对假定的抗原发展免疫应答，使用ELISA测试了血液样品以确定针对假定的抗原的抗体水平。

还可使用适合的动物模型来测试引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分或当向哺乳动物受试者施用时用作抗原的部分的存在。例如，可使用在实施例4中所述的ITP小鼠模型。然后，在施用缺少抗原或假定抗原的多聚蛋白或包含抗原或假定抗原的多聚蛋白之后，测试了对抗原的免疫应答的程度和类型。

适合地，尽管用于根据本发明第一方面使用的多聚蛋白能够与C1q结合，它不会激活补体的经典途径(Mekhaiel等,2011a)。如在Lewis M等,Mol.Immunol 2008,45:818-827中所述的并如在实施例3中所进行的，可通过包被多聚蛋白或对照IgG或单体Fc的孔上的ELISA来评价补体结合和活化。用在碳酸盐缓冲液,pH 9中100μl蛋白过夜包被96孔板的孔。洗涤之后，室温下用包含0.5mM MgCl₂、2mM CaCl₂、0.05％吐温-20、0.1％明胶和0.5％BSA的佛罗那缓冲盐水中1/100稀释的100μl人血清孵育板1小时。洗涤之后，用100μl的1/800稀释的绵羊抗C1q-HRP(Serotec)或1/500稀释的生物素缀合的抗C5b-9(Quidel,Santa Clara,CA)孵育板，随后在室温下用PBS-T,0.5％BSA中1/1000稀释的100μl链霉亲和素-HRP(Dako)孵育1小时。认为低于0.4的吸光度值是阴性的。在用于C1q结合的典型检测中，当用2μg/ml以上、或4μg/ml以上或10μg/ml以上的多聚蛋白包被板时取得了0.4以上的吸光度值。在用于指示补体活化的C5b-9沉积的典型检验中，当用多达2μg/ml、多达4μg/ml、多达10μg/ml、多达20μg/ml或多达50μg/ml的多聚蛋白包被板时，没有取得0.4以上的吸光度值。

适合地，根据本发明第一方面使用的多聚蛋白能够以足够的总亲和力结合蛋白G或蛋白A，以允许两个底物的任一个被用作纯化多聚蛋白的捕捉剂。蛋白G结合于Cγ2-Cγ3结构域间区域中并在实施例中用于纯化六聚体和单体Fc蛋白。与相同区域结合的其他受体也可结合多聚蛋白，诸如TRIM21(Mallery DL等,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107(46):19985-19990；McEwan WA等201,BioEssays.33:803-809)。TRIM21被认为在去除病毒和对病毒的免疫性方面是重要的。

适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白具有从约230kD到400kD的分子量。例如，它可具有约230kD、240kD、250kD、260kD、270kD、280kD、290kD、300kD、310kD、320kD、330kD、340kD、350kD、360kD、370kD、380kD、390kD或400kD的分子量。在此大小范围的聚合体对于哺乳动物细胞比具有更大分子量的分子，像约750kDa的IgM、或像需要表达并组装两个不同多肽链(轻链和重链)的抗体的复合物蛋白，典型地更容易合成并组装。包括抗体的具有多个不同多肽链的蛋白更难以在制造中产生同质性。

适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白具有约20nm、诸如从15nm到25nm或多达30nm的直径。已经证明20nm颗粒比45nm和100nm纳米颗粒更容易递送到淋巴***，这对于功能和组织渗透可以是重要的(Reddy等,2007)。更小颗粒也更容易通过重组表达技术制造。

作为分子大小和直径的结果，多聚蛋白典型地具有良好程度的组织渗透，其可帮助其治疗效果(Vollmers和Brandlein,2006)。与小分子或单体相比，聚合体将天然地显示出随时间更缓慢的渗透，然而在静脉内(i.v.)或腹腔内(i.p.)施用之后，甚至完整IgM分子(750kDa)到达小鼠中的植入肿瘤和患者中的原发性肿瘤和转移瘤中(Vollmers等,1998a,b,Oncol Rep 5:549-552；Oncol Rep 5:35-40)。通过标准免疫组织化学技术可证明，当腹腔内注射时五聚体IgM可达到并皮下收缩在动物后背上的移植的肿瘤(所有Vollmers参考文献，同上)。这显示，大至750kDa的分子能够离开腹膜腔，进入循环并到达植入的肿瘤。在它们的途中，在分子到达其靶之前，它们不得不穿过***和血管的若干内皮障碍，Jain等,2001J.Control.Release74:7-25。总之，预测根据本发明使用的多聚蛋白，包括示例的六聚体Fc蛋白，将显示出在更大的IgM(几天)和更小的IgG(几分钟)之间的中间渗透时间(几小时)。对于像ITP需要生物活性的状况，中间渗透和积聚可比优选快速渗透的情况下使用抗体作为载体的治疗有优势。

适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白具有相对于细胞表面为顺式(每个Fc在平行于细胞表面的相同平面中且每个Fc的长轴为垂直于细胞表面)的空间定向，而不是反式的。顺式定向允许在相同细胞上连接多个受体，因为受体结合部分全部紧密地与相同细胞相对。相反地，在其中Fc在与细胞表面垂直的平面中的反式定向可导致两个细胞通过相同蛋白交联。以顺式定向，受体结合的生物效果集中于特定细胞，并因此更可能为富有成效的。

根据本发明的第一方面，预期多聚蛋白用于治疗自身免疫性疾病或炎性疾病。“自身免疫性疾病”包括在其中免疫***攻击身体自身组织的任何疾病。“炎性疾病”包括通过特征为破坏性炎症的任何疾病，其可为复发的或慢性的且不涉及正常组织修复。此类疾病特别地包括在其中先天免疫***引起可以因为未知原因的炎症的“自身炎性疾病”。自身炎性紊乱特征为导致此类症状诸如发烧、皮疹或关节肿胀的炎症强烈发作。这些疾病还带来淀粉样变性的风险，淀粉样变性是在重要器官中血液蛋白潜在致命聚集。

用于治疗的适合自身免疫性疾病或炎性疾病包括那些可用静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗的疾病。这些可以是当前常规地用IVIG治疗的或已经发现IVIG在临床上有用的疾病，诸如自身免疫血细胞减少症、格林-巴利综合征、重症肌无力、抗因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎和葡萄膜炎(参见,van der Meche FG等,Lancet i,406(1984)；Sultan Y等,Lancetii,765(1984)；Dalakas MC等,N.Engl.J.Med.329,1993(1993)；Jayne DR等,Lancet 337,1137(1991)；LeHoang P等,Ocul.Immunol.Inflamm.8,49(2000))。IVIG典型地用于治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)、川崎病、格林-巴利综合征和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Orange等,2006,JAllergy Clin Immunol 117:S525-53)。IVIG还越来越多地用于治疗对主流治疗没有响应的多种其他自身免疫性疾病，包括关节炎、糖尿病、肌炎、克罗恩结肠炎和***性红斑狼疮。

适合于治疗的自身免疫性疾病或炎性疾病包括自身免疫血细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、哮喘、川崎病、格林-巴利综合症、史蒂芬斯-强森综合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、克罗恩结肠炎、糖尿病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力、抗因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎、葡萄膜炎或阿尔茨海默氏病。

将被治疗的状况可包括具有在细胞因子网络中失衡的炎性疾病、由致病自身抗体或自身侵袭性T细胞介导的自身免疫紊乱、或慢性复发性自身免疫、炎性或感染性疾病或过程的急性期或慢性期。此外，包括具有炎性组分的其他医疗状况诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中风、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒相关炎症、肾上腺脑白质营养不良、和癫痫性紊乱、特别是那些被认为与包括Rasmussen综合征、West综合征和Lennox-Gastaut综合征的病毒后脑炎相关的癫痫性紊乱。

将被治疗的状况可以是血液免疫疾病，例如特发性血小板减少性紫癜、同种免疫性/自身免疫性血小板减少症、获得性免疫血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、细小病毒B19相关红细胞再生障碍、获得性抗因子VIII自身免疫、获得性血管性血友病(acquired von Willebrand disease)、多发性骨髓瘤和意义不明确的单克隆丙种球蛋白病、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍、Diamond-Blckfan贫血、新生儿溶血病、免疫介导的中性粒细胞减少症、血小板输注不应性、新生儿输血后紫癜、溶血性尿毒综合征、***性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜、或埃文氏综合征。

可选地，可治疗神经性免疫疾病，例如格林-巴利综合症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、副蛋白血症的IgM脱髓鞘性多发性神经病(Paraproteinemic IgM demyelinating Polyneuropathy)、兰伯特-伊顿肌无力综合征、重症肌无力、多灶性运动神经病、与抗GM1抗体有关的下位运动神经元综合征、脱髓鞘、多发性硬化和视神经炎、僵人综合征、具有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑退化、副肿瘤性脑脊髓炎、具有抗Hu抗体的感觉神经病、癫痫、脑炎、脊髓炎、脊髓病特别是与人T细胞嗜淋巴病毒-1相关的脊髓病、自身免疫性糖尿病神经病变、或急性特发性自主神经障碍神经病(Acute Idiopathic Dysautonomic Neuropathy)或阿尔茨海默氏病。

可治疗风湿性疾病，例如川崎病、类风湿关节炎、费尔蒂综合征、ANCA阳性血管炎、自发性多发性肌炎、皮肌炎、抗磷脂综合征、复发性自发流产、***性红斑狼疮、幼年特发性关节炎、雷诺病、CREST综合征或葡萄膜炎。

可治疗皮肤免疫疾病，例如表皮坏死松解症、坏疽、肉芽肿、包括寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮、和落叶型天疱疮的自身免疫性皮肤起疱疾病、白癜风、链球菌中毒性休克综合征、硬皮病、包括弥漫性和有限的皮肤***性硬化症的***性硬化症、特应性皮炎或皮甾醇依赖性特应性皮炎。

可治疗肌骨免疫疾病，例如包涵体肌炎、坏死性筋膜炎、炎性肌病、肌炎、抗核心蛋白聚糖(BJ抗原)肌病、副肿瘤坏死肌病、X连锁空泡肌病、青霉胺诱导的多发性肌炎、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病或心肌病。

可治疗胃肠免疫疾病，例如恶性贫血、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、疱疹样皮炎、隐源性肝硬化、反应性关节炎、克罗恩病、惠普尔氏病、溃疡性结肠炎或硬化性胆管炎。

疾病可以是例如感染后疾病的炎症、哮喘、伴随抗β细胞抗体的1型糖尿病、干燥综合征、混合性***病、阿狄森氏病、Vogt-小柳-原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada Syndrome)、膜增生性肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's syndrome)、Graves病、桥本氏甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、微多动脉炎(micropolyarterits)、丘-斯综合征、结节性多动脉炎或者多***器官功能衰竭。

用于治疗的示例性疾病为特发性血小板减少性紫癜(ITP)。

在给定物种中使用的多聚蛋白典型地包括来自该物种的IgG的Fc部分，且还可以包括来自该物种的IgA或IgM的尾片段部分。尽管可治疗其他哺乳动物且实际上可治疗鸟类、两栖动物类和爬行动物类，典型地待治疗的哺乳动物受试者为人。

典型地，提供多聚蛋白作为适当地配制的治疗组合物。适合地，提供它们作为液体溶液或悬浮液的可注射剂(injectables)；还可制备适合用于在注射之前在液体中成溶液、或成悬浮液的固体形式。还可以乳化制剂。此外，如果期望，可包括少量辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂。

载体可优选为液体制剂，且优选为缓冲的等渗含水溶液。适合地，治疗组合物具有生理的或接近生理的pH。适合地，它具有生理的或接近生理的渗透性和盐度和/或无菌且不含内毒素。它可包含氯化钠和/或醋酸钠。药学上可接受的载体还可包括赋形剂，诸如稀释剂等等和添加剂诸如稳定剂、防腐剂、增溶剂等等。如本文中使用的，术语“药学上可接受的”是指美国或欧洲或其他政府的管理机构所批准的或在美国药典或其他一般公认的药典中列出用于在人中使用的。

药物组合物可以被配制用于以任何适当方式的施用，包括例如局部(例如，经皮或眼)、口服、含服、经鼻、经***、经直肠或肠胃外施用。本文使用的术语肠胃外包括皮下、皮内、血管内(例如，静脉内)、肌内、脊柱、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射、以及任何相似的注射或输注技术。适合用于口服使用的形式包括例如，片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。本文提供的组合物可配制为冷冻干产品。典型地，配制组合物用于静脉内施用。

含水悬浮液包含与适于制备含水悬浮液的赋形剂混合的活性成分。此类赋形剂包括悬浮剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hydropropylmethylcellulose)、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和***树胶)；和分散剂或润湿剂(例如，天然产生的磷脂类诸如卵磷脂、环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物诸如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂族醇类的缩合产物诸如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇、环氧乙烷与源自脂肪酸的部分酯类和己糖醇的缩合产物诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、或环氧乙烷与源自脂肪酸的部分酯类和己糖醇酐的缩合产物诸如聚乙烯失水山梨醇单油酸酯)。含水悬浮液还可包含一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯、或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

制剂可用于局部或体表施用，诸如用于体表应用到皮肤、伤口或黏膜诸如眼中。用于体表施用的制剂典型地包含与活性剂组合的体表媒介物，含有或不含另外任选的组分。适合的体表媒介物和另外组分在本领域中是公知的，且媒介物的选择将取决于特定物理形式和递送模式是明显的。体表媒介物包括水；有机溶剂诸如醇类(例如，乙醇或异丙醇)或甘油；二醇类(例如，丁二醇、异戊二醇或丙二醇)；脂肪族醇类(例如，羊毛脂)；水和有机溶剂的混合物以及有机溶剂诸如醇和甘油的混合物；脂质基材料，诸如脂肪酸、酰基甘油类(包括油类，诸如矿物油，以及天然或合成来源的脂肪)；磷酸甘油酯类，鞘脂类和蜡；蛋白基材料，如胶原和明胶；硅酮基材料(包括非挥发性和挥发性的)；和烃基材料，诸如微海绵和聚合物基质。

药物组合物可配制为吸入制剂，包括喷雾剂、雾剂或气雾剂。对于吸入制剂，可通过本领域技术人员已知的任何吸入方法递送本文提供的化合物。此类吸入方法和装置包括但不限于带有诸如CFC或HFA的推进剂或生理上且环境上可接受的推进剂的计量剂量吸入器。其他适合的装置为气动吸入器(breath operated inhaler)、多剂量干粉吸入器和气雾剂喷雾器。用于所述方法中的气雾剂制剂典型地包括推进剂、表面活性剂和助溶剂且可装到由适合的计量阀密封的常规气雾剂容器中。

吸入剂组合物可包含含有活性成分的适合用于雾化和支气管内使用的液体或粉末组合物、或通过气雾剂单元分配计量剂量施用的气雾剂组合物。合适的液体组合物包含在含水、药学上可接受的吸入溶剂，例如等渗盐水或抑菌水中的活性成分。借助于泵或挤压致动雾化喷雾分配器，或通过引起或使得必要剂量的量的液体组合物被吸入到患者的肺中的任何其他常规手段施用溶液。其中载体是液体的作为例如经鼻喷雾或经鼻滴剂的用于施用的合适剂型包括活性成分的水性溶液或油性溶液。

其中载体是固体的适合于经鼻施用的制剂或组合物包括具有例如在20到500微米的范围的粒径的粗粉末，其以在其中施用嗅剂(即，通过从紧密接近鼻子的粉末的容器穿过鼻腔的快速吸入)的方式施用。通过例证的方式，适合的粉末组合物包括与乳糖或支气管内施用可接受的其他惰性粉末彻底混杂的活性成分的粉末化制品。粉末组合物可通过气雾剂分配器施用或装到易碎胶囊中，其可由患者***到穿刺胶囊并吹出粉末到适合于吸入的稳定气流中的装置中。

可通过身体和生理因素诸如体重、状况的严重性、被治疗的疾病类型、先前或并行治疗干预、患者的特发症和施用的途径确定向哺乳动物受试者施用的组合物的实际剂量的量。在任何情况下，负责施用的医师将确定在组合物中活性成分的浓度和对个体受试者的适当剂量。

药物组合物可包含，例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，例如，活性化合物可构成单元重量的约2％到约75％之间、或在约25％到约60％之间、和可从此得出的任何范围。在其他非限制性实例中，剂量还可包含每次施用从约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、和可从此得出的任何范围。有效多聚蛋白剂量一般从约1％到约20％的有效IVIG剂量。取决于被治疗的状况，有效IVIG剂量可一般在约100mg/Kg到约2克/Kg的范围。

在向人类患者施用之前，可在动物模型中测试多聚蛋白和治疗组合物的适合性。对于适合的动物模型，动物中的Fc受体能够与多聚蛋白的Fc受体结合部分结合是重要的。已知人免疫球蛋白可与小鼠Fc受体结合。例如，人IgM与小鼠Fcμ受体结合。Pleass RJ,2009Parasite Immunology 31:529-538报道了哪种Fc受体可结合来自哪种物种的哪种抗体。然而，在多聚蛋白包含源自人免疫球蛋白重链序列的Fc结合部分的情况下，使用表达人Fc受体的转基因小鼠是有优势的。适合的转基因小鼠表达与人IgG1和IgG3结合的人FcγRI受体(CD64)(Heijnen IA等,J Clin Invest.1996Jan15；97(2):331-8)。表达低亲和力FcR的转基因小鼠也是可获得的，所述低亲和力FcR诸如FcγRIIA(CD32)(McKenzie SE 2002,Blood Rev 16:3-5)。

适合的小鼠模型为在实施例4中描述的ITP小鼠模型。其他适合模型包括小鼠中胶原诱导的关节炎(Jain等,2012)或非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型(Inoue,Y.等.(2007)J.Immunol.179,764-774)。

根据本发明的第二和第三方面，提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法。

根据第二方面，通过施用包含5个、6个或7个多肽单体单元的多聚蛋白治疗受试者；其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分组成，所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区；和任选地，连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。

根据第三方面，通过施用包含5个、6个或7个多肽单体单元的多聚蛋白治疗受试者；其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分和尾片段区组成；其中Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区；和任选地连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；其中每个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；且其中，尾片段区融合到多肽单体单元的两个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的每个，并促进单体单元组装成聚合体。

对于第二或第三方面的任一个，术语“免疫球蛋白G重链恒定区”为如关于本发明的第一方面所描述的。免疫球蛋白G重链恒定区典型地作为单体单元通过二硫键相缔合，诸如在天然抗体中发生的。可选地，两个恒定区可作为具有中间接头区的氨基酸单链，即作为单链Fc(scFc)来产生。

借助于包含半胱氨酸残基的每个免疫球蛋白G重链恒定区形成了根据本发明的第二方面使用的多聚蛋白，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。尾片段未被包括。与之相比，根据本发明的第三方面使用的多聚蛋白包括尾片段，其促进单体单元组装成聚合体。尾片段为如关于本发明的第一方面描述的。可在尾片段区和免疫球蛋白重链恒定区之间提供短接头序列。

关于第二和第三方面，当单体单元已经组装成聚合体，Fc受体结合部分在多聚结构中排列，其被空间定向以允许每个Fc受体结合部分与Fc受体结合。每个单体单元的Fc受体结合部分如关于本发明的第一方面所述。在Fc受体结合部分包含人IgG同种型或其变体的免疫球蛋白重链恒定区的情况下，它将典型地与人Fcγ受体(FcγRI、FcγRII和FcγRIII)和/或人FcRL5和/或CD22和/或DC-SIGN结合。多聚蛋白将比对照单体单元(其不会聚合因为它们缺少必需的半胱氨酸残基)具有对Fc受体更大的总亲和力。

根据本发明的第二或第三方面使用的多聚蛋白的免疫调节性质由Fc受体结合部分和Fc受体和/或免疫***的与Fc部分相互作用的其他受体和组分之间的相互作用产生。特别地，不需要另外的免疫调节部分；且不需要当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分。典型地，不存在当向哺乳动物受试者施用时作为抗原的部分。

关于本发明的第一方面描述了根据本发明的第二或第三方面使用的多聚蛋白的其他特征。典型地，尽管多聚蛋白可与C1q结合，它事实上激活补体的经典途径；典型地，它可结合蛋白G或蛋白A；典型地它具有从约230到400kDa的分子量；典型地，它具有约20nm的直径；典型的，它具有良好组织渗透度；且典型地，它具有关于细胞表面为顺式的空间定向。

如关于本发明的第一方面所述的，预期根据本发明的第二或第三方面使用的多聚蛋白治疗自身免疫性疾病或炎性疾病。

本发明的第四方面提供了包含5个、6个或7个多肽单体单元的多聚蛋白；其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区；其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；其中多聚蛋白不包含另外免疫调节部分，或当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分；其中每个多肽单体单元不包含融合到两个免疫球蛋白G重链恒定区中每个的尾片段区。

第四方面的多聚蛋白为如关于根据第一方面使用的多聚蛋白描述的，除了明确地排除了每个多肽单体单元包含融合到两个免疫球蛋白G重链恒定区的每个的尾片段区。典型地，单体单元不包含多肽区。多聚蛋白不包含尾片段区。

本发明的第五方面提供了由5个、6个或7个多肽单体单元组成的多聚蛋白；其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分组成，所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区；和任选地，连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；且其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。

第五方面的多聚蛋白为如关于根据本发明的第三方面使用的多聚蛋白所述的。

本发明的第六方面提供了包含编码如根据本发明第四或第五方面定义的多聚蛋白的多肽单体单元的编码部分的核酸分子。编码关于本发明的第一、第二或第三方面所述的多聚蛋白的多肽单体单元的核酸分子。

可利用常规重组DNA方法学用于产生多聚蛋白，如描述于例如(Sambrook等,"Molecular cloning:A laboratory manual",2001,3^rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。单体单元结构优选在DNA水平产生，并将产生的DNA整合到表达载体中，并表达以产生组装以形成多聚蛋白的单体单元。

本发明的第六方面的核酸分子包含编码部分，其包含以5'到3'方向的免疫球蛋白G重链恒定区或单链Fc(scFc)的编码序列。在适当实施方案中，后者与尾片段区的编码序列符合读框地融合。编码该编码序列的DNA可在其基因组构型中或其cDNA构型中。将理解，另外的编码序列可提供于重链和尾片编码序列之间以允许这些组分通过接头序列在表达蛋白中彼此分离。可包括编码接头序列的核酸，例如以允许并入有用的限制位点和/或允许重链区和尾片段编码区符合读框地转录。适合编码区可通过PCR扩增且使用标准技术操作(Sambrook等,同上)。与天然核酸序列相比的突变可通过重叠PCR(SOEing PCR)或定点诱变进行。

适合地，核酸分子的编码部分编码信号肽，其与多肽单体单元毗邻。这促进了表达的单体单元从宿主细胞中的分离。因此，核酸分子将包含编码部分，其包含以5'到3'方向的与单体单元的编码序列符合读框地融合的信号序列。编码信号序列的DNA部分优选编码引导单体单元分泌的肽区段且此后从单体单元的剩余部***解掉。信号序列为编码引发蛋白跨内质网的膜转运的氨基酸序列的多核苷酸。有用的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等.(1989)J.OF IMMUNOL.METH.,125:191)，抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等.(1980)NATURE 286:5774)，和本领域已知的其他任何信号序列(参见，例如，Watson(1984)NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12:5145)。

本发明的另外方面为包含本发明第六方面的核酸分子的表达载体；包含该表达载体的宿主细胞；和包含本发明第四或第五方面的多聚蛋白的治疗组合物。治疗组合物为如关于根据本发明第一方面使用的多聚蛋白所述。

如本文所述的核酸分子一般可为表达载体的部分。如本文所用的，术语“载体”被理解为意指包含能够并入宿主细胞且与宿主细胞基因组重组并整合到宿主细胞基因组、或自主地复制为附加体的核苷酸序列的任何核酸。此类载体包括线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒、RNA载体、病毒载体等等。病毒载体的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。如本文所用的，术语单体单元的“基因表达”或“表达”理解为意指DNA序列的转录、mRNA转录物的翻译、和任选地还有单体单元的分泌。

典型地，提供了用于表达载体的表达的宿主细胞。细胞可以为哺乳动物、鸟类、昆虫、爬行动物、细菌、植物或真菌细胞。哺乳动物细胞的实例包括但不限于人、兔、鸡、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞。典型的哺乳动物细胞包括骨髓瘤细胞、Sp2/0细胞、CHO细胞、L细胞、COS细胞、成纤维细胞、MDCK细胞、HT29细胞、HEK细胞、或T84细胞。优选的宿主细胞是CHO-K1。可使用标准技术将表达载体引入到宿主细胞，包括磷酸钙转染、核显微注射、DEAE-葡聚糖转染、细菌原生质体融合和电穿孔。

可通过以下方法制备多聚蛋白，包括：(1)制备包含编码单体单元的核酸分子的载体；(2)用载体转染宿主细胞；(3)培养宿主细胞以提供表达；和(4)回收多聚蛋白。

可回收多聚蛋白作为不同分子大小的产物。典型地，包含5个、6个或7个单体单元的期望多聚蛋白占包括单体单元的全部蛋白的以重量计至少40％。适合地，它占包括单体单元的全部蛋白的以重量计至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。可被回收作为期望的多聚蛋白的高比例的单体单元有助于生产效率。

如果通过宿主细胞分泌多聚蛋白，它可方便地利用其对Fc结合剂，诸如蛋白A或蛋白G、适合地蛋白G HiTrap(GE healthcare)柱的亲和力通过亲和色谱法来回收。可通过低pH从此类柱洗脱蛋白到中性缓冲液中。随后可用缓冲液交换进行透析。如果宿主细胞不分泌多聚蛋白，它可通过溶解细胞之后亲和色谱法来回收。

在以下实施例中将进一步详述本发明，但对其无任何限制。

实施例1：重组多聚Fc蛋白的产生

如以下制备了DNA构建体。市购可得的pFUSE-hIgG1-Fc2表达载体从InvivoGen获得，来源于Autogen Bioclear,Wiltshire,UK。表达载体包含来自IL2的信号序列的编码序列和其下游的来自人IgG1的Fc部分的编码序列。为了产生多聚蛋白，对人IgG1Fc部分的编码序列进行了两处改变。将来自IgM的18个氨基酸尾片段亚克隆到Fc部分的C端，并且在Cγ3结构域中进行了另外突变以分别转变309残基和310残基(从始到终为EU编号)为半胱氨酸和亮氨酸。

为了将IgM尾片段序列***到市购可得的载体中，设计了当一起退火时将形成具有编码Nhe1限制性位点的突出碱基的双链序列的引物，以允许将C端亚克隆到Fc。为了维持由质粒编码的蛋白的阅读框，去除现有的终止密码子，并且允许方便的限制位点，***了额外的DNA碱基。在IgM尾片段之前的是编码四个氨基酸Leu-Val-Leu-Gly的短5'接头；接头不影响IgM尾片段的功能。

通过温度梯度将引物1和引物2(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)一起退火，以形成包含Nhe1***物的双链IgM尾片段。

然后用限制酶Nhe1消化pFUSE载体，并连接以上的IgM尾片段***物以产生中间质粒。为了允许在Fc区之后翻译IgM尾片段，利用QuickChange II试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA,USA)通过定点诱变在后续步骤中突变存在的终止密码子。设计了引物3和引物4(SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)以去除此终止密码子并在Fc区和IgM尾片段之间产生AvrII限制酶位点。这产生了称为pFUSE-hIgG1-Fc-TP的质粒。

在人IgM中，位置309的半胱氨酸参与五聚体中IgM的两个单体之间形成二硫桥。为了更好地模拟人IgM的蛋白序列，再次如以上地通过定向诱变设计了引物5和引物6(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)以引入在位置309的半胱氨酸残基。在编码人IgM的蛋白序列的核苷酸序列与人IgG1-Fc的比对之后，另外地，决定用中性亮氨酸残基替换在位置310处的邻近组氨酸残基。并入两个突变的最终质粒被命名为pFUSE-hIgG1-Fc-TP-LH309/310CL。

还制备了编码缺少309/310突变和尾片段的人IgG1Fc的单体的对照质粒。

组装为聚合体的单体单元的核酸编码序列为SEQ ID No.7。

编码序列具有以下区域：

组装为聚合体的单体单元的氨基酸序列为SEQ ID No.8。

氨基酸序列具有以下区域：

在表达期间，IL2信号肽被裂解且如此终蛋白产物具有249个氨基酸。

如以下制备了多聚Fc蛋白和对照单体Fc蛋白。通过电穿孔用所选的质粒和阳性克隆转染CHO-K1细胞(European Collection of Cell Cultures)。在37℃/5％CO₂下，将细胞生长于补充有10％超低(ultra-low)牛IgG FCS、100IU/ml青霉素、和100μgml^-1链霉素(PAA)的DMEM完全培养基。在包含400μgml^-1Zeocin(Invivogen)的培养基中选择了稳定的转染子。通过使用山羊抗人IgG-Fc(Sigma-Aldrich:A0170)的夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了分泌Fc融合蛋白的克隆。在蛋白G-Sepharose(GEHealthcare,Little Chalfont,Bucks,UK)上从补充有包含超低IgG的FBS(Gibco)的DMEM中的大规模培养物纯化了Fc融合蛋白。汇集来自亲和纯化的洗脱的级分并使用AKTA_FPLC(GE Healthcare)在高效Superdex-20010/300GL柱上通过体积排阻色谱法分离。将洗脱的级分与已知的高MW凝胶过滤标准(Biorad)相比较。通过SDS-PAGE在天然6％Tris-甘氨酸凝胶上针对SeeBlue2预染色分子量标志物(Novex-Invitrogen)验证了蛋白的完整性。

多聚蛋白表达为约312kD和约100kD的复合物，与作为六聚实体和二聚实体的表达相一致。如在图1B中图示的，根据体积排阻色谱法，比例为约90％六聚体对10％二聚体(w/w)。

实施例2：重组多聚Fc蛋白的结构特征

通过在溶液中轻敲模式原子力显微术(AFM)使六聚Fc成像。六聚Fc形成了良好界定的结构的高度均匀群体。获得的AFM图像显示复合物在结构上是圆柱形(直径18±2nm(n＝51)，高度5.7±0.4nm(n＝54))。在图1A中显示了代表性图像。获得的图像还与从计算机模拟建模分析预测的尺寸一致，也在图1A中图示。

如下且如在Mekhaiel等,2011a中描述的进行了AFM。以0.2xHBSS缓冲液将在1xHBSS缓冲液中的hIgG1-Fc-LH309/310CL-TP储备溶液稀释到10μgml^-1且然后直接应用到白云母的新鲜切割段。在孵育20分钟之后，用0.2xHBSS缓冲液彻底冲洗样品以去除未吸附的分子。在运输至AFM以及在AFM中成像期间样品总在溶液中。用Nanoscope IIIa Multimode AFM(Veeco,Santa Barbara,CA)在0.5xHBSS缓冲液中使用具有0.32N/m的弹性常数的氮化硅悬臂(NP-S,Veeco Probes,Santa Barbara,CA)以轻敲模式进行成像。典型扫描率和最初振荡幅度分别为3Hz和20nm，且将应用的力最小化到约0.1nN。使用云母和黄金标线校准压电式扫描仪(9μm,D scanner,Veeco)。所有报道的图像在不同的尖端和不同快速扫描方向是可再现的。所有侧向尺寸从在半高处的全宽确定。

如下且如描述于Mekhaiel等,2011a中的进行分子(计算机模拟)建模。使用铰链区和尾片段区两者的随机链结构，从hIgG1Fc结构域的晶体结构中构建了单体。在组装为六聚体复合物之前，使每个单体能量最小化。使用VMD/NAMD使用CHARMM27力场进行所有能量计算。NAMD由在伊利诺伊大学厄本那-香槟分校(University of Illinois at Urbana-Champaign)的贝克曼高等科技研究所(Beckman Institute for Advanced Science andTechnology)中的伦理生物物理小组(Theoretical Biophysics Group)开发。为了构建六聚体，考虑了两个实验性观察结果：首先，复合物的化学计量是有限的(即，寡聚不会无限地进行)，以及第二，寡聚需要Cys309突变。前一观察结果表明，存在一些阻止进一步组装的物理原因，我们论述将其归因于复合物为环形，类似于以天然IgM复合物所观察到的那些。后一观察结果表明，毗邻单体通过这些C309残基连接。为了这些连接可能在环形复合物中，这些残基必须全部在共同平面之内，如在IgM五聚体中同源半胱氨酸残基的情况。关于这些Fc融合物，存在可满足这些标准的两种类型的寡聚物：星形，其中C309平面与Fc平面相同；和桶形，其中C309平面与Fc平面垂直。经过一个另外的标准，检查了两种模型以确定哪种模型产生具有更低能量的结构。由于这些Fc融合物没有进化为彼此相互作用而是借助于突变的C309残基连接，我们假定单体不经过显著结构变化而形成这些键，且因此对任何此类变化分配了能量罚分。这通过将骨架原子束缚在位于能量最小化的单体结构的位置的中心的谐波孔内(弹性常数，)来实现。通过监测此束缚电位对总的最小化的能量的贡献，可评价每个单体从单体形式改变构象的程度。在没有此束缚的情况下，在最初C309-C309距离的范围下评价的星形和桶形结构，将具有相似的最小化能量。然而在具有束缚的情况下，明显的是，在全部距离中，桶形结构比星形模型需要显著更少的结构变化以形成C309-C309二硫桥。因此，在没有此束缚的情况下，桶形结构实现了与星形结构相似的最小化的能量，然而需要到单体形式的更少变化。因此，我们偏向桶形结构用于六聚体。最终模型构建于最接近最初C309-C309间隔，在此处存在到单体结构的最小程度的结构变化。进行这些计算而没有任何尾片段连接到其他单体。如通过蛋白骨架的均方根偏差(root-mean-squared-deviation)判断的，在此最小化的模型中，尾片段连接到复合物内的其他随机选择的单体，且然后用TIP3水使整个复合物成溶剂化物、最小化并最终平衡。

实施例3：多聚Fc蛋白与免疫***的组分的相互作用

1.与Fc受体的相互作用

六聚体Fc与全部测试的Fc受体，即人FcγRI、FcγRIIA与FcγRIIB、以及小鼠FcγRI与FcγRIIB结合。与以微摩尔范围与相同受体结合的二聚体或单体相比，六聚体Fc以更高亲和力(在纳摩尔范围内)与低亲和力人FcγR(FcγRIIA^R131和FcγRIIB)结合。这确认了，更高等级聚合体事实上具有对已知参与保护免受ITP的受体改善的结合动力学。在SPR分析中，六聚体Fc以1.6x10¹⁰的KA(1/M)与人FcγRI结合。二聚体以6.4x10⁹的KA(1/M)结合。在图2中显示了通过ELISA，六聚体或单体Fc与Fc受体的结合。

可在ITP中起作用的另一个受体为FcγRIII(Park-Min等,2007)。可以预计六聚体Fc与人FcγRIII结合，因为FcγRIII在IgG上的结合位点与FcγRIIB和FcγRI的结合位点重叠(Sondermann等,2001)。IgG较低铰链区在与FcγRI和FcγRII的相互作用中起了关键作用，且所有FcγR共享共同的与IgG相互作用的模式看起来是可能的(Woof和Burton,2004)。事实上，基于FcγRIII—IgG Fc晶体结构，在IgG Fc与FcγRI以及FcγRII之间产生模式复合物是可能的，并从而使特定结合特征合理化(Sondermann等,2001)。使用FcγRIII的晶体结构对FcγRIII和六聚体Fc复合物的相互作用进行计算机模拟建模。模型显示，在针对FcγRIII的六聚体中的结合位点是最有可能暴露的，如同对于其他FcγR明显的。因此，我们预测FcγRIII将与六聚体Fc结合。

通过如下面并在Mekhaiel等,2011a中描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)确定了Fc蛋白与Fc受体的结合。用滴定量的PBS或碳酸盐缓冲液pH 9中Fc蛋白(50-0.3nM)包被微量滴定孔(Nunc)并在4℃孵育过夜，随后在室温(RT)下用4％脱脂牛奶(Acumedia)封闭1小时。用PBS/0.005％吐温20(PBS/T)pH 7.4洗涤孔4次，随后添加在4％脱脂牛奶PBS/0.005％吐温20(PBS/T)pH 7.4中稀释的GST或HIS-融合的hFcγRI、hFcγRIIA、hFcγRIIB、mFcγRI或mFcγRIIB并添加到孔。在室温下孵育2小时并如上洗涤之后，添加来自山羊的HRP缀合的多克隆抗GST(1:8000；GEHealthcare)并在室温下孵育1小时。如上洗涤孔，将100μl底物TMB(Calbiochem)添加到每个孔并孵育45分钟，随后添加100μl的0.25M HCl。使用Sunrise TECAN分光光度计(TECAN,Maennedorf,Switzerland)在450nm下测量吸光度。

如以下关于FcRn确切描述的，还通过表面等离子体共振分析分析了与人FcγRI的结合。

2.与已知在控制自身免疫中起作用的聚糖受体的相互作用

人DC-SIGN和其在小鼠中的同源物(SIGN-R1)已经证明通过结合发现于附着在IgG的Fc的N297上的聚糖上的末端唾液酸来参与控制ITP(Anthony等,2011；Samuelsson等,2001)。如下证明了六聚体Fc蛋白的唾液酸化。如前所述，还原的蛋白在4-12％Bis-Tris凝胶上运行并转移到PVDF膜并用1％Roche封闭剂封闭(Samuelsson等,2001)。然后，将用1/200稀释的生物素化的接骨木树皮凝集素(Sambucus nigra bark lectin)(VectorLaboratories)孵育膜，并用链霉亲和素-HRP(Serotec)显影。计算机模拟建模预测，发现于六聚体Fc蛋白的这些末端唾液酸将可用于结合DC-SIGN或SIGN-R1(图1)。

3.与新描述的可在控制自身免疫性疾病中起作用的受体的相互作用

人B细胞抑制性受体在控制自身免疫性疾病中是重要的(Pritchard和Smith,2003)。已经描述了在人B细胞表面上的IgG的两种抑制性受体：FcγRIIb(Daeron等,1995)和较新的FcRL5(Wilson等,2012)。尽管在人B细胞中FcRL5相对FcγRIIb冗余是可能的，通过FcγRIIb和SHP-1同时募集SHIP-1到FcRL5的潜力提供了反复活化B细胞的实质性障碍。有趣地，在天然B细胞上的FcRL5也被痘病毒MHC I类样immunoevasin所靶向，说明FcRL5在调节免疫中的重要作用(Campbell等,2010)。FcRL5仅结合复合的IgG并且不结合单体IgG且因此IVIG将不太可能以高的总亲和力结合此受体，尽管IVIG的多聚级分可以以高的总亲和力结合。总之，FcγRIIb和FcRL5可限制针对慢性病原体或自反应抗原的B细胞活化，且具有靶向两种受体的潜力的方法可证明在旨在控制B细胞活化的治疗中是有益的。

因此，我们调查了六聚体IgG1-Fc与人CD19+B细胞的结合(图3)。作为评价六聚体IgG1-Fc与参与控制自身免疫的免疫细胞的相互作用的第一步，我们通过FACS分析调查了六聚体IgG1-Fc结合人B细胞的能力。我们证明了，六聚体IgG1-Fc与从健康人志愿者的外周循环中纯化的CD19⁺B细胞结合。如在Mekhaiel等,2011a中描述的进行了流式细胞术。按照制造商的说明书通过Polymorphprep梯度离心从全血中纯化了人白细胞。在室温下用200μl包含50μg的六-Fc的FAC缓冲液(磷酸盐缓冲盐水、0.2％牛血清白蛋白、5％山羊血清)或仅用缓冲液孵育1x10⁵细胞1小时。用FAC缓冲液洗涤细胞两次并在4℃下用在200μl FAC缓冲液中1/500稀释的F(ab')₂山羊抗hIgG-Fc-藻红蛋白(PE)和山羊抗hCD19荧光素异硫氰酸盐(FITC)缀合的Ab(Southern Biotechnology)孵育1小时。用FAC缓冲液洗涤之后，在FACScan(BD Biosciences)上分析细胞。用CELLQuest软件(BD Biosciences)进行数据采集并用FlowJo 9.1版进行分析。考虑到CD19+B淋巴细胞前向和侧向散射图对它们进行了门控，并用PE标记的二抗监测了Fc蛋白的结合。在缺少Fc蛋白的情况下没有检测到PE-标记的二抗的结合。通过用特异性阻断FcRL5的单克隆抗体509F6在先孵育细胞证明了六聚体Fc结合人B细胞表面上的FcRL5，所述特异性阻断FcRL5的单克隆抗体509F6使六聚体Fc蛋白的结合脱落。

4.与新生FcRn的结合

我们调查了六聚体Fc与负责维持Ab在循环中的长半衰期的新生FcRn相互作用的能力(Mekhaiel等,2011a)。尽管FcRn在ITP中没有起显著的作用，它可在六聚体Fc介导的更多种慢性自身免疫性疾病的控制中起作用，其中长半衰期对于治疗是重要的。尽管六聚体Fc不能与人FcRn结合，它事实上与以前的观察相一致地以nM亲和力与小鼠FcRn结合(pH6下0.1-10nM)(Andersen等,2010)。这表明，对现有构建体的较小修改，例如Leu310回复为His310，可使与人FcRn的结合恢复。

通过表面等离子体共振分析并如以下以及在Mekhaiel等,2011a中所述的确定了Fc蛋白与FcRn的结合。使用Biacore 3000仪器(GE Healthcare)进行了表面等离子体共振(SPR)分析。使用如在由制造商提供的方案中描述的胺偶联化学反应将CM5传感器芯片的流动小室与重组形式的可溶性人或小鼠FcRn(hFcRn或mFcRn；约2200-3000RU)相偶联。通过注射10mM醋酸钠pH 5.0(GE healthcare)中2μgml^-1蛋白进行了偶联。使用pH 6.0下磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲液、0.15M NaCl、0.005％吐温20)或HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)作为运行缓冲液和稀释缓冲液。用25℃下20μl/min的流速，在pH 6.0或pH 7.4下将100nM的每种Fc融合蛋白注射到固定化受体上。使用pH 7.4下的注射HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)进行了表面的再生。在全部实验中，将数据调零且减去了参考小室。使用BIAevaluation 4.1软件(GE Healthcare)评价了数据。

5.与补体的结合

至今研究的大多数Fc融合物不结合C1q且不能活化后续补体级联(Czajkowsky等,2012)。Fc融合物不能活化补体很可能源自在融合物中缺少有助于完整IgG与C1q相互作用的Fab残基(Gaboriaud等,2003)。由于六聚体Fc缺少Fab残基，它不可能能够以与对天然抗体观察到的相同亲和力结合C1q。尽管如此，我们事实上调查了六聚体Fc结合C1q和活化经典途径的能力(Mekhaiel等,2011a)。与二聚体相比，六聚体Fc几乎不结合C1q，二聚体转而比完整单体IgG结合更差，这一等级反映在C5-9末端复合物的检测中相称的减少。即使当腹腔注射施用这些剂到小鼠时或当与明矾一起皮下施用时，在注射时进行观察，还是存在完全缺少阿蒂斯反应(Arthus reaction)，阿蒂斯反应是一种通过免疫复合物在接种位点上的形成引发的类型III超敏反应。缺少补体活化一般被认为是旨在治疗自身免疫性疾病的注射疗法的期望性质。然而，按照DC-SIGN、C1q和gC1qR在可在控制自身免疫性疾病中重要的源自单核细胞的不成熟树突细胞的表面上形成三分子受体复合物的发现，C1q结合而没有后续的经典途径的活化可以是有利的(Hosszu等,Blood 2012；120:1228-1236)。

阿蒂斯反应包括在抗原的皮肤内注射之后，抗原/抗体复合物的原位(insitu)形成(如在被动免疫中观察到的)。如果以前敏化了动物/患者(具有循环抗体)，阿蒂斯反应则出现。类型III超敏反应的大多数机制典型特征为，由于在真皮血管中基于IgG的免疫复合物的沉积，阿蒂斯反应表现为局部血管炎。补体的活化主要导致可溶性过敏毒素C5a和C3a的裂解，其驱动了PMN的募集以及局部肥大细胞脱粒(需要免疫复合物结合到FcγRIII)，导致了炎性反应。免疫复合物相关过程的进一步聚集确保在组织血管壁中局部类纤维蛋白坏死，伴随局部缺血加重的叠加的血栓形成。最后结果为局部的红色区域，可容易地通过肉眼在注射位点上观察到，典型地持续一天左右。

实施例4：六聚体Fc可在ITP临床相关小鼠模型中恢复血小板计数。

在通常使用的ITP血小板消耗模型中，通过与相似剂量0.035g/kg的IVIG的比较，我们可证明，低至0.035g/kg的六聚体Fc具有对血小板恢复的显著积极作用。

用0.035g/kg的六-Fc、0.035g/kg或2g/kg的IVIG(GammaGard)，或PBS以200μl终体积腹腔内注射了Balb/C小鼠。一小时以后，通过腹腔内注射200μl体积的无菌PBS中的12.5μg小鼠整联蛋白β₃链/CD61特异性IgG1-κ、克隆2C9.G2(BD Pharmingen；产品号:550541)在全部小鼠中诱导了ITP。通过使用APC缀合的抗CD61抗体的流式细胞术，在处理之后12小时、24小时、36小时和48小时时间点计数血小板。n＝每组4只小鼠，来自2次独立实验。通过使用Dunnett's多重比较检验的重复ANOVA相对于对照组分析了组平均值±SD。对照对比六聚体：q＝3.13，^*P<0.05；对照对比IVIG：q＝8.66，^***P<0.0001。数据是平均％血小板±SD。在消耗之前每个组中的平均％血小板计数：六聚体组＝9.6％±1.2，高剂量IVIG组＝9.4％±1.2，低剂量IVIG组＝9.4％±1.2，PBS组＝9.3％±1.2。

实施例5：治疗患有ITP的患者

用公开的六聚体Fc蛋白治疗ITP的方案将以遵循ITP hIVIG疗法的标准指南诸如美国血液学学会执行委员会(Executive Committee of theAmerican Society of Hematology)对诊断和管理原发性免疫血小板减少性紫癜的实践指南的方式来利用。参见George,J N,等，Idiopathicthrombocytopenic purpura:a practice guideline developed by explicit methodsfor the American Society of Hematology.Blood.1996Jul.1；88(1):3-40。可选地，用于ITP的方案可包括以约0.1倍到约0.001倍的以上治疗方案剂量的剂量的初始施用阶段。设计了初始低剂量阶段以最小化Fc蛋白施用的任何短期促炎性作用，而仍然足以诱导长期抗炎性作用，所述长期抗炎性作用随后通过以上所述的第二阶段标准给药增强并维持。此替代方法的基本原理是，一些多聚蛋白可通过减少FcγRIIa的表达具有短期炎性作用以及长期抗炎作用。可使用初始低剂量(或初始多个低剂量)以刺激长期抗炎性作用同时使短期炎性作用最小化。

Fc蛋白将被静脉施用且有效Fc蛋白剂量一般从约1％到约20％的有效IVIG剂量。在ITP中有效hIVIG剂量一般在每10-21天施用约100mg/Kg到约2克/Kg的范围。

Fc蛋白静脉内制剂将与FDA批准的hIVIG制剂基本相同，但可不包括存在于一些hIVIG制剂中的稳定剂。

实施例6 Fc蛋白的计算机模拟建模

Fc蛋白调节自身免疫性疾病或炎性疾病的能力将取决于它们与免疫***的适当组分相互作用的能力，同时不引起不希望的反应。这将反过来依赖于Fc蛋白的结构。在寡聚体的情况下，三级结构和四级结构将对蛋白表面和用于与免疫***的组分结合的暴露部分的可利用性具有重要影响。均匀和界定的三级结构和四级结构可减少可能另外由复合体混合物内的少数物质引起的不希望反应的风险。均匀和界定的结构还允许对医药产品更容易的质量控制。

发明人证明了，本文公开的六聚体Fc具有规则和均匀圆柱体形状(实施例2)，与免疫***的多个期望受体和组分结合(实施例3)且不会活化补体(实施例3)。这些发现与在实施例1所述的六聚体Fc的计算机模拟建模都一致。

US 2010/0239633(University of Maryland,Baltimore；Strome)公开了包含多个连接的Fc部分的IVIG替代化合物。设想了线性或五聚体排列。通过加入IgM的Cμ4结构域和J链设想了五聚体化(如在US2010/0239633的图10A-D和第18页优选实施方案中描绘的)。在天然IgM中，重链恒定区的Cμ4结构域与J链结合以实现五聚体化。进行了深入的计算机模拟建模/分子动力学模拟以确定在US2010/0239633中提出的结构是否可行。

在US2010/0239633的图10A-D中描绘的结构中，Cμ4结构域通过其N端连接到Cγ3结构域的C端(即，IgG分子的CH3结构域)，且Cγ3结构域连接到Cγ2结构域。单体的类似结构域被描述为二聚化在一起以形成更高等级结构的单体臂。然而，这提出了结构的构象问题。

在天然免疫球蛋白中，Cμ3、Cμ4、Cγ2和Cγ3结构域形成了“V”形或倒立“V”形，即“Λ”的同二聚体。一个单体形成了“V”的“\”部分且类似单体形成了“V”的“/”部分；或一个单体形成了“Λ”的“/”部分且类似单体形成了“Λ”的“\”部分。Cγ3或Cμ4二聚体为V”形，而Cμ3和Cγ2为“Λ”形。在天然免疫球蛋白中，“V”和“Λ”形二聚体交替。例如，“V”形Cγ3结构域的N端放置于毗邻“Λ”形Cγ2的C端。同样地，“V”形Cμ4结构域的N端放置于毗邻“Λ”形Cμ3结构域的C端。

在US2010/0239633中描绘的单体中，“V”形Cγ3结构域直接连接到另一个“V”形Cμ4结构域。由于Cγ3的C端残基彼此接近而Cμ4的N端残基彼此远离，这是个问题。很可能将需要接头以将结构域连接在一起。此结构限制的最有可能的结果是，对于最可能采用的接头长度，Cμ4结构域将不得不相对于Cγ2-Cγ3结构域旋转90度。Cμ4结构域将处于旋转应变下。在Cγ3之内的单体内部二硫键和Cμ4之内的单体内部二硫键彼此竞争。一个或两者都将变弱。因此，蛋白可不稳定或可不恰当地折叠。

为了模拟如发现于Cγ2-Cγ3-Cμ4中的Cγ2-Cγ3结构域相对于Cμ4结构域的正常定向，IgM的结构域将需要超过20个氨基酸的接头。接头(非特定序列)的引入增加了这些结构的显著问题，尤其是不希望的免疫原性的增加的可能性。还将存在对可制造性的负面影响和增加的蛋白水解裂解可能性。Cγ3-Cμ4连接的此几何学限制对寡聚体具有显著性结果，使得其与六聚体Fc蛋白根本上不同。

在Fcγ与Fcμ结构域之间的接头序列是关键的。然而，尽管术语“接头”意味着柔性，在现在的情况下对此柔性存在限制。在诸如Fab与Fc区之间的单点连接(在铰链)中，事实上可存在大量的旋转柔性。如在US2010/0239633中描绘的实施方案中的区别为存在两个连接位置，一个在各Cγ3-Cμ4对之间。所以一个Fc相对于其他Fc的转动导致两个接头缠绕在一起，其是能量上不利的，增加了错误折叠或不稳定的风险。

US2010/0239633中描绘的结构通过它们仅通过Cμ4结构域的连接形成良好界定的寡聚体(如在IgM中)是不太可能的。在所有多聚抗体中发现的非结构化的18个氨基酸C端尾部，不能负责规则五聚体和/或五聚体结构，所述规则五聚体和/或五聚体结构必须来自在Fc之内的结构化Ig结构域的存在。随着贯穿结构化Ig区发生的聚合，通过结构化区的大小和形状设置了化学计量。在随机非结构化的区域之间的相互作用必须必然地导致宽范围的聚合体大小。所以为了确定在IgM中观察到的在Cμ4结构域中(少数)单体内部接触是否足以维持五聚体化学计量，我们仅对这些结构化区域(即，缺少尾片段)进行了广泛的分子动力学模拟。在模拟期间，Cμ4的结构化区域快速失去了其五聚体排列，且开始(明显地)聚集在一起(非特异性)。因此，规则五聚体/六聚体结构是非常不可能的。这与天然IgM不同，在天然IgM中Cμ4和Cμ3结构域两者有助于规则五聚体/六聚体结构。尽管US2010/0239633表明使用J链促进了聚合，预计这将不会成功。J链可稳定免疫球蛋白结构，但是不能转换单体或二聚体成为更高等级寡聚体。例如，J链可促进IgA的二聚，但是不足以形成如在IgM中的更高等级寡聚体，因为IgA的Ig结构域不适合用于更高等级聚合。

如果聚合可通过随机尾部发生，能够可能形成的最有可能的结构是三维(3d)星形结构，其中在三维中，尾部位于冠状物中央内部且单体的Fc区径向地向外伸出。随着通过非结构化的肽发生聚合，可以不存在良好界定的化学计量且将发生可适合于三维的诸如此类的。取决于多少连接尾部可适合在相互作用尾部的中心球体内，存在多达大概20-mer的二聚体的可能性。

还需要重点注意的是，通过实验方法，我们已经发现，将18个氨基酸的尾片段添加至人IgG1的Fc不足以诱导多聚化(Mekhaiel,2011a)。我们还已经证明，随着恒定结构域交换，Cμ4结构域的存在不能够诱导五聚体和/或六聚体形成(Ghumra等,2009)。因此，我们认为，无论通过Cμ4结构域或通过尾部，US2010/0239633中的结构实际上可多聚化的可能性为不太可能。

即使从模型产生的预测是错误的，且单体中的Cμ4结构域能够相互作用以形成与IgM相似的结构，所得的结构将与五聚体Fc是非常不同的。假设Cμ4如它们在IgM中地相互作用(通过US2010/0239633来假设的)，Cμ4结构域相对于Cγ2-Cγ3结构域旋转90度的需求将引起Cγ2-Cγ3区在能够从单体中形成的任何寡聚体中(主要地)彼此“面对”。即，Cγ2-Cγ3的侧面将直接地面对在邻近臂中的Cγ2-Cγ3的相对侧面。整个结构将类似闭合的雨伞。与之相比，在六聚体Fc蛋白中，这些侧面形成了“桶”的壁且因此不彼此面对，而是面向外面。可容易地与六聚体Fc蛋白中的这些侧面结合的受体可因此不会与US2010/0239633寡聚体结合。在Cγ2-Cγ3Fc单元中的加糖区对于被Fc受体和聚糖受体两者的结合是关键的。在六聚体Fc中，加糖的区域面向外面，所以与加糖区结合的受体可结合。与之相比，在US2010/0239633寡聚体中，这些聚糖的受体将不得不进入到单体之间，且尽管不是不可能的，这将影响在寡聚体和关键受体之间的整体结合强度。虽然US2010/0239633寡聚体的单个单体可以被定向使得单个Cγ2-Cγ3结构域对可接近受体，由于以上所述的几何学考虑事项以及由于单体的物理大小，不清楚在寡聚体中多于一个其他单体是否能够与相同表面上的不同受体结合。因此，不清楚US2010/0239633寡聚体是否可以同时与多于一个/两个受体结合。相似问题将从可选的多聚化恒定结构域例如来自IgA的那些的使用产生。因此，尽管在US2010/0239633中设想了在结构中存在多个单体单元，与免疫***的关键Fc受体和其他组分的结合与以单体或二聚体免疫球蛋白观察到的相比也许并没有更强烈(avid)，如果此类结构确实可形成的话。

此构造块(building block)策略严重地限制了在US2010/0239633中描述的结构的相互作用可能性。更有问题的是，即使这些分子可显示多聚化，Cμ4结构域的存在将对这些嵌合分子的生物分布和可能来自这些嵌合分子的体内相互作用具有严重影响，其被预期与如在此申请中描述的六聚体Fc所观察到的那些显著不同。这些在表1中详细地概述。

表1：六聚体Fc与US2010/0239633设想的结构之间的区别

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Claims (15)

1.一种用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：

向所述哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多肽单体单元；

其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区；

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；

其中所述多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当施用到哺乳动物受试者时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中每个多肽单体单元包含融合到所述两个免疫球蛋白G重链恒定区的每个的尾片段区；其中所述每个多肽单体单元的尾片段区促进所述单体单元组装成聚合体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述尾片段区是IgM或IgA尾片段、或其片段或变体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白G重链恒定区的每个包含与天然人免疫球蛋白G1重链恒定区具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白G重链恒定区的每个包含根据EU编号***在位置309处包含半胱氨酸残基，且优选地在位置310处还包含亮氨酸残基的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白G重链恒定区的每个包含与天然免疫球蛋白G重链恒定区的氨基酸序列相比修饰的氨基酸序列，以修饰所述Fc受体结合部分对至少一种Fc受体的亲和力。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白G重链恒定区的每个包含与天然免疫球蛋白G重链恒定区的氨基酸序列相比修饰的氨基酸序列，以通过增加所述Fc受体结合部分对新生Fc受体的亲和力来适合地增加所述多聚蛋白的体内半衰期。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病为可用静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病为自身免疫血细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、哮喘、川崎病、格林-巴利综合症、史蒂芬斯-强森综合征、克罗恩结肠炎、糖尿病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力、抗因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎、和葡萄膜炎或阿尔茨海默氏病。

10.一种用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：

向所述哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单元组成；

其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分组成，所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接所述两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；且

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。

11.一种用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：

向所述哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单元组成；

其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分和尾片段区组成；

其中所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接所述两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；

其中每个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；且

其中所述尾片段区融合到所述多肽单体单元的两个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的每个，并促进所述单体单元组装成聚合体。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述尾片段区是IgM或IgA尾片段、或其片段或变体。

13.一种多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多肽单体单元；

其中每个多肽单体单元包含Fc受体结合部分，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区；

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；

其中所述多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分；

其中每个多肽单体单元不包含融合到所述两个免疫球蛋白G重链恒定区的每个的尾片段区。

14.一种多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单元组成；

其中每个多肽单体单元由Fc受体结合部分组成，所述Fc受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接所述两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fc的多肽接头组成；且

其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。

15.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如在权利要求13或权利要求14中定义的多聚蛋白的多肽单体单元的编码部分。