CN103974977A - 杂交恒定区 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种杂交恒定区及包含所述杂交恒定区的抗体或融合蛋白。所述杂交恒定区至少包含IgG或IgA恒定区的CH2区和CH3区及Cμ恒定区的Cμ3区和Cμ4区。所述杂交体保留了两种恒定区组分的性能。所述杂交体保留了Cμ恒定区的形成多价复合物的能力,例如,五聚体或六聚体结构。IgG杂交体也保留了IgG的性能,包括与较长的体内半衰期相关联的pH依赖性的FcRn结合,以及利于纯化的特异性结合G蛋白。取决于同种型和亚型、抗原的本质和额外存在的IgG CH1和铰链结构域,IgG杂交体也保留了这些性能:特异性结合蛋白A、效应器功能ADCC、CDC和调理素作用。IgA杂交体保留了IgA的与Fc-α受体CD89的结合性能。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是递交于2011年9月26日的USSN61/539,416的非临时申请案。
背景技术
抗体是由在免疫***中发挥重要作用的B细胞产生的糖蛋白(Schroeder et al.,J.Allergy Clin.Immunol.125:S41-S52,2010)。哺乳动物可产生五类抗体,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。人类可产生IgG的四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgA的两个亚类(IgA1和IgA2)。每种抗体是由以单体形式存在的两条相同轻链和两条相同重链构成。这四条链通过共价和非共价键的组合而彼此连接,形成一个Y形分子。在哺乳动物中有两种轻链的型,κ和λ。重链存在几种不同类型,由此定义了抗体的类。在人类中,μ重链被并入到IgM中,δ重链被并入到IgD中,γ-1重链被并入到IgG1中,γ-2重链被并入到IgG2中,γ-3重链被并入到IgG3中,γ-4重链被并入到IgG4中,α-1重链被并入到IgA1中,α-2重链被并入到IgA2中,ε重链被并入到IgE中。这些抗体的单体形式具有两个抗原结合位点,并且因此所述抗体对于抗原结合是二价的(divalent)。虽然IgG、IgD和IgE仅作为单体被产生,然而在缺少J链时,IgM作为六聚体被产生并因此对于抗原结合是十二价的(dodecavalent),而当J链存在时,形成十价的(decavalent)五聚体(Gilmour et al.,Trans.Med.18:167-174,2008)。有J链时,IgA形成四价的二聚体,而J链不存在时IgA是单体,但也有报道称在无J链存在时可自发形成二聚的IgA(Johansen et al.,Scand.J.Immunol.52:240-248,2000)。
截至2010年年底,美国食品和药物管理局批准28种单克隆抗体作为人类治疗剂。所有这些治疗性抗体是IgG抗体或它们的衍生物。除了特异性抗原结合,IgG抗体还引发由Fc区介导的各种生物学功能(Schroeder etal.supra;Desjarlais et al.,Exp.Cell Res.317:1278-1285,2011)。在人类中,通过将所述Fc区结合到在NK细胞上表达的Fcγ受体III型(CD16),细胞结合的IgG1和IgG3抗体介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)(Hulett et al.,Adv.Immunol.57:1-127,1994)。同样地,通过Fc区与补体成分(complement components)相互作用,细胞结合的IgG1和IgG3抗体可有效地触发补体依赖性细胞毒性(CDC)(Bindon et al.,J.Exp.Med.168:127-142,1988)。
人IgG抗体的所有四个亚类的Fc区与新生儿Fc受体(FcRn)结合,所述FcRn是由跨膜α链和β2-微球蛋白组成的异源二聚体,所述结合是pH依赖性的,所述结合导致:将通过胞饮作用内在化的IgG抗体从溶酶体中分解代谢降解中抢救,并使它们回收到循环中(Ghetie et al.,Annu.Rev.Immunol.18:739-766,2000)。因此,IgG抗体表现在循环中的慢的清除,这导致了其在人类中长的血清半衰期,通常是23天(Kindt et al.,Chapter4,Kuby Immunology,Sixth Edition,W.H.Freeman&Co.,2006)。此外,所述IgG抗体的Fc区结合到蛋白A(除IgG3)和蛋白G,由此,通过蛋白A或蛋白G亲和层析来纯化IgG抗体是可能的(Andrew et al.,Unit2.7,Chapter III,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.1997)。
在细胞表面上的特定分子的二聚化通常可以触发一个或多个生物反应。单克隆IgG抗体结合到位于细胞表面的PSMA(***特异性膜抗原)蛋白增加了PSMA的内在化(internalization)速率(Liu et al.,CancerRes.58:4055-4060,1998)。I型跨膜蛋白ΜUC1的内在化和下调可以通过结合到小鼠IgG1抗体引发(Hisatsune et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.388:677-382,2009)。抗c-Met的单克隆抗体使细胞表面的c-Met二聚化,并启动细胞内信号而导致细胞增殖(Prat et al.,J.Cell Sci.111:237-247,1998)。类似地,单克隆抗-EPO受体抗体可通过使表面的EPO受体同源二聚化而用作细胞生长激动剂(Schneider et al.,Blood89:473-482,1997)。死亡受体5(DR5)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员,然而,在细胞表面上的死亡受体5(DR5)的抗体介导的二聚化并不总是触发信号转导,而通过小鼠单克隆的抗-DR5IgG抗体和山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的混合物介导的DR5的多聚化,例如,会引发在细胞质中的信号转导并触发细胞凋亡(Griffith et al.,J.Immunol.162:2597-2605,1999)。
J链存在时,IgM抗体为五聚体,在J链不存在时,IgM抗体为六聚体(Gilmour et al.,同上)。与IgG抗体相反(IgG抗体仅能二聚化抗原),由于IgM抗体的十价或十二价的抗原结合能力,IgM抗体可以使细胞表面蛋白多聚化。Fas是TNFR超家族的成员(Cosman,Stem Cells12:440-455,1994),对Fas具有特异性的单克隆的IgM抗体能有效地诱导表达Fas的细胞凋亡,这是由于表面的Fas蛋白的多聚化(Yonehara et al.,J.Exp.Med.169:1747-1756,1989),然而,抗-Fas IgG抗体不能进行所述诱导,除非它们是交联的(Matsuno et al.,J.Rheumatol.29:1609-1614,2002)。相比于IgG,IgM抗体具有更短的循环半衰期,在人类中通常为5天,因为它无法与FcRn结合(Kindt et al.,同上)。由于不与CD16结合,IgM抗体也不能介导ADCC。此外,由于IgM不与蛋白A和蛋白G结合,因此IgM抗体不能通过蛋白A和蛋白G亲和层析分别来纯化(Gautam et al.,Biotechnol.Adv.E-publication,July2011)。
多种结构形式(structural formats)已被用于尝试产生多价抗体的新形式(novel forms)。多价抗体工程的最新进展总结在Cuesta等人的综述文章(Trends Biotech.,28:355-362,2010)。优选的多价IgG抗体能够有效地在细胞表面上使抗原多聚化。同样重要的是,通过γ重链的Fc区介导的性能例如ADCC、CDC、调理素作用、pH依赖性的FcRn结合和结合到蛋白A和蛋白G的能力,仍旧保持在这些多价IgG抗体中。
为了产生多价IgG抗体,Caron等(J.Exp.Med.,176:1191-1195,1992)介绍了一种自人源化抗-CD33抗体IgG1/kappa抗体中的人γ-1重链的羧基末端起第四个位置丝氨酸-至-半胱氨酸替换,HuG1-M195。这种改造的HuG1-M195,称为Hd-IgG抗体,被纯化,并经Ellman氏试剂处理,以使之交联,和随后阻断过量的巯基位点。使用苯基琼脂糖凝胶柱层析法将单体的HuG1-M195从Hd-IgG中消除。由此产生的Hd-IgG显示了显著改善的使CD33分子内在化的能力,而且比HuG1-M195在ADCC和CDC中更有效。
通过复制人源化抗HER2的IgG1单克隆抗体(hu4D5)的重链中的VH-CH1区,Miller等构建了一个四价IgG抗体(J.Immunol.,170:4854-4861,2003)。所述被改造的γ重链,从N末端到C末端,由以下组成:VH、CH1、VH、CH1、铰链、CH2和CH3区。一条轻链结合到所述改造的IgG中的所有四个VH-CH1区,形成了一个四价hu4D5抗体(TA-HER2)。相比于HER2-表达细胞上的亲源(parental)二价抗-hu4D5抗体,TA-HER2更快速地被内在化。Miller等(出处同上)也构建了一个四价抗-DR5IgG抗体,称为TA-DR5,具有与TA-HER2一样的重链形式(heavy chain format)。TA-DR5触发细胞凋亡的浓度比亲源二价抗-DR5IgG单克隆抗体低100倍。
Rossi等(Cancer Res.,68:8384-8392,2008)报道了采用对接和锁定(Dock-and-Lock)方法构建六价抗-CD20IgG抗体,被认定为Hex-hA20。为产生由6个Fab区和2个Fc区构成的Hex-hA20,两种组分被构建并分别在哺乳动物细胞中生产。首先,A-激酶锚定蛋白(AD)的锚定结构域被基因地(genetically)融合到人源化抗-CD20IgG1抗体(hA20)的重链的羧基末端。该构建体被命名为CH3-AD2-IgG-hA20。其次,环AMP依赖性蛋白激酶(DDD)的对接结构域被基因地(genetically)融合到h20的Fab片段的羧基末端。这种结构被指定为CH1-DDD2-Fab-hA20。CH3-AD2-IgG-hA20和CH1-DDD2-Fab-hA20分别由蛋白A和蛋白L亲和层析纯化。Hex-hA20通过以下方法得到:将纯化的CH3-AD2-IgG-hA20和CH1-DDD2-Fab-hA20在氧化还原条件下进行混合,然后用蛋白A纯化。Hex-h20抑制CD20-表达B淋巴细胞系的增殖,而不需要交联抗体。Hex-h20保留了hA20的ADCC活性,但失去了CDC活性。
Yoo等(J.Biol.Chem.,47:33771-33777,1999)构建了变体的人抗-DNS IgG2抗体,其中,部分γ-2重链被替换为人α-1重链的相应部分。在所述构建的被称为γγγ-αtp的抗体中,18个氨基酸的多肽存在于人α-1重链的C-末端,称为αtp(也称为α尾端(tailpiece)),被连接到人γ-2重链的C-末端。所述γγγ-αtp构建体进一步被改造以成为如下的三种变体IgG2抗体。在αγγ-αtp中,所述γ-2重链的CH1区被替换为人α-1重链的对应物。在ααγ-αtp中,CH1、铰链和CH2区被替换为人α-1重链的对应物。在γαγ-αtp中,铰链和CH2区被替换为人α-1重链的对应物。这些构建体被稳定地表达于产生J链的小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。每种纯化的γγγ-αtp、αγγ-αtp、ααγ-αtp和γαγ-αtp抗体均是单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的混合物。所述混合物中五聚体和六聚体的组合百分比分别为:对于γγγ-αtp为20%、对于αγγ-αtp为25%、对于ααγ-αtp为45%、对于γαγ-αtp为32%。
Sorensen等(J.Immunol.156:2858-2865,1996)在人单克隆抗-NIP(3-硝基-4-羟基-5-iodophenulacetic酸)IgG3抗体变体的基础上,制备了多价抗体,其中第一、第二和第三铰链区域被删除。所述变体IgG3抗体的γ-3重链两个位置被改造。首先,人μ重链的C-末端中存在的18氨基酸多肽,称为μtp(也称为μ尾端(tailpiece)),被连接到重链的C-末端。第二,CH2区中第309位的一个亮氨酸残基变成了一个半胱氨酸残基。这种被改造的单克隆IgG3抗体,被称为IgGL309Cμtp,在产生J链的小鼠骨髓瘤细胞系J558L中表达,并使用NIP-琼脂糖凝胶柱纯化。据报道,相比亲源IgG3抗体,IgGL309Cμtp具有相对差的分泌水平,并且很大一部分IgGL309Cμtp被保留在细胞内。分析表明,五聚体和六聚体构成所述纯化的IgGL309Cμtp的81%。
Sorensen等(Int.Immunol.,12:19-27,2000)也改造了与上述相同的人抗-NIP IgG3抗体变体,通过取代γ-3重链的CH2和CH3区为人μ重链的包括μtp的CH3和CH4区。这种改造的IgG3/IgM杂交分子的重链,称为IgG-Cμ3-Cμ4,自N-末端开始,由抗-NIP VH区、人γ-3重链的CH1和第四铰链区和人μ重链的包含μtp的CH3和CH4区。IgG-Cμ3-Cμ4在产生J链的J558L细胞中表达并用NIP-琼脂糖凝胶柱纯化。在纯化的IgG-Cμ3-Cμ4中,六聚体和五聚体分别构成了14.0%和66.7%。因为IgG-Cμ3-Cμ4没有人γ-3重链的CH2和CH3区,它将缺乏Fcγ-介导的性能,例如ADCC、pH依赖性的FcRn结合和结合到蛋白A和蛋白G的能力。
发明内容
本发明提供了一种包含免疫球蛋白重链恒定区的抗体或融合蛋白,所述重链恒定区从N-端至C-端依次包含CH2区、CH3区、Cμ3区和Cμ4区,所述CH2区或CH3区是IgG或IgA的同种型。任选地,所述免疫球蛋白重链还包含位于所述CH2区N-端的铰链区。任选地,所述免疫球蛋白重链还包含位于所述铰链区N-端的CH1区。
任选地,所述抗体或融合蛋白是抗体,其中所述重链恒定区与重链可变区融合,并且所述抗体进一步包括含有轻链可变区和轻链恒定区的轻链。任选地,所述抗体是多特异性抗体的组分,所述多特异性抗体包含多种由权利要求4定义的抗体,所述多种抗体具有不同的重链可变区以及可选地,不同的轻链可变区;所述多种抗体通过所述Cμ3和Cμ4区集合于所述多特异性抗体中。
任选地,如上面提到的抗体或融合蛋白,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG1的区。任选地,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG2的区。任选地,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG3的区。任选地,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG4的区。任选地,若存在CH1区,所述CH1、CH2和CH3区是IgA的区。任选地,若存在CH1区和铰链区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人CH1区、铰链区、CH2区和CH3区,并且所述Cμ3区和Cμ4区是人Cμ3和Cμ4区。
任选地,所述抗体或融合蛋白是一种单链抗体,所述单链抗体包含与所述重链恒定区连接的单链Fv。任选地,所述单链抗体是多特异性抗体的组分,所述多特异性抗体包含多种单链抗体,其中所述多种单链抗体的所述单链Fv具有不同的VH区,并且所述多种单链抗体通过所述Cμ3和Cμ4区集合于所述多特异性抗体中。任选地,所述单链Fv具有相同的VL区。
任选地,抗体或融合蛋白是多聚体形式,所述多聚体包含一种单元的至少五个或六个拷贝,所述单元包含两条所述重链和两条所述轻链,所述拷贝通过所述Cμ3和Cμ4区集合于所述多聚体中。
可选地,在上述的抗体或融合蛋白中,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是IgG,并且所述抗体或融合蛋白显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G、特异性结合蛋白A、表现出ADCC、表现出CDC和/或表现出调理素作用。
可选地,在上述的抗体或融合蛋白中,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人IgG1的区,并且所述抗体显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G及特异性结合蛋白A。可选地,这些抗体显示ADCC、CDC和调理素作用。
可选地,在上述的抗体或融合蛋白中,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人IgG2或IgG4的区,并且所述抗体或融合蛋白显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G及特异性结合蛋白A。
可选地,在上述的抗体或融合蛋白中,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人IgG3的区,并且所述抗体显示pH依赖性结合FcRn及特异性结合蛋白G。可选地,所述抗体或融合蛋白显示ADCC、CDC和调理素作用。
可选地,在上述的抗体或融合蛋白中,若存在CH1区,所述CH1区、CH2和CH3区是人IgA,并且所述抗体与Fcα受体结合。
可选地,上述抗体或融合蛋白是一种融合蛋白,所述融合蛋白包含与异源多肽连接的所述免疫球蛋白重链。可选地,述异源蛋白通过例如Gly-Gly-Ala-Ala的柔性连接器与所述恒定区的所述铰链连接。可选地,所述异源多肽是受体细胞外结构域或与受体细胞外结构域特异性结合的蛋白质。可选地,所述融合蛋白是包含多种融合蛋白的多特异性复合体的组分,所述多种融合蛋白包含不同的异源多肽。
可选地,如上所述的抗体或融合蛋白是多特异性复合体,所述多特异复合体包含通过所述Cμ3和Cμ4区集合的抗体和融合蛋白。
可选地,如上所述的抗体或融合蛋白是人源化抗体、嵌合抗体、饰面抗体或人抗体。
可选地,如上所述的抗体或融合蛋白与受体的细胞外结构域特异性结合。
可选地,如上所述的抗体或融合蛋白是与CD79a、CD30或DR5特异性结合的抗体。
可选地,如上述的抗体或融合蛋白是一种是包含TNF-α受体、LFA-3或IL-1受体的细胞外结构域的融合蛋白,或是包含TRAIL蛋白的融合蛋白。
可选地,如上所述抗体或融合蛋白与毒性部分结合。
本发明进一步提供了一种包含如上所述抗体或融合蛋白的药物组合物。
本发明进一步提供一种治疗癌症的方法,所述方法包括对患有癌症和有患癌症风险的病人以有效的方案给予如上所述的抗体或融合蛋白。
本发明进一步提供一种治疗免疫失调的方法,所述方法包括对患有免疫失调和有患免疫失调风险的病人以有效的方案给予如上所述的抗体或融合蛋白。
本发明进一步提供了一种制备抗体和/或融合蛋白的多特异性复合体的方法,所述方法包括:a.用编码多种由权利要求1定义的抗体和/或融合蛋白的一种或多种载体转染细胞,所述抗体和/或融合蛋白具有不同的特异性;其中所述抗体和/或融合蛋白被表达并通过所述Cμ3和Cμ4区被组装在多特异性复合体中;及b.从细胞培养物中分离所述多特异性复合体。可选地,所述多种抗体或多种融合蛋白中的每一种抗体或每一种融合蛋白由不同载体编码。
本发明进一步提供了一种包含杂交恒定区的抗体或融合蛋白,所述杂交恒定区包含N-端的IgG恒定区片段和C-端的IgM恒定区片段;其中所述抗体显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G及由IgM恒定区介导的多聚化,所述多聚化至少形成五聚体或六聚体。
附图说明
图1:抗体表达载体结构示意图。
图2:单体形式的重组抗体的结构示意图。
图3A-E:来自Superose6凝胶过滤柱的抗-CD79a IgG1抗体的洗脱图谱。
图4:通过多价抗-CD79a IgG1抗体诱导的Ramos细胞凋亡。
图5:pH依赖性的多价IgG1抗体与FcRn的结合。
图6A-I:多价IgG1抗体与CD16的结合。
图7A-D:来自Superose6凝胶过滤柱的抗-CD30IgG1抗体的洗脱图谱。
图8:通过多价抗-CD30IgG1抗体引起的Karpas299细胞的细胞抑制。
图9:来自Superose6凝胶过滤柱的在HEK293细胞中表达的多价抗-CD30IgG1抗体的洗脱图谱。
图10A-D:来自Superose6凝胶过滤柱的抗-DR5IgG1抗体的洗脱图谱。
图11:由多价抗-DR5IgG1抗体诱导的Jurkat细胞凋亡。
图12A-C:来自Superose6凝胶过滤柱的多价抗-CD79a IgG4抗体的洗脱图谱。
图13A-E:来自Superose6凝胶过滤柱的抗-CD79a IgG3抗体的洗脱图谱。
图14:pH依赖性的多价IgG3抗体与FcRn的结合。
图15A-G:多价IgG3抗体与CD16的结合。
图16的A、B、C:γ-1(SEQ ID NOs:15-18),γ-2(SEQ ID NOs:19-22),γ-3(SEQ ID NOs:23-26),γ-4(SEQ ID NOs:27-30),α-1(SEQID NOs:31-33),α-2(SEQ ID NOs:34-36),μ重链恒定区(SEQ IDNOs:51-54),和J链(SEQ ID NO:55)。18氨基酸μ尾端在Cμ序列中被画了下划线。显示J链的前22个氨基酸是个被切除的(cleaved)信号肽。
图17:六聚体结构的(in hexameric conformation)具有杂交恒定区的实例性抗体。链间的二硫键由直线显示。每个单体单元有两个结合位点,每个形成自一条重链和一条轻链的可变区。六个单体单元是通过不同单体单元的Cμ3和Cμ4区之间的二硫键而彼此结合。包括所示化合价和二硫键结合模式的所述抗体仅是本发明的用以提供说明的一个实施例。
图18:经HuYON007-MVIgG1或HuYON007-IgG1处理的具有Ramos的CB17SCID小鼠的存活数据。
定义
抗体或融合蛋白通常以分离的形式提供。这意味着抗体或融合蛋白通常是干扰蛋白或其他污染物(产生于生产或纯化)的至少50%w/w的纯度,但不排除这样的可能,即所述的抗体与过量的一种(或多种)药物上可接受的载体或其他介质结合,以方便其使用。通常分离的单克隆抗体或其他的生物实体剂是纯化后剩余的优势大分子种类。有时,抗体或融合蛋白通常是干扰蛋白或其他污染物(产生于生产或纯化)的至少60、70、80、90、95或99%w/w的纯度。通常,抗体或融合蛋白是其纯化后剩余的主要大分子种类。
抗体或融合蛋白与其靶抗原的特异性结合意味着亲非和力至少有106、107、108、109或1010M-1。特异性结合可检测到更高的量级,且可从非特异性结合至少一个不相关靶标的情况中区分。特异性结合可以是特定官能团或特定空间配合(例如,锁和钥匙型)之间的键形成的结果,而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而特异性结合并不必然意味着抗体或融合蛋白只结合一个且只有一个靶标。
基本的抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包含两对相同的多肽链,每对多肽链有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括一个可变区来主要负责抗原识别,可变区约100至110或更多的氨基酸。该可变区最初被表达时连接到一个可***的信号肽上。没有信号肽的可变区,有时也被称为成熟的可变区。因此,例如,轻链成熟可变区,意味着没有轻链信号肽的轻链可变区。然而,提及可变区并不意味着信号序列必然存在;实际上,本发明的抗体或融合蛋白一旦表达和分泌,信号序列就被切割。一对重链和轻链可变区定义了抗体的结合区。轻链和重链的羧基端部分分别定义了轻链和重链恒定区。每所述重链恒定区主要负责效应功能。在IgG抗体中,所述重链恒定区被分成CH1、铰链、CH2和CH3区。在IgA中,所述重链恒定区被分成CH1、CH2和CH3。CH1区通过二硫键和非共价键结合到轻链恒定区。铰链区提供了抗体的结合区和效应器区之间的灵活性,并且还提供了一个四聚体亚基中两个重链恒定区之间分子间二硫键结合位点。所述CH2和CH3区是效应器功能和FcRn结合的主要位点。在IgM抗体中,μ重链恒定区(Cμ)被细分为四个区域Cμ1,Cμ2,Cμ3和Cμ4。所述Cμ3和Cμ4区,有时与一个或多个J链组合,在天然IgM抗体和本发明的抗体或融合蛋白中提供了多聚化的功能。μ尾端(tailpiece)是一个位于IgM重链恒定区C-末端的18个氨基酸长的多肽。J链存在时,IgM多聚化形成一个五聚体结构,J链不存在时,IgM多聚化形成一个六聚体结构。
轻链被分类为为κ或λ轻链。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε,并定义对应抗体的同种型(isotype)分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过一个约12个或12个以上的氨基酸的“J”区连接,同时重链还包括一个约10个或更多个氨基酸“D”区。(通常参见Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989),Ch.7)(在此为所有目的并入参考)。
每个轻/重链对的成熟可变区可形成的抗体结合位点。因此,一个完整的抗体具有2个结合位点。在天然抗体中,所述结合位点是一样的。然而,双特异抗体可以被制备,其中,两个结合位点是不同的(参见例如Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990);Kostelnyet al.,J.Immunol.,148:1547-53(1992))。可变区全表现出相对保守的骨架区(FR)的相同的通用结构,所述骨架区通过3个高变区连接,所述的高变区也叫互补决定区或CDRs。源自每个对(pair)的两条链的CDRs是由框架区对准,以使之结合到特定的抗原表位。从N-末端至C-末端,轻链和重链均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配与Kabat《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(国立卫生研究院,Bethesda,MD,1987和1991)中的定义或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987);Chothia等,Nature342:878-883(1989)的定义是一致的。Kabat还提供了一种广泛使用的编号惯例(Kabat编号),其中,不同重链可变区或不同轻链可变区之间的相应残基被分配了相同的编号。尽管Kabat编号可用于抗体恒定区,但如本发明的情况,EU索引(EU index)被更普遍地使用。
多聚化单元(multimerization unit)是指本发明的并入了杂交(hybrid)恒定区的抗体或融合蛋白的单体单元(monomeric unit),通过其IgM部分经受多聚化。所述多聚化单元本身可以是一或二价的。在单特异性(mono-specific)二价抗体单元中,两条重链和两条轻链是相同的。在双特异性(bispecific)二价抗体单元中,具有两个不同的重链和轻链对,所述两个重链和轻链对具有不同结合特异性。抗体单元也可以是含有单一重链和轻链组合的一价抗体,如单链抗体的情况,其中,重链和轻链可变区分子内配对。融合蛋白单元可以是单体的(monomeric)、包含一种融合蛋白的两个拷贝的同型二聚体(homodimeric)、包含不同融合蛋白异源二聚体(heterodimeric)。
多聚化指至少两个多聚化单元的联合,更通常5或6个这样的单元通过杂交恒定区的Cμ部分联合。含有杂交恒定区的抗体或融合蛋白的多聚化有时会形成比普通IgM的五聚体或六聚体结构更高过更低序(order)结构。有时,这类多聚化的特征在于通过多聚化形成一个具有至少约五或六个单元的复合体。
化合价(valency)是指结合区的数量或者换言之,能被抗体或融合蛋白结合的靶抗原分子的最大数目。一个标准的同型二聚体IgG抗体有两个化合价。一个标准的IgM抗体具有10或12化合价,取决于是形成五聚体还是六聚体结构(即五或六个IgM的元,每个单元均是含有两个结合位点的四聚体)。本发明的抗体或融合蛋白(其中的单体单元是二价的)可以有10个或12个化合价,然而抗体或融合蛋白(其中单体单元是一价)可具有5或6个化合价。化合价可以在这些值中变化,这是因为具有杂交恒定区的抗体或融合蛋白有时会形成比常规的IgM的五聚体或六聚体结构更高序或更低序的结构。这些化合价是理论最大值。在实践中,由于空间位阻的限制,结合的抗原的拷贝数可能小于理论上的最大值。
如果所有其抗原(或配体)结合区具有相同的特异性,本发明的抗体或融合蛋白是单特异性的抗体。如果它的抗原结合区包括至少两种不同的特异性,该抗体或融合蛋白是多特异性的。多特异性的抗体或融合蛋白中的不同特异性的数量可以为2至多达所述抗体或融合蛋白的最大价数(例如,10或12)。在由通过相同细胞培养的抗体或融合蛋白群体中,不同特异性的数目在不同的所述群体中是变化的。
术语“抗体”包括任何形式的具有至少一个结合区(包含单价片段)抗体、两条重链和两条轻链的二价四聚体单元、以及更高序的复合物,特别是一价或二价单元的五聚体和六聚体。所述抗体可以是单特异性的,在这种情况下,所有结合区具有相同特异性,或者所述抗体可以是多特异性,在这种情况下,所述结合位点具有至少两种特异性。抗体片段通常包括一个重链可变区和杂交重链恒定区,也可以包括一个轻链可变区。例如,抗体片段可以包括从N-末端到C末端的轻链可变区,肽间隔区,重链可变区和本发明的杂交重链恒定区。另一个片段包含重链可变区(结合区)和杂交重链恒定区和无轻链(即,Dab或纳米抗体)。同样地,融合蛋白包括单体或二聚的融合蛋白单元,或更高序的复合物,特别是五聚体和六聚体。
术语“表位”是指位于抗原上的能与抗体结合的位点。抗原表位可由一个或多个蛋白三级折叠的并列的连续的氨基酸或不连续的氨基酸形成。由连续氨基酸形成的抗原表位(也称为线性表位)通常暴露于变性剂后保留,而由三级折叠形成的抗原表位(也称为构象表位)通常经变性剂处理后通常消失。一些抗体结合到终端-特异性表位,意味着:相比与其他多肽融合的多肽(这导致失去自由终端),抗体优先结合到具有自由终端的多肽。抗原表位的独特空间构象中通常包括至少为3个,更通常为5个或8-10个氨基酸。抗原表位独特空间构象的测定方法包括,例如,x-射线结晶学和二维核磁共振,见,例如Epitope Mapping Protocols,in Methods inMolecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)。
术语“抗原”或“靶抗原”是指通过抗体或融合蛋白结合的靶标分子。抗原可以是任何长度的(天然的、合成的或重组表达)蛋白质、核酸或其他分子中的碳水化合物。抗原包括受体、配体(ligands)、反受体(counterreceptors)和外壳蛋白。
在一个融合蛋白中的异源多肽是不天然地连接至免疫球蛋白恒定区的多肽。这样的多肽可以是全长的蛋白质或其片段,该片段有足够的长度以保持其可以跟与所述全长蛋白质结合的抗原特异性地结合。例如,异源多肽可以是受体胞外结构域或其配体。
识别相同或重叠抗原表位的抗体可被简单的免疫分析法检定,该免疫分析法显示一个抗体相对于另一个抗体竞争结合靶抗原的能力。抗体的对应抗原表位也可以通过结合于抗原的抗体的X-射线晶体学来确定,以鉴定接触残基。或者,如果可减少或消除一种抗体结合的抗原所有氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合,则这两种抗体具有相同的抗原表位。如果可减少或消除一种抗体结合的抗原某些氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合,则这两种抗体具有重叠的抗原表位。
抗体间的竞争由试验分析来确定,其中被测的抗体抑制参照抗体(reference antibody)与共有抗原的特异结合(见,如Junghans等,CancerRes.50:1495,1990)。在竞争性结合试验分析中,若过量的被测试抗体(例如,至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制至少50%,但优选为75%、90%或99%参照抗体的结合,则被测试抗体与参照抗体竞争。由竞争法确定的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体具有相同结合抗原表位的抗体,及与一个毗邻抗原表位(由于空间位阻发生,该毗邻抗原表位充分接近与参照抗体结合的抗原表位)结合的抗体。
术语“患者”包括接受预防或治疗处理的人类和其他哺乳动物受试者。
为了对氨基酸替换的保守性和非保守性进行分类,氨基酸分组如下:组I(疏水性侧链):甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸亮,氨酸、异亮氨酸;组II(中性亲水性侧链):半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸;组III(酸性侧链):天冬氨酸、谷氨酸;组IV(基本侧链):天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸;组V(影响链定位的残基):甘氨酸、脯氨酸;组VI(芳香侧链):色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替换涉及同一类氨基酸之间的替换,非保守替换构成一类氨基酸的成员被另一类氨基酸的成员替换。
序列一致性百分率根据Kabat编号法则(对可变区)或EU编号法则(对恒定区)对抗体序列进行最大比对。如果受试抗体区域(如一条轻链或一条重链的完整的成熟可变区)与一个参照抗体的相同序列比对,比对后,受试抗体与参照抗体相同序列百分率为受试抗体与参照抗体中占据相同位置的氨基酸数量除以两个区域的比对位置的总数,缺口不算在内,乘以100以转换成百分率。
“包括”的一个或多个例举元素的组合物或方法还囊括其它没有特别例举的元素。例如,一个包括抗体的组合物,该组合物可以仅含有该抗体,也可与其它成分相结合。
术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性”,或ADCC,是一种用于诱导细胞死亡机制,所述机制取决于抗体包被的靶细胞(即结合抗体的细胞)与具有细胞溶解活性(也称为效应细胞)的免疫细胞之间的相互作用。这样的效应细胞包括自然杀伤细胞,单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。ADCC是由结合到细胞的抗体的Fc区与Fcγ受体之间的相互作用触发,所述Fcγ受体尤其是FcγRI和FcγRIII,位于如嗜中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的免疫效应细胞上。靶细胞通过吞噬作用或细胞溶解除去,这取决于介导的效应细胞的类型。经抗体包被的靶细胞的死亡的发生是效应器细胞活性的结果。
术语调理素作用(opsonization)也被称为“抗体依赖性细胞吞噬作用”,或ADCP,是指经由全部或部分吞噬性免疫细胞(如巨噬细胞,嗜中性粒细胞和树突状细胞)将被抗体包被的细胞的内在化(internalized)过程,其中所述吞噬性免疫细胞结合到免疫球蛋白Fc区。
术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC是指一种诱导细胞死亡机制,其中与标靶结合的抗体的Fc效应器结构域激活一系列最终在标靶细胞膜上形成孔洞的酶反应。典型地,抗原-抗体复合物(如被抗体包被的靶细胞)结合并激活补体成分C1q,从而激活导致靶细胞死亡的补体级联反应。补体的活化还可能导致补体成分沉积在所述靶细胞表面,通过结合白细胞上的补体受体(例如,CR3)而促进ADCC。
pH依赖性的抗体与FcRn受体的结合是指,相比在pH7.5时,pH6.0使抗体更强烈地结合于受体。在通过胞饮作用内在化后,在核内体(endosomes)中低pH值环境下的FcRn结合可以将IgG抗体从溶酶体中分解代谢降解中解救出来。被解救的IgG抗体然后在中性pH中从FcRn释放出,并被回收到循环里。这样的pH依赖性FcRn结合是IgG抗体(也包括本发明的含有杂交恒定区的抗体和融合蛋白)血清半衰期长的基础(Ghetie et al.,Annu.Rev.Immunol.18:739-766,2000)。例如,人IgG抗体在pH6.0时结合到人类新生儿Fc受体(FcRn),然而它们在pH为7.5时的结合十分弱。IgG抗体中的FcRn结合位点位于在CH2和CH3结构域的连接处。由于在pH6.0或7.5时,μ重链不与FcRn结合,所以天然IgM抗体不能利用FcRn介导途径将抗体从溶酶体的降解中解救出来,因此,IgM抗体一般比天然IgG抗体具有更短的半衰期。
人源化抗体是经基因工程改造过的抗体,其中源自非人“供体”抗体的CDRs被嫁接于(grafted into)人“受体”抗体序列(见例如Queen,US5,530,101及5,585,089;Winter,US5,225,539;Carter,US6,407,213;Adair,US5,859,205;及Foote,US6,881,557)。所述受体抗体序列可为例如成熟人抗体序列、所述序列的组合物、人抗体序列的共有序列(consensussequence)或种系区域序列(germline region sequence)。因此,人源化抗体是这样一种抗体,其具有完全或实质上源自供体抗体的部分或全部CDRs,和完全或实质上源自人抗体序列的可变区框架序列及恒定区(若存在的话)。类似地,人源化重链具有至少一、二及通常所有三个完全或实质上源自供体抗体重链的CDRs,及实质上源自人重链可变区框架及恒定区序列的重链可变区框架序列及重链恒定区(若存在的话)。类似地,人源化轻链具有至少一、二及通常所有三个完全或实质上源自供体抗体轻链的CDRs,及实质上源自人轻链可变区框架及恒定区序列的轻链可变区框架序列及轻链恒定区(若存在的话)。不同于奈米抗体(nanobodies)及dAb,人源化抗体包含人源化重链及人源化轻链。当人源化抗体中的CDR与非人抗体中的对应CDR之间的对应残基(如Kabat定义)具有至少60%、85%、90%、95%或100%的一致性时,该人源化抗体中的CDR则实质上源自该非人抗体中的对应CDR。当抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区与由Kabat定义的对应残基具有至少85%、90%、95%或100%的一致性时,则抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区其实质上源自人的可变区框架序列或人的恒定区。
虽然人源化抗体通常纳入所有六个来自小鼠抗体的CDRs(优选地,由Kabat定义),其也可以由少于所有源自小鼠抗体的CDRs(例如至少3、4或5CDRs)制备(例如Pascalis et al.,J.Immunol.169:3076,2002;Vajdos etal.,Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002;Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999;Tamura et al,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
嵌合抗体(chimeric antibody)是这样的抗体,其中非人抗体(例如小鼠)的轻链及重链的成熟可变区与人轻链及重链恒定区组合(combined)。该抗体实质上或完全保留该小鼠抗体的结合特异性,且具有大约三分之二的人序列。
饰面抗体(veneered antibody)是一种人源化抗体的类型,其保留非人抗体的一些及通常所有的CDRs及一些非人可变区框架残基,但用源自人抗体序列对应位置的残基来取代其他可能贡献B-或T-细胞表位(例如暴露的残基)的可变区框架残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。结果是这样一种抗体,其CDRs完全或实质上源自非人抗体,而该非人抗体的可变区框架由于所述取代而更似人。
人抗体(human antibodies)可以分离自人,或来自人免疫球蛋白基因的表达(如,在基因小鼠中、体外试验或噬菌体展示)。用于制备人抗体的方法包括三源杂交瘤方法(Oestberg et al.,Hybridoma2:361-367(1983)、Oestberg的美国专利第4,634,664号、及Engleman等人之美国专利第4,634,666号)、使用转基因小鼠(该小鼠含有人免疫球蛋白基因)(见例如Lonberg et al.,WO93/12227(1993);US5,877,397,US5,874,299,US5,814,318,US5,789,650,US5,770,429,US5,661,016,US5,633,425,US5,625,126,US5,569,825,US5,545,806,Nature148,1547-1553(1994),NatureBiotechnology14,826(1996),Kucherlapati,WO91/10741(1991))及噬菌体展示方法(见例如Dower et al.,WO91/17271及McCafferty et al.,WO92/01047,US5,877,218,US5,871,907,US5,858,657,US5,837,242,US5,733,743及US5,565,332)。
蛋白A最初是在细菌Staphylococcus aureus细胞壁中发现的40-60kDa的表面蛋白。蛋白A高亲和力地特异性结合至人类IgG1、IgG2和IgG4的以及小鼠IgG2a和IgG2b。蛋白A不与人IgG3或IgA或IgM结合。蛋白A可用于抗体的亲和纯化
蛋白G是65kDa的(G148蛋白G)和58kDa的(C40蛋白G)链球菌细胞表面蛋白。它包含一个对于IgG结合不需要的血清白蛋白结合结构域,它往往被删除。蛋白G特异性结合所有人类IgG同种型,但非IgA或IgM。G蛋白对于抗体纯化也是有用的。
具体实施方式
I.概要
本发明提供一种杂交恒定区与含有所述杂交恒定区的抗体或融合蛋白。所述杂交恒定区至少包括IgG或IgA恒定区的CH2和CH3区,以及Cμ恒定区的Cμ3和Cμ4区。所述杂交体保留了两者组分恒定区的特性。所述杂交体保留了Cμ恒定区的形成多价复合体(complexes)的能力,如五聚体或六聚体结构(如图17所示)。IgG杂交体也保留IgG的特性,包括pH依赖性的FcRn结合,这与相对长的体内半衰期相关联,也包括与蛋白G的特异性结合,而这利于纯化。取决于同种型和亚型、抗原的实质和额外的IgG CH1的和铰链结构域的存在,IgG杂交体也保留了与蛋白A特异性结合的性能,效应器功能ADCC,CDC和调理素作用。IgA杂交体保留了IgA的结合于人Fc-α受体CD89(Swiss Prot P24071)的性能。
IgG效应器功能、相对较长的半衰期、易于纯化及IgM的多聚化能力的结合导致了抗体或融合蛋白具备这些性能的新颖的组合。例如,一些这样的抗体或融合蛋白可有效地使细胞表面上的受体或配体多聚,相对于具有IgG同种型(isotype)的抗体,这样的抗体或融合蛋白保持甚至提高Fcγ-介导的性能,例如ADCC、CDC、调理素作用、pH依赖性的FcRn结合、以及与蛋白A和蛋白G结合的能力。相比与传统的IgG、IgM或IgA抗体,不同同种型的性能的组合对于治疗癌症和其他疾病提供了更大效力的可能性。
IgM抗体的多聚化能力还提供了用于制备抗体和融合蛋白的多特异性复合体的形式(format),其中,具有不同特异性的单元(units)通过IgM的恒定区之间的结合而联系在一起。
上述的优点可以不通过体外(in vitro)操作而实现,这不同于涉及制备核酸构建体以用于表达杂交抗体或融合蛋白。
II.杂交恒定区的成分
杂交恒定区包括IgG或IgA部分和Cμ部分。所述IgG或IgA部分至少包括IgG或IgA的CH2和CH3区。所述CH2和CH3区至少部分地负责FcRn结合、蛋白A、G结合、ADCC,CDC和调理素作用。所述IgG部分优选还包括铰链区和/或CH1区。所述铰链区提供了抗体或融合蛋白的结合区和效应器区之间的灵活性,并有助于有效的效应器功能如ADCC、调理素作用和CDC。所述铰链区还是将一对IgG重链连结在一起的二硫键位点。所述CH1区与轻链恒定区结合,并通常包含了多种形式(formats),其中,具有轻链恒定区的轻链是存在的,但是它也可以在融合蛋白或单链抗体形式(无轻链恒定区)中被省略。根据区的Kabat划分,IgA不具有铰链区。然而,IgA中相接这些区之间的边界的CH1和CH2的残基提供了有效作为铰链区的灵活性。CH1优选被包含于具有抗体轻链恒定区的IgA融合体中,否则,所述CH1优选被省略。
所述Cμ部分包括Cμ恒定区的Cμ3和Cμ4。Cμ部分负责多聚化多个单价或二价结合单元以形成一个多价复合体。尽管本发明的实施并不要求理解机制,但我们认为,所述杂交抗体或融合蛋白的多聚化的发生与天然IgM抗体具有类似的方式,即通过不同单体的Cμ3区之间的链间二硫键和不同单体的μ尾端之间的链间二硫键而多聚化。一些IgM抗体的多聚体还包含结合到μ尾端的J链。在有一个或多个J链时,IgM可形成五聚体结构,在无J链时,IgM可形成六聚体结构。据报道,六聚体IgM抗体比五聚体具有更强的CDC。对于IgM,虽然本发明的抗体和融合蛋白被认为可以形成五聚体或六聚体,其他非五聚体或六聚体形式的更大或更小的多聚体也可以形成。
上面提及的成分从N末端到C末端的顺序为:IgG或IgA CH1区(如果存在的话)、IgG铰链区(如果存在的话),IgG或IgA CH2区、IgG或IgA CH3区、Cμ3区和Cμ4区。
通常,所有的IgG或IgA区具有相同的同种型(isotype)和亚型(subtype)。也就是说,所有的IgG区是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,并且所有IgA区来自IgA1或IgA2。
优选地,所述IgG或IgA区是人IgG或IgA区。同样,所述Cμ3和Cμ4区优选是人的。图16A、B、C显示了人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM重链恒定区的序列,成分被描述为CH1、铰链、CH2、CH3、Cμ1、Cμ2、Cμ3和Cμ4和J链。然而,来自其他物种的区也可以被使用,包括非人灵长类、骆驼科、软骨鱼,小鼠或大鼠。
提及人IgG、IgA和IgM区(即,CH1、铰链、CH2、CH3、Cμ3和Cμ4)或J-链是指所述示例性序列、它们的同种异型(allotypes)或同族同种异性(isoallotypes)、或其他与示例性序列具有90、95、98或99%序列一致性的变体序列,和/或与所述示例性序列不同,不同之处在于:对于CH1、CH2、CH3、Cμ3和Cμ4和J-链具有至多1、2,、3、4、5、10或15个氨基酸缺失、取代或***,对于IgG1、2或4铰链区,具有1、2或3个氨基酸缺失、取代或***,对于IgG3铰链区,具有至多1、2、3、4、5或6个氨基酸缺失。取代若存在的话,最好是保守的。人类恒定区显示了不同个体之间同种异型变异(allotypic variation)和同族同种异型变异(isoallotypic variation),即,在一个或多个多态性位点,恒定区可以在不同个体中不同。同族同种异型与同种异型的区别在于,识别一种同种异型的血清可以结合到一个或多个其它同种型(isotype)的非多态性区域。提及人恒定区,其包括具有任何天然同种异型(包括同族同种异型)的恒定区,或包括具有占据天然同种异型中的多态位点的残基的任何排列的恒定区。非人类的恒定区序列由例如Swiss-Prot or Genbank databases提供。提及非人恒定区,其同样包括同种异型或同族同种异型变异体,和它们的排列(permutations),或不同于天然序列的其它变异体序列。变异的范围是由序列一致性和/或关于非人恒定区的天然序列的取代数目来定义,这类似于上述关于人恒定区的变异体。Eu编号法则用于定义同种异型间的或不同物种间的对应位置,或用于定义突变的位置。
轻和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸,如重链的C-末端赖氨酸,可能丢失或部分或全部其分子被衍生化。取代可以在恒定区进行,以减少或增加效应器功能,例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见,例如Winter et al.,US Patent No.5,624,821;Tso et al.,US Patent No.5,834,597;and Lazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005,2006)或以延长在人类中的半衰期(见,例如,Hinton et al.,J.Biol.Chem.279:6213,2004)示例性的取代包括在250位的Gln和/或在428位的Leu(EU编号),用以增加抗体的半衰期。234,235,236和/或237任何位置的取代会降低对于Fcγ受体的亲和力,尤其是FcγRI受体(参见,例如美国专利6624821)。任选地,人IgG的234、236和/或237位由丙氨酸取代,及235位由谷氨酰胺取代(参见,例如,美国专利5,624,821)。
如果使用铰链区,所述铰链的一部分可以被合成的连接器取代。这融合蛋白中是经常的,其中融合蛋白的结合区通过一个铰链区连接到CH2和CH3IgG或IgA恒定区,在所述铰链区中,例如高达10个N-末端残基被合成的柔性的连接器取代。Gly-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Leu-Ala-Ala-Ala-Ala和它们的多聚体是这样的连接器的例子。所述铰链区也可以通过合成的连接器被整个取代或整个被删除而无取代。
一些可能的例外是如下面讨论的:合成的连接器取代了部分或全部铰链区、一个或一些氨基酸取代用以增强或抑制效应器功能或FcRn结合、或N-末端被附加上结合区,而优选的是,杂交恒定区仅包含上面提及的CH1、铰链、CH2、CH3、Cμ3和Cμ4区,而不含其他序列。然而,其他的序列,如六组氨酸标签(hexa-histidine tag),可以被添加,但不是必要的。
III.抗体的性能
上述含有杂交重链恒定区的抗体或融合蛋白的性能取部分决于同种型、CH1和铰链(如果存在)及CH2和CH3区的亚型、是否存在CH1和/或铰链区及所述抗体或融合蛋白结合的抗原的性质。
含有杂交恒定区的抗体和融合蛋白保留了至少Cμ3和Cμ4的能力以使单价或二价单元多聚以形成更高的价,或保留了IgG或IgA抗体的至少一种性能。当CH1、铰链(如果存在)、CH2和CH3是IgG来源的,那么所述抗体保留至少IgG样的蛋白G结合、pH依赖性FcRn结合性能,及特异性结合靶抗原的能力。
同种型或亚型的选择取决于所需的性能。对于非杂交抗体,如果需要强效应器功能(通常是针对癌细胞、病原体),那么选择IgG1或IgG3,如果需要弱的或不需要CDC、ADCC和调理素作用(这种情况可能是抑制受体-配体相互作用),那么选择gG2或IgG4。
当CH1和铰链区(如果存在的话)、CH2和CH3区是人类IgG1,那么含有杂交恒定区的抗体或融合蛋白具有以下性能:pH依赖性FcRn结合、特异性结合到蛋白A和蛋白G,并且可以具有效应器功能,诸如取决于结合的抗原的ADCC、CDC、调理素作用。如果结合的抗原是表面受体(例如,在细胞或病毒上),所述效应器功能通常存在。如果所述抗原通常是可溶形式,则效应器功能通常不针对可溶性抗原表达,但是可以通过将所述抗原以结合形式(例如,细胞表面上)表达来证明。
当所述CH1和铰链区(如果存在的话)、CH2和CH3区是人类IgG2、IgG4的,那么含有杂交恒定区的抗体或融合蛋白至少具有pH依赖性FcRn结合和特异性结合到蛋白A和蛋白G的性能。人IgG2和IgG4同种型普遍缺乏CDC。IgG4针对结合的抗原具有一定的ADCC和调理作用,但是弱于人IgG1或IgG3。
当所述CH1和铰链区(如果存在的话)、CH2和CH3区是人类IgG3,那么含有杂交恒定区的抗体或融合蛋白至少显示pH依赖性FcRn结合和特异性结合到蛋白G的性能。该抗体或融合蛋白还可能显示效应器功能,如ADCC、CDC、调理素作用,这取决于结合的抗原是表面抗原还是可溶的,正如IgG1的情况。
含有杂交恒定区的抗体或融合蛋白如果存在CDC、ADCC或调理素作用,那么相比于可供比较的含有常规IgG恒定区的抗体或融合蛋白,所述CDC、ADCC或调理素作用的水平有时相同(在实验误差范围内)或有时更高。
IV.抗体和融合蛋白的形式(formats)
杂交恒定区可以被并入单特异性抗体、融合蛋白、以及多特异性复合体。对于单特异性抗体的表达,杂交重链恒定区可以链接到重链可变区,并且与包含可变区和恒定区的轻链一起表达。所述重链和轻链通过重链CH1区和轻链恒定区彼此结合以形成异源二聚体。二个异源二聚体然后通过铰链、重链的IgG或IgA部分的CH2和CH3区联合,以四聚体单元,正如常规抗体的情况。四聚体单元可以通过所述单元的重链恒定区的Cμ部分的联合而多聚。所述重链恒定区可以通过不同链的Cμ3区之间的二硫键联合,和/或不同链的μ尾端之间的二硫键联合。
对于单特异性单链抗体,重链和轻链可变区被表达为通常通过肽间隔区隔开的同一条链(参见,例如US5,260,203,US5869203,US6,291,159)。肽间隔的长度决定了重链和轻链可变区是否分子内(intramolecularly)联合形成一种单元(该单元含有一条轻链可变区及一条分子内配对的重链可变区)或分子间(intermolecularly)联合形成四聚体单元(该四聚体单元有两个轻链可变区和两个重链可变区,每个轻链可变区分子间地结合到重链可变区)。在两种情况下,所述单元可以通过与重链可变区连接的杂交恒定区的Cμ部分而多聚。通过Cμ部分的二硫键的多聚化可以导致含有至少约五或六个单元的复合物的形成。
所述杂交恒定区可以用于任何类型的工程抗体(engineeredantibody),包括嵌合的、人源化的、饰面的或人抗体。所述抗体可以是单克隆抗体、或基因工程化的多克隆抗体制备物(参见US6,986,986)。
对于融合蛋白,杂交恒定区被表达为连接至异源多肽。所述异源多肽提供了一个在恒定区的N-末端的结合区,有时也简称为结合区。IgG或IgA的CH1区通常不包括在融合蛋白的恒定区内。IgG铰链区可以包括在内或不被包括在内。在一些融合蛋白中,部分或全部铰链区被合成的连接器肽(linker peptide)替换,所述连接器肽赋予了融合蛋白的结合部与所述杂交恒定区之间的灵活性。
融合蛋白的结合区(binding region)可以是任何迄今为止生产的用于其它融合蛋白中的结合部(binding portion)的类型。结合区的实例是细胞受体的胞外结构域,或它们的配体或反受体(例如,TNF-α受体、LFA3或IL-1受体或Trail)。
抗体和融合蛋白均可以以多特异性形式表达,即作为一个复合体,该复合体含有不同靶特异性的抗体或融合蛋白单元。个体的特异性通过恒定区的Cμ部分的多聚化而相联合。在一个复合体中的不同特异性的数目可以是,例如2、3、4、5,、6、7、8、9、10、11或12。不同特异性的单元的组合可以发生在两个水平。在第一个水平,二价多聚化单元可以像双特异性抗体或异源二聚体融合蛋白那样包含两个结合特异性。在组合的第二个水平,不同特异性的多聚化单元可以通过Cμ介导的多聚化彼此结合。这种多聚化生成至少约五个或六个单元的复合体。
当结合特异性的上述两个水平聚合,本发明的方法使得至少约10个(五聚体)或12(六聚体)的特异性结合在一个相同复合体中。虽然在许多应用中,这个特异性的数量多于需要,但本发明的方法在特异性需求较少的应用中提供了优势(例如,仅有2)。因为在第二个水平中特异性被组合,统计学上更可能是所形成的任何复合体包括每个所需特异性的至少一个单元。相反,当通过常规方法表达双特异性抗体时,多特异性单元的形成会与单特异性单元的形成相竞争,这导致抗体异质群体,其中有些是双特异性的,但其中有相当多的是单特异性。
在抗体的多特异性形式中,所述单元通常包含不同的重链可变区。轻链可变区也可以是不同的。然而,也可以选择(例如,使用噬菌体展示)含有相同轻链可变区的具有不同结合特异性的抗体。此类抗体可以以多特异性形式组合,其中,所述单元具有不同的重链可变区,但相同的轻链可变区。
多特异性抗体或融合蛋白可包括对于在靶标(例如,癌细胞或病原体)上的抗原的结合特异性,也包括对于在效应细胞(例如,T-细胞上的CD3)上的抗原的结合特异性。样的多特异性复合体在靶细胞和效应细胞之间形成一座桥,并促进效应细胞的细胞毒作用或调理素作用活性。多特异性抗体或融合蛋白可另外或可选地包括对于在同一靶标(例如,肿瘤细胞或病原体)上的两个不同抗原的结合特异性。相比仅对单一抗原具有特异性的抗体或融合蛋白,这些抗体或融合蛋白对靶细胞具有更强的选择性毒性。其它的多特异性抗体或融合蛋白包括对于受体和其配体或反受体的结合区。相比仅能单独结合受体或配体/反受体的抗体或融合蛋白,这些抗体或融合蛋白可发挥更大的抑制作用。这些特异性中的任何一个和其他特异性均可组合在一个相同的多特异性复合体中。
V.基因工程和表达
含有杂交重链恒定区链的抗体或融合蛋白通过重组表达产生。杂交恒定区是通过将编码IgG或IgA部分的DNA片段框内(in-frame)融合编码Cμ部分的DNA片段。优选地,IgG或IgA部分的CH3外显子的最后一个氨基酸被框内融合到(fused in frame to)Cμ3外显子的第一个氨基酸。编码杂交恒定区的片段的N-末端可以被融合到编码结合区(binding region)的DNA片段,当是抗体的情况下,所述结合区是重链可变区,当是融合蛋白的情况下,所述结合区是其他结合区(例如,一个细胞表面受体的细胞外区域)。在单链抗体中,编码至少轻链可变区的DNA构建体可以框内融合编码重链的片段。可选地,所述轻链可分别表达,既可作为与重链相同的载体中的不同表达单元,也可作为单独载体上的表达单元。如在常规抗体的产生中,编码抗体链或融合蛋白的DNA片段通常可操作地在N-末端被连接到编码信号肽的DNA片段,以使之分泌。
对于构建一个编码多种成分的构建体,其所融合的遗传元件的顺序并不重要。例如,编码重链可变区的DNA片段可以连接到编码杂交恒定区的IgG部分的DNA,也可以连接到编码IgM部分的DNA,或编码杂交恒定区的片段可以首先被彼此连接(linked to one another first)。所述片段还可以在重叠PCR类型反应(overlapping PCR-type reaction)中,通过加入编码各个片段的重叠寡核苷酸被同时连接。在实践中,一旦编码杂交恒定区的表达载体被制备,所述同一载体可用于***任何重链可变区或在融合蛋白情况下(有时是轻链可变区)的其他结合区,而不需要再创建编码杂交恒定区的DNA片段。
哺乳动物细胞是用于表达编码发明的抗体或融合蛋白的核苷酸片段的优选宿主(见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987))。许多能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系如今已被开发,并包括CHO细胞系,各种COS细胞系,HeLa细胞,HEK293细胞,L细胞和包括SP2/0和NS0的非抗体产生(non-antibody-producing)骨髓瘤。优选地,所述细胞是非人的。用于产生抗体的细胞可以是或不是内源性表达J链。如果内源J链不被表达或表达水平不足,宿主细胞可以被遗传修饰以表达J链(即,通过引入一个构建体编码它)。然而,也可以使用不表达J链的宿主细胞。带或不带J链的细胞选择影响着所产生的抗体或融合蛋白的化合价(例如,带J链的为五聚体,不带J链的为六聚体)。优选地,本发明的抗体或融合蛋白从单克隆细胞系中表达。
这些细胞的表达载体可以包括:表达控制序列,如复制起点,启动子,增强子(Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986)),和必要的加工信息位点,如核糖体结合位点,RNA剪接位点,聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是来自内源基因、巨细胞病毒、SV40,腺病毒、牛***瘤病毒等的启动子。见Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992)。
细胞转染了编码所述要被表达的抗体或融合蛋白的一个或多个载体。对于多链抗体,重链和轻链可以表达在相同或不同的载体上。为表达多特异性复合体,编码该复合体(即,不同的抗体或融合蛋白)成分的DNA可以在相同或不同的载体上。
抗体或融合蛋白链被表达,加工以去除信号肽,组装和从宿主细胞分泌。据认为,多聚化和与J链联合至少主要发生在细胞内,由此,分泌的抗体或融合蛋白主要是多聚体,尤其是通过杂交恒定区的Cμ部分将5个或6个单元联合的多聚体。
抗体或融合蛋白可通过常规的抗体纯化方法从细胞培养上清液中进行纯化。如果杂交恒定区包括IgG部分,则该纯化可以包括使用蛋白A或蛋白G作为亲和试剂的层析步骤。如果杂交恒定区包括IgA部分,可用Jacalin lectin亲和层析法来代替。常规抗体纯化方法,如离子交换,羟磷灰石色谱法或高效液相色谱法也可用(一般参见,Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,NY,1982))。
VI.靶标
含有杂交恒定区的抗体或融合蛋白可以被定向于任何靶分子。所述抗体或融合蛋白尤其适用于表面结合的靶蛋白(surface-bound targetproteins)(例如,在细胞或病毒上),其中,所述靶蛋白的团聚(aggregation)诱导所需的反应。所希望的反应可以是,例如,清除具有靶标的细胞或病毒、通过受体的信号转导,例如,诱导细胞凋亡,抑制受体结合于配体或反受体,或内在化结合有毒剂的抗体或融合蛋白。抗体或融合蛋白可以被制备成具有与现有的商业抗体或融合蛋白相同的靶标,或所述抗体或融合蛋白可以是商业抗体或融合蛋白的衍生版本,其中现有的恒定区已被本发明的杂交恒定区取代。通过与目标配体(该目标配体与表面结合的抗原结合)结合,所述抗体或融合蛋白还可以直接团聚表面结合的抗原。
为了说明作用的一种可能的机制,本发明的对肿瘤坏死因子受体超家族的成员具有特异性的、包含杂交重链恒定区的抗体或融合蛋白被制备。这种受体需要三聚化来进行信号转导。由于所述抗体是多价的(例如,五聚体或六聚体),它可以使肿瘤细胞的表面上抗原多聚化,并诱导肿瘤细胞凋亡和/或生长停滞。这样的多价抗体用于治疗癌症的功效可以通过小鼠异种移植模型(mouse xenograft models)或其他合适的癌症的动物模型来研究。
为了说明另一种机制,本发明的包含杂交重链恒定区的抗体或融合蛋白被制备,其对于免疫细胞上表达的抗原具有特异性,所述免疫细胞例如B细胞、T细胞、单核细胞,嗜中性粒细胞或树突状细胞。这样的抗体可以使免疫细胞表面上的抗原多聚化,并触发正常或异常的信号转导。可替换地,这样的抗体可以触发细胞表面抗原的内在化。这样的免疫细胞的功能得到增强或抑制,这取决于抗原、细胞类型和结合的表位,从而导致免疫***的调节。这样的抗体用于治疗免疫***疾病的功效可以在适当的体外***中进行研究,或在免疫失调的动物模型中进行研究。
为了说明另一种机制,包含杂交重链恒定区的抗体或融合蛋白被制备,其对于由病原体表达的抗原具有特异性,所述病原体如传染性细菌、酵母、真菌或病毒。所述抗体使传染性微生物或病毒无效(例如,通过ADCC,CDC,调理素作用,或通过抑制病原体和细胞受体之间的相互作用,或者通过体毒性部分(toxic moiety)连接到抗体的作用)。这样的抗体用于治疗传染性疾病的功效可以在适当的体外***中进行研究,或在传染的动物模型中进行研究。
感兴趣的标靶包括:肿瘤细胞上的受体和它们的配体或反受体(例如CD3、CD20、CD22、CD30、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、DR4、DR5、EGFR、CA-125/Muc-16、ΜC1受体、PEM抗原、gp72、EpCAM、Her-2、VEGF或VEGFR、神经节苷脂GD3、CEA、AFP、CTLA-4、alpha v beta3、HLA-DR10beta、SK-1)。其它感兴趣的靶标是自身抗体或介导自身免疫性疾病的T-细胞亚群。其他感兴趣的靶标是生长因子受体(例如,FGFR、HGFR、PDGFR、EFGR,NGFR和VEGFR)及其配体。其它靶标是G-蛋白受体并包括物质K受体(substance K receptor)、血管紧张素受体、α和β肾上腺素受体、血清素受体,和PAF受体。参见,例如,Gilman,Ann.Rev.Biochem.56:625649(1987)。其他靶标包括离子通道(例如,钙,钠,钾通道)、毒蕈碱受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸盐受体和多巴胺受体(见Harpold,U.S.Pat.No.5,401,629and U.S.Pat.No.5,436,128)。其它靶标是粘附蛋白(adhesion proteins)如整合素、选择素、和免疫球蛋白超家族成员(见Springer,Nature346:425433(1990).Osborn,Cell62:3(1990);Hynes,Cell69:11(1992))。其它靶标是细胞因子,如白介素IL-1贯穿至最新的IL-37、肿瘤坏死因子、干扰素、和肿瘤生长因子β、集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。见人细胞因子:Handbook for Basic&Clinical Research(Aggrawal et al.eds.,BlackwellScientific,Boston,Mass.1991)。其它靶标是淀粉样肽(amyloidogenicpeptides),如Abeta,α-突触核蛋白或朊病毒肽。其它靶标是激素、酶、细胞内和细胞间信使,例如,腺苷酸环化酶(adenyl cyclase)、脒环化酶(guanyl cyclase)和磷脂酶C。靶标分子可以是人类的,哺乳动物的或细菌的。其它靶标是抗原,如来自病毒和细菌的微生物病原体的和肿瘤的蛋白质、糖蛋白和碳水化合物。
一些商业抗体和它们的靶标的例子包括:alemtuzumab、CD52、rituximab、CD20、trastuzumab Her/neu、nimotuzumab、cetuximab、EGFR、bevacizumab、VEGF、palivizumab、RSV、abciximab、GpIIb/IIIa、infliximab、adalimumab、certolizumab、golimumab TNF-alpha、baciliximab、daclizumab、IL-2、omalizumab、IgE、gemtuzumab、CD33、natalizumab、VLA-4、vedolizumab alpha4beta7、belimumab、BAFF、otelixizumab、teplizumab CD3、ofatumumab、ocrelizumab CD20、epratuzumab CD22、alemtuzumumab CD52、eculizumab C5、canakimumab IL-1beta、mepolizumab IL-5、reslizumab、tocilizumab IL-6R、ustekinumab、briakinumab IL-12,23。商业融合蛋白的实例包括:结合TNF-α的依那西普(etanercept)、alefacept(LFA3-Fc融合体,其结合CD2)、TACI-Fc融合体(其结合BAFF和APRIL)、abatacept(CTLA-4-Fc,其结合CD80and CD86)、romiplostim(与Fc融合的血小板生成素的肽类似物)。所述任何商用的抗体或融合蛋白可被修改,将现有的重链恒定区替换为本发明的杂交恒定区。另外,杂交恒定区可以被连接到与上述任何商业抗体或融合蛋白有相同靶特异性(例如,如通过竞争测定法测定)的其它抗体。
VII.免疫偶联物
抗体或融合蛋白可以偶联于毒性剂。毒性剂可以是细胞毒性的(cytotoxic)或抑制细胞生长的(cystostatic)。毒性剂一些例子包括:抗微管蛋白剂、auristatin类、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如,铂络合物,如顺铂,单(铂),双(铂)和三核铂络合物和卡铂(carboplatin))、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、duocarmycins、喜树碱、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、lexitropsins、亚硝基脲、、platinols、预成形的化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射增敏剂、类固醇、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱,或类似物。多种放射性核素可用于生成放射偶联性抗体(radioconjugated antibodies)。例子包括:212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体,所述抗体与毒性剂的偶联物可以使用很多多种双功能蛋白偶联剂制备,如N-琥珀酰亚胺3-2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基噻吩(iminothiolane,IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如dimethyladipimidate HCl)、活性酯类(如,双琥珀酰亚胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate))、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(如,对(p-叠氮苯甲酰基)己二胺,bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine)、双-重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基-乙二胺,bis-(p-diazonium benzoyl)-ethylenediamine)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。毒性剂也可以通过连接器(linker)连接到抗体,所述连接器可以在细胞内的条件下被切割(US2003-0083263,2005-0238649和2005-0009751)。对于上述毒性剂,它们在细胞中内在化(internalized)是唯一有效的或最有效的。本发明的抗体或融合蛋白可通过结合到细胞受体而被内在化,例如,细胞受体的交联可促进内在化。
VIII.治疗方法和药物组合物
本发明的抗体或融合蛋白可用于治疗癌症,这些癌症包括上述商业抗体已被用来治疗的那些。所述方法可用于治疗实体瘤(solid tumors),尤其是血液恶性肿瘤,例如白血病(例如T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病),淋巴瘤(Hodgkin’s或Non-Hodgkin’s),或多发性骨髓瘤。实体瘤包括皮肤的(例如黑素瘤),卵巢的,子宫内膜的,膀胱的,乳腺的,直肠的,结肠的,胃的,胰腺的,肺的,胸腺的,肾的和脑的。
本发明的抗体和融合蛋白也可用于抑制各种不希望的免疫应答,包括那些在上文中提到的已经用商业抗体抑制的。
一类可由本发明的抗体或融合蛋白治疗的免疫失调是移植排斥。当同种异体细胞或器官(例如,皮肤,肾,肝,心脏,肺,胰腺和骨髓)移植到宿主(即供体和受者是来自相同物种的不同的个体),宿主的免疫***可能针对移植体中外源抗原(宿主抗移植体疾病,host-versus-graftdisease)装载免疫应答,这导致移植组织的破坏。本发明的抗体对于在受体中阻断异体抗原诱导的免疫应答是特别有用的。
本发明的抗体或融合蛋白的一个相关的用途是调节涉及“移植体抗宿主(graft versus host)”病(GVHD)的免疫应答。GVHD是潜在的致命疾病,它发生于免疫活性细胞(immunocompetent cells)被转移到同种异体接受者时。在这种情况下,供体的免疫活性细胞可能攻击受体中的组织。皮肤、肠上皮细胞和肝组织中是频繁的目标,在GVHD过程中可能被破坏。当免疫组织被移植时,例如骨髓移植,该疾病产生了一个特别严重的问题;但在其他情况下,包括心脏和肝脏移植,GVHD也被报道不太严重。
另一种需要免疫抑制的情况是治疗自身免疫性疾病如1型糖尿病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、μltiple硬化症(μltiple sclerosis)、僵人综合征(stiff man syndrome)、类风湿性关节炎、重症肌无力和***性红斑狼疮。在这些疾病中,身体产生细胞和/或体液免疫应答来抵抗其自身抗原,这导致抗原的破坏和潜在的后果严重和/或致命的的结果。自身免疫性疾病通过施用本发明的抗体或融合蛋白中的一种来治疗。
其他可被本发明的抗体或融合蛋白治疗的免疫失调包括:哮喘、过敏症、腹腔疾病(celiac disease)、牛皮癣和眼色素层炎。腹腔疾病,牛皮癣和眼色素层炎是自身免疫性疾病。
所述抗体或融合蛋白还可以用于治疗病原性感染,如病毒、细菌、原生动物或真菌感染。病毒性感染的一些实例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如,VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV和Epstein Barr病毒)、腺病毒、XMRV病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、cornovirus、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、MLV-相关病毒、***状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒(arboviral encephalitisvirus)。细菌性感染的一些实例包括衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、pneumonococci、脑膜炎球菌和conococci、克雷伯氏菌属、变形杆菌、沙雷氏菌属、假单胞菌属、军团菌、白候杆菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽菌、瘟疫、钩端螺旋体、Lymes疾病细菌、链球菌或奈瑟氏球菌。致病性真菌的一些实例包括念珠菌、曲霉属,隐球菌菌、组织胞浆菌、肺孢子菌和穗霉菌。原生动物的例子包括隐孢子虫、贾第鞭毛虫和疟原虫。
抗体或融合蛋白以有效的方案实用意味着施用的剂量和路径,它们可以延迟发作、降低严重程度、抑制进一步恶化,和/或改善至少一种迹象或失调的症状。如果患者已经经受失调,方案(regime)可以被称为治疗上的有效方案。如果患者相对于一般群体具有提高的失调(disorder)的风险但又尚未经历症状,所述可以被称为预防上的有效方案。在一些实例中,治疗上的或预防上的功效可以相比于同一病人的历史对照或过去经历而在个体患者中被观察。在其他实例中,治疗上的或预防上的功效可以相比于未经治疗的对照群体患者而在一个群体中的临床前或临床试验中证明。
示例性的抗体或融合蛋白的剂量是0.01-20,或者0.5-5,或者0.01-1,或者0.01-0.5,或0.05-0.5mg/kg体重(例如,0.1,0.5,1,2,3,4或5mg/kg)或10-1500毫克作为固定剂量。剂量取决于患者状况和对先前治疗的反应,如果有的话,治疗是预防性的还是治疗性的,所述失调是否为急性或慢性,及其他因素。
施用可以是肠胃外,静脉内,口服,皮下,动脉内,颅内,鞘内,腹膜内,外用,鼻内或肌内。通过静脉内或皮下给药而施用到体循环是优选的。静脉内给药可以是,例如,通过输注一段时间如30-90分钟。
给药频率依赖于抗体或融合蛋白在循环中的半衰期、患者情况、给药途径等因素。该频率可以是每天,每周,每月,每季度,或以不规则的间隔,这响应于患者情况和治疗的失调的进展的变化。示例的用于静脉内给药的频率是介于每周和每季度之间经历一个连续的治疗,尽管更多或更少的给药频率也是可能的。对于皮下给药,示例性的给药频率为每天至每月,尽管更多或更少的给药频率也是可能的。
给药剂量的数目取决于所述失调是急性或慢性的、和对于治疗的失调的应答。对于急性失调或慢性失调的急性发作,1和10之间的剂量通常是足够的。对于急性失调或慢性失调的急性发作,有时单次推注剂量,任选地以分开的形式,是足够的。对于急性失调或急性发作的复发,可重复治疗。对于慢性失调,抗体可以定期施用,如至少1,5年或10年内的每周、每两周、每月、每季、每6个月,或患者的一生。
对于胃肠外给药的药物组合物优选是无菌的,基本上等渗,并在GMP条件下生产。药物组合物可以以单位剂量形式(unit dosage form)来提供(即,单次给药的剂量)。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料进行配制。剂型(formulation)取决于所选择的给药途径。对于注射,抗体可在水溶液中配制,优选在生理相容的缓冲液如Hank氏溶液,林格氏溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液(以减少注射部位的不适感)。该溶液可以含有配制剂(formulatory agents)如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。作为一种选择,抗体可以是冻干形式,在使用前与合适的载体构造,例如,无菌无热原水。
本发明的抗体可以与有效针对所治疗的失调的其他治疗方法结合起来治疗。对于治疗免疫失调,常规治疗包括:肥大细胞脱颗粒抑制剂、皮质类固醇、非类固醇消炎药,以及更强的抗炎药物,如咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、瘤可宁、FK506和环孢菌素。生物抗炎剂,如(那他珠单抗)或(阿达木单抗),也可以被使用。当治疗癌症时,本发明的抗体可与化疗、放疗、干细胞治疗、外科手术或用其它生物制剂一起使用,所述生物制剂例如针对HER2抗原的(曲妥珠单抗)、针对VEGF的(贝伐单抗)、对EGF受体的抗体如(西妥昔单抗)和(帕尼单抗)。化疗剂包括:苯丁酸氮芥、环磷酰胺或苯丙氨酸氮芥、卡铂、道诺霉素,多柔比星,伊达比星,和米托蒽醌,氨甲喋呤,氟达拉滨和阿糖胞苷,依托泊苷或拓扑替康,长春新碱和长春碱。对于感染,治疗可与抗生素、抗病毒剂、抗真菌或抗原生动物剂或类似物一起使用。
IX.其他应用
在临床诊断或治疗或研究的情况下,所述抗体或融合蛋白可用于检测靶分子。例如,所述抗体可用于检测癌症相关的抗原,用于作为患者正经受免疫介导的的并需要治疗的失调的指示。该抗体也可以作为研究试剂而出售,用于检测靶标和对各种刺激的响应。在这些用途中,抗体或融合蛋白可以用荧光分子、自旋标记分子、酶或radioisotypes标记,并且可以跟与执行测定必要的试剂一起以试剂盒的形式提供。所述抗体或融合蛋白还可以用于纯化它们的靶抗原,例如,通过亲和层析。
所有以上和以下引用的专利申请、网站、其出版物、注册号等以全文引用的方式并入,其引用程度就如同将每一项特定且个别地以全文引用的方式并入。如果不同版本的序列在不同时期结合了不同注册号,则所述版本及其注册号以本申请的有效申请日为准。如果适用,关于所述的注册号,有效申请日意味着比实际申请日更早或优先申请的申请日。同样,如果不同版本的公开文本、网站等公开于不同时间,则以最接近本申请有效申请时间的版本为准,除非另有说明。本发明的任何功能,步骤,元件,实施例可以结合任何其他使用,除非另有说明。虽然本发明已经通过图示和实施例描述了本发明的一些细节,以便于清楚和理解,很明显某些实施某些变化和修改也是在权利要求保护范围之内的。
实施例
实施例1:表达载体
在这项工作中的基因克隆、形成突变和质粒构建使用标准的分子生物学技术。参见Sambrook和Russel(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),Kostelny et al.(Int.J.Cancer93:556-565,2001),和Cole et al.(J.Immunol.159:3613-3621,1997),其在此引入作为参考。
为了制备小鼠抗人CD79a单克隆抗体9G6的嵌合的IgG1形式(Ch9G6-IgG1),哺乳动物表达载体pCh9G6-IgG1(图1)被构建成包含下列基因成分。从图1的pCh9G6-IgG1的SalⅠ位点顺时针转动,质粒包含重链转录单元,所述重链转录单元起始自人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(图中的CMV-P),以启动该抗体重链基因的转录。CMV启动子之后是:小鼠抗-人CD79a单克隆抗体9G6的重链可变区外显子(9G6VH)(其侧翼为SpeI位和HindIII位点),含有人γ-1重链恒定区的基因组序列,它包括CH1(CH1(γ1))、铰链(h(γ1))、CH2(CH2(γ1))和CH3(CH3(γ1))外显子与***的内含子,和人γ-1重链基因的多聚腺苷酸化位点。在重链基因序列之后,轻链转录单元自CMV启动子(CMV-P)起始,其次是小鼠抗-人CD79a单克隆抗体9G6的轻链可变区(9G6VL)外显子(侧翼为NheI和EcoRI位点),含有人κ链的恒定区外显子(CL)(它前面有一部分内含子),在CL外显子后是人κ链基因的多聚腺苷酸化位点。所述轻链基因之后是SV40早期启动子(SV40-P)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位点的片段(SV40-A)。最后,所述质粒包含质粒pUC19的一部分,它包括细菌复制起点(pUC ori)和β内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。图中的箭头表示转录方向。
产生抗-人CD79a单克隆IgG抗体9G6的小鼠杂交瘤在JN Biosciences公司(Mountain View,CA)制备,使用重组人CD79a蛋白作为免疫原,并按照标准杂交瘤技术制备。VH和VL序列通过标准实验程序测定,如Tsurushita等人描述的方法(Methods36:69-83,2005)。SpeI-HindⅢ片段中的9G6VH基因被设计成一个外显子,所述外显子包括在编码区的3'末端的剪接供体信号。包含信号肽、由pCh9G6-IgG1中VH外显子编码的9G6VH的氨基酸序列如下所示。成熟的9G6VH序列开始于SEQ IDNO:1的第20位。
9G6VH的氨基酸序列(SEQ ID NO:1):
MGWSRIFLFLLSITAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSTSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSVDSAVYFCERFYYGNTFAMDYWGQGTSVTVSS
在NheI-EcoRI片段内的9G6VL基因也被设计成一个外显子,该外显子包括在编码区的3'末端的剪接供体信号。含有信号肽、由pCh9G6-IgG1中的VL外显子编码的9G6VL的氨基酸序列如下所示。成熟9G6VL序列开始于SEQ ID NO:2的第20位。
9G6VL的氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKR
pCh9G6-IgG1中编码的免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
在pCh9G6-IgG1中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:3):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在pCh9G6-IgG1中编码的免疫球蛋白轻链恒定区的氨基酸序列如下所示。
在pCh9G6-IgG1中编码的轻链恒定区(SEQ ID NO:4):
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表达载体pCh9G6-IgG1被改造,以构建新的表达载体pCh9G6-IgG1/M,以这样的方式,编码人μ重链CH3和CH4区(分别为Cμ3和Cμ4)的cDNA衍生的片段被框内融合到(fused in frame to)pCh9G6-IgG1铰链区中的最后一个氨基酸。Cμ3和Cμ4的氨基酸序列如下所示。
人μ重链的Cμ3和Cμ4(SEQ ID NO:5):
DQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
在pCh9G6-IgG1/M中,人γ-1重链的CH2和CH3外显子被删除。pCh9G6-IgG1的轻链序列并未在pCh9G6-IgG1/M中被改造。pCh9G6-IgG1/M的结构示意图显示于图1。pCh9G6-IgG1/M中编码的重链恒定区的结构从N-末端到C-末端包括:人γ-1重链的CH1和铰链区、Cμ3和Cμ4区。的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-IgG1/M中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:6):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
表达载体pCh9G6-IgG1还被改造,以这样种方式,Cμ3和Cμ4的编码被框内融合到(fused in frame to)pCh9G6-IgG1的CH3外显子中的最后一个氨基酸。轻链序列未被改造。所得质粒即pCh9G6-MVIgG1显示于图1。pCh9G6-MVIgG1中编码的重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-MVIgG1中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:7):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
产生自pCh9G6-IgG1、pCh9G6-IgG1/M和pCh9G6-MVIgG1的抗体的单体形式(分别为Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1)的示意性结构显示于图2。图2中符号“CH1”、“铰链”、“CH2”和“CH3”分别表示人γ重链的CH1、铰链、CH2和CH3区。符号“Cμ3”和“Cμ4”分别表示人μ重链的CH3和CH4区。符号“CL”表示人κ恒定区。
实施例2:多价抗-CD79a IgG1抗体的表达、纯化及表征
表达载体pCh9G6-IgG1、pCh9G6-IgG1/M和pCh9G6-MVIgG1被引入小鼠骨髓瘤细胞系NS0(European Collection of Animal Cell Cultures,Salisbury,Wiltshire,UK)的染色体,以获得分别稳定生产Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1抗体的细胞系。NS0细胞在37℃下,在7.5%CO2培养箱中,生长于含10%胎牛血清的DME培养基(FBS;HyClone,Logan,UT)。通过电穿孔稳定转染NS0,如Bebbington et al.的描述(Bio/Technology10:169-175,1992)。转染前,各表达载体用FspI线性化(linearized)。在一个典型的实验中,用20μg线性化的质粒转染约107细胞,悬浮于含10%FBS的DME培养基中,并接种(plate)到几个96孔板中。48小时后,使用选择培养基(DME培养基,含10%FBS,HT媒介补充物(Sigma,St.Louis,MO),0.25mg/ml黄嘌呤和1μg/ml麦可酚酸)。选择启动大约10天后,转染子的培养上清被用来测定抗体的产生。
抗体表达通过夹心ELISA测定。在一个典型的实验中,用在PBS(磷酸盐缓冲盐水,pH7.4)中的1/2000稀释的山羊抗-人IgG Fcγ-链-特异性的(对Ch9G6-IgG1和Ch9G6-MVIgG1抗体)或抗-人IgM Fcμ-链-特异性的(对Ch9G6-IgG1/M)的多克隆抗体,以100μl/孔在4℃包被ELISA板过夜,用Wash Buffer(含0.05%吐温20的PBS)洗涤,用200μl/孔的Block Buffer(2%脱脂奶粉和0.05%吐温20的PBS)在室温下阻断0.5小时。用Wash Buffer洗涤后,适当稀释在ELISA Buffer(含1%脱脂奶粉和0.025%吐温20的PBS)中的100μl/孔测试样品被加入到所述ELISA板中。适当的人IgG/κ或IgM/κ抗体作为标准。在室温下孵育ELISA板1小时并用Wash Buffer洗涤后,使用100μl/孔的稀释于ELISAbuffer中的1/2000稀释的HRP-偶联的山羊抗-人κ链多克隆抗体检测结合的抗体。在室温下孵育1小时后,用Wash Buffer洗涤,加入100μl/孔的ABTS底物进行显色。通过加入100μl/孔的2%草酸使显色停止。在405nm处读吸光度。
分别产生Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1抗体的NS0稳定转染子适合于生长在使用Hybridoma SFM(Invitrogen)的无血清培养基中,在摇瓶中培养至密度约106/ml,供给1/10th体积的60mg/ml的溶解在SFM4MAb介质(HyClone)中的Ultrafiltered Soy Hydrolysate(Irvine Scientific,Santa Ana,CA),并进一步生长,直到细胞活力变得小于50%。离心和过滤后,培养上清液上样于蛋白质A柱(HiTrapMABSelect SuRe,GE Healthcare,Piscataway,NJ),用于Ch9G6-IgG1和Ch9G6-MVIgG1。在抗体用0.1M甘氨酸-盐酸(pH值3.0)洗脱之前,所述柱用PBS洗涤。由于Ch9G6-IgG1/M因缺乏人γ-1重链的CH2和CH3区,其不结合蛋白A,生产Ch9G6-IgG1/M的NS0稳定转染子培养物上清被上样到羊抗-人IgM琼脂糖柱(Sigma)。在抗体用0.1M甘氨酸-盐酸(pH值2.5)洗脱之前,所述抗-人IgM琼脂糖柱用PBS洗涤。所有洗脱的抗体的缓冲液用1M的Tris-HCl(pH8)中和,然后通过渗析改变到PBS中。抗体浓度通过测量280nm处的吸光度(1mg/ml=1.4OD)来确定。Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1被证实为特异性结合于人CD79a。
纯化的Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1抗体根据标准方法,通过SDS-PAGE表征。在还原条件下的分析表明,每种抗体是由两条链组成的。每条链的分子量通过跟分子量标记(markers)比较在凝胶上迁移率而被估计。在Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1之间相同的轻链的分子量估计有大约26kDa。对于Ch9G6-IgG1,重链的分子量估计为54kDa,对于Ch9G6-IgG1/M为58kDa,对于Ch9G6-MVIgG1为76kDa。每个轻和重链的估计分子量与基于相应氨基酸序列的预期分子量是一致的。
天然形式的Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1的分子大小是通过凝胶过滤来分析的,使用带有Superose610/300GL柱的AKTA Basic FPLC***,其对球蛋白的分离范围从5kDa到5000kDa(GE Healthcare,Indianapolis,IN)。PBS用作洗脱缓冲液。图3C-E显示了Ch9G6-IgG1(图3C)、Ch9G6-IgG1/M(图3D)和Ch9G6-MVIgG1(图3E)的洗脱图谱。对于Ch9G6-IgG1(在16.7ml洗脱)和Ch9G6-MVIgG1(9.9ml)只观察到一个主峰,而对于Ch9G6-IgG1/M,有两个主要的和几个次要的峰存在。从骨髓瘤细胞系纯化的人单克隆IgM抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)在10.4ml洗脱(图3B)。通过与分子量标准(Gel Filtration Standard,BioRad,Hercules,CA)比较(图3A),Ch9G6-IgG1/M的分子量在11.7ml和14.8ml两个洗脱主峰中估计分别为800kDa的和220kDa。主峰中的Ch9G6-IgG1的分子量估计为154kDa,这与基于SDS-PAGE上的重链和轻链的大小的Ch9G6-IgG1(160kDa)的单体的所预测的分子量是一致的。Ch9G6-MVIgG1在9.9ml被洗脱出,而人IgM在10.4ml被洗脱出,这表明Ch9G6-MVIgG1比人IgM稍大。由于SDS-PAGE分析表明,Ch9G6-MVIgG1的重链和轻链的分子量分别为76kDa和26kDa,Ch9G6-MVIgG1的单体的分子量被计算约为200kDa,这稍微比人IgM(约180kDa)的单体大。由于纯化自骨髓瘤细胞的人IgM可能以五聚体(或可能为六聚体)存在,因此可以推断,纯化自NS0细胞的Ch9G6-MVIgG1可能天然以五聚体或六聚体的形式存在。
实施例3:多价抗-CD79a IgG1抗体介导的细胞凋亡
人Burkitt淋巴瘤细胞系Ramos在细胞表面表达B细胞受体,它由膜结合的IgM/λ、CD79a和CD79b蛋白组成(Ollila et al.,Mol.Immunol.44:3537-3551,2007;Reth,Annu.Rev.Immunol.10:97-121,1992)。通过交联而使B细胞受体多聚化是已知可以诱导Ramos细胞凋亡的(Ollia et al.,同上)。
Ramos细胞生长于含10%FBS的DME介质中。为评估Ch9G6-IgG1和Ch9G6-MVIgG1抗体通过结合CD79a蛋白而多聚化细胞表面的B细胞受体从而导致细胞凋亡,每种终浓度为1μg/ml的抗体与Ramos细胞一起孵育(三份)。同时1μg/ml Ch9G6-IgG1被加入到10μg/ml山羊抗-人IgG多克隆抗体,用于交联。作为细胞凋亡的阳性对照,1μg/ml的山羊抗-人λ轻链多克隆抗体与Ramos细胞一起孵育。在7.5%CO2培养箱中培养3天之后,根据生产商的说明书,用alamarBlue(Invitrogen)测量细胞活力(cell viability)。
细胞活力百分比的计算是归一化存在抗体的吸光度值对不存在抗体的吸光度。没有细胞的吸光度值用作背景。山羊抗-人λ轻链多克隆抗体(图中“抗-λpAb”)情况下的活力为69%,Ch9G6-IgG1为107%,Ch9G6-IgG1和山羊抗-人IgG多克隆抗体的混合物(图中为“Ch9G6-IgG1+抗-人IgG”)为42%,对Ch9G6-MVIgG为153%。二价Ch9G6-IgG1没有诱导Ramos细胞凋亡,而交联的Ch9G6-IgG1能够诱导细胞凋亡。Ch9G6-MVIgG1几乎能跟交联的Ch9G6-IgG1一样,高效地诱导Ramos细胞凋亡。有多价抗-CD79a抗体功能的Ch9G6-MVIgG1可以使细胞表面的B细胞上的受体多聚化并导致Ramos细胞凋亡(图4)。
实施例4:多价IgG1抗体与新生儿Fc受体的结合
Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1抗体与FcRn在pH依赖性方式下的结合的能力通过流式细胞仪分析,使用在细胞表面上表达人FcRn的NS0细胞。稳定表达人FcRn(在细胞表面上的、由FcRnα链和β2-microglubulin成的异源二聚体)的NS0/FcRn转染子由Hinton et al.(J.Biol.Chem.279:6213-62162004)描述的一般方法制备,其通过引用并入本文。在Hinton et al.(supra)描述的步骤后,1μg/ml Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M和Ch9G6-MVIgG1分别与NS0/FcRn细胞在pH6.0和7.5在初期染色步骤中孵育。与FcRn结合的抗体用PE标记的羊多克隆的抗-人μ链抗体(对于Ch9G6-IgG1和无抗体对照)或PE标记的羊多克隆的抗-人γ链抗体(对于Ch9G6-IgG1/M、Ch9G6-MVIgG1和无抗体对照)在二次染色步骤中检测。如图5所示,Ch9G6-IgG1和Ch9G6-MVIgG1均可在pH为6.0时强烈结合FcRn。相比于pH6.0,它们在pH7.5的FcRn结合显著更弱,显示出pH依赖性的与FcRn的结合,表明这些抗体具有长的血清半衰期。在pH为6.0和7.5时,Ch9G6-IgG1/M均几乎不结合FcRn,表明了Ch9G6-IgG1/M的短的半衰期。这也跟Ch9G6-IgG1/M缺少与FcRn结合位点的事实是一致的。
实施例5:多价的IgG1抗体结合至CD16
细胞结合的IgG1和IgG3抗体的Fc区与NK细胞表面上表达的CD16分子(也称为Fcγ受体III型)的相互作用在人中触发了NK细胞针对抗体结合的细胞的抗体依赖性细胞介导的胞毒性(ADCC)(Hulett et al.,Adv.Immunol.57:1-127,1994)。CD16结合位点存在于编码在人γ-1和γ-3链的CH2区中的较低铰链(Sarmay et al.,Mol.Immunol.29:633-639,1992)。
多价IgG1抗体与人CD16的结合用流式细胞术分析。在第一抗体结合的步骤中,在其表面瞬时表达人CD16的HEK293细胞与1μg/ml的Ch9G6-IgG1、Ch9G6-IgG1/M,Ch9G6-MVIgG1或小鼠单克隆抗-人CD16IgG抗体3G8(BioLegend,San Diego,CA)在FACS Buffer(含0.5%牛血清白蛋白及0.025%叠氮化钠的PBS)中,在冰上30孵育分钟。作为对照,表达人CD16的HEK293细胞被孵育,但不含被测试的抗体。第二染色步骤中,用FACS buffer洗涤后,细胞与藻红蛋白(PE)标记的山羊多克隆抗-人γ重链抗体(对于Ch9G6-IgG1、Ch9G6-MVIgG1和无抗体对照)、PE-标记的山羊多克隆抗-人μ重链抗体(对于Ch9G6-IgG1/M、Ch9G6-MVIgG1和无抗体对照)或PE标记的山羊多克隆抗-小鼠γ重链抗体在FACS buffer中在冰上孵育15分钟。用FACS buffer洗涤后,染色的细胞悬浮于FACS buffer中,并通过流式细胞术分析。
小鼠抗-CD16抗体强烈结合到瞬时表达人CD16的HEK293细胞(图6I)。Ch9G6-IgG1也显示出强烈结合人CD16(图6D)。Ch9G6-MVIgG1表现出比Ch9G6-IgG1更强的结合至CD1(图6F),表明发挥ADCC的能力。另一方面,相比单独用PE-标记的山羊抗-μ重链抗体显色的细胞(图6C),Ch9G6-IgG1/M仅显示出边际结合至(marginalbinding to)人CD16(图6E)。Ch9G6-IgG1/M与CD16的明显的弱的结合不是由于PE-标记的山羊抗-μ重链抗体,因为当PE标记的山羊抗-μ重链抗体被用于第二染色步骤中时,Ch9G6-MVIgG1与CD16的结合强烈(图6G)。Ch9G6-IgG1/M不能结合到CD16,这导致无ADCC活性,这与所述Ch9G6-IgG1/M缺乏人γ-1重链的CH2和CH3区的事实是一致的。
例6:多价抗-CD30IgG1抗体的产生、表达、纯化及的表征
产生抗人CD30单克隆抗体San11的小鼠杂交瘤在JN Biosciences公司分离,使用重组人CD30蛋白作为免疫原即参照标准杂交瘤技术。San11VH和VL序列通过标准实验程序测定,如Tsurushita等人(同上)描述的方法。含有信号肽的San11VH氨基酸序列如下所示。成熟San11VH序列开始于SEQ ID NO:8的第20位。
San11VH(SEQ ID NO:8):
MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTIYDPNFQGKATITAYTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGYYGSSYWYFDVWGAGTTVTVSS
包括信号肽的San11VL的氨基酸序列如下所示。成熟San11VL序列开始于SEQ ID NO:9的第21位。
San11VL(SEQ ID NO:9):
MESDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTGLMQWYQQKPGQPPKLLIYSASNVESGVPARFTGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR
哺乳动物表达载体pChSan11-IgG1和pChSan11-MVIgG1通过下述步骤构建。首先,San11VH基因作为外显子构建,所述外显子含有编码区的3'末端的剪接供体信号和侧翼的SpeI和HindIII位点。类似地,San11VL基因作为外显子构建,所述外显子含有剪接供体信号和侧翼的NheI和EcoRI位点。携带San11VH外显子的SpeI位-HindⅢ片段和带San11VL外显子的NheI位-EcoRI片段被引入到pCh9G6-IgG1的相应位点,导致pChSan11-IgG1的产生。同样,携带San11VH外显子的SpeI-HindⅢ片段和携带San11VL外显子的NheI-EcoRI片段被引入到pCh9G6-MVIgG1的相应位点,导致pChSan11-MVIgG1的产生。pChSan11-IgG1和pChSan11-MVIgG1的整体结构分别与pCh9G6-IgG1和pCh9G6-MVIgG1(图1)是相同的。图2显示了产生自pChSan11-IgG1和pChSan11-MVIgG1的抗体(ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1)的示意性结构。
分别生产ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1的NS0稳定转染子的产生如实施例2所述。ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1通过蛋白A亲和层析法进行纯化,如实施例2所述。ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1在还原条件下的SDS-PAGE分析表明,每个抗体由两条链构成。通过比较分子量标记物,ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1的轻链的分子量估计均为25kDa。ChSan11-IgG1的重链的分子量估计为53kDa,对于ChSan11-MVIgG1为79kDa。在SDS-PAGE中观察到的轻和重链的大小与根据对应氨基酸序列预期的大小是一致的。
天然ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1抗体的分子大小通过采用凝胶过滤用Superose610/300GL分析,正如实施例2中所描述的。图7显示了ChSan11-IgG1和ChSan11-MVIgG1抗体的洗脱图谱。ChSan11-IgG1在15.7ml洗脱体积时具有单一的主峰(图7C)。通过与采用分子量标准(Gel Filtration Standard,BioRad)的洗脱图谱的校准曲线比较(图7A),主峰内的ChSan11-IgG1的分子量估计为约150kDa。这对应于基于SDS-PAGE上的轻链和重链的的大小而估计出的ChSan11-IgG1的分子量(156kDa)。ChSan11-MVIgG1在9.9ml洗脱有一个单一主峰(图7D)。人单克隆IgM型抗体(Jackson ImmunoResearch)在相同的条件下在10.4ml(图7B)被洗脱。考虑到ChSan11-MVIgG1,其具有基于SDS-PAGE结果的大约208kDa的分子量,而这稍大于人IgM单体(约180kDa),因此,我们推断,纯化自NS0细胞的ChSan11-MVIgG1其存在的天然形式是五聚体或六聚体。
通过单克隆抗-CD30IgG抗体与多克隆抗-IgG抗体的混合物处理,以使细胞表面上的CD30蛋白质交联,会引起人T细胞淋巴瘤细胞系Karpas299的细胞阻滞效应(cytostasis)(Wahl et al.,Cancer Res.62:3736-3742,2002)。为调查ChSan11-MVIgG1交联CD30蛋白质的能力,2x105Karpas299细胞在0.2ml RPMI-1640介质中孵育,所述RPMI-1640介质在96孔板中含有10%FBS,所述96孔板存在(1)2μg/ml的ChSan11-IgG1,(b)2μg/ml的ChSan11-IgG1和10μg/ml的山羊抗-人IgG多克隆抗体,或(c)2μg/ml的ChSan11-MVIgG1(图8)。5天培养后,Karpas299与四唑盐WST-8(Dojindo Molecular Technologies,Rockville,MD)孵育,测试450nm处吸光度,其表示脱氢酶活性并因此表示细胞活力。细胞活力百分比的计算是归一化存在测试抗体的吸光度值对存在对照IgG抗体(不结合Karpas299细胞)的吸光度。没有细胞的吸光度值用作背景。对于Karpas299细胞的活力,如图所示,8ChSan11-IgG1为95%、ChSan11-IgG1和山羊抗-人IgG多克隆抗体的混合物(图中的“ChSan11-IgG1(x-linked)”)为44%,ChSan11-MVIgG1为48%。与通过羊抗-人IgG多克隆抗体交联的ChSan11-IgG1一样,ChSan11-MVIgG1同样高效地诱导了Karpas299细胞的细胞阻滞效应(cytostasis)。因此,ChSan11-MVIgG1作为多价抗体,可以交联细胞表面上的CD30分子,从而诱导Karpas299细胞的生长停滞。
实施例7:在HEK293细胞中ChSan11-MVIgG1的表达
在J链存在下,IgM形成五聚体,例如,在小鼠骨髓瘤细胞系NS0中,而无J链时,IgM抗体形成六聚体,例如,在中国仓鼠卵巢细胞系CHO中(Gilmour et al.Transfus.Med.18:167-1742008)。为研究无J链情况下的结构,ChSan11-MVIgG1被表达于人胚胎肾细胞系HEK293中。通过供应商的方案,使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将pChSan11-MVIgG1载体瞬时转染到HEK293细胞中。瞬时转染的HEK293细胞的培养上清通过使用Superose6凝胶过滤柱进行分级(fractionated),按照实施例2中所述的程序。每0.5ml分级物(fraction)中的ChSan11-MVIgG1通过ELISA监测,如实施例2中描述的。图9显示出每个分级物中的ChSan11-MVIgG1水平。对ChSan11-MVIgG1最高的ELISA信号显示于9.0ml洗脱体积。在16ml洗脱分级物周围无显著的ELISA信号,所述16ml洗脱的地方单体ChSan11-IgG1抗体被洗脱下来(图7C)。由于在相同条件下人单克隆IgM抗体在10.4ml被洗脱,天然ChSan11-MVIgG1比IgM的大。由此推断,ChSan11-MVIgG1作为五聚体或六聚体被产生,或者在无J链的情况下,可能比六聚体更大。
实施例8:多价嵌合抗-DR5IgG1抗体的产生、表达、纯化及表征
小鼠抗-人DR5单克隆抗体的VH基因的编码区被转到(convertedto)一个包含信号肽编码序列、剪接供体信号和侧翼的SpeI和HindIII位点的外显子。同样的,相同的小鼠抗-DR5单克隆抗体的V L基因被转到(converted to)一个包含信号肽编码序列、剪接供体信号和侧翼的NheI和EcoRI位点的外显子。携带所述VH外显子的SpeI-HindⅢ片段和携带小鼠抗-DR5单克隆抗体的VL外显子的NheI-EcoRI片段被引入到pCh9G6-IgG1的相应位点,以产生pChADR5-IgG1。同样,SpeI-HindIIIVH片段和NheI-EcoRI VL片段分别被导入pCh9G6-MVIgG1生成pChADR5-MVIgG1。pChADR5-IgG1和pChADR5-MVIgG1的整体结构分别与pCh9G6-IgG1和pCh9G6-MVIgG1是相同的(图1),不同的是VH基因和VL基因是不同的。从pChADR5-IgG1和pChADR5-MVIgG1分别产生的抗体(ChADR5-IgG1和ChADR5-MVIgG1)示意性结构显示于图2。
分别生产ChADR5-IgG1和ChADR5-MVIgG1的NS0稳定转染子的产生如实施例2所述。ChADR5-IgG1和ChADR5-MVIgG1通过蛋白A亲和层析法进行纯化,如实施例2所述。ChADR5-IgG1和ChADR5-MVIgG1在还原条件下的SDS-PAGE分析表明,每个抗体由两条链构成:两个抗体之间的相同大小的轻链和每个抗体中大小不同的重链。通过比较凝胶上的分子量标记物的位置,相同轻链的分子量估计均为26kDa。ChADR5-IgG1的重链的分子量估计为51kDa,而ChADR5-MVIgG1重链的分子量估计为75kDa。
天然ChADR5-IgG1和ChADR5-MVIgG1抗体的分子大小通过采用凝胶过滤用Superose610/300GL分析,正如实施例2中所描述的。图10A-D显示了洗脱图谱。ChADR5-IgG1在15.9ml洗脱体积时具有单一的主峰(图10C)。通过比较分子量标准Gel Filtration Standard,BioRad)的洗脱图谱(图10A),主峰内的ChADR5-IgG1的分子量估计为约150kDa。这对应于ChADR5-IgG1单体的预测的分子量。ChADR5-MVIgG1在9.2ml洗脱有一个单一主峰(图10D)。由于纯化自人骨髓瘤细胞(JacksonImmunoResearch)的人单克隆IgM抗体在10.4ml(图10B)被洗脱,ChADR5-MVIgG1的分子大小比人IgM稍大。考虑到ChADR5-MVIgG1单体约200kDa,人IgM单体约180kDa,因此,我们推断,ChADR5-MVIgG1其存在的天然形式是五聚体或六聚体。
表面上DR5分子的交联会诱导人T细胞白血病细胞系Jurkat(Guo etal.,J.Biol.Chem.280:41940-41952,2005)的细胞凋亡。通过与Jurkat细胞进行孵育,ChADR5-IgG1和ChADR5-MVIgG1诱导细胞凋亡的能力被评估。三组试验抗体(ⅰ)ChADR5-IgG1、(ⅱ)ChADR5-IgG1与用于交联的10倍过量的山羊抗-人γ重链的多克隆抗的混合,以及(iii)ChADR5-MVIgG1,使用一系列的浓度被加入,所述浓度起始于终浓度为333ng/ml,并连续的3倍稀释。于37℃、在7.5%CO2培养箱中,细胞在96孔板中培养1天。使用WST-8试剂(Dojindo)进行细胞活力测定。无测试抗体的Jurkat细胞的吸光度值被用于100%的细胞活力,没有细胞的吸光度值用作背景。其结果显示于图11。ChADR5-IgG1表现为没有能力诱导细胞凋亡。用过量10倍的山羊抗-人γ重链的多克隆抗体交联的ChADR5-IgG1(图中为“ChADR5-IgG1(x-linked)”)在111ng/ml时显示约70%的细胞杀死能力,在4ng/ml时显示低于20%的细胞杀死能力。ChADR5-MVIgG1表现出更强的细胞凋亡诱导活性(apoptosis-inducingactivity),其在333ng/ml和1.4ng/ml之间杀死90%以上的细胞。甚至在0.15ng/ml时,ChADR5-MVIgG1显示杀死近40%的细胞。因此,ChADR5-MVIgG1作为多价抗体,可以有效地交联细胞表面上的DR5分子。
实施例9:多价抗-CD79a IgG4抗体的生成
表达嵌合的抗CD79a IgG4单克隆抗体的pCh9G6-IgG4载体通过以下方法构建,用编码人γ-4的重链的CH1、铰链、CH2和CH3区(在图中分别为CH1(γ4)、h(γ4)、CH2(γ4)和CH3(γ4))(图1)的cDNA衍生的片段来取代pCh9G6-IgG1中的人γ-1重链的基因组CH1、铰链、CH2和CH3区序列。pCh9G6-IgG4中编码的γ-4重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-IgG4中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:10)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表达多价嵌合抗-CD79a IgG4单克隆抗体的pCh9G6-MVIgG4载体通过以下方法构建:将Cμ3和Cμ4区(SEQ ID NO:5)框内融合到(inframe to)pCh9G6-IgG4中的CH3区的最后一个氨基酸(图1)。pCh9G6-MVIgG4中编码的重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-MVIgG4中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:11)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
生产Ch9G6-MVIgG4的NS0稳定转染子的产生如实施例2所述。Ch9G6-MVIgG4通过蛋白A亲和层析法进行纯化,如实施例2所述。在还原条件下的SDS-PAGE分析表明,Ch9G6-MVIgG4由一个约25kDa的轻链和一个约78kDa的重链组成。
天然Ch9G6-MVIgG4的分子大小通过采用凝胶过滤用Superose610/300GL分析,正如实施例2中所描述的。在Ch9G6-MVIgG4的洗脱图谱中(图12C),可以观察到一个主峰(10.1ml洗脱)和一个次峰(14.1ml洗脱)。通过比较BioRad分子量标准的洗脱图谱(图12A)和人IgM(在10.4ml洗脱;图12B)的洗脱图谱,并考虑到单体Ch9G6-MVIgG4(约208kDa)和IgM(约180kDa)的预期大小,我们可以推断出,在10.1ml洗脱的Ch9G6-MVIgG4是一个五聚体或六聚体。这种多聚的Ch9G6-MVIgG4占总纯化抗体的83%。
实施例10:多价IgG3抗体的表达、纯化和表征
三种载体被构建,用于表达嵌合的抗CD79a IgG3单克隆抗体及其两种衍生物的。pCh9G6-IgG3D的构建方法为:将pCh9G6-IgG1中的携带了人γ-1重链的基因组CH1、铰链、CH2和CH3区的HindIII-EagI片段替换为携带人γ-3重链的CH1、第四铰链、CH2和CH3(分别为图中CH1(γ3)、h(γ3)、CH2(γ3)和CH3(γ3))(图1)的HindIII-EagI片段。第一、第二和第三铰链区的编码序列在中pCh9G6-IgG3D中被删除。在pCh9G6-IgG3D中编码的重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-IgG3D中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:12)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
pCh9G6-IgG3D/M载体通过将人μ重链的Cμ3和Cμ4区(SEQ IDNO:5)框内融合到pCh9G6-IgG3D的铰链区的最后一个氨基酸上而构建(图1)。在pCh9G6-IgG3D/M中,人γ-3重链的CH2和CH3外显子被除去。pCh9G6-IgG3D/M编码的重链恒定区的最终结构为,从N末端到C末端:人γ-3的重链的CH1和第四铰链区、人μ重链的CH3和CH4区,这与Sorensen et al.(Int.Immunol.12:19-272000)报道的IgG-Cμ3-Cμ4的重链恒定区是一样的。pCh9G6-IgG3D/M中编码的重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-IgG3D/M中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:13)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDTPPPCPRCPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
pCh9G6-MVIgG3D载体通过将人μ重链的Cμ3和Cμ4区(SEQ IDNO:5)框内融合到pCh9G6-IgG3D(图1)中的人γ-3的重链中的CH3外显子的最后一个氨基酸。pCh9G6-MVIgG3D中编码的重链恒定区的氨基酸序列如下所示。
pCh9G6-MVIgG3D中编码的重链恒定区(SEQ ID NO:14)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
产生于pCh9G6-IgG3D、pCh9G6-IgG3D/M和pCh9G6-MVIgG3D的单体形式(分别为Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D)的抗体的示意性结构显示于图2。
生产Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D抗体的NS0稳定转染子的制备用实施例2概括的方法执行。高产Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D抗体的NS0稳定转染子用Hybridoma SFM在无血清培养基中培养,并扩展到摇瓶(expanded into aroller bottle)中,如实施例2所述。离心和过滤后,对于Ch9G6-IgG3D和Ch9G6-MVIgG3D,将培养上清液上样到蛋白G Sepharose柱(GEHealthcare)上。在用0.1M甘氨酸-盐酸(pH值2.5)洗脱抗体之前,所述蛋白G Sepharose柱用PBS洗涤。用1M的Tris-HCl(pH8)中和后,通过渗析将洗脱的抗体的缓冲液变成PBS。
由于Ch9G6-IgG3D/M缺乏人γ-3重链的CH2和CH3区,不结合G蛋白,因此,生产Ch9G6-IgG3D/M的NS0稳定转染子的培养上清液被上样到山羊抗-人IgM琼脂糖柱(Sigma)。在用0.1M甘氨酸-盐酸(pH值2.5)洗脱抗体之前,所述抗-人IgM琼脂糖柱用PBS洗涤。用1M的Tris-HCl(pH8)中和后,通过渗析将洗脱的抗体的缓冲液变成PBS。
根据标准程序,将纯化的抗体用SDS-PAGE表征。在还原条件下分析表明,Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D抗体均由两条链构成。每条链的分子量是通过与分子量标记比较凝胶上的迁移率而估计。在Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D中相同的轻链具有大约25kDa的分子量。对于重链的分子量,Ch9G6-IgG3D估计为53kDa、Ch9G6-IgG3D/M估计为60kDa、Ch9G6-MVIgG3D估计为81kDa。每条轻链和重链的估计大小跟基于相应氨基酸序列推测的大小是一致的。
天然形式Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D抗体的分子大小通过采用凝胶过滤用AKTA Basic FPLC***(带有Superose610/300GL柱)分析,正如实施例2中所描述的。图13显示了Ch9G6-IgG3D(图13C)、Ch9G6-IgG3D/M(图13D)和Ch9G6-MVIgG3D(图13E)的洗脱图谱。Ch9G6-IgG3D在15.6ml洗脱体积时具有单一的优势峰。与Gel Filtration Standard(BioRad)的洗脱图谱(图13A)比较,优势峰内的Ch9G6-IgG3D的分子量估计为约150kDa,这与从SDS-PAGE结果推测的单体Ch9G6-IgG3D的分子量是一致的。
Ch9G6-IgG3D/M被观察到有4个主峰(图13D)。洗脱于12.3ml、15.0ml和16.1ml时的Ch9G6-IgG3D/M的分子量分别估计为650kDa、180kDa和90kDa。20.8ml洗脱的主峰中的蛋白质,分子量估计有大约200kDa,很可能是Ch9G6-IgG3D/M的降解部分(degradation projects ofCh9G6-IgG3D/M),它们结合到并从抗-IgM琼脂糖柱中洗脱。
Ch9G6-MVIgG3D被观察到在10.4ml洗脱中有单一的优势峰(图13E)。人IgM也在10.4ml时被洗脱(图13B)。从SDS-PAGE结果考虑到Ch9G6-MVIgG3D(约200kDa的)和IgM(约180kDa)单体的大小,可以推测出Ch9G6-MVIgG3D生产的天然形式是五聚体或六聚体。
实施例11:多价IgG3抗体与FcRn的结合
以pH依赖性方式的Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M和Ch9G6-MVIgG3D与FcRn结合的能力通过流式细胞仪分析,使用在细胞表面上表达人FcRn的NS0细胞(NS0/FcRn细胞)。1μg/mlCh9G6-IgG3D、Ch9G6-Ig3D/M和Ch9G6-MVIgG3D分别与NS0/FcRn细胞在pH6.0和7.5在初期染色步骤中孵育,如实施例4中所描述的。与FcRn结合的抗体用PE标记的羊多克隆的抗-人γ链抗体(对于Ch9G6-IgG3D和无抗体对照)或PE标记的羊多克隆的抗-人μ链抗体(对于Ch9G6-IgG3D/M、Ch9G6-MVIgG3D和无抗体对照)在二次染色步骤中检测。如图14所示,pH6.0时Ch9G6-IgG3D强烈地结合FcRn,在pH7.5时的结合很弱。pH为6.0时,Ch9G6-MVIgG3D强烈地结合FcRn。Ch9G6-MVIgG1在pH6.0时比在pH7.5时的结合更强。因此,Ch9G6-IgG3D和Ch9G6-MVIgG3D均表现出pH依赖性的与FcRn的结合,这表明这些抗体具有长的血清半衰期。无论在pH6.0或7.5,Ch9G6-IgG3D/M均未显示出任何与FcRn有显著的结合,这表明Ch9G6-IgG3D/M短的血清半衰期。这也跟Ch9G6-IgG3D/M缺少与FcRn结合位点的事实是一致的。
实施例12:多价IgG3抗体与CD16的结合
多价IgG3抗体与人CD16的结合采用流式细胞术分析。细胞表面上瞬时表达人CD16的HEK293细胞与1μg/ml Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-IgG3D/M或Ch9G6-MVIgG3D在FACS Buffer(PBS含有0.5%牛血清白蛋白及0.025%叠氮化钠)中在冰上孵育30分钟。作为对照,表达人CD16的HEK293细胞也不与测试抗体孵育。用FACS缓冲液洗涤后,将细胞与PE-标记的山羊多克隆抗-人γ重链抗体(对于Ch9G6-IgG3D、Ch9G6-MVIgG3D和无抗体对照)或PE-标记的山羊多克隆抗-人μ重链抗体(对于Ch9G6-IgG3D/M、Ch9G6-MVIgG3D和无抗体对照)在FACS缓冲液中在冰上孵育15分钟,进行二次染色的步骤。用FACS缓冲液洗涤后,染色的细胞用流式细胞仪分析。
Ch9G6-IgG3D表现出强烈结合人CD16(图15D)。相比Ch9G6-IgG3D,Ch9G6-MVIgG1表现甚至更强与CD16的结合(图15F),这表明显示ADCC能力。另一方面,当与单独用PE标记的山羊抗-μ重链抗体的细胞(图15C)相比较,如果有的话,Ch9G6-IgG1/M显示出非常弱的与人类CD16的结合(图15E),这表明该Ch9G6-IgG1/M没有ADCC活性。Ch9G6-IgG3D/M与CD16的不显著的结合不是由于不同的PE-标记的第二抗体的差异,因为在二次染色步骤中,当使用PE-标记的山羊抗-μ重链抗体时,CD16与Ch9G6-MVIgG3D强烈结合(图15G)Ch9G6-IgG3D/M不能结合到CD16与Ch9G6-IgG3D/M缺乏人γ-3重链的CH2和CH3区的事实是一致的。
对于制备多价的IgG2抗体,人γ-2重链的CH3外显子的最后一个氨基酸被框内融合到人μ重链的CH3和CH4区。所得到的重链,从N末端到C末端,由以下组成:(i)人γ-2重链的CH1、铰链和CH2和CH3区,然后(ⅱ)人μ重链的CH3和CH4区。所得到的多价IgG2抗体表达于哺乳动物细胞中,诸如NS0、CHO或HEK293细胞中,使用蛋白A亲和柱从耗尽培养上清液(spent culture supernatant)中纯化,用凝胶过滤和SDS-PAGE表征。
实施例13:多价IgG2抗体:
对于制备多价的IgG2抗体,人γ-2重链的CH3外显子的最后一个氨基酸被框内融合到人μ重链的CH3和CH4区。所得到的重链,从N末端到C末端,由以下组成:(i)人γ-2重链的CH1、铰链和CH2和CH3区,然后(ⅱ)人μ重链的CH3和CH4区。所得到的多价IgG2抗体表达于哺乳动物细胞中,诸如NS0、CHO或HEK293细胞中,使用蛋白A亲和柱从耗尽培养上清液(spent culture supernatant)中纯化,用凝胶过滤和SDS-PAGE表征。
实施例14:多价IgA抗体:
对于制备多价的IgA抗体,人α-1或α-2重链的CH3外显子的最后一个氨基酸被框内融合到人的μ重链的CH3和CH4区。所得到的重链,从N末端到C末端,由以下组成:(i)人α-1或α-2重链的CH1、CH2和CH3区,然后(ii)人μ重链的Cμ3和Cμ4区域。所得到的多价IgA抗体表达于哺乳动物细胞中,诸如NS0、CHO或HEK293细胞中,使用Jacalin lectin柱或其它标准方法从培养上清液中纯化,用凝胶过滤和SDS-PAGE表征。
实施例15:多价Fc融合蛋白
在本工作中发明的制备多价IgG抗体的技术也适用于制备多价Fc融合蛋白。例如,pCh9G6-MV IgG1载体以这样的方式被改造(i)VH和CH1外显子被除去,编码信号肽和人TRAIL(TRAIL EC)胞外区的由cDNA衍生的片段被框内融合到铰链外显子的第一个氨基酸,(iii)轻链的转录单元被消除。一种柔性的多肽连接器,例如Thr-Gly-Gly-Gly,可被放置在TRAIL与铰链区之间。所得Fc融合蛋白(TRAIL-MVFc),从N末端到C末端,由以下构成:(ⅰ)TRAIL EC,(ii)人γ-1重链的铰链、CH2和CH3区,(iii)人μ重链的Cμ3和Cμ4区。这样的Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中作为五聚体或六聚体产生。这类多聚化的Fc融合蛋白的生物活性(诱导表达DR4或DR5的细胞的细胞凋亡)是通过标准方法进行分析。
实施例16:多特异性Fc融合蛋白
用于制备多价Fc融合蛋白的技术进一步适用于制备多特异性Fc融合蛋白。例如,三个载体被构建成表达三种不同Fc融合蛋白。第一个表达载体编码人TNF受体II型的胞外区(TNFR-II EC),它被融合进人γ-1重链的铰链、CH2和CH3区,这又被接着融合进人μ重链的Cμ3和Cμ4区(TNFR-II-MVFc)。第二个载体编码人LFA-3胞外区,它被融合进人γ-1重链的铰链、CH2和CH3区,这又被接着融合进人μ重链的Cμ3和Cμ4区(LFA-3-MVFc)第二个载体编码人IL-1受体胞外区,它被融合进人γ-1重链的铰链、CH2和CH3区,这又被接着融合进人μ重链的Cμ3和Cμ4区(IL-1R-MVFc)。TNFR-II-MVFc、LFA-3-MVFc和IL-1R-MVFc同时表达,以产生多价Fc融合蛋白,其能够结合于TNFα、CD2(LFA-3的受体)和IL-1。这样的多特异性、多价Fc融合蛋白治疗炎症性疾病的功效使用标准方法来研究。
实施例17:由IgG抗体和Fc融合蛋白组成的多价蛋白
用于制备多价IgG抗体和Fc融合蛋白的技术也适用于制备由IgG抗体和Fc融合蛋白组成的多价蛋白质。例如,在哺乳动物细胞中共转染两种表达载体:(ⅰ)产生多价抗-DR5IgG抗体的表达载体,以及(ii)生产多价TRAIL-Fc融合蛋白的表达载体。表达的多聚蛋白由抗-DR5IgG抗体和TRAIL-Fc融合蛋白共同组成。对于这类蛋白诱导DR4介导的和DR5介导的细胞凋亡的生物学活性,通过标准方法分析。
实施例18:双特异性多价抗体
载体pCh9G6-MVIgG1和pChSan11-MVIgG1,其表达分别结合人CD79a和CD30的多价IgG1抗体,使用供应商的方案、采用Lipofectamine2000(Invitrogen),被分别或一起转染到HEK293细胞。培养上清中的瞬时表达的抗体的抗原结合,用以下两种形式的ELISA检测。
在ELISA的第一种形式中,用重组人CD30胞外区来包被微量滴定板的孔,所述重组人CD30胞外区融合到人γ1链的Fc区(CD30-Fc;SEQ IDNO:37)。用Block Buffer阻断孔后,适当稀释的HEK293细胞的培养上清液被施加到孔中并且4℃下孵育过夜。用Wash Buffer洗涤孔之后,ELISA Buffer中的C端融合到人λ2恒定区的重组人CD79a胞外区(CD79a-Cλ;SEQ ID NO:38)被加入到孔中。人λ2恒定区的自羧基末端的第2位的半胱氨酸残基,在CD79A-Cλ中变为丝氨酸残基。在室温下孵育ELISA板1小时后,用Wash Buffer洗涤各孔,结合的CD79a-Cλ用HRP-偶联的山羊抗人λ链多克隆抗体进行检测。通过加入ABTS底物启动显色,用2%的草酸阻断。吸光度在405nm处读数。
与未转染的HEK293细胞的培养上清液相比,转染pCh9G6-MVIgG1或pChSan11-MVIgG1的HEK293细胞的培养物上清液在ELISA的第一种形式中均无信号。当pCh9G6-MVIgG1和pChSan11-MVIgG1共转染HEK293细胞,培养上清液在这种ELISA形式中显示出很强的信号,这表明了双特异性抗体的存在,这种双特异性抗体可同时结合溶液中的CD79a-Cλ和包被在ELISA板上的CD30-Fc。
在ELISA的第二形式中,微量滴定板的孔用重组人CD79a胞外区包被,所述重组人CD79a胞外区被融合到人γ1链的Fc区的C-末端(CD79a-Fc;SEQ ID NO:39)。用Block Buffer阻断孔后,适当稀释的HEK293细胞的培养上清液被施加到孔中并且4℃下孵育过夜。用WashBuffer洗涤孔之后,ELISA Buffer中的C端融合到人λ2恒定区的重组人CD30胞外区(CD30-Cλ;SEQ ID NO:40)被加入到孔中。人λ2恒定区的自羧基末端的第2位的半胱氨酸残基,在CD30-Cλ中变为丝氨酸残基。在室温下孵育ELISA板1小时后,用Wash Buffer洗涤各孔,结合的CD30-Cλ用HRP-偶联的山羊抗人λ链多克隆抗体进行检测。通过加入ABTS底物启动显色,用2%的草酸阻断。吸光度在405nm处读数。
与未转染的HEK293细胞的培养上清液相比,转染pCh9G6-MVIgG1或pChSan11-MVIgG1的HEK293细胞的培养物上清液在ELISA的第二种形式中均无信号。然而,当pCh9G6-MVIgG1和pChSan11-MVIgG1共转染HEK293细胞,培养上清液在第二ELISA形式中显示出很强的信号,这证实了可以同时结合CD79a和CD30的双特异性抗体的存在。
C-端与人γ-1链的Fc区融合的重组人CD30胞外区(CD30-Fc)的氨基酸序列:
FPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDTGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:37).
C-端与人λ2恒定区融合的重组人CD79a胞外区(CD79a-Cλ)的氨基酸序列:
ALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRTGGGGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTESS(SEQ ID NO:38).
C-端与人γ1链的Fc区融合的重组人CD79a胞外区(CD79a-Fc)的氨基酸序列:
ALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRTGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:39).
C-端与人λ2恒定区融的重组人CD30胞外区(CD30-Cλ)氨基酸序列
FPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDTGGGGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTESS(SEQ ID NO:40).
实施例19:多聚化的抗-DR4IgG抗体在小鼠的***性异种移植Ramos细胞模型中的治疗功效
抗-人死亡受体4(DR4,也称为Apo2、TRAIL受体1和TNFRSF10A)单克隆IgG1/λ抗体YON007在JN Biosciences公司(Mountain View,CA)被制备,在制备时,使用融合到人γ-1重链的Fc区的人DR4细胞外区(DR4-Fc)(SEQ ID NO:41)作为免疫原,并使用标准杂交瘤技术。
YON007VH和VL的氨基酸序列通过标准实验程序测定,如通过Tsurushita等人(同上)描述的方法测定。包括信号肽序列的YON007VH的氨基酸序列是:
MNRLTSSLLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLKISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:42)(US61/679,045)。成熟YON007VH开始于SEQ ID NO:42的第20位。包括信号肽序列的YON007VL的氨基酸序列是:
MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:43)(US61/679,045)。成熟YON007VL开始于SEQ ID NO:43的第20位。
YON007VH和VL的人源化通过Tsurushita等人(同上)描述的过程进行。包括信号肽的人源化YON007(HuYON007)VH的氨基酸序列是:
MNRLTSSLLLLIVPAYVLSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:44)(US61/679,045)。成熟HuYON007VH序列开始于SEQ ID NO:44的第20位。
人源化YON007(HuYON007)VL的氨基酸序列是
MAWISLILSLLALSSGAISQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSLLGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:45)(US61/679,045)。成熟HuYON007VL序列开始于SEQ ID NO:45的第20位。
编码HuYON007VH(SEQ ID NO:46)的基因作为外显子被合成,该外显子包括:位于编码区3'端的剪接供体信号、所述片段5'端的SpeI位点、所述片段3'端的HindⅢ位点。编码HuYON007VL(SEQ ID NO:47)的基因作为外显子被合成,该外显子包括:编码区3'端的剪接供体信号、所述片段5'端的NheI位点、所述片段3'端的EcoRI位点。
产生人源化抗-人DR4单克隆IgG1/λ抗体HuYON007-IgG1的哺乳动物表达载体pHuYON007本质上与pCh9G6-IgG1(图1)的结构相同,除了(1)SpeI和HindⅢ位点之间的9G6VH基因被HuYON007VH基因(SEQ ID NO:46)替换,(2)NheⅠ和EcoRI位点之间的9G6VL基因被HuYON007VL基因(SEQ ID NO:47)替换,(3)Cκ-编码外显子被编码人λ-2恒定区的外显子替换,及(4)gpt基因被嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因替换。
pHuYON007中编码的成熟重链的氨基酸序列是
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:48).
pHuYON007中编码的成熟轻链的氨基酸序列是
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:49).
对于多聚HuYON007IgG抗体的表达,Cμ3和Cμ4的编码区被框内融合到pHuYON007中CH3外显子的最后一个氨基酸。轻链序列是未经修饰。所得质粒(pHuYON007-MVIgG1)中编码的成熟重链的氨基酸序列是:
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO:50).
表达载体pHuYON007和pHuYON007-MVIgG1被分别引入到中国仓鼠卵巢细胞系CHO-S(Invitrogen)染色体中,以获得稳定产生人源化IgG1/λ抗体HuYON007-IgG1和HuYON007-MVIgG1的细胞系。CHO-S细胞生长在SFM4CHO介质中(HyClone),在37℃下在7.5%CO2培养箱中培养。通过电穿孔,稳定转染进CHO-S中。转染前,各表达载体用FSPI线性化。在一个典型的实验中,用20μg经线性化的质粒转染约107个细胞,悬浮在SFM4CHO,适当稀释细胞后,接种到多个96孔板中。48小时后,加入嘌呤霉素溶液,用于选择稳定的转染。选择启动大约两个星期后,转染子的培养上清用于测定抗体的产生。通过夹心ELISA测定抗体的表达,所述夹心ELISA使用山羊抗-人γ重链的多克隆抗体用来包被,使用HRP-偶联的山羊抗-人λ链抗体检测结合的HuYON007-IgG1的或HuYON007-MVIgG1抗体。生产HuYON007-IgG1或HuYON007-MVIgG1的CHO-S稳定的转染子用SFM4CHO扩展。
离心和过滤后,培养上清上样到蛋白A柱(HiTrap MABSelect SuRe,GE Healthcare,Piscataway,NJ)。在用0.1M甘氨酸-盐酸(pH值3.0)洗脱抗体之前,所述柱用PBS洗涤。所有洗脱的抗体的缓冲液用1M的Tris-HCl(pH值为8)中和,然后通过渗析变为PBS。在上述的使用Superose610/300GL的凝胶过滤分析中,对于HuYON007-IgG1可以观察到一个对应于约150kDa的单一优势峰。在凝胶过滤分析中,对于HuYON007-MVIgG1可以观察到一个对应于约1000kDa的单一优势峰。
人Burkitt淋巴瘤细胞系Ramos在细胞表面表达DR4(Daniel et al.Blood.110:4037-4046,2007)。据报道,通过在细胞表面上的DR4的交联会诱导细胞凋亡(Griffith et al.J.Immunol.162:2597-2605,1999)。在200ng/ml HuYON007-MVIgG1或HuYON007-IgG1存在下将Ramos细胞孵育在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中。孵育24小时后,HuYON007-MVIgG1处理的Ramos细胞的活力小于5%,而HuYON007-IgG1处理的Ramos细胞的活力大于75%以上,表明HuYON007-MVIgG1有效地诱导Ramos细胞凋亡。
使用***性小鼠异种移植Ramos细胞模型评估HuYON007-MVIgG1的治疗功效。CB17SCID雌性小鼠在第0天接种5x106Ramos细胞,静脉注射到尾静脉用于形成肿瘤。在第7、10、14、17、21、24,28和31天通过静脉给药,将HuYON007-IgG1(0.5mg/kg)、HuYON007-MVIgG1(0.5mg/kg)或PBS施加到负荷肿瘤的小鼠。每日监测所述小鼠为发病率和死亡率。在小鼠后腿麻痹发作或体重减轻20%以上时,将小鼠安乐死。
使用Kaplan-Meier法绘制小鼠存活率(图18),并用通过Mantel-Cox检验分析显着性。PBS处理组的平均存活时间为27.5天、HuYON007-IgG1处理组的平均存活时间为31.5天、HuYON007-MVIgG1处理组的平均存活时间为37.5天。PBS处理组和HuYON007-MVIgG1处理组织之间的P值为0.0019。HuYON007-IgG1处理组和HuYON007-MVIgG1处理组织之间的P值为0.0128。在小鼠的***性异种移植Ramos细胞模型中,HuYON007-MVIgG1疗法的功效显著高于HuYon007-IgG1疗法。
SEQ ID NO:41与人γ-1重链的Fc区融合的人DR4胞外区(DR4-Fc)的氨基酸序列
ASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNTGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:46编码HuYON007VH的外显子的核苷酸序列
ACTAGTACCACCATGAACAGGCTTACTTCCTCATTGCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGTCACCTTGAGGGAGTCTGGTCCTGCCCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACACTGACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATCAGACAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAAGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTCGACACAGCCACCTATTACTGTACTCGGAGAGGGGAGTATGGTAACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCTGCTGTACTGAAGCTT
SEQ ID NO:47编码HuYON007VL的外显子的核苷酸序列
GCTAGCACCACCATGGCCTGGATTTCACTTATCCTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAGACTGTCGTGACCCAGGAGCCATCCTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTTCTGGGGCTGTTACAACCAGTAACTTTGCCAACTGGGTCCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCACGCGGCCTCATCGGCGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCATCCTTGGGAACAAAGCTGCCCTCACCATCACCGGGGCCCAGGCAGATGATGAATCTGATTATTACTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGAGTCTCTTCTCCCCGAATTC
Claims (40)
1.一种包含免疫球蛋白重链恒定区的抗体或融合蛋白,所述重链恒定区从N-端至C-端依次包含CH2区、CH3区、Cμ3区和Cμ4区,所述CH2区或CH3区是IgG或IgA的同种型。
2.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其中所述免疫球蛋白重链还包含位于所述CH2区N-端的铰链区。
3.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其中所述免疫球蛋白重链还包含位于所述铰链区N-端的CH1区。
4.根据权利要求3所述的抗体或融合蛋白,其是抗体,其中所述重链恒定区与重链可变区融合,并且所述抗体进一步包括含有轻链可变区和轻链恒定区的轻链。
5.根据权利要求4所述的抗体,所述抗体是多特异性抗体的组分,所述多特异性抗体包含多种由权利要求4定义的抗体,所述多种抗体具有不同的重链可变区以及可选地,不同的轻链可变区;所述多种抗体通过所述Cμ3和Cμ4区集合于所述多特异性抗体中。
6.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG1的区。
7.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG2的区。
8.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG3的区。
9.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区和铰链区,所述CH1、铰链区、CH2和CH3区是IgG4的区。
10.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区,所述CH1、CH2和CH3区是IgA的区。
11.根据前述任一权利要求所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区和铰链区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人CH1区、铰链区、CH2区和CH3区,并且所述Cμ3区和Cμ4区是人Cμ3和Cμ4区。
12.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其是单链抗体,所述单链抗体包含与所述重链恒定区连接的单链Fv。
13.根据权利要求12所述的抗体,所述抗体是多特异性抗体的组分,所述多特异性抗体包含多种由权利要求12定义的单链抗体,其中所述多种单链抗体的所述单链Fv具有不同的VH区,并且所述多种单链抗体通过所述Cμ3和Cμ4区集合于所述多特异性抗体中。
14.根据权利要求13所述的抗体,其中所述单链Fv具有相同的VL区。
15.根据权利要求4所述的抗体或融合蛋白,所述抗体或融合蛋白是多聚体形式,所述多聚体包含一种单元的至少五个或六个拷贝,所述单元包含两条所述重链和两条所述轻链,所述拷贝通过所述Cμ3和Cμ4区集合于所述多聚体中。
16.根据权利要求2所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是IgG,并且所述抗体或融合蛋白显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G、特异性结合蛋白A、表现出ADCC、表现出CDC和/或表现出调理素作用。
17.根据权利要求2所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人IgG1的区,并且所述抗体显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G及特异性结合蛋白A。
18.根据权利要求17所述的抗体,所述抗体显示ADCC、CDC和调理素作用。
19.根据权利要求2所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人IgG2或IgG4的区,并且所述抗体或融合蛋白显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G及特异性结合蛋白A。
20.根据权利要求2所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区,所述CH1区、铰链区、CH2和CH3区是人IgG3的区,并且所述抗体显示pH依赖性结合FcRn及特异性结合蛋白G。
21.根据权利要求20所述的抗体或融合蛋白,所述抗体或融合蛋白显示ADCC、CDC和调理素作用。
22.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,若存在CH1区,所述CH1区、CH2和CH3区是人IgA,并且所述抗体与Fcα受体结合。
23.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其是融合蛋白,所述融合蛋白包含与异源多肽连接的所述免疫球蛋白重链。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白,其中所述异源蛋白通过例如Gly-Gly-Ala-Ala的柔性连接器与所述恒定区的所述铰链连接。
25.根据权利要求23所述的融合蛋白,其中所述异源多肽是受体细胞外结构域或与受体细胞外结构域特异性结合的蛋白质。
26.根据权利要求23所述的融合蛋白,所述融合蛋白是包含多种融合蛋白的多特异性复合体的组分,所述多种融合蛋白包含不同的异源多肽。
27.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,所述抗体或融合蛋白是多特异性复合体,所述多特异复合体包含通过所述Cμ3和Cμ4区集合的抗体和融合蛋白。
28.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体、饰面抗体或人抗体。
29.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,所述抗体或融合蛋白与受体的细胞外结构域特异性结合。
30.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其是与CD79a、CD30或DR5特异性结合的抗体。
31.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其是包含TNF-α受体、LFA-3或IL-1受体的细胞外结构域的融合蛋白。
32.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,其是包含TRAIL蛋白的融合蛋白。
33.根据权利要求1所述的抗体或融合蛋白,所述抗体或融合蛋白与毒性部分结合。
34.根据权利要求33所述的抗体或融合蛋白,其中所述毒性部分是细胞毒性的。
35.包含由权利要求1定义的抗体或融合蛋白的药物组合物。
36.一种治疗癌症的方法,所述方法包括对患有癌症和有患癌症风险的病人以有效的方案给予权利要求1所定义的抗体或融合蛋白。
37.一种治疗免疫失调的方法,所述方法包括对患有免疫失调和有患免疫失调风险的病人以有效的方案给予权利要求1所定义的抗体或融合蛋白。
38.一种制备抗体和/或融合蛋白的多特异性复合体的方法,所述方法包括:
a.用编码多种由权利要求1定义的抗体和/或融合蛋白的一种或多种载体转染细胞,所述抗体和/或融合蛋白具有不同的特异性;其中所述抗体和/或融合蛋白被表达并通过所述Cμ3和Cμ4区被组装在多特异性复合体中;及
b.从细胞培养物中分离所述多特异性复合体。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述多种抗体或多种融合蛋白中的每一种抗体或每一种融合蛋白由不同载体编码。
40.一种包含杂交恒定区的抗体或融合蛋白,所述杂交恒定区包含N-端的IgG恒定区片段和C-端的IgM恒定区片段;其中所述抗体显示pH依赖性结合FcRn、特异性结合蛋白G及由IgM恒定区介导的多聚化,所述多聚化至少形成五聚体或六聚体。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108602857A (zh) * | 2016-01-27 | 2018-09-28 | 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司 | 重组IgG Fc多聚体 |
CN109561681A (zh) * | 2016-07-20 | 2019-04-02 | Igm生物科学股份有限公司 | 多聚gitr结合分子及其用途 |
CN112368021A (zh) * | 2018-06-14 | 2021-02-12 | 蓝鸟生物公司 | Cd79a嵌合抗原受体 |
CN114206936A (zh) * | 2019-06-14 | 2022-03-18 | 2赛文缇生物公司 | 用于治疗癌症的组合物和方法 |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US20150038682A1 (en) * | 2013-08-02 | 2015-02-05 | Jn Biosciences Llc | Antibodies or fusion proteins multimerized via homomultimerizing peptide |
AU2014332458B2 (en) * | 2013-09-05 | 2020-03-12 | Igm Biosciences, Inc. | Constant chain modified bispecific, penta- and hexavalent Ig-M antibodies |
CN106068274A (zh) * | 2014-03-05 | 2016-11-02 | Ucb生物制药私人有限公司 | 多聚体Fc蛋白 |
EP3114137A1 (en) * | 2014-03-05 | 2017-01-11 | UCB Biopharma SPRL | Multimeric fc proteins |
US10280208B2 (en) | 2014-04-30 | 2019-05-07 | Albert Einstein College Of Medicine | TMIGD2 and its derivatives as blockers or binders of cancer-expressed HHLA2 for immunotherapies |
MA41044A (fr) | 2014-10-08 | 2017-08-15 | Novartis Ag | Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer |
SI3247728T1 (sl) * | 2015-01-20 | 2020-09-30 | Igm Biosciences, Inc. | Super-družina receptorjev, ki vežejo molekule TNF (dejavnik tumorske nekroze), in njihova uporaba |
CN107921285B (zh) | 2015-03-25 | 2022-06-07 | Igm生物科学股份有限公司 | 多价乙型肝炎病毒抗原结合分子及其应用 |
KR20180002653A (ko) * | 2015-04-07 | 2018-01-08 | 제넨테크, 인크. | 효능작용 활성을 갖는 항원 결합 복합체 및 사용 방법 |
CA2983034A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Igm Biosciences, Inc. | Multi-valent human immunodeficiency virus antigen binding molecules and uses thereof |
GB201515745D0 (en) * | 2015-09-04 | 2015-10-21 | Ucb Biopharma Sprl | Proteins |
CN110913895B (zh) * | 2017-05-08 | 2024-04-02 | 阿迪马布有限责任公司 | 抗cd3结合结构域和包含它们的抗体以及它们的产生及使用方法 |
JP7358365B2 (ja) * | 2018-02-26 | 2023-10-10 | アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | がんを治療するための、化学療法剤と併用した多量体抗dr5結合分子の使用 |
WO2020086745A1 (en) * | 2018-10-23 | 2020-04-30 | Igm Biosciences, Inc. | MULTIVALENT IgM- AND IgA-Fc-BASED BINDING MOLECULES |
KR102450007B1 (ko) * | 2020-10-16 | 2022-10-04 | 주식회사 아이엠바이오로직스 | IgM 영역을 이용한 융합단백질 플랫폼 |
IL309957A (en) | 2021-07-14 | 2024-03-01 | 2Seventy Bio Inc | Transgenic T cell receptors attached to antibody binding sites |
WO2023196997A2 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | 2Seventy Bio, Inc. | Multipartite receptor and signaling complexes |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7148321B2 (en) * | 2001-03-07 | 2006-12-12 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
US7754308B2 (en) * | 2003-11-13 | 2010-07-13 | So.F.Ter S.P.A. | Artificial turf systems having a vulcanised thermoplastic elastomer or styrene-ethylene-butadiene-styrene polymer as infill material |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8719963D0 (en) * | 1987-08-24 | 1987-09-30 | Cattaneo A | Recombinant dna products |
DE10001372A1 (de) * | 2000-01-14 | 2001-08-02 | Deutsches Krebsforsch | Anti-CD3-Einzelketten-Antikörper mit humanem Cmu3- und Cmu4- Domänen |
ATE442386T1 (de) | 2000-04-28 | 2009-09-15 | Planet Biotechnology Inc | Immunoadhesin zur impfung gegen rhinovirus |
EP2706116A1 (en) * | 2001-01-17 | 2014-03-12 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
WO2008148884A1 (en) | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Universite De La Mediterranee | Compositions and methods for treating pancreatic tumors |
US8952134B2 (en) | 2011-09-26 | 2015-02-10 | Jn Biosciences Llc | Hybrid constant regions |
-
2012
- 2012-09-26 US US13/627,929 patent/US8952134B2/en active Active
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-
2014
- 2014-11-17 US US14/543,845 patent/US20150073130A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7148321B2 (en) * | 2001-03-07 | 2006-12-12 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
US7754308B2 (en) * | 2003-11-13 | 2010-07-13 | So.F.Ter S.P.A. | Artificial turf systems having a vulcanised thermoplastic elastomer or styrene-ethylene-butadiene-styrene polymer as infill material |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MICHAELA SCHAFFNER,ET AL: "CHIMERIC INTERLEUKIN 2 RECEPTOR α CHAIN ANTIBODY DERIVATIVES WITH FUSED μ AND γ CHAINS PERMIT IMPROVED RECRUITMENT OF EFFECTOR FUNCTIONS", 《MOLECULAR IMMUNOLOGY》 * |
MICHAELA SCHAFFNER,ET AL: "CHIMERIC INTERLEUKIN 2 RECEPTOR α CHAIN ANTIBODY DERIVATIVES WITH FUSED μ AND γ CHAINS PERMIT IMPROVED RECRUITMENT OF EFFECTOR FUNCTIONS", 《MOLECULAR IMMUNOLOGY》, vol. 32, no. 1, 31 December 1995 (1995-12-31), pages 9 - 20 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108602857A (zh) * | 2016-01-27 | 2018-09-28 | 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司 | 重组IgG Fc多聚体 |
CN109561681A (zh) * | 2016-07-20 | 2019-04-02 | Igm生物科学股份有限公司 | 多聚gitr结合分子及其用途 |
CN112368021A (zh) * | 2018-06-14 | 2021-02-12 | 蓝鸟生物公司 | Cd79a嵌合抗原受体 |
CN114206936A (zh) * | 2019-06-14 | 2022-03-18 | 2赛文缇生物公司 | 用于治疗癌症的组合物和方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8952134B2 (en) | 2015-02-10 |
JP2015501291A (ja) | 2015-01-15 |
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140806 |