CN114053403A - 融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和治疗病毒感染的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和治疗病毒感染的药物中的用途，所述融合蛋白包括特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段和人干扰素。本发明还涉及所述融合蛋白在制备预防和治疗病毒感染导致的疾病的药物中的用途。本发明的融合蛋白具有可激活OX40信号通路，调节人获得性免疫***，并且与调节人先天免疫***的干扰素信号相互配合，协同增强人体对病毒的免疫力，以达到强效抗病毒的效果。本发明的融合蛋白可在预防和/或治疗病毒导致的疾病，特别是乙肝病毒、水痘‑带状疱疹病毒、流感病毒、冠状病毒(包括但不限于流感病毒、SARS、MERS、SARS‑Cov‑2等)感染及其导致的疾病中显示出独特的在药效和依从性方面的优势。

Description

融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和治疗病毒感染的药物中的 用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种抗人OX40抗体和干扰素的融合蛋白在制备疫苗佐剂或抗病毒的药物中的应用。
背景技术
目前抗病毒药物大体上分为两大类，一类直接抑制病毒，另一类则是通过调节人体免疫***来清除病毒。直接抑制病毒的药物是针对病毒的生命周期的关键环节开发的。病毒感染人体有几个主要环节，包括：1)病毒结合并侵入细胞；2)病毒的遗传物质在细胞内的复制；3)病毒衣壳蛋白的表达、加工和新一代病毒的组装；和4)病毒的释放。针对以上环节，可以开发出各种药物。直接抑制病毒的药物由于针对性强，可开发出高效、低副作用的特效药。然而由于许多病毒的变异性强，容易出现耐药现象。一旦出现耐药，则必须重新开发新的药物，对时效性和开发成本都是很大的挑战。另一类通过调节人体免疫力起效的药物则恰好具有与直接抑制病毒的药物互补的优势。人体的先天免疫***对包括病毒在内的病原体有着迅速且广谱的打击能力，而获得性免疫***则包括具有巨大多样性的免疫细胞。因此，充分调动人体的免疫***可以有效地抵御多种病毒，包括突变的病毒。
目前机制明确的且被广泛用于抗病毒的调节人体免疫力的药物是干扰素类药物。干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广泛生物活性的糖蛋白。干扰素通过诱导细胞进入特殊的抗病毒状态，激活细胞合成抗病毒蛋白(AVP)，产生降解病毒mRNA、抑制病毒多肽链的合成等多种效应，从而实现干扰病毒增殖的效果。另外，干扰素也与多个信号通路产生联系，调节获得性免疫***，促进高特异性细胞免疫和体液免疫的形成，达到强效且持久的抗病毒效果。
根据其对应的受体的不同，通常将干扰素分为3种主要类型：I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。其中I型干扰素在临床上应用最为广泛，包括IFNα-2a、IFNα-2b、IFNα-2c、IFNβ-1a、IFNβ-1b、IFNω等。I型干扰素被广泛应用于肝炎、多发性硬化病及多种恶性肿瘤的治疗。
IFN药物也曾被尝试用于同为冠状病毒引起的SARS(严重急性呼吸***综合症)和MERS(中东呼吸综合症)的治疗。以SARS为代表的致命性冠状病毒的爆发往往呈现突发、多地爆发的形式。这就导致没有足够的时间去根据病毒的特点研发特异性治疗性药物，所以老药新用或者广谱抗病毒药物(免疫激活剂)成为首要的应急选择。I型干扰素作为经典的广谱抗病毒药物，对SARS的治疗作用限于流行病爆发的特点而未经过严格的随机对照实验证实。I型干扰素对MERS的治疗作用也只是有一些病例报告，在使用Ribavirin与PEG-IFNa2b后，危重病人的预后得到了明显的改善。而I型干扰素在灵长类动物冠状病毒模型中也被报道有明确的治疗作用。在SARS食蟹猴模型中，预防性给予食蟹猴PEG-IFNa2b(感染前3天、1天)，可以较强地阻断SARS-Cov的分泌、复制以及病毒抗原蛋白在感染组织里的表达；而治疗性给药(感染后1天、3天)，PEG-IFNa2b只有中等程度的对病毒的分泌、复制以及病毒抗原蛋白在感染组织里的表达的抑制作用。在MERS食蟹猴模型中，Ribavirin与PEG-IFNa2b联用，感染病毒8小时后，相对于对照组，治疗组动物未见明显的呼吸***异常，仅有轻微的肺炎发生，低水平的血清与肺部炎性反应，病毒拷贝数也明显较低。
但是，总体而言，干扰素抗病毒的效果仍不令人满意，同时干扰素可导致多种不良反应，其副作用包括：流感样症状、发热、头痛、乏力、全身肌肉酸痛、外周血红细胞和血小板减少、情绪和精神异常，存在加重或诱发原有的或潜在的自身免疫性疾病的可能。这成为限制干扰素临床应用的主要原因。
人OX40主要表达于活化的T细胞上，包括CD4、CD8、Th和Treg细胞等。抗原依赖性OX40L/OX40共刺激分子的活化与T细胞内多个信号通路相偶联。晶体结构研究表明，OX40L与OX40的结合可诱导OX40-OX40L复合物三聚体化，从而在细胞内形成与receptor-associated factor(TRAF)结合的结合位点。后者(TRAF2、5)则可进而激活NF-κB信号通路，抑制T细胞凋亡。有研究发现，OX40活化可以导致Bcl-2和Bcl-xL高表达，提示OX40可能通过NF-κB信号通路诱导抗凋亡蛋白表达而实现其抑制T细胞凋亡的功能。PKB/PI3K是OX40下游的另一个重要信号通路。研究发现，一方面，T细胞上OX40的共刺激信号是维持PKB活化的必要条件，另一方面，组成型活化的PKB可以拮抗OX40缺陷导致的T细胞中抗凋亡蛋白的下调。OX40共刺激信号可以通过PKB/PI3K信号通路维持Survivin的表达。最后，T细胞上TCR和OX40的活化还可以协同引起钙流和NFAT信号通路的活化，调节包括IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ在内的细胞因子的表达。综上，上述研究表明OX40的活化可以通过NF-κB信号通路、PKB/PI3K信号通路和NFAT信号通路来调节T细胞的增殖、凋亡和细胞因子分泌活性，从而达到增强免疫***活力的效果。基于上述发现，OX40已成为免疫疗法的一个重要靶点，众多的临床前和临床研究都提示OX40可以作为肿瘤免疫疗法的一个重要靶点。有趣的是，最近的研究还发现OX40信号通路在抑制乙肝病毒感染中的作用，提示OX40激动剂可以作为抗乙肝病毒感染，进而***病人的潜在手段。
近年来，呼吸***病毒感染及其导致的疾病大规模频繁爆发，严重危害人类健康，甚至引发全球性健康危机。在此背景下，急需开发有效地对抗呼吸***病毒感染，提高人体免疫力的新型药物。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的应用。本发明的研究意外地发现，该融合蛋白具有特异性抗病毒活性，可激活OX40信号通路，调节人获得性免疫***，并且与调节人先天免疫***的干扰素信号通路相互配合，协同增强人体针对病毒的免疫力，以达到强效抗病毒的效果。
第一方面，本发明提供了一种融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途，其中所述融合蛋白包含：
a)特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段；和
b)人干扰素；
其中所述人干扰素直接或通过肽接头连接至所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的羧基端或氨基端。
在根据本发明的用途中，所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段可以包含：
重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH CDR1、SEQID NO:2所示的氨基酸序列的VH CDR2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的VL CDR1、SEQID NO:5所示的氨基酸序列的VL CDR2和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VL CDR3。
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成。
在根据本发明的用途中，所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段可以选自骆驼化单域抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体中的一种或多种。
在根据本发明的用途中，所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段还可以包含免疫球蛋白的恒定区；优选地，所述免疫球蛋白的恒定区选自人IgG1、IgG2或IgG4的恒定区中的一种或多种。
在根据本发明的用途中，所述人干扰素可以选自I型人干扰素、II型人干扰素或III型人干扰素中的一种或多种；优选地，所述人干扰素选自IFNα2a、IFNβ、IFNγ、IFNλ3或IFNα2b中的一种或多种；更优选地，所述人干扰素为IFNα2b，例如氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b。
进一步优选地，所述人干扰素为IFNα2b的突变体，例如在SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中具有一个或多个选自以下的突变的IFNα2b突变体：T106A、R149A、A145G、A145D、R120A或L117A，或者在SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中具有一个或多个选自以下的双突变的IFNα2b突变体：T106A/A145D、T106A/R149A、T106A/A145G、T106A/R120A或T106A/L117A。
在根据本发明的用途中，所述肽接头选自(G)m、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSAGSAAGSGEF、(GGGGS)n或(GGSGG)n中的一种或多种，其中m为1-20之间的整数，n为1-5之间的整数；优选地，m为5-10之间的整数，n为1-3之间的整数；更优选地，所述肽接头为(GGGGS)n，其中n为1-5之间的整数；进一步优选地，n为1-3之间的整数。
在根据本发明的用途的具体实施方案中，所述融合蛋白包含：UMY02-L1、UMY02-L2、UMY02-L3、UMY02-L4、UMY02-L5、UMY02-L6、UMY02-L7、UMY02-L8、UMY02-L13、UMY02-L14、UMY02-L15、UMY02-L16、UMY02-L17、UMY02-L18、OX40-IFN-α2a、OX40-IFNβ、OX40-IFNγ、OX40-IFNλ3中的一种或多种，或其组成；优选地，所述融合蛋白包含UMY02-L17和/或UMY02-L18，或由其组成。其中：
UMY02-L1：氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述重链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L2：氨基酸序列为SEQ ID NO:12的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L3：氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素；所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L4：氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链在其羧基端连接人干扰素，所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L5：氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L6：氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L7：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L8：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L13：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/A145D突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L14：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/R149A突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L15：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/R120A突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L16：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/A145G突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L17：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述人干扰素为包含T106A/R149A突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
UMY02-L18：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/L117A突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
OX40-IFN-α2a：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:14所示的IFNα2a；
OX40-IFNβ：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:14所示的IFNα2a；
OX40-IFNγ：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:16所示的IFNγ；
OX40-IFNλ3：氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:17所示的IFNλ3。
第二方面，本发明提供了编码上述融合蛋白的多核苷酸在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途。
第三方面，本发明提供了一种载体在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途，其中所述载体包含所述多核苷酸。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途，其中宿主细胞包含所述载体。优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为HEK293细胞。
在根据本发明的用途中，所述疫苗佐剂或药物还可以包含药学上可接受的载体、辅料、稀释剂和/或赋形剂。
相应地，本发明提供了一种用于增强疫苗效果、预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的方法，其包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的所述融合蛋白、多核苷酸、载体或宿主细胞。
在根据本发明的用途或方法中，所述病毒感染可以选自乙肝病毒感染、水痘-带状疱疹病毒感染、流感病毒感染或冠状病毒感染(包括但不限于SARS、MERS、SARS-Cov-2等)感染中的一种或多种；优选地，所述冠状病毒感染选自SARS感染、MERS感染或SARS-Cov-2感染中的一种或多种。优选地，所述病毒感染导致的疾病选自慢性乙肝、乙肝病毒阳性的肝癌、流感、带状疱疹或COVID-19感染导致的疾病中的一种或多种。
研究表明，新型冠状病毒(SARS-Cov-2)导致的重症肺炎与机体的非特异性先天免疫过强有关。因此，帮助机体在建立抗击病毒的第一道先天免疫防线的同时，尽快诱导出特异性高、功能强的获得性免疫力在抵御病毒的同时避免机体受到非特异性杀伤中就变得十分重要。OX40激动剂能够帮助机体快速激活高特异性、高活性获得性免疫力，甚至在活化具有长期免疫记忆的记忆性T细胞方面也具有重要作用。因此，本发明意外地发现了OX40激动剂和干扰素在抗呼吸***病毒方面优势互补，因此在干扰素药物的基础上结合OX40激动性抗体，开发出作为高效、低副作用的新一代免疫调节剂的融合蛋白，其在预防和/或治疗病毒，例如呼吸***病毒，特别是新型冠状病毒感染及其导致的疾病中有重要的应用价值或潜力。
本发明的优势在于：(1)OX40激动性抗体与干扰素的融合蛋白具有协同激活先天性免疫和获得性免疫的独特作用，可能显示出独特的临床优势；(2)本发明发现，当融合蛋白中的干扰素部分结合到高表达干扰素受体的细胞表面时，可以以干扰素受体介导的模式增强OX40激动性抗体的活性，从而更好的增强获得性免疫***活性；(3)此外，本发明的融合蛋白较干扰素分子的半衰期大大延长，在临床上可以以更低的频次用药；(4)最后，本发明的融合蛋白在保持高抗病毒活性的同时，还可以降低干扰素的相对剂量，从而减少与干扰素相关的副作用。
综上，本发明的融合蛋白可以作为疫苗佐剂，或在预防和/或治疗病毒感染，特别是乙肝病毒、水痘-带状疱疹病毒、流感病毒、冠状病毒(包括但不限于SARS、MERS、SARS-Cov-2等)感染及其导致的疾病中显示出独特的在药效和依从性方面的优势。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示替代药物OX86-IFN、OX86和mutOX86-IFN的结构。
图2显示替代药物OX86-IFN、OX86和mutOX86-IFN对小鼠的免疫激活活性。
图3显示替代药物OX86-IFN、OX86和mutOX86-IFN对小鼠A20细胞的增殖抑制活性。
图4显示替代药物OX86-IFN、OX86和mutOX86-IFN对小鼠血清中HBV DNA的拷贝数和HBsAg的降低作用。
图5A显示替代药物OX86-IFN增强小鼠产生抗S1(RBD)蛋白抗体的功能。
图5B显示替代药物OX86-IFN增强小鼠对Sars-CoV-2的免疫。
图6显示替代药物OX86-IFN作为佐剂增强抗原免疫原性。
图7显示UMY02-L17和UMY02-L18对食蟹猴外周血CD4+和CD8+细胞活化增殖水平的影响；
图8显示皮下、静脉注射UMY02-L17和UMY02-L18在食蟹猴体内的半衰期；
图9显示UMY02-L17和UMY02-L18对食蟹猴外周血中新蝶呤水平的影响。
具体实施方式
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对本申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本发明中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一可变区和第一、第二和第三恒定区组成；每条轻链由一可变区和一恒定区组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型，Y型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包括其一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)。轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1，HCDR2、HCDR3。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别(AI-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4):927(1997)；Chothia,C.等，J.Mol.Biol.,186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)；Chothia，C.等，Nature,342(6252):877-83(1989)；Kabat,E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要类别或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体类别还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
本发明中“载体”是指可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地***其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬茵体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40))。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
“药学上可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，无论其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明在本发明的范围内的特定实施方式。本领域熟练技术人员可不依赖创造性及不偏离本发明范围开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动仍然包括在本发明范围内。本发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例1：替代药物的制备
由于大分子药物的高度靶向特异性，药物在不同动物种属间往往并不具备作用靶点的交叉反应性。为了能在动物模型上完成必要的研究，制备相关的替代药物(surrogatedrug)是常用的研究手段(参考文献：Surrogate approaches in development ofmonoclonal antibodies.Drug Discovery Today2009,14(23-24):1159-1165)。
为了在小鼠模型上验证OX40-IFNα融合蛋白具有免疫调节活性及抗病毒活性，我们设计并表达了小鼠替代药物OX86-IFN(见图1)。OX86-IFN由小鼠OX40激活性抗体OX86和小鼠IFNα4两部分组成，其中IFNα4融合于OX86轻链的C末端，连接处的肽接头序列为(GGGGS)3(重链序列为SEQ ID NO:18，轻链序列为SEQ ID NO:19)。
作为对照，我们还表达了OX86(即OX86抗体)(重链序列为SEQ ID NO:18，轻链序列为SEQ ID NO:20)和mutOX86-IFN(突变的OX86抗体融合了小鼠IFNα4)(重链序列为SEQ IDNO:21，轻链序列为SEQ ID NO:19)(见图1)。
本发明所用的抗体融合蛋白及替代药物OX86-IFN/OX86/mutOX86-IFN由泰州市百英生物科技有限公司提供技术服务，制备方法简述如下：
将编码抗体的重链和轻链的cDNA(OX86-IFN重、轻链cDNA分别为SEQ ID NO:22和23；OX86重、轻链cDNA分别为SEQ ID NO:22和24；mutOX86-IFN重、轻链cDNA分别为SEQ IDNO:25和23，包含信号肽)分别克隆到pcDNA3.4质粒(Thermo Fisher，Cat#A14697)。
抗体融合蛋白的表达采用常规哺乳动物细胞HEK293表达体系。首先将HEK293细胞在细胞培养箱(125rpm，5％CO2，37℃)中培养至1×106个/ml左右。经1：5稀释传代培养2次后，准备转染。将生长至密度约2-3×106个/ml的HEK293细胞稀释至密度1.5×106个/ml。以100mL表达体系为例，用细胞培养液稀释25μg pcDNA3.4-HC(克隆有融合蛋白重链序列)和25μg pcDNA3.4-LC(克隆有融合蛋白轻链序列)，并混匀，总体积为100μl。用培养液稀释100μl转染试剂并混匀。将稀释后的转染试剂加入质粒溶液混匀，37℃下孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养，表达一周后8000rpm离心5min收集上清。用Protein A亲和层析柱结合上清中的抗体融合蛋白，然后用10倍柱体积的1x PBS溶液洗去未结合的杂质。最后用柠檬酸钠溶液(pH 3.4)洗脱，分管收集，每管约300μl，共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。将有较多洗脱蛋白的洗脱管合并，并将液体转移至透析袋中，放至1x PBS溶液中透析6个小时以上。最后，再次使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。经检测，表达的OX86-IFN浓度为2.1mg/ml，OX86浓度为3.3mg/ml，mutOX86-IFN浓度为3.6mg/ml。
实施例2：替代药物激活小鼠免疫***实验
分别将3.6mg/kg OX86-IFN，3.0mg/kg OX86及3.6mg/kg mutOX86-IFN腹腔注射至雌性Balb/c小鼠(n＝5)(动物来源：上海灵畅生物科技有限公司)体内后，在不同时间采集外周全血，EDTA-K2抗凝。采用红细胞裂解液(生工生物，货号B541001-0100)将红细胞裂解，PBS洗两次后，加入150μl含有FCγR(CD16/32)封闭抗体(BioLegend,货号101302)的PBS，在4℃下孵育15分钟。将孵育后的细胞分成两部分：(1)其中100μl细胞悬液分别加入PerCP-Cy5.5大鼠抗小鼠CD3(BioLegend，货号100218)，APC大鼠抗小鼠CD4(BioLegend，货号100412)和PE大鼠抗小鼠CD8a(BioLegend，货号100708)抗体，在4℃下避光孵育45分钟。之后将淋巴细胞用固定/透化缓冲液(BD bioscience，货号562574)破膜固定，并加入FITC大鼠抗-Ki-67抗体(eBiosciences，货号14-5698-82)在4℃下避光孵育45分钟。用透化/洗涤缓冲液洗两次后，将细胞用400μl PBS悬起，上机检测；(2)另一部分50μl细胞悬液中加入50μl PBS补足体积至100μl，加入APC大鼠抗小鼠CD115(BioLegend，货号135509)，在4℃下避光孵育45分钟，用PBS洗两次后，将细胞用400μl PBS悬起，上机检测。
如图2A所示，相对OX86或mutOX86-IFN，融合蛋白OX86-IFN对小鼠外周血T细胞的激活程度更高，激活维持时间更久。
如图2B所示，相对OX86或mutOX86-IFN，融合蛋白OX86-IFN可刺激小鼠外周血单核巨噬细胞比例上升。
实施例3：A20细胞增殖抑制试验
A20细胞(来自ATCC)为小鼠B细胞淋巴瘤来源的细胞株，其高表达干扰素受体，干扰素可以通过结合A20表面的干扰素受体发挥抑制细胞生长的作用。因此可以用A20细胞增殖试验来评估融合蛋白中干扰素基团的活性。
将A20细胞以10000个细胞/90微升/孔铺96孔板，将待检测样品配制成浓度梯度稀释的10×工作液，分别以10微升/孔加入96孔板，置于37℃的孵箱，72小时后加CCK8(CellCounting Kit-8)检测OD450，并计算各孔细胞的增殖抑制率。该抑制率反映了样品中干扰素的活性。
如图3所示，实验结果显示小鼠干扰素IFNα4对A20细胞有较强的细胞增殖抑制功能(IC50＝10.31nM)，而OX86-IFN和mutOX86-IFN具有较弱、但是相似的A20细胞增殖抑制活性(IC50分别为855.4nM，712.9nM)。OX86则由于缺少干扰素活性，而对A20细胞完全没有抑制作用。融合蛋白OX86-IFN中干扰素活性较低对于协同发挥靶向OX40和干扰素信号通路的作用是有利的。
实施例4：融合蛋白的不同结构和活性
设计并表达了一系列抗人OX40激活性抗体与人IFNα2b的融合蛋白。这些融合蛋白具有与OX86-IFN相似的连接组合方式，但是在肽接头和IFNα2b的序列上进行了不同的修饰，以获取具有最佳的OX40激活活性和干扰素活性的融合蛋白。表1和表2汇总了对这一系列融合蛋白的活性比较研究。其中MT01-C1为OX40单抗(重链：SEQ ID NO：10，轻链：SEQ IDNO：11)。
表1 抗体亚型和肽接头长度对干扰素活性的影响
Figure BDA0002612014730000121
Figure BDA0002612014730000131
表2 突变的抗体融合蛋白的活性
Figure BDA0002612014730000132
1突变的氨基酸位置序号参照野生型人干扰素IFNa2b的氨基酸序列标示。
2.将IFNα2b的活性定义为1。
3.将OX40单抗MT01-C1的活性定义为1。
实施例5：替代药物在小鼠高压水动力HBV模型中的药效实验
将32只雄性C57BL/6小鼠(来源：湖南斯莱克景达实验动物有限公司)分为4组，每组8只。小鼠尾静脉注射约10μg溶解于磷酸盐缓冲液的pAAV/HBV1.2质粒(来源：华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科)，注射体积为小鼠体重的10％，注射时间为5-8秒。在注射pAAV/HBV1.2后第7天，小鼠分别腹腔注射给予生理盐水，以及3.6mg/kg OX86-IFN，3.0mg/kg OX86或者3.6mg/kg mutOX86-IFN。在注射pAAV/HBV1.2后的第1、7、8、12、17、24天采集小鼠血清，采用酶联免疫吸附法测定血清里的HBsAg(上海科华生物)。采用real timePCR法测定血清里HBV DNA的拷贝数，正向引物为：5’-CTG CAT CCT GCT GCT ATG-3’(nt408-425)，反向引物为：5’-CAC TGA ACA AAT GGC AC-3’(nt 685-701)。参考序列见Genbank accession number AY220698.1。
如图4所示，相对于OX86和mutOX86-IFN，替代药物OX86-IFN具有更强的降低小鼠血清里HBV DNA拷贝数(平均下降了1.25log)和血清HBsAg的作用，特别是有50％的小鼠(8只中的4只)实现了HBsAg血清转阴，而两个对照药物组中分别只有1只实现了血清学转阴。
实施例6：替代药物增强小鼠免疫***对Sars-CoV-2的免疫
将6只Balb/c小鼠(动物来源：上海灵畅生物科技有限公司)随机分成2组，每组3只，在第-1天，取3只Balb/c小鼠腹腔注射3.0mg/kg OX86-IFN，另3只小鼠腹腔注射等体积生理盐水；在第0天，以上6只小鼠分别皮下注射30μg Sars-CoV-2S1(RBD)(泰州市百英生物科技有限公司，货号B232004)蛋白混合等体积不完全弗氏佐剂(Chondrex，货号7002)，作为第一次免疫。在第8天，再次按照相同的给药方式分别对6只小鼠注射3.0mg/kg OX86-IFN或等体积生理盐水，并于当天分别皮下注射30μg S1(RBD)蛋白混合等体积不完全弗氏佐剂，作为第二次免疫。第15天，6只小鼠分别取血，收集血清检测血清中抗S1(RBD)蛋白抗体功能。
配制S1protein/PBS溶液，将浓度为1μg/mL的蛋白溶液以100μL/孔包被96孔板，4℃下振荡过夜。3μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3遍。用100μL/孔的5％BSA/PBS封闭1小时，室温振荡孵育。300μL PBST洗涤3遍。用PBS将小鼠血清稀释100倍，以100μL/孔加入96孔板。室温振荡孵育1小时。300μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3遍。用PBS将Ace-2FC(近岸蛋白质科技，货号C05Y)稀释至0.5μg/mL，以100μL/孔加入96孔板。室温振荡孵育1小时。300μLPBST(Tween20：0.5‰)洗涤3遍。配制二抗溶液：山羊抗人IgG HRP(Abcam，货号ab6858)(1:15000)/PBS，室温振荡孵育0.5小时。300μL PBST洗4遍。100μL/孔TMB，显色3分钟，加入100μl 0.6N H2SO4，终止显色。OD450读板。
第18天，将6只小鼠安乐死，无菌取出脾脏并去除脂肪。通过用注射器柱塞在细钢网上研磨脾脏而获得单细胞悬液。离心去上清，轻弹细胞使其分散，然后直接加入1ml的1×红细胞裂解液进行红细胞裂解，37℃下，5分钟左右。然后用完全RPMI-1640培养基，含有10％FBS+1％P/S中洗涤两次。将脾细胞按照5×105细胞/孔，两复孔铺在96孔培养白板中(Corning，货号3610)，180μL/孔。S1(RBD)蛋白的配制：母液3.5mg/ml，终浓度0、0.1和1μg/ml。先配置10×，即10μg/ml，将母液稀释350倍，2μL母液+698μL完全培养基。然后10倍稀释，70μL+630μL完全培养基稀释。再按照20μL/孔加入到上述的细胞中。用不同浓度的S1蛋白刺激细胞。培养48和72小时后，分别收集细胞和上清：(1)细胞用PBS洗两次后，加入100μL含有FCγR(CD16/32)封闭抗体(BioLegend，货号101302)的PBS，在4℃下孵育15分钟。分别加入PerCP-Cy5.5大鼠抗小鼠CD3(BioLegend，货号100218)抗体，在4℃下避光孵育45分钟。之后将淋巴细胞用固定/透化缓冲液(BD bioscience，货号562574)破膜固定，并加入FITC大鼠抗-Ki-67抗体(eBiosciences，货号14-5698-82)在4℃下避光孵育45分钟。用透化/洗涤缓冲液洗两次后，将细胞用400μLPBS悬起，上机检测；(2)上清用ELISA MAXTM Deluxe Set小鼠IL-6(Biolegend，货号431304)试剂盒检测IL-6浓度。
如图5所示，融合蛋白OX86-IFN可以促进小鼠针对Sars-CoV-2S1(RBD)生成中和抗体，可以增强小鼠针对Sars-CoV-2S1(RBD)的免疫记忆作用。
实施例7：替代药物作为佐剂增强抗原免疫原性
将11只Balb/c小鼠(动物来源：上海灵畅生物科技有限公司)随机分成2组，每组5只或6只，分别用不同的方式进行免疫：第一组5只小鼠分别在第1天和第14天进行两次免疫，皮下注射50μl下白介素1受体蛋白(购自上海近岸生物科技有限公司)混合等体积不完全弗氏佐剂(Chondrex，货号7002)，每次免疫前一天，即第0天和第13天，每只小鼠腹腔注射3mg/kg OX86-IFN；第二组6只小鼠分别在第1天和第21天进行两次免疫，采用市售佐剂QuickAntibody(Biodragon，货号KX0210041)，参照说明书混合20μg白介素1受体蛋白进行肌肉注射。第34天，两种免疫方式的11只小鼠分别取血，收集血清检测血清中抗白介素1受体蛋白的抗体滴度及抗体功能。
滴度检测方法如下：白介素1受体蛋白1μg/ml，100μl包板，4℃过夜；用300μl/孔的PBST洗四遍，5％BSA封闭，室温振荡孵育30分钟；用300μl/孔的PBST洗三遍，加入不同稀释梯度的待测血清100μl/孔，室温振荡孵育2小时；用300μl/孔的PBST洗三遍，加山羊抗小鼠IgG HRP(金斯瑞生物科技，货号A00160)1：10000(1％BSA/PBS稀释)，100μl/孔，室温振荡孵育1小时；用300μl/孔的PBST洗三遍，100μL/孔TMB，显色5分钟，加入100μl 0.6N H2SO4，终止显色。OD450读板。
功能检测方法如下：在96孔板中分别加入4×104个细胞/80μL/孔A431细胞，铺板后培养过夜；配制1:25或1:125的血清，或20μg/ml阳性抗体，将配置的血清或阳性抗体加入96孔圆底板，体积为40μL/孔，37℃孵育1小时；配制48ng/ml人IL36a，加入96孔圆底板，体积为40μL/孔，37℃孵育24小时；收集细胞培养上清，采用ELISA MAXTM Deluxe Set人IL-8(Biolegend，货号431504)试剂盒检测IL-8浓度。
如图6所示，融合蛋白OX86-IFN具有免疫激活作用，可以充当免疫佐剂。
实施例8：UMY02-L17和UMY02-L18对食蟹猴免疫激活、血液学指标的影响以及药代动力学的实验
将8只2-5岁雄性食蟹猴(动物来源：广西防城港常春生物技术开发有限公司)分为4组，每组2只，分别静脉注射给予UMY02-L17和UMY02-L18，给药剂量为3mg/kg；皮下注射给予UMY02-L17和UMY02-L18，给药剂量为5.5mg/kg。在给药前和给药后的不同时间点采集动物外周静脉抗凝全血和血清。采用BD Accuri C6流式细胞检测仪检测给药前后食蟹猴外周全血里的CD4、CD8，以及活化的CD4、CD8细胞数目(CD4检测抗体货号为BD biosciences551980；CD8检测抗体货号为BD biosciences 551980；Ki67检测抗体货号为BDbiosciences 565310)。采用迈瑞BC6800全自动血液细胞分析仪检测给药前后食蟹猴外周全血血液学指标的变化情况。
采用酶联免疫吸附法检测给药前后食蟹猴外周血清里的药物浓度。具体地，浓度为1μg/mL的人OX40蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃下振荡过夜。第二天先以300μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3次，之后用100μL/孔的5％BSA/PBS封闭1小时，室温振荡。300μL PBST洗涤4次。用PBS配制待测血清样品以及不同浓度对照品血清溶液的100倍稀释溶液。以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1.5小时。300μL PBST洗涤4次。对于MT01-C1，配制二抗驴抗人IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，货号709-035-149)溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μL PBST洗涤4次。加入100μL/孔TMB，显色20min。以100μL/孔加入0.6N H2SO4，终止显色，检测OD450nm。对于UMY02-L1和UMY02-L3，配制0.5μg/mL的兔抗人IFN(abcam，货号ab222552)溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温下振荡1.5小时。300μLPBST洗涤4次。配制二抗羊抗兔IgG HRP(金斯瑞生物科技，货号A00098)溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μL PBST洗涤4次。加入100μL/孔TMB，显色20min。以100μL/孔加入0.6N H2SO4，终止显色，检测OD450nm。不同浓度的对照品溶液检测值与对照品浓度进行Logistic四参数拟合，得到标准曲线回归方程。将待测样品的检测值代入方程计算，得到不同时间点的血清药物浓度。
采用液质联用仪(AB Sciex三重四极杆5500LC/MS/MS)检测给药前后食蟹猴外周血清里新蝶呤的浓度。
如图7所示，UMY02-L17和UMY02-L18可以导致食蟹猴外周血CD4+和CD8+细胞活化增殖水平上升。
如图8所示，皮下注射UMY02-L17和UMY02-L18后，融合蛋白在食蟹猴体内暴露水平良好，比IFNα2b的2-3小时的半衰期大大延长(参见Merck公司产品Intron A的产品说明书)。
如图9所示，UMY02-L17和UMY02-L18可以导致食蟹猴外周血中新蝶呤水平上升。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案的范围情况下，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京优迈生物科技有限公司
<120> 融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和治疗病毒感染的药物中的用途
<130> DIC20110024
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
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<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 15
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 16
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
130 135 140
<210> 17
<211> 175
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Val Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys
1 5 10 15
His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe
20 25 30
Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys
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Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu
50 55 60
Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr
65 70 75 80
Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp
85 90 95
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
100 105 110
Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly
115 120 125
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
130 135 140
Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
145 150 155 160
Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val
165 170 175
<210> 18
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Met Arg Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Gly Arg Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
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Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 19
<211> 396
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Arg Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro His Thr
225 230 235 240
Tyr Asn Leu Gly Asn Lys Arg Ala Leu Thr Val Leu Glu Glu Met Arg
245 250 255
Arg Leu Pro Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp Arg Lys Asp Phe Gly Phe
260 265 270
Pro Leu Glu Lys Val Asp Asn Gln Gln Ile Gln Lys Ala Gln Ala Ile
275 280 285
Leu Val Leu Arg Asp Leu Thr Gln Gln Ile Leu Asn Leu Phe Thr Ser
290 295 300
Lys Asp Leu Ser Ala Thr Trp Asn Ala Thr Leu Leu Asp Ser Phe Cys
305 310 315 320
Asn Asp Leu His Gln Gln Leu Asn Asp Leu Lys Ala Cys Val Met Gln
325 330 335
Glu Pro Pro Leu Thr Gln Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val Arg Thr Tyr
340 345 350
Phe His Arg Ile Thr Val Tyr Leu Arg Lys Lys Lys His Ser Leu Cys
355 360 365
Ala Trp Glu Val Ile Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser
370 375 380
Thr Asn Leu Leu Ala Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu
385 390 395
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Arg Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 21
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 21
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Met Arg Ala Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ala Asp Gly Arg Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 22
<211> 1387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggcccaggtg 60
cagctgaagg aaagcggccc cggcctggtg cagccctcac agacactgag cctgacctgc 120
accgtgagcg gcttcagcct gacaggctac aacctgcact gggtgagaca gccccccggc 180
aaaggactgg agtggatggg aagaatgaga tacgacggag acacctacta taacagtgtg 240
ctgaaatcta ggctgagcat cagtagagac accagcaaga accaggtgtt cctgaagatg 300
aacagcctgc agaccgacga caccgccatc tactactgca ccagagacgg cagaggagac 360
agcttcgact actggggcca gggagtgatg gtgaccgtga gcagcgcttc tacgacaccc 420
ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg 480
ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc 540
ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc 600
agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc 660
cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag 720
ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag 780
gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag 840
gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag 900
acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc 960
atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc 1020
cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccgcaggtg 1080
tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg 1140
ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg 1200
gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc 1260
aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta 1320
catgagggcc tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1380
ttctaga 1387
<210> 23
<211> 1252
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccgacatt 60
gtgatgaccc agggcgccct gcccaacccc gtgccttctg gagagagcgc tagcattacc 120
tgcagatcct cccagagcct ggtgtataag gacggccaga cctacctgaa ctggttcctg 180
cagagacccg gccagagccc ccagctgctg acctattgga tgagcaccag agccagcggc 240
gtgtccgaca gattctccgg cagcggcagc gggacctact tcaccctgaa gatcagcaga 300
gtgagagctg aggacgccgg cgtgtactac tgccagcagg tgagagagta tccctttacc 360
tttggcagcg gcaccaagct ggagattaaa agagcagatg ctgcaccaac tgtatccatc 420
ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 480
aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 540
ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 600
accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact 660
cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg tggaggagga 720
ggaagcggag gaggagggag cggaggaggg ggaagctgcg acctgccaca cacatacaac 780
ctgggaaaca agagagccct gacagtgctg gaggagatga gaagactgcc accactgagc 840
tgcctgaagg ataggaagga cttcgggttt cccctggaga aggtggacaa ccagcagatc 900
cagaaggccc aggccatcct ggtgctgaga gacctgaccc agcagatcct gaacctgttc 960
accagcaagg acctgagcgc tacctggaac gctacactgc tggacagctt ctgcaacgac 1020
ctgcatcagc agctgaacga tctgaaagcc tgcgtgatgc aggagccccc cctgacccag 1080
gaggacagcc tgctggccgt gagaacctat ttccatagaa tcacagtgta cctgagaaaa 1140
aagaagcaca gcctgtgcgc ctgggaggtg atcagagccg aggtgtggag agccctgagc 1200
agcagcacca acctgctggc cagactgagc gaggagaagg agtgattcta ga 1252
<210> 24
<211> 721
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccgacatt 60
gtgatgaccc agggcgccct gcccaacccc gtgccttctg gagagagcgc tagcattacc 120
tgcagatcct cccagagcct ggtgtataag gacggccaga cctacctgaa ctggttcctg 180
cagagacccg gccagagccc ccagctgctg acctattgga tgagcaccag agccagcggc 240
gtgtccgaca gattctccgg cagcggcagc gggacctact tcaccctgaa gatcagcaga 300
gtgagagctg aggacgccgg cgtgtactac tgccagcagg tgagagagta tccctttacc 360
tttggcagcg gcaccaagct ggagattaaa agagcagatg ctgcaccaac tgtatccatc 420
ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 480
aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 540
ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 600
accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact 660
cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg ttgattctag 720
a 721
<210> 25
<211> 1387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggcccaggtg 60
cagctgaagg aaagcggccc cggcctggtg cagccctcac agacactgag cctgacctgc 120
accgtgagcg gcgcctccct gaccggatac aacctgcact gggtgagaca gccccccggc 180
aaaggactgg aatggatggg ccggatgaga gccgacggag acacctacta taacagcgtg 240
ctgaagagca gactgagcat cagcagagac accagcaaga accaggtgtt cctgaagatg 300
aatagcctgc agaccgacga caccgccatc tattactgca ccgccgacgg caggggagac 360
agcttcgact actggggcca gggcgtgatg gtgaccgtga gctctgcttc tacgacaccc 420
ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg 480
ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc 540
ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc 600
agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc 660
cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag 720
ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag 780
gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag 840
gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag 900
acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc 960
atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc 1020
cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccgcaggtg 1080
tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg 1140
ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg 1200
gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc 1260
aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta 1320
catgagggcc tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1380
ttctaga 1387

Claims (12)

1.一种融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途，其中所述融合蛋白包含：
a)特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段；和
b)人干扰素；
其中所述人干扰素直接或通过肽接头连接至所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的羧基端或氨基端。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VH CDR1、SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的VH CDR2和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的VH CDR3；和/或
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VL CDR1、SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的VL CDR2和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的VL CDR3；
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或由其组成，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或由其组成。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段选自骆驼化单域抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体中的一种或多种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述特异性结合人OX40的抗体或其抗原结合片段还包含免疫球蛋白的恒定区；优选地，所述免疫球蛋白的恒定区选自人IgG1、IgG2或IgG4的恒定区中的一种或多种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述人干扰素选自I型人干扰素、II型人干扰素或III型人干扰素中的一种或多种；优选地，所述人干扰素选自IFNα2a、IFNβ、IFNγ、IFNλ3或IFNα2b中的一种或多种；更优选地，所述人干扰素为IFNα2b，例如氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
进一步优选地，所述人干扰素为IFNα2b突变体，例如在SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中具有一个或多个选自以下的突变的IFNα2b突变体：T106A、R149A、A145G、A145D、R120A或L117A，或者在SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中具有一个或多个选自以下的双突变的IFNα2b突变体：T106A/A145D、T106A/R149A、T106A/A145G、T106A/R120A或T106A/L117A。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述肽接头选自(G)m、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSAGSAAGSGEF、(GGGGS)n或(GGSGG)n中的一种或多种，其中m为1-20之间的整数，n为1-5之间的整数；优选地，m为5-10之间的整数，n为1-3之间的整数；
更优选地，所述肽接头为(GGGGS)n，其中n为1-5之间的整数；进一步优选地，n为1-3之间的整数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述融合蛋白包含一组或多组选自以下的组分，或由其组成：
(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述重链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(2)氨基酸序列为SEQ ID NO:12的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(3)氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(4)氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链在其羧基端连接人干扰素，所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(5)氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(6)氨基酸序列为SEQ ID NO:10的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(7)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(8)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述干扰素为如SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；
(9)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/A145D突变的SEQ IDNO:9所示的IFNα2b；
(10)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/R149A突变的SEQ IDNO:9所示的IFNα2b；
(11)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/R120A突变的SEQ IDNO:9所示的IFNα2b；
(12)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/A145G突变的SEQ IDNO:9所示的IFNα2b；
(13)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述人干扰素为包含T106A/R149A突变的SEQ IDNO:9所示的IFNα2b；
(14)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且所述人干扰素为包含T106A/L117A突变的SEQ IDNO:9所示的IFNα2b；
(15)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:14所示的IFNα2a；
(16)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:15所示的IFNβ；
(17)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:16所示的IFNγ；或
(18)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为GGGGS，并且所述人干扰素为如SEQ ID NO:17所示的IFNλ3；
优选地，所述融合蛋白包含一组或多组选自以下的组分，或由其组成：
(13)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)3，并且所述人干扰素为包含T106A/R149A突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b；或
(14)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的特异性结合人OX40的抗体的重链和氨基酸序列为SEQ ID NO:11的特异性结合人OX40的抗体的轻链，其中所述轻链通过肽接头在其羧基端连接人干扰素，所述肽接头为(GGGGS)2，并且人干扰素为包含T106A/L117A突变的SEQ ID NO:9所示的IFNα2b。
8.编码权利要求1至7中任一项所述的用途中的融合蛋白的多核苷酸在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途。
9.一种载体在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途，其中所述载体包含根据权利要求8所述用途中的多核苷酸。
10.一种宿主细胞在制备疫苗佐剂或预防和/或治疗病毒感染和/或病毒感染导致的疾病的药物中的用途，其中宿主细胞包含根据权利要求9所述用途中的载体；
所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为HEK293细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，其中所述疫苗佐剂或药物还包含药学上可接受的载体、辅料、稀释剂和/或赋形剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，其中所述病毒感染选自乙肝病毒感染、水痘-带状疱疹病毒感染、流感病毒感染或冠状病毒感染中的一种或多种；优选地，所述冠状病毒感染选自SARS、MERS或SARS-Cov-2中的一种或多种；
优选地，所述病毒感染导致的疾病选自慢性乙肝、乙肝病毒阳性的肝癌、流感、带状疱疹或COVID-19感染导致的疾病中的一种或多种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114773487A (zh) * 2022-05-31 2022-07-22 湖南大学 一种流感病毒和新型冠状病毒融合重组蛋白疫苗免疫原及其制备方法
CN115057946A (zh) * 2022-06-30 2022-09-16 四川省医学科学院·四川省人民医院 干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用

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