CN109900901A - 改进的诊断真菌感染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断患者的曲霉菌属感染的方法，其包括检测样品中来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的蛋白质抗原的步骤，其中使所述样品与特异性结合所述抗原的第一抗体接触，并且其中通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组，以及涉及结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的蛋白质抗原的抗体用于增加用于诊断患者的曲霉菌属感染的免疫测定的可靠性的用途，以及包括用特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的蛋白质抗原的第一抗体包被诊断装置的步骤的方法。

Description

改进的诊断真菌感染的方法
发明领域
本发明涉及诊断患者的曲霉菌属(Aspergillus)感染的方法，其包括检测样品中来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的步骤，其中使所述样品与特异性结合所述抗原的第一抗体接触，并且其中通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组，以及涉及结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的抗体用于增加用于诊断患者的曲霉菌属感染的免疫测定的可靠性的用途，以及包括用特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体包被诊断装置的步骤的方法。
发明背景
侵袭性曲霉菌病(IA)是患有血液***恶性肿瘤和深度免疫抑制(例如在造血干细胞移植后)的患者以及非血液病患者(例如患有选自包括以下的组的病状的患者：糖尿病、***性红斑狼疮、老年肺结核和肝或肾移植)中的发病率和死亡率的重要原因。
使用免疫诊断对IA的快速检测过程已经集中在对真菌半乳甘露聚糖(GM)的检测上(Latge等人(1994)Chemical and immunological characterization of theextracellular galactomannan secreted by Aspergillusfumigatus.lnfect.Immun.62:5424-5433；Pazos等人(2005)Contribution of(1～3)-β-D-glucan chromogenic assay to diagnosis and therapeutic monitoring of invasiveaspergillosis in neutropenic adult patients:a comparison with serialscreening for circulating galactomannan.J.Clin.Microbiol.43:299-305；Quindos(2006)New microbiological techniques for the diagnosis of invasive mycosescaused by filamentous fungi.Clin.Microbiol.Infect.12:40-52)。GM是支链碳水化合物，其包含甘露糖主链和包含半乳糖分子的短侧链。
单克隆抗体(mAb)已成功用于检测GM，它们构成了商业化的基于实验室的测试的基础，这样的测试包括例如Platelia曲霉菌属ELISA试剂盒，其中包含针对四(1～5)-β-D呋喃半乳糖苷(抗原中的优势免疫表位)的大鼠mAb(EB-A2)(Morelle等人(2005)Galactomannoproteins of Aspergillus fumigatus.Euk.Cell 4:1308-1316；Stynen等人(1995)A new sensitive sandwich enzyme linked immunosorbent assay to detectgalactofuran in patients with invasive aspergillosis.J.Clin.Microbiol.33:497-500；Stynen等人(1992)Rat monoclonal antibodies against Aspergillusgalactomannan.Inf.Immun.60:2237-2245)。
由于用于GM检测的免疫测定在疾病进展的早期阶段检测到抗原，该免疫测定是用于管理处于感染IA的风险的患者的重要资产。尽管它们被广泛使用，但最近的研究表明其在表现上存在显著差异。
假阳性结果归因于mAb EB-A2与各种试剂例如来自非曲霉菌属真菌的GM(Giacchino等人(2006)Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbentassay cross-reactivity caused by invasive Geotrichumcapitatum.J.Clin.Microbiol.44:3432-3434；Kappe等人(1993)New cause for falsepositive results with the Pastorex Aspergillus antigen latex agglutinationtest.J.Clin.Microbiol.31:2489-2490,Quindos(2006)New microbiologicaltechniques for the diagnosis of invasive mycoses caused by filamentousfungi.Clin.Microbiol.lnfect.12:40-52；Swanink等人(1997)Specificity of thesandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan.J.Clin.Microbiol.35:257-260；Verweij等人(2006)Issues with galactomannantesting.Med.Mycol.44:179-183)和来自新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的半乳糖木甘聚糖(galactoxylomannan)(Dalle等人(2005)Cryptococcus neoformansgalactoxylomannan contains an epitope(s)that is cross-reactive withAspergillus galactomannan.J.Clin.Microbiol.43:2929-2931)的交叉反应。
虽然有几位作者已经报道了令人满意的>85％的灵敏度，但是该测定的灵敏度可以变化很大，并且据报道可低至29％(Verweij等人(2006)lssues with galactomannantesting.Med.Mycol.44:179-183)。几组证据表明，灵敏度很大程度上取决于所选的患者群组和已经对他们进行治疗的方式。例如，已经报道了用泊沙康唑治疗的患者的样品的较低灵敏度(Marr等人(2005).Antifungal Therapy Decreases Sensitivity of theAspergillus Galactomannan Enzyme Immunoassay.Clin Infect Dis.40,1762–1769)。原因是未知的。似乎报道了较高灵敏度的许多作者使用来自排除此类患者的群组的血清样品。
另一种免疫测定由Thornton(2008)(Development of anImmunochromatographic Lateral-Flow Device for Rapid Serodiganosis of InvasiveAspergillosis,Clin.And Vacc.Immun.15-7,1095-1105)开发。它基于针对曲霉菌属JF5抗原(后来被鉴定为β-1,5-呋喃半乳糖)的单克隆抗体JF5在侧流装置中的使用。然而，这样的装置对于常规诊断中样品的高通量筛选几乎没有用。此外，根据该研究，由于获得了一系列假阴性结果，该测定的灵敏度留下了显著的改进空间。
在WO2010/082034中已经公开了相同的测定，但GM ELISA和JF5侧流装置测定均被报道具有基本相同的灵敏度(100％)。由于使用来自人工感染的豚鼠的样品，这些结果不能转换至人，并且事实上仍然存在改善用于在人的诊断中使用的测定的灵敏度的空间。WO2010/082034公开了ELISA测定，但仅用于使用包被的抗原检查抗体的质量，而不是基于人样品的诊断测定，更没有公开煮沸步骤。
与此相一致，当Hoenigl等人(2014)(Performance of Galactomannan,Beta-D-Glucan,Aspergillus Lateral-Flow-Device,Conventional Culture and PCR Testswith Bronchoalveolar Lavage Fluid for Diagnosis of Invasive PulmonaryAspergillosis,J.Clin.Microbiol 52-6,2039-2045)使用人样品比较这些方法时，报道了显著更低的灵敏度，更具体地，两种测定的灵敏度为80％。
Davies等人(2017)(Towards translational ImmunoPET/MR Imaging ofInvasive Pulmonary Aspergillosis:The Humanised Monoclonal Antibody JF5DetectsAspergillus Lung Infections In Vivo,Theranostics,7-4,3398-3414)报道了人源化单克隆抗体hJF5用于体内检测曲霉菌属感染的用途。作为他们研究的一部分，他们使用单克隆和人源化的JF5抗体来检测鼠而非人的样品中的曲霉菌属感染。此外，检查了通过切除肺获得的鼠肺组织。抗体用于常规高通量筛选人样品的诊断可靠性没有得到解决。他们没有公开对样品进行煮沸处理。
Ku等人(2012)报道了使用来自非血液病患者的样品的GMA ELISA的相当不令人满意的表现。灵敏度为23.1％，该作者认为该值“非常低”。
发明内容
因此，本发明的问题是提供改进的非膜基免疫测定，优选选自包括ELISA或基于珠子的测定的组，其克服了常规测定的缺点，特别是克服了可重复性、特异性和灵敏度的缺乏，并且可以优选用于样品的高通量筛选。
本发明的另一个问题是克服常规测定的缺点，特别是对于患有CGD(慢性肉芽肿病)和/或具有复发感染的高IgE综合征(HIES；Job综合征)的患者，增加特异性和灵敏度。
本发明的另一个问题是提供诊断上可靠的测定，特别是具有优化的特异性和/或灵敏度，其可以以自动化方式用于多种样品的高通量形式。
本发明的另一个问题是提供用于高通量筛选的诊断上可靠的测定，其在用于测试来自用抗真菌药物如泊沙康唑治疗的患者或非血液病患者的样品时，具有改善的灵敏度。
本发明的另一个问题是提供诊断上可靠的测定，其中可以在感染的早期和/或感染的晚期(特别是与现有技术的测定相比较，分别更早或更晚地)实现阳性诊断，从而导致其中可以基于血清学测定进行可靠的诊断的延长的时期。
通过所附独立权利要求和从属权利要求的主题解决了本发明的问题。
在第一方面，通过用于诊断患者的曲霉菌属感染的方法解决了本发明的问题，该方法包括检测样品中来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的步骤，其中使所述样品与特异性结合β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体接触，并且其中优选通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定更优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组。
在第二方面，通过特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的抗体用于增加用于诊断患者的曲霉菌属感染的免疫测定的诊断可靠性的用途解决了本发明的问题，该用途包括检测样品中所述抗原的步骤，其中使样品与针对所述抗原的第一抗体接触，然后优选通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定更优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组。
在优选的实施方案中，免疫测定是ELISA，优选夹心ELISA。
在第三方面，通过包括以下步骤的方法解决了本发明的问题：用特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体包被诊断装置，其中所述诊断装置优选是非膜基装置，更优选选自包括微孔板和珠子的组，优选微孔板。
在优选的实施方案中，将第一抗体包被在微孔板或珠子上。
在优选的实施方案中，第一抗体是单克隆抗体。
在第一个实施方案中，抗体是抗体JF5或其变体。
在优选的实施方案中，曲霉菌属菌株选自包括以下的组：烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)和构巢曲霉(A.nidulans)，并且优选为烟曲霉AF293。
在优选的实施方案中，样品选自包括以下的组：血清样品和支气管肺泡灌洗样品。
在优选的实施方案中，该方法用于诊断侵袭性曲霉菌病。
在优选的实施方案中，在使样品与抗体接触之前，对样品进行变性步骤，优选煮沸步骤。
在优选的实施方案中，使用第二抗体检测抗原，所述第二抗体优选是与第一抗体相同的抗体。
在优选的实施方案中，该用途是用于增加灵敏度。
在优选的实施方案中，该用途是用于增加在感染的早期阶段的诊断可靠性，优选灵敏度或特异性。
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现，即不基于膜的使用来检测来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖例如JF5抗原的高通量测定(例如ELISA)与基于其他检测方法的常规类似测试相比，具有显著增加的灵敏度。相比之下，现有技术提示基于JF5抗原的膜基免疫测定(例如侧流装置)具有与基于半乳甘露聚糖抗原的免疫测定相同的灵敏度。
此外，现有技术表明，与其他免疫测定相比，基于半乳甘露聚糖检测的常规ELISA提供了最佳灵敏度，其没有改进的空间。本发明基于本发明人的令人惊讶的发现，即如果使用用于检测来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的蛋白质抗原例如JF5的ELISA，则患者群组(包括用抗真菌药物如泊沙康唑治疗的患者)中的灵敏度可以得到改善。
本发明还基于本发明人的令人惊讶的发现，即使样品变性(例如通过煮沸)增加了测试的诊断可靠性，特别是增加在低浓度的抗原下(包括不存在抗原时)的特异性，从而可以避免产生假阳性结果。本发明人推测，这会释放出可能被其他成分掩盖或者与样品中的其他成分竞争结合的抗原，或者使样品中具有不希望的交叉反应(这可能导致假阳性反应)的其他成分变性。
在优选的实施方案中，所使用的抗体结合β-1,5-呋喃半乳糖。这可以是纯化的β-1,5-呋喃半乳糖，但它优选是来自传染性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖，其中它可能与较大的大分子缔合，例如携带超过一个分子的β-1,5-呋喃半乳糖的碳水化合物。来自菌丝体的这种抗原性β-1,5-呋喃半乳糖可如WO2010082034中关于称为“JF5抗原”的物质所公开的那样分离。
在WO2010082034的实施例1中已经详细描述了这些抗原的制备和可用作检测它们的第一抗体的诊断上有用的抗体的产生。简言之，用悬浮在PBS中的病原性曲霉菌属菌株的冻干菌丝体免疫小鼠，然后进行杂交瘤的标准产生，并通过ELISA使用一系列杂交瘤的上清液来测定抗体特异性。
在优选的实施方案中，选自包括血清样品和支气管肺泡灌洗液样品的组的样品(优选来自哺乳动物，更优选人患者)用于所述测定。患者可以是怀疑患有IA的患者。优选地，患者是非血液病患者或用抗真菌药物如泊沙康唑治疗的患者。非血液病患者可包括已经经历实体器官(例如肺、肝或肾)移植的患者、患有多发性损伤的患者、重症监护患者和患有非血液肿瘤的患者。
根据本发明使用至少一种结合所述抗原的第一抗体。可以使用WO2010082034中公开的JF5抗体，或者基于其在WO2010082034和Davies等人(2017)中公开的序列，本领域技术人员可以容易地设计和纯化所述抗体的变体，所述变体也与来自病原性曲霉菌属菌株(优选烟曲霉)的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖结合。在优选的实施方案中，抗体及其变体与来自曲霉菌属(优选烟曲霉)的β-1,5-呋喃半乳糖特异性结合。也可以使用Davies等人公开的抗体hjF5及其变体。获得的这种抗体的结合特异性可以通过重复WO2010082034、更具体地实施例3中的实验来确认。简而言之，Hartley豚鼠可以通过暴露于由病原性曲霉菌属菌株制备的分生孢子进行感染，然后进行使用待表征的抗体的免疫测定。
结合所述抗原的第二抗体可用于替代的测定形式，其包括使用第一抗体用于固定抗原，和使用第二抗体用于检测固定的抗原。优选地，抗原是携带超过一个分子的β-1,5-呋喃半乳糖的抗原，以使得结合β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体和第二抗体可以同时结合抗原。
在优选的实施方案中，第一和/或第二抗体是与识别的抗原或表位特异性结合的抗体。在优选的实施方案中，如本文所用，术语“特异性结合”是指结合强于由如通过使用Biacore设备的表面等离子体共振在25℃、pH7的PBS缓冲液中测定的以下解离常数所表征的结合反应：1×10-5M，更优选1×10-7M，更优选1×10-8M，更优选1×10-9M，更优选1×10-10M，更优选1×10-11M，更优选1×10-12M。
在优选的实施方案中，免疫测定是非膜基免疫测定。在更优选的实施方案中，如本文所用，术语“非膜基免疫测定”是指在不存在膜(特别是其上固定有诸如抗体或抗原的试剂的膜)的情况下进行的免疫测定。基于膜的免疫测定的实例包括侧流装置，蛋白质印迹，斑点印迹和线印迹。非膜基免疫测定的实例包括基于珠子的免疫测定和基于使用微量滴定板的ELISA。
在优选的实施方案中，诊断装置或载体是珠子。在优选的实施方案中，本文所用的术语“珠子”是指其上连接(优选以共价方式)有抗原或抗体的固体珠，优选由碳水化合物或其衍生物如琼脂糖或琼脂糖凝胶(sepharose)制成。如果珠子用作诊断装置，优选抗原或第二抗体具有化学发光标记并通过化学发光检测。在优选的实施方案中，珠子是磁珠。同样，抗原优选是携带超过一个分子的β-1,5-呋喃半乳糖的抗原，以使得结合β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体和第二抗体可以同时结合所述抗原。
可以根据本发明使用特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体和任选地例如在基于使用第一抗体用于固定抗原的ELISA免疫测定中，特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的第二抗体，例如Davies等人(2017)公开的抗体JF5或抗体AB633-HC3-LC2-T1-1B3-1G10(hjF5)或其变体。
在优选的实施方案中，本文所用的术语“抗体”应广义地解释，并且不仅包括全长抗体，还包括其衍生物和片段，例如Fab，F(ab’)2，Fr，ScTv，Fdb和dAb。
在另一个优选的实施方案中，如本文所用，术语抗体的“变体”是指包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列的所述抗体的多肽或片段(优选包含至少80个，更优选100个，更优选110个连续氨基酸的片段)，其中除了对生物活性(例如特异性结合目的抗原的能力)或多肽的折叠或结构必需的氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代和/或一个或多个这样的必需氨基酸以保守方式进行替换和/或添加或缺失氨基酸以使得至少部分保留多肽的生物活性。
现有技术包括可用于比对两种给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,OxfordUniversity Press,2008，第3版。在优选的实施方案中，以默认设置使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)。
在优选的实施方案中，变体可另外包含化学修饰，例如标记或共价修饰，例如糖基化，磷酸化，乙酰化，脱羧，瓜氨酸化，羟基化等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。此外，还可以通过与其他已知的多肽或其变体的融合来产生变体。
抗体的变体具有生物活性。在优选的实施方案中，这种生物活性是特异性结合β-1,5-呋喃半乳糖、优选来自病原性曲霉菌属菌株(最优选来自烟曲霉)的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖(其优选为在活跃生长期间专门分泌的抗原)的能力。如本发明实施例1中所述，可以在ELISA中容易地确定抗体的变体是否具有生物活性。
在优选的实施方案中，免疫测定是使用微量滴定板进行的ELISA。在优选的实施方案中，使微量滴定板与包含待检测的抗原的样品接触，然后使用第一抗体检测抗原。在另一个优选的实施方案中，微量滴定板用第一抗体包被，然后与包含抗原的样品一起孵育，并使用第二抗体检测与第一抗体结合的任何抗原。第二抗体可携带可检测的标记或可使用识别第二抗体的缀合抗体检测(并且缀合的抗体携带可检测的标记)，或通过标记的结合间接检测。在优选的实施方案中，可检测标记选自包括荧光、化学发光、放射性或酶活性标记的组。
在优选的实施方案中，使用相同的抗体作为第一和第二抗体。
在另一个优选的实施方案中，微量滴定板用抗体包被，然后与包含待检测的抗原的样品接触，然后在包含可检测标记的抗原(其随后与待检测的抗原竞争)存在下孵育。
在另一个实施方案中，微量滴定板用抗原包被，然后与包含待检测的抗原的样品接触。在随后的孵育步骤中，这两者将竞争添加的经标记的抗体的结合位点。
本发明的教导提供了一种试剂盒，其优选用于诊断曲霉菌病。这样的试剂盒是包含实施本发明方法所需的特定试剂的容器，该试剂特别是非膜基载体，优选选自包括ELISA微量滴定板和珠子的组，其包被有抗原，优选为通过特异性结合所述抗原的第一抗体或特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的蛋白质抗原的第一抗体固定的抗原的形式。包被的任何抗原可以是携带可检测标记的抗原。任选地，试剂盒另外包含实施本发明方法所需的一种或多种溶液。所述一种或多种溶液优选选自或全是来自包括以下的组的溶液：样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液和包含用于检测结合抗体的工具例如第二抗体和任选用于检测后者的工具的缓冲液。试剂盒可包含特异性结合抗原的第二抗体，所述第二抗体为溶液或用于制备这样的溶液的固体形式。在优选的实施方案中，第一和第二抗体是相同的抗体，并且在更优选的实施方案中，抗体结合JF5抗原。试剂盒可包含至少三种、四种或五种不同的溶液，其具有不同的已知浓度的β-1,5-呋喃半乳糖或曲霉菌属细胞或其衍生物，用于建立校准曲线或作为阳性或阴性对照。此外，试剂盒可以包括详细说明如何使用试剂盒和本发明的诊断上有用的载体的说明书。
在优选的实施方案中，如本文所用，术语“诊断”是指旨在获得有助于评估患者在过去、诊断时或将来是否患有或可能患有或比平均或比较受试者(后者优选具有相似的症状)更可能患有IA以了解疾病如何进展或将来可能如何进展或评估患者对于某种治疗(例如施用合适的药物如抗真菌药物)的反应性的信息的任何类型的程序。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。
因此，术语“诊断”优选地并不意味着根据本发明的诊断方法或药剂将确定和足以在单个测试(更不用说参数)的基础上完成诊断，而是可以指对所谓的“鉴别诊断”的贡献，即基于一系列诊断参数考虑一系列可能病状的可能性的***诊断程序。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或药剂。换句话说，该方法或药剂可以涉及为受试者选择治疗方案。
本发明提供了特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的抗体或用所述抗体包被的非膜基载体(优选ELISA微孔板或珠子)用于制备用于诊断IA的试剂盒的用途，其中提供了具有增加的灵敏度的诊断测定。这样的制备可以涉及一种方法，该方法包括在诊断上有用的载体上固定特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的蛋白质抗原的抗体的步骤，其中载体是非膜基载体，优选选自包括ELISA微量滴定板和珠子的组。
在优选的实施方案中，如本文所用的术语“诊断可靠性”是指免疫测定的灵敏度和特异性的组合。
在优选的实施方案中，如本文所用，术语“灵敏度”是指通过进行感兴趣的测定正确识别的阳性样品与检测的样品总数的比例。换句话说，如果来自感染患者的所有样品都给出阳性结果，则测定具有100％的灵敏度，即没有假阴性结果。
在优选的实施方案中，如本文所用，术语“特异性”是指通过进行感兴趣的测定正确识别的阴性样品与检测的样品总数的比例。换句话说，如果来自健康受试者的所有样品都给出阴性结果，则测定具有100％的特异性，即没有假阳性结果。
在优选的实施方案中，在使样品与抗体接触的步骤之前，对样品进行变性步骤，优选煮沸步骤。可以存在螯合剂如EDTA。这可以通过升高样品中的温度以使液体样品溶液开始沸腾来实现，例如通过将样品置于沸水浴中。在更优选的实施方案中，将样品在将使样品沸腾的温度(例如100℃)下保持至少1、2、3、4、5或10分钟，优选3分钟。随后，可以将任何不溶性组分与液体样品分离，优选通过使煮沸的样品进行离心。然后将上清液作为免疫测定的样品用于后续步骤。或者，变性步骤可以通过加入变性剂，例如6摩尔盐酸胍来实现，然而必须将其除去或必须降低其浓度，以便保持本发明方法中使用的抗体的结合活性。
在优选的实施方案中，本发明提供了特异性结合β-1,5-呋喃半乳糖的抗体或编码特异性结合β-1,5-呋喃半乳糖的抗体的核酸或与编码特异性结合β-1,5-呋喃半乳糖的抗体的核酸特异性杂交的核酸或包含所述核酸的载体或细胞用于制备用于以增加的诊断可靠性诊断曲霉菌属感染的试剂盒的用途。
在另一个优选的实施方案中，该方法可以是用于确定或确认抗体检测测定的可靠性的体外方法，并且可以涉及检测溶液中的β-1,5-呋喃半乳糖或曲霉菌属细胞，所述溶液不是来自患者的样品，但已知包含(优选以已知浓度)β-1,5-呋喃半乳糖或曲霉菌属细胞或其衍生物。在更优选的实施方案中，所述方法和试剂可用于建立校准曲线，所述校准曲线包含代表β-1,5-呋喃半乳糖或曲霉菌属细胞或其衍生物的不同浓度的至少两个、优选至少三个、四个或五个不同的点，其中优选地，对于所述至少三个、四个或五个不同点中的每一个，在单独的测定中测试包含已知浓度的一种溶液。这样的包含已知浓度的溶液优选不是来自人体的样品。或者，溶液可以是不含抗原的阴性对照以检查背景。这种方法可以与诊断方法并行、在其之后或之前进行。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供变性样品(优选血清样品)用于增加诊断可靠性(优选用于诊断患者中曲霉菌属感染的测定的特异性)的用途，优选包括检测样品中来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的步骤，
其中使样品与特异性结合所述抗原的第一抗体接触，和
其中优选通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组。当使用时，第一抗体可以存在于样品中。
具体实施方式
实施例1：
1.患者：
招募了包括38名患有确诊的IA的患者的群组。患者由专家级临床医生根据EORTC/MSG指南进行诊断。他们包括广泛的受试者，包括血液病患者和重症监护患者。一系列非感染患者用作对照。
测量在不同时间点从每位患者取得的几个样品，以排除由于疾病处于早期阶段而导致抗体滴度太低而无法检测的可能性。
来自79名怀疑患有蜱传疾病的健康受试者的对照群组的血液样品作为阴性对照进行测试。
2.样品的制备
使用100μl样品稀释剂(包含0.1M EDTA的PBS)混合300μl样品或校准物(例如掺有不同量的烟曲霉抗原的人血清，如实施例3中的)。然后将该混合物在沸水浴中加热3分钟，离心(10分钟，10000×g)，然后回收上清液，用于后续使用。
3.抗体包被孔的制备
使用标准方法将WO2010/082034中描述的JF5抗体固定在来自微孔板(NUNCMaxiSorp)的孔的表面上。
4.测定
将100μl包含校准物、对照或样品上清液的所述混合物转移到包被有JF5抗体的微孔板中
对于孵育步骤，将孔覆盖并在轨道摇床上以中速(约450rpm)在室温(18℃至25℃)下保持1小时。取出样品，然后每孔加入300μl洗涤缓冲液(可获得自EUROIMMUN AG，Lübeck的ZE1120)并在每个洗涤循环中孵育30至60秒。进行三次洗涤循环。
除去洗涤缓冲液，然后在EUROIMMUN Probenpuffer(目录号ZE1100)中每孔加入100μl生物素化的JF5抗体。将孔覆盖并在轨道摇床(450rpm)上在室温下孵育1小时。重复洗涤步骤。
在第三孵育步骤中，加入100μl酶缀合物(EUROIMMUN AG，ZE 6911-2)并在室温下在轨道摇床(450rpm)上孵育30分钟。
重复洗涤步骤，然后每孔加入100μl色原体和底物(标准ELISA TMB底物，可从EUROIMMUN AG获得，目录号ZE 1200)并在室温下孵育15分钟。通过每孔加入100μl终止溶液(EUROIMMUN AG，目录号ZE 1210)终止反应。
在450nm测量溶液的吸光度。
如果450nm的吸光度超过通过常规方法计算的截止阈值，则将样品确定为阳性。
5.从Bio-Rad获得的半乳甘露聚糖测定：
根据制造商的说明书并行进行来自Bio-Rad的Platelia曲霉菌属AG测定(目录号62794)。
6.结果
使用常规半乳甘露聚糖测定(Bio-Rad)，38名患者中的20名被鉴定为阳性(灵敏度：53％)。8名患者被误诊。
使用根据本发明的测定，38名患者中的25名被正确诊断(灵敏度：66％)。只有两名患者被误诊。
79名健康受试者中的78名被检测为阴性(特异性：98.7％)。
实施例2：
在分开的研究中，研究了两种测定在感染后的哪个时间点产生正确的阳性结果。
从患有白血病和可能的曲霉菌病的患者每周收集几个样品，并如实施例1中那样进行分析。所有这些患者最终使用测定(常规测定和根据本发明的测定)测试为阳性。
使用根据本发明的测定，可以更早地诊断出3名患者。而直到常规半乳甘露聚糖测定产生阳性结果的延迟则为4至29天。
仅在一个病例中，常规测定在根据本发明的测定之前产生阳性结果。
结论：
当使用来自患有各种疾病的患者的血清与常规测定进行比较时，根据本发明的测定在灵敏度和到可以获得正确的阳性结果的时间方面是优越的。
实施例3：
使用掺入递增浓度的烟曲霉提取物的人血浆制备的参考组、来自健康献血者的5个阴性样品和使用BioRad半乳甘露聚糖测定测试的5个样品进行实施例1中所述的测定。
结果如表1所示。
表1
截止值为0.5，即信号<0.5表示阴性结果，信号>0.5表示阳性结果。在没有煮沸步骤的情况下获得的错误结果以粗体显示。
参考组包括不含抗原的经处理的人血浆(RP1)，不含抗原的来自两个不同献血人的CPD-血浆(RP2，RP3)，含有0.08ng/ml烟曲霉裂解物的经处理的人血浆(RP4)，含有0.12ng/ml烟曲霉裂解物的经处理的人血浆(RP5)，含有0.18ng/ml烟曲霉的裂解物的经处理的人血浆(RP6)，含有0.5ng/ml烟曲霉裂解物的经处理的人血浆(RP7)，含有0.6ng/ml烟曲霉裂解液的经处理的人血浆(RP8)。
基本上，根据本发明的测定显示与样品中抗原的递增浓度一致的递增的信号。相反，如果在低浓度下省略煮沸步骤，结果是散乱的并且看起来是任意的，表明煮沸步骤有助于避免在抗原的较低浓度下的假阳性结果，即增加测试的特异性。
如果在没有煮沸步骤的情况下进行处理，阴性样品中有两个是假阳性的，但如果使用包括煮沸步骤的根据本发明的测定，则其被正确评价为阴性。这证实了增加特异性的发现。
如果省略煮沸步骤，则五个样品中有一个看起来是假阴性的，但如果包括煮沸步骤则其不是假阴性的。
总之，这些数据表明，使样品变性增加了测定的诊断可靠性(特别是特异性)和再现性。
实施例4：
在分开的研究中，使用更多的患者数量再次研究了两种测定在感染后的哪个时间点产生正确的阳性结果。同样，基于实施例1中描述的方案使用JF5测定，并且根据制造商的说明书使用GM测定。
对根据医学指南诊断为阳性或可能阳性的31名患者的群组进行多天的测试。除了第0天(诊断的时间)的样品外，还分析了第0天之前或之后的其他样品。
在31名患者中的11名中，基于JF5的测定在较长时间内产生(正确的)阳性结果。对于8名患者，与GM测定相比，可以在更早的时间使用基于JF5的测定来实现阳性诊断。对于4名患者，测试结果在第0天后更长时间内保持阳性。
相比之下，与基于JF5的测试相比，在31名患者中的仅3名患者中，使用GM测试可以在更长的时间段内获得正确的阳性结果。这些患者中有两个可以在第0天后的更长时间内被诊断为阳性，而与基于JF5的测定的结果相比，一名患者可以在第0天之前更早地诊断为阳性。
总之，这些结果表明，如果使用基于JF5的测定而不是基于GM的测定，则可以获得正确诊断患者为阳性的更长的时间段。通过使用JF5，到可以获得阳性结果的时间更短，并且到不再能获得阳性结果的时间得到延长。

Claims (15)

1.一种诊断患者的曲霉菌属感染的方法，其包括检测样品中来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的步骤，
其中使所述样品与特异性结合所述抗原的第一抗体接触，
其中通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组。
2.特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的抗体用于增加用于诊断患者的曲霉菌属感染的免疫测定的诊断可靠性的用途，
其包括检测样品中所述抗原的步骤，
其中使所述样品与针对所述抗原的第一抗体接触，然后通过非膜基免疫测定检测与所述第一抗体结合的任何抗原，所述非膜基免疫测定优选选自包括ELISA和基于珠子的测定的组。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法或用途，其中所述免疫测定是ELISA，优选夹心ELISA。
4.一种包括以下步骤的方法：用特异性结合来自病原性曲霉菌属菌株的菌丝体的β-1,5-呋喃半乳糖的第一抗体包被诊断装置，
其中所述诊断装置是非膜基装置，优选选自包括ELISA微孔板和珠子的组，优选微孔板。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法或用途，其中所述第一抗体包被在微孔板或珠子上。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法或用途，其中所述第一抗体是单克隆抗体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法或用途，其中所述第一抗体是抗体JF5。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或用途，其中所述曲霉菌属菌株选自包括以下的组：烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)和构巢曲霉(A.nidulans)，并且优选为烟曲霉AF293。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法或用途，其中所述样品选自包括以下的组：血清样品和支气管肺泡灌洗样品，优选来自人患者。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法或用途，其中所述方法用于诊断侵袭性曲霉菌病。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法或用途，其中在使所述样品与所述抗体接触之前对所述样品进行变性步骤。
12.根据权利要求11所述的方法或用途，其中所述变性步骤是煮沸步骤。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法或用途，其中使用第二抗体检测所述抗原，所述第二抗体优选为与所述第一抗体相同的抗体。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的用途，其中所述用途是用于增加特异性，优选在用抗真菌药物、更优选泊沙康唑治疗的人患者的诊断中增加特异性。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的用途，其中所述用途是用于增加在感染的早期阶段的诊断可靠性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11230594B2 (en) 2020-03-23 2022-01-25 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Anti-galactofuranose antibodies for detecting and treating aspergillosis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101149377A (zh) * 2007-10-29 2008-03-26 南方医科大学珠江医院 用于检测曲霉的抗体
US20130017561A1 (en) * 2009-11-23 2013-01-17 Yeshiva University Lateral Flow Device for Diagnosing Microbial Infections
US20140178902A1 (en) * 2011-05-16 2014-06-26 National University Of Ireland, Maynooth Method for detecting infections

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2387585A1 (en) 2009-01-16 2011-11-23 University of Exeter Antibody

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101149377A (zh) * 2007-10-29 2008-03-26 南方医科大学珠江医院 用于检测曲霉的抗体
US20130017561A1 (en) * 2009-11-23 2013-01-17 Yeshiva University Lateral Flow Device for Diagnosing Microbial Infections
US20140178902A1 (en) * 2011-05-16 2014-06-26 National University Of Ireland, Maynooth Method for detecting infections

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER R. THORNTON: "Development of an Immunochromatographic Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillosis", 《CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY》 *
CHRISTOPHER R. THORNTON: "Development of an Immunochromatographic Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillosis", 《CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY》, vol. 15, no. 7, 31 July 2008 (2008-07-31), pages 1095 - 1105, XP007912963, DOI: 10.1128/CVI.00068-08 *
D. STYNEN ET AL.: "A New Sensitive Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay To Detect Galactofuran in Patients with Invasive Aspergillosis" *
D. STYNEN ET AL.: "A New Sensitive Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay To Detect Galactofuran in Patients with Invasive Aspergillosis", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》, pages 497 - 500 *
D. STYNEN ET AL.: "A New Sensitive Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay To Detect Galactofuran in Patients with Invasive Aspergillosis", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》, vol. 33, no. 2, 28 February 1995 (1995-02-28), pages 497 - 500, XP055488902 *
GRACE MEGAN HOWELLS: "Monoclonal Antibody ED1 as a Diagnostic Antibody for Human Invasive Pulmonary Aspergillosis" *
GRACE MEGAN HOWELLS: "Monoclonal Antibody ED1 as a Diagnostic Antibody for Human Invasive Pulmonary Aspergillosis", 《UNIVERSITY OF EXETER》, 7 October 2017 (2017-10-07), pages 1 - 41 *
GRACE MEGAN HOWELLS: "Monoclonal Antibody ED1 as a Diagnostic Antibody for Human Invasive Pulmonary Aspergillosis", pages 9 - 32 *
王彦艳 等: "血清半乳甘露聚糖抗原检测在血液病患者侵袭性曲霉菌病诊断中的应用价值", 《中华血液学杂志》, pages 2610 - 501 *

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