CN108530521A - 重组丙型肝炎抗原的制备及应用 - Google Patents

重组丙型肝炎抗原的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组丙型肝炎抗原的制备及应用，重组丙型肝炎抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白结构是可溶性蛋白。编码重组丙型肝炎抗原氨基酸的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。所述的重组丙型肝炎抗原的制备方法，将包含SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列的宿主细胞进行培养，分离纯化培养所得的多肽或蛋白分子抗原，得到重组丙型肝炎抗原。本发明有助于HCV核心抗原检测的规范化与标准化，可用于制备检测丙型肝炎病毒的试剂盒，有利于弥补现有试剂盒检测HCV灵敏度不足的缺陷。

Description

重组丙型肝炎抗原的制备及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组丙型肝炎抗原的制备及应用。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的传染病之一，在世界范围内流行，全球约有1．7亿人感染了HCV。HCV感染人体后，有将近一半的人会变为慢性肝炎，还可能导致肝纤维化、肝硬化、腹水和肝癌，预后较差。目前诊断丙肝病毒感染的方法有多种，最准确的就是丙肝病毒重组免疫印迹法(HCV—RIBA)和丙肝病毒核糖核酸(HCV—RNA)检测，但是这两种方法操作复杂，实验条件要求严格，且成本高，医院应用较少。实验室传统检测主要是丙肝病毒抗体酶联免疫法，近年来丙肝病毒核心抗原(HCV—eAg)酶联免疫法也广泛应用于临床，主要用于丙肝病毒感染早期诊断。HCV．Ab检测和HCV—cAg检测操作简单，一般实验室即可操作，但可能造成漏诊和误诊。
丙型病毒性肝炎是能够经血液、医疗器械、母婴传播的一种传染性疾病，全球每年有三、四百万的丙型肝炎病毒感染发生。丙型肝炎可发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，Shire等悼。的一项研究发现，丙型肝炎病毒是肝癌的主要危险因素，部分地区73．3％的肝癌患者是由于感染HCV而发病。当前，对丙型病毒性肝炎尚无有效的预防和治疗措施，因此，及时准确地检测出丙肝病毒感染，防止HCV传播至关重要。长期以来，实验室检测HCV感染，一般采用HCV．Ab酶联免疫法。该方法简便易操作，实验条件要求低，但可能造成一定的漏诊和误诊。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明通过基因重组技术，分段克隆HCV 核心抗原基因，提供一种重组丙型肝炎抗原及其制备与应用。
一种重组丙型肝炎抗原，其氨基酸序列如如SEQ ID NO ：1 所示，其蛋白结构是可溶性蛋白。
编码重组丙型肝炎抗原氨基酸的核苷酸序列，如SEQ ID NO ：2 所示。
一种宿主细胞，其特征在于，其包含SEQ ID NO ：2所述的核苷酸序列。
所述的重组丙型肝炎抗原的制备方法，将包含SEQ ID NO ：2所述的核苷酸序列的宿主细胞进行培养，分离纯化培养所得的多肽或蛋白分子抗原，得到重组丙型肝炎抗原。
所述重组丙型肝炎抗原在制备丙型肝炎病毒疫苗或丙型肝炎病毒疫苗引起的疾病的治疗制剂或预防制剂中的应用。
所述重组丙型肝炎抗原在制备丙型肝炎病毒诊断制剂或诊断试剂盒中的应用。
有益效果：
本发明克服了现有技术中丙型肝炎病毒检测灵敏度不高，容易出现假阴性结果的缺陷。创造性地发现了上述核心抗原多态性位点的氨基酸片段可作为HCV核心抗原检测的分子标记用于检测丙型肝炎病毒，并且该分子标记的存在能够指示现有的抗原定量检测试剂检测灵敏度降低，有助于HCV核心抗原检测的规范化与标准化，可用于制备检测丙型肝炎病毒的试剂盒，有利于弥补现有试剂盒检测HCV灵敏度不足的缺陷，进一步完善现有技术中的检测丙型肝炎病毒的试剂盒的检测灵敏度和准确度，使之更加广谱有效。
具体实施方式
实施例1
以含有HCV 全长基因组DNA 的质粒pM-HCV_Genomeo 为模板，并用针对核心抗原基因各片段设计引物，进行PCR 扩增，扩增产物经电泳分离并胶回收相应的特异扩增基因产物，并亚克隆到pMD-18(TaKaRa,Inc) 载体中，分别得到各个基因重组质粒。
P1: GGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCAT
P2: CTCGGAGGTGTTGCTGTCTCCCAAGAGCGTCCTT
按设计的限制性内切酶位点，从上述重组质粒中双酶切获得相应的基因片段，采用基因亚克隆技术将获得的各个基因pET41a 连接，构建相应的HCV 核心抗原表达载体，获得具有前述Seq.2 编码序列的表达载体，经过筛选鉴定后，重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21 菌，并进行诱导表达分析，建立表达HCV 核心抗原的融合蛋白抗原工程菌，用于制备重组融合蛋白抗原。
表达工程菌经过发酵、收集发酵菌体、破菌、分离，二步亲和层析，获得纯化融合蛋白抗原，经测序得到其氨基酸序列如如SEQ ID NO ：1 所示，核苷酸序列，如SEQ ID NO ：2所示。
实施例2 重组丙型肝炎抗原的分离与纯化
1、大肠杆菌BL21 表达菌的化学裂解：
经过诱导表达的菌体采用化学裂解法，按每克湿菌加入5-10ml 细菌裂解液（2%Triton-X100,10-50ug/ml 溶菌酶，1mM DTT,0.2M PBS，优选采用默克公司的BugBuster溶液）充分悬浮菌体，37 度慢摇温育1 小时; 于4 度12000 转/ 分高速离心20 分，收集上清即用于下一步亲和层析纯化。
2、采用重力法两步亲和层析以纯化目标重组蛋白，纯度大于95% ：
] A) 将上述经过充分离心后上清，Ni2+-NTA 亲和层析柱经上样缓冲液（100mMNaH2PO4,10mMTris,10mM2-ME,pH8.0）充分平衡后，滴加裂解的上清，收集流出液，取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。用洗脱液I（100mM NaH2PO4,10mM Tris,pH6.3）充分洗柱到流出液的OD280=0.01. 分步收集洗脱液，取10ul 洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。用洗脱液II（100mM NaH2PO4,10mMTris,500mM Imidazole,pH8.0）洗脱目标蛋白：收集每1mL 级分，分别取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。合并各纯组分，以进行GST 亲力层析凝胶柱下一步纯化。
B) 用10 倍柱床体积的磷酸盐缓冲液(4.5mM Na2HPO4.12H2O，1.5mM KH2PO4，0.15MNaCl（pH7.3）) 充分平衡柱，加入经过镍柱亲和层析后的样品，收集流穿组分并置于冰上。以10x 体积1xGST Bind/Wash Buffer(4.5mM Na2HPO4.12H2O，1.5mM KH2PO4，0.15MNaCl，2.7mM KCl（pH7.3）) 洗柱，收集流穿组分并置于冰上。以3x 体积1xGSTWashBuffer（4.5mM Na2HPO4.12H2O，1.5mM KH2PO4，0.15M NaCl，2.7mM KCl10mM GST( 还原型)（pH7.3））洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续蛋白电泳分析, 并合并相同的蛋白组分，冻存于-20 度备用。
实施例3 不同HCV基因型样本核心抗原水平的比较
1、病例选择
2015年6月至9月，收集203例CHC患者血清，其中男性130例，女性73例，年龄24-76岁，平均( 37 .3±8 .6 )岁。HCV基因型使用Versant HCV Genotype 2 .0( LiPA，西门子公司，马尔堡，德国)检测，其中基因型1b为41例，2a为43例，3a为31例，3b为43例，6a为45例，基本涵盖中国常见基因型。HCV RNA使用罗氏Taqman HCV RNA试剂盒定量，最低检测限为15IU/mL。不同HCV基因型患者在年龄、性别和HCV病毒载量具有可比性。
2、方法
使用雅培Architect HCV Ag核心抗原定量检测试剂盒，在雅培Architect i2000全自动化学发光仪上进行H C V抗原定量检测。定量检测的线性范围为3 .0 0 f m o l / L -20000fmol/L，最低检测限为3 .00fmol/L。分别使用单因素方差分析法和LSD法进行整体均数的比较和各组均数的多重比较，P<0 .05为差异有显著性意义。
3、结果
不同基因型患者组HCV抗原定量结果显示，本发明重组丙型肝炎抗原检测灵敏度高，有助于HCV核心抗原检测的规范化与标准化，可用于制备检测丙型肝炎病毒的试剂盒，有利于弥补现有试剂盒检测HCV灵敏度不足的缺陷。
序列表
<110> 南京京达生物技术有限公司
<120> 重组丙型肝炎抗原的制备及应用
<141> 2018-04-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe
1 5 10 15
Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu
20 25 30
Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys
35 40 45
Tyr Leu Ala Thr Ser Glu Val Leu Leu Ser Pro Lys Ser Val Leu Glu
50 55 60
Pro Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Val His Tyr Gly Gly Lys Asn
65 70 75 80
Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn
85 90 95
Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Ser Gly Arg Ala Pro
100 105 110
Arg Lys Ser Thr Leu Ile Cys Glu Ala Leu Asn Phe Thr Pro Lys Pro
115 120 125
Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe
130 135 140
Thr Thr Asp Gly Val Thr Ile Glu Arg Lys Gly Leu Thr Pro Gln Thr
145 150 155 160
Tyr Lys His Ile Ser Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn
165 170 175
Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val Asp His Arg Ala Leu Thr Phe Leu
180 185 190
Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser Arg Pro Thr Asp Ile Leu
195 200 205
Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser
210 215 220
Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu Thr Thr Tyr Glu Thr Leu
225 230 235 240
Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu Pro Leu Glu Ala Lys Ile
245 250 255
Lys Ile Met Glu Ser His Ser Asn Gly Thr Phe Ser Ala Lys Pro Val
260 265 270
Ala Ser Val Cys Val Glu Gln Trp Asn Asn Arg Lys Glu Ser Val Cys
275 280 285
Thr Val Ser His Arg Asp Leu Met Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser
290 295 300
Lys Pro Asn Glu Val Ser Lys His Pro Pro
305 310
<210> 2
<211> 942
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctgtctga taagaatctg gtggccatgg gctgcctggc ccgggacttc ctgcccagca 60
ccatttcctt cacctggaac taccagaaca acactgaagt catccagggt atcagaacct 120
tcccaacact gaggacaggg ggcaagtacc tagccacctc ggaggtgttg ctgtctccca 180
agagcgtcct tgaaccttca gatgaatacc tggtatgcaa agtacactac ggaggcaaaa 240
acagagatct gcatgtgccc attccagctg tcgcagagat gaaccccaat gtaaatgtgt 300
tcgtcccacc acgggatggc ttctctggcc gggcaccacg caagtctacg ctcatctgcg 360
aggccctaaa cttcactcca aaaccgatca cagtatcctg gctaaaggat gggaagctcg 420
tggaatctgg cttcaccaca gatggggtga ccatcgagcg gaaaggactg acaccccaaa 480
cctacaagca cataagcaca cttaccatct ctgaaatcga ctggctgaac ctgaatgtgt 540
acacctgccg tgtggatcac agggcactca ccttcttgaa gaacgtgtcc tccacatgtg 600
ctgccagtcg cccaacagac atcctaacct tcaccatccc cccctccttt gccgacatct 660
tcctcagcaa gtccgctaac ctgacctgtc tggtctcaaa cctgacgacc tatgaaaccc 720
tgaatatctc ctgggcttct cagagtggtg aaccactgga agccaaaatt aaaatcatgg 780
aaagccatag caatggcacc ttcagtgcta agccggtggc tagtgtttgt gtggaacagt 840
ggaataacag gaaggaaagt gtgtgtactg tgagccacag ggatctgatg tcaccacaga 900
agaaattcat ctcaaaaccc aatgaggtga gcaaacatcc ac 942
<210> 3
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtctggaac agattattct ctcaccat 28
<210> 4
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcggaggtg ttgctgtctc ccaagagcgt cctt 34

Claims (6)

1.一种重组丙型肝炎抗原，其特征在于，其氨基酸序列如如SEQ ID NO ：1 所示，其蛋白结构是可溶性蛋白。
2.编码权利要求1重组丙型肝炎抗原氨基酸的核苷酸序列，如SEQ ID NO ：2 所示。
3.一种宿主细胞，其特征在于，其包含SEQ ID NO ：2所述的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的重组丙型肝炎抗原的制备方法，其特征在于，将包含SEQ ID NO ：2所述的核苷酸序列的宿主细胞进行培养，分离纯化培养所得的多肽或蛋白分子抗原，得到重组丙型肝炎抗原。
5.权利要求1所述重组丙型肝炎抗原在制备丙型肝炎病毒疫苗或丙型肝炎病毒疫苗引起的疾病的治疗制剂或预防制剂中的应用。
6.权利要求1所述重组丙型肝炎抗原在制备丙型肝炎病毒诊断制剂或诊断试剂盒中的应用。
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