CN101230097B - 丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开提供丙型肝炎病毒(HCV)第一高变区抗原，还公开了该抗原在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途。本发明采用生物信息学技术对现有丙型肝炎病毒第一高变区序列分析，筛选出17条具有变异株特异性HVR1多靶点抗原，采用间接酶联免疫法检测患者血清与上述17条HVR1抗原的反应情况，根据HVR1抗体的异质程度判断病毒的变异情况，通过对丙型肝炎病毒第一高变区(HVR1)抗体异质性检测，达到对HCV变异检测的目的，通过本发明抗原的应用，可研究HCV疾病的转归和预后、干扰素疗效的预测等问题，具有一定的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及肝炎病毒的抗原，具体涉及丙型肝炎病毒高变区抗原，还涉及该抗原在制备检测丙型肝炎病毒试剂中的用途。
背景技术
HCV感染引起的丙型肝炎是一种十分严重的传染性肝脏疾病。目前，我国共有患者4000万，并且随着***、吸毒、不规范输血等社会问题的出现呈增加趋势。由于丙型肝炎多为慢性病毒感染性疾病，治疗难度大，又没有疫苗，故我国主要通过加强血制品的筛查来达到控制该病蔓延的目的，这使HCV诊断试剂的研究具有十分重要的意义。
尽管近几年HCV的诊断领域获得长足的发展，但是，目前的诊断技术只是停留在HCV病毒感染的确诊上，并不具有真正的临床指导意义。而在丙型肝炎的临床药物中，最经常使用的干扰素的总有效性仅有25％，大部分患者对干扰素不敏感(Fried MW and Hoofnagle JH.Therapy of hepatitis C，SeminLiver Dis，1995；15：82-91)。由于IFN治疗的疗程长、费用高、副作用大，因此，迫切需要发展一种可用于预测IFN疗效的诊断试剂。
在HCV变异的研究中，位于病毒第二包膜蛋白N端的第一高变区(HVR1)处于十分重要的地位。研究显示：尽管HVR1仅有27个氨基酸，但其变异占到整个病毒基因组变异的80％以上，常以HVR1序列的变化作为衡量病毒变异的标准；HVR1含有HCV唯一的中和性抗原表位，其抗体能阻止病毒吸附敏感细胞，早期HVR1抗体的出现，有助于疾病的自愈；HVR1的变异的复杂程度与IFN的治疗效果有密切关系等(修冰水，凌世淦。丙型肝炎病毒第一高变区的研究进展，国外医学病毒学分册，2000，7(5)：158-160)。国内外十分重视对HCV病毒变异的检测，现在，对HCV变异的检测是建立在“HCV-RNA的提取-逆转录-PCR”三大环节的基础上。根据最后PCR产物分析的手段不同分为以下几种：
1.序列分析法
这是其他所有检测变异技术的基础。最后通过对PCR产物的直接克隆测序，来对HCV病毒的变异情况进行检测。由于HCV变异大，有时甚至同一标本的不同克隆序列亦有差异。因此该方法测序工作量大、重复性差、周期长，难以进行大数量的研究。
2.PCR-限制性长度多态性法(RFLP)
用同一种限制性内切酶对PCR扩增的DNA片段进行酶切，根据酶切图谱进行多态性分析，检测病毒的变异。该方法比序列分析法简单快速，能进行大批量样本的处理。但该方法要求被检测位点附近的碱基高度保守，多用于HCV的基因分型。
3.PCR-单链构象多态性分析法(SSCP)
该方法目前应用较广的HCV变异检测技术。PCR扩增靶序列后，变性成单链后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，由于变异单链的构象不同导致电泳的迁移率不同，最终形成不同的带型，从而确定病毒的变异与否。SSCP简单、易行，但无法确立变异的部位，同时，只有少于200bp以下的PCR产物才能达到检测病毒变异的敏感性。鉴于此，SSCP通常采用HVR1作为检测的靶序列(刘锡光，祁自柏，熊诗松，肝炎实验诊断指南，人民卫生出版社，第一版，2004，175-179)。
不难看出，上述几种方法无法离开对HCV病毒RNA的检测，对人员素质、设备要求高，因此，至今国内外对HCV变异的检测仅限于大的科研机构水平，无法进行大规模推广。寻找一种简单、快速、重复性好、易于推广的HCV变异的检测方法，无疑是HCV基础、临床研究中亟需解决的问题。
发明内容
为了使HCV变异的检测满足临床的需要，本发明通过对HCV诊断领域的深入研究，提出了一种用于检测HCV变异的新方法。本发明以HVR1作为研究靶点，通过生物信息学筛选多种HVR1抗原，采用间接酶联免疫法，检测HCV患者血清中HVR1抗体的异质程度，从而建HCV变异的多靶点检测技术。
本发明的目的是提供丙型肝炎病毒第一高变区抗原及抗原组合。
本发明公开的丙型肝炎病毒第一高变区抗原，其氨基酸序列分别如序列表中下列序列所示：
(1)序列表中序列2，
(2)序列表中序列4，
(3)序列表中序列6，
(4)序列表中序列9，
(5)序列表中序列11，
(6)序列表中序列12，
(7)序列表中序列14，
(8)序列表中序列15，
(9)序列表中序列16，
(10)序列表中序列18，
(11)序列表中序列19，
(12)序列表中序列21，
(13)序列表中序列22，
(14)序列表中序列23，
(15)序列表中序列25，
(16)序列表中序列26，或
(17)序列表中序列27。
本发明还公开了多个丙型肝炎病毒第一高变区抗原的抗原组合，其中丙型肝炎病毒第一高变区选自上述序列中两种或两种以上序列。
本发明还公开了上述丙型肝炎病毒第一高变区抗原在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途。本发明提供了一种检测HCV变异的酶联免疫技术。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1.发明是建立在免疫学检测的原理上
目前，HCV的诊断行业多以血清免疫学检测为主，通过对血清中的各种抗HCV抗体的检测，确定HCV感染。本发明通过检测HCV变异抗体的存在，反映患者体内病毒的变异情况，可有效的避开RT-PCR的基因检测，使本发明具有简单易操作、重复性好等特点而得到推广和应用。
2.发明多靶点HVR1抗原的筛选是建立在生物信息学技术的基础上
HCV是一种变异性极高的RNA病毒，其变异速度超过HBV等DNA病毒的千倍以上，因此，必须采用多HVR1靶点抗原检测。由于HVR1的变异特别大，不可能一一对其活性做出判断，所以，本发明采用生物信息学技术，根据氨基酸序列同源性，对上千条HVR1序列进行筛选。对筛选的候选序列，进行克隆表达，并根据ELISA反应结果，筛选出具有一定株特异性靶点抗原，极大提高筛选效率和质量。
3.本发明具有一定的临床意义。本发明所采用的靶点抗原是由27个氨基酸组成的第一高变区(HVR1)，它集中了HCV 80％以上的变异，还含有HCV唯一的中和性抗原表位。HVR1抗体具有多种临床意义，HVR1与临床研究关系密切，目前，国内外在这方面积累了大量资料。如早期HVR1抗体的出现与有助于患者的自愈，而HVR1的异质程度随着慢性肝炎、肝硬化、肝癌的发展而不断增加。而HVR1的变异的复杂程度与IFN的疗效密切相关。
为实现上述目的，发明人从文献调研、Internet、基因钓取等方式获得1683条HVR1变异株序列，利用自编程序进行同源性比较，筛选27条候选HVR1抗原序列，其氨基酸序列分别如序列表中序列1-序列27所示。
基因工程表达后，纯化上述HVR1候选抗原，用ELISA方法做进一步鉴定，获得17条具有HVR1变异株的靶点抗原。将上述多靶点变异代表抗原包被到酶联板上，建立HCV变异多靶点ELISA检测技术，研究HCV患者血清与各个靶点抗原的反应情况，统计患者血清中HVR1抗体的异质程度，并分析其临床意义。
本发明是通过以下技术方案得以实现的：
利用自编VB程序，精选了27条候选HVR1抗原序列，合成基因后，分别重组表达，然后用ELISA确定其与丙型肝炎患者血清的交叉反应性，并从中选择17条优势HVR1变异株序列的用于多靶点检测抗原制造。
为了有利于HVR1基因在E.coli中获得高效的表达，选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成HVR1基因。为了使获得的抗原具有较好的活性，我们在的HVR1基因的上下游分别加上连接臂G-G-G-S和S-G-G-G，；为了便于基因克隆到表达载体，在连接臂的两端引入XhoI和XbaI两个酶切位点，以适合表达载体pBVIL1(参见中国专利ZL00100695.9：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途)。双酶切后***载体pBVIL1中，构建相应的表达质粒。构建的表达质粒需用PCR法鉴定，以证明各基因片段已获正确地***。
各单片段HVR1抗原表达质粒，转化E.coli HB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明各表达质粒均已获得了高效的表达，再经离子交换柱及凝胶过滤纯化，均可获得电泳纯的HVR1靶点抗原纯品(参见中国专利ZL 01141879.6：丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其融合抗原)。用ELISA检测单个片段与HCV病人血清的交叉反应性，选出其中靶点HVR1抗原序列。
采用上述靶点抗原包被酶联板，采用间接酶联免疫法建立HCV变异检测技术，并检测其临床意义。
实验结果证明，本发明的HCV所筛选的HVR1靶点抗原与34份血清的交叉范围在29.4％到38.2％之间，具有一定的株特异性，总覆盖面达到91.2％，临床检测显示：慢性患者与高交叉反应组的符合率是77.6％，而急性患者与低交叉组符合率为85％，该结果具有统计意义(P＜0.01)
附图说明
附图1纯化后的1-9HVR1候选抗原的SDS-PAGE
附图2候选抗原与34份HCV血清的ELISA检测结果
具体实施方式
实施例1候选抗原表位的选择
我们通过自编VB程序对国内外1,600条HVR1序列进行分析，根据氨基酸序列的同源性，依次分组，筛选出27条候选HVR1序列。其序列分别如序列表中序列1-序列27所示。
实施例227条候选HVR1抗原的克隆与表达
1.含HVR1单片段抗原表达质粒的构建
1.1候选HVR1抗原基因的合成
根据各上述HVR1氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子委托上海生工生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。
1.2候选HVR1抗原表达质粒的构建
1.2.1PCR产物及表达载体pBVIL1双酶切
取以上合成基因产物及pBVIL1表达载体各30μl分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(H)4μl、Xba I(10u/μl)和Xho I(12u/μl)各1μl，加灭菌蒸馏水至40μl，置37℃水浴酶切过夜。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：PCR产物及载体pBVIL1经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收：即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。
1.2.2连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1μl、10×T4DNALigase buffer 1μl、T4 DNALigase(12u/ul)1μl，加灭菌蒸馏水至10μl，置16℃过夜。
1.2.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。
2.抗原的表达与纯化
2.1表达菌株的培养：取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，1,2000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1％β-巯基乙醇。再于20℃，1,2000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。
2.3纯化：将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.05mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。
3.候选HVR1抗原活性鉴定
将纯化的候选抗原用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到2.0μg/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对本室保存的国内31份HCV阳性血清，进行了测定。部分结果如图1所示。
实施例3多靶点HVR1抗原的筛选
根据图1实验结果，我们选出17条具有一定株特异性的HVR1靶点抗原2，4，6，9，11，12，14，15，16，18，19，21，22，23，25，26，27#(其氨基酸序列分别如序列表中序列2，4，6，9，11，12，14，15，16，18，19，21，22，23，25，26，27所示)。该17条HVR1靶点抗原的综合覆盖率为91.2％。将上述抗原包被酶联板，即可建立HCV变异多靶点检测技术。
实施例4HCV变异的多靶点检测及临床意义
利用间接ELISA法，检测28份急性患者血清(北京红十字血液中心)和41份慢性患者血清(解放军302医院)的反应情况，并根据反应结果分为2组，与超过9条(含9条)靶点抗原的反应的血清设定为高交叉反应组；而小于8条(含8条)靶点抗原反应的血清设定为低交叉反应组。反应结果如图2所示。实验结果证明，本发明的HCV所筛选的HVR1靶点抗原与34份血清的交叉范围在29.4％到38.2％之间，具有一定的株特异性，总覆盖面达到91.2％，临床检测显示：慢性患者与高交叉反应组的符合率是77.6％，而急性患者与低交叉组符合率为85％，该结果具有统计意义(P＜0.01)。见表1
表1HVR1多靶点检测的临床应用
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
<120>丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途
<130>
<160>27
<170>PatentIn version 33
<210>1
<211>27
<212>PRT
<213>
<400>1
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1 5 10 15
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20 25
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20 25
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20 25
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Ser Thr Leu Phe Ser Pro Gly Ala Arg Gln Asn
20 25
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Ala Ser Leu Phe Thr Gln Gly Thr Lys Gln Asn
20 25
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20 25
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<400>25
Glu Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Arg Ala Ala Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Thr Ser Phe Leu Ser Val Gly Pro Lys Gln Asp
20 25
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<211>27
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<400>26
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Ala Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Lys Gln Asn
20 25
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<211>27
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<400>27
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1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Thr Pro Gly Ser Ser Gln Lys
20 25
Claims (2)
1.丙型肝炎病毒第一高变区抗原组合，其特征在于：该组合由17种丙型肝炎病毒第一高变区抗原组成，所述的17种抗原的氨基酸序列分别如序列表中下列序列所示：
(1)序列表中序列2，
(2)序列表中序列4，
(3)序列表中序列6，
(4)序列表中序列9，
(5)序列表中序列11，
(6)序列表中序列12，
(7)序列表中序列14，
(8)序列表中序列15，
(9)序列表中序列16，
(10)序列表中序列18，
(11)序列表中序列19，
(12)序列表中序列21，
(13)序列表中序列22，
(14)序列表中序列23，
(15)序列表中序列25，
(16)序列表中序列26，和
(17)序列表中序列27。
2.权利要求1所述抗原组合在制备丙型肝炎病毒变异检测试剂中的用途。
Priority Applications (1)
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| CN2007100026266A CN101230097B (zh) | 2007-01-25 | 2007-01-25 | 丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
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Assignee: Hunan Jynda Bioengineering Co., Lts. Assignor: Basic Medical Research Institute of Military Medical Science Academy of the PLA Contract record no.: 2011430000213 Denomination of invention: Hepatitis c virus hypervariable region 1 antigen and its use in preparation of hepatitis c virus detection reagent Granted publication date: 20110525 License type: Exclusive License Open date: 20080730 Record date: 20111008 |
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