CN103214561A

CN103214561A - 人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103214561A
Application number: CN2013100788782A
Authority: CN
Inventors: 庄明强
Original assignee: ZHEJIANG JIAHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Fang Siyong; Lou Yonghua; Tang Ling; ZHEJIANG JIAHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: CN103214561B

Abstract

本发明公开了一种人丙型肝炎病毒核心抗原，利用这种抗原蛋白可应用于免疫产生针对丙型肝炎核心抗原的单克隆抗体。本发明采用基因工程方法研制重组融合蛋白可溶性抗原，特点是抗原具有相对完整的天然蛋白空间结构，在用于免疫产生抗核心抗原抗体上，具有较线性的合成肽抗原，抗体特异性高，对天然样品中的核心抗原特异性和亲和性更佳的特点。

Description

人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药和基因工程技术领域，具体涉及人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用。

背景技术

丙型肝炎是由人丙型肝炎病毒（HCV,Hepatitis C Virus）感染引起的传染病，在全球广泛流行，尤其我国是HCV流行较严重的国家之一，人群感染率约为3.2％，有4000万以上的感染者。血源性传播是一种非常重要的传播途径，由于没有有效的预防性疫苗及有效的治疗手段，因此早期诊断及血液筛查对控制HCV的传播具有十分重要的作用。

目前临床上HCV的诊断与筛查以检测HCV抗体为主，由于HCV抗体检测一般存在7-10周的窗口期，建立早期、简便、敏感、特异的HCV核心抗原诊断试剂，缩短检测的窗口期是降低HCV感染的有效途径。虽然RT-PCR可定性和定量的检出HCV RNA并有效的缩短窗口期，但因RT-PCR操作复杂，容易污染且价格昂贵，使之不能广泛应用。研发基于丙型肝炎核心抗原的单克隆抗体，对于早期检测丙型肝炎病毒感染，通过双抗体夹心ELISA筛选能高灵敏度检测丙型肝炎核心抗原，建立丙型肝炎核心抗原检测***并结合检测血清丙型肝炎抗体，为抗原抗体联检应用打基础。

虽然丙型肝炎核心抗原的高度保守性并兼有很强的免疫原性，但是丙型肝炎核心抗原蛋白需要宿主信号肽酶剪切其C端内信号肽序列从而加工形成成熟的核心抗原蛋白(p21)，因而造成通过基因工程尤其是原核表达出构像天然的丙型肝炎核心抗原蛋白变得异常困难。另外核心抗原蛋白极易与核酸和脂蛋结合，且其C端有很强的疏水性，也都为核心抗原蛋白的体外表达和纯化增加了难度。近年一些研究人员利用酵母和哺乳动物细胞成功表达了全长的核心抗原白(191aa，p23)，并发现p23可以被细胞的信号肽酶剪切形成成熟的p21蛋白，并可在体外自组装形成直径约35nm的核衣壳样颗粒（nucleocapside1ike particles，NLPs)。有研究者发现利用E．coli表达丙型肝炎核心抗原N端前120个氨基酸，在一定条件下也可形成病毒样颗粒（VLPs，Virus LikeParticles）。并且用该VLPs免疫小鼠、兔和山羊后会产生强且持久的体液和细胞免疫应答。由于通过真核途径大量表达并纯化HCV core重组抗原在方法上并不成熟，因此很多研究者选择用大肠杆菌***表达核心抗原蛋白，并避开核心抗原蛋白C端信号肽部分的氨基酸。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过基因重组技术，分段克隆HCV核心抗原基因，表达并分离纯化HCV核心抗原的GST融合蛋白抗原，该抗原用于研制HCV诊断试剂盒，尤其是在免疫阶段，用于免疫产生具有更佳亲和力与识别特性的抗核心抗原抗体，用于早期HCV感染的HCV核心抗原的检测。因此，本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程融合蛋白抗原及其制备方法和应用、编码该融合蛋白抗原的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体，以及被该表达载体转化的原核宿主细胞。

本发明的目的是这样实现的：

一种人丙型肝炎病毒核心抗原，它为多肽或蛋白分子，所述的多肽或蛋白分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

一种DNA分子，它编码上述的多肽或蛋白分子。

在本发明的一个较佳的实施例中，上述的DNA分子编码所述多肽或蛋白分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示。

一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

一种原核宿主细胞，它被上述的表达载体转化。优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌。进一步优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21。

试验证明，上述的人丙型肝炎病毒核心抗原可以用于制备诊断丙型肝炎病毒的试剂或药物。

一种制备上述人丙型肝炎病毒核心抗原的方法，包括如下步骤：

（1）提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；

（2）用步骤（1）所述的表达载体转化原核宿主细胞；

（3）在适合所述的多肽或蛋白分子抗原表达的条件下培养步骤（2）所得的原核宿主细胞；

（4）分离纯化获得所述的多肽或蛋白分子抗原。

上述的制备方法，其中所述的表达载体为融合表达载体，表达的融合蛋白抗原具有正确折叠的结构，以可溶性的目标蛋白形式存在于胞质内，并且目标蛋白能够通过二步亲和层析法获得纯化蛋白。

本发明采用一种全新的分段表达方式，并采用与GST蛋白融合在大肠杆菌中获得表达，且这种表达是可溶性蛋白，其蛋白结构以接近天然折叠方式，从而为HCV的基础研究及诊断试剂研制及应用打下了基础。

与现有技术相比，本发明涉及的人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法具有如下优点和显著的进步：

（1）采用核心抗原基因的分段和全长分子克隆方法，获得的一组基因工程融合蛋白抗原；

（2）采用GST融合表达技术，获得的融合蛋白抗原具有可溶性表达，其结构特征更接近天然蛋白的特点。

附图说明

图1为丙型肝炎病毒核心抗原基因编码序列及引物配对组合示意图。

图2为PCR产物克隆示意图。

图3为融合表达载体pET41-HCVCore191的构建示意图。

具体实施方式

本发明涉及的基因工程融合蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：

1、以含有HCV全长基因组DNA的质粒pM-HCV_Genomeo为模板，并用针对核心抗原基因各片段设计引物，进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离并胶回收相应的特异扩增基因产物，并亚克隆到pMD-18(TaKRa,Inc)载体中，分别得到各个基因重组质粒。

2、设计的引物如表1所示

表1.丙型肝炎核心抗原基因各区段抗原引物序列设计表

a)采用引物1、3扩增获得PCR产物1，克隆T载体得pMD-H1;

b)采用引物2、4扩增获得PCR PCR产物2，克隆获得pMD-H2；

c)采用“巨引物二轮PCR中国专利（ZL95113311.x）”技术，以含有HCV全长基因组DNA的质粒pM-HCV_Genomeo为模板，以引物1+引物6，引物5+引物2分别扩增的核心抗原编码基因，所得二片段PCR产物经电泳胶回收后，按等分子比混合作为第二轮PCR反应的模板，采用引物1+引物2组合继续进行第二轮PCR，以扩增全长核心抗原基因编码序列，获得突变了内部Xho I位点的全长编码基因。此PCR产物3，用于构建pMD-H3；

d)引物1、3扩增获得PCR产物4，用于构建pMD-H4,参见图1。

3、pMD-H1-4经过DNA测序验证。

4、按设计的限制性内切酶位点，从上述pMD-H1、pMD-H2、pMD-H3、pMD-H4中双酶切获得相应的基因片段，采用基因亚克隆技术将获得的各个基因pET41a连接，构建相应的HCV核心抗原表达载体，获得具有前述Seq.6-10编码序列的表达载体，经过筛选鉴定后，重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21菌，并进行诱导表达分析，建立表达HCV核心抗原的融合蛋白抗原工程菌，用于制备重组融合蛋白抗原。

5、表达工程菌经过发酵、收集发酵菌体、破菌、分离，二步亲和层析，获得纯化融合蛋白抗原。

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1丙型肝炎病毒核心抗原各区段编码基因的获得及鉴定

1、抗原靶基因的片段扩增：

采用含有人HCV1b型全基因组质粒为模板，采用不同配对引物组合，并使用高保真的PrimStar(购自TAKARA Inc.)基因进行PCR扩增以获得各个基因编码片段。条件如下：

50μlPCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

其中引物组合：

(1)引物1+引物3：扩增产物为含有内部Xho I切点的编码核心蛋白前120个氨基酸残基的序列，产物命名Seq1，如SEQ ID NO:5所示；

(2)引物4+引物2:扩增产物为核心蛋白C端70个氨基酸残基的编码序列,产物命名Seq2，如SEQ ID NO:6所示；

(3)引物1+引物6，引物5+引物2分别扩增的核心抗原编码基因的两段序列，产物经电泳胶回收后作为模板，继续进行第二轮PCR，采用引物1+引物2组合以扩增全长核心抗原基因编码序列，获得突变了内部Xho I位点的全长编码基因。方法沿用中国专利（ZL95113311.x）中所提供的技术。产物命名为Seq3，如SEQ ID NO:7所示；

(4)引物1+引物3：以产物Seq3作为基因扩增的模板，扩增得到产物命名Seq4，如SEQ ID NO:8所示。

2、PCR产物的电泳分离及纯化：

将4种PCR扩增产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）分离目的基因条带20分，电泳胶在凝胶成像***下切取含有目的基因片段凝胶条；采用DNA凝胶回收试剂盒（Solarbio Inc）按说明书进行纯化:

(1)按1：3重量/积体比加入溶胶液，置于55度水浴10分钟，期间颠倒混合数次以保证充分溶胶；

(2)加入7：10从中体积比的异丙醇混匀后加到吸附柱，8000rpm,4度离心1分，将收集柱中液体再加到柱中再吸附一次，8000rpm，4度再离心1分，弃取废液;

(3)向吸附柱中加入0.5ml漂洗液，12000rpm,4度离心30秒，重复一遍，弃去收集柱中废液，吸附柱以12000rpm,4度离心3分；

(4)将吸附柱转移到一新的收集管，向吸附柱中央加30微升无菌水（或10mMTris-EDTA溶液，pH>8.0为佳），放置于60-70度烤箱内5分，取出后12000rpm,4度离心2分，收集柱内即纯化的DNA片段；

(5)用Nano-1000微量分光光度计测定DNA浓度后，置于-20度冰箱内备用。

3、PCR产物克隆到pMD-18T载体

纯化的PCR产物按TaKaRa公司T载体说明定量并连接到pMD-18T载体中，获得相应的4种重组质粒，分别命名pMD-H1、pMD-H2、pMD-H3、pMD-H4。

（1）连接反应

连接反应的组成是：

pMD-18T 0.5ul

PCR(>100ng) 4.5ul

Sol I(T4Ligase,Buffer) 5.0ul

混匀后，置16度水浴3小时，进行连接反应；

（2）大肠杆菌的转化

采用化学感受菌（DH5a,购自Solarbio Inc）进行转化：取3微升连接反应液加到50微升感受态菌中，置于冰上30分，转移到42度水浴90秒进行热冲击后，转移到冰上置5分，加入无抗生长素的LB培养基1ml，转移到37度摇床慢摇45分，5000rpm,4度离心10分，弃去多余的培养基，将留下约200微升的菌轻轻吹吸数后加到含有氨苄青霉素（100mg/ml）的LB琼脂平板，均匀涂布至干，置于37度培养箱培养过夜。

（3）重组克隆的筛选鉴定

A）重组克隆的菌落PCR筛选：从转化平板上挑取10个分离良好的单菌落，接种在10个加有无菌水的PCR管中进行充分混匀，分别吸取5微升加入有含有氨苄青霉素的1ml LB中，作相应的编号离心管用于37度摇床培养；另外10个PCR管中的5微升将被作为菌落PCR的模板，进行PCR反应；

总体积10微升。

PCR反应程序：

进行筛选时，延伸时间可根据所扩目标基因片段长度进行调整，循环次数也可按时间安排调整；PCR结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，扩增出基因产物并且大小是较目标基因片段略大100bp者是为阳性克隆；根据阳性克隆的编号将相应的离心管中菌液转接到加有5ml含氨苄青霉素(100mg/ml)的试管中摇过夜。

B）小提质粒DNA：按质粒DNA小量抽提试剂盒说明（Solarbio Inc）进行：收集过夜菌1.5ml到1.5微量离心管中，10000rpm离心1分沉淀细菌，弃上清，加0.25ml溶液I充分悬浮菌体沉淀，加入溶液II0.25ml轻轻倾倒数次以混匀，室温放2分（溶液应已经完全清亮），加0.35ml溶液III后迅速颠倒混5-10次使蛋白质和基因组沉淀析出，12000rpm，4度离心10分，将上清轻轻到至吸附柱中，8000rpm，4度离心30秒，将收集管中液体再加至吸附柱中吸附一次，离心去除刻液后，向吸附柱中加入0.5ml漂洗液，12000rpm，4度离心1分，重复一次，弃去收集管中废液，将吸附柱再12000rpm,4度离心3分，向吸附柱中央加入50微升无菌水（或10mM Tris-EDTA溶液，pH>8.0为佳），放置于60-70度烤箱内5分，取出后12000rpm,4度离心2分，收集柱内即纯化的DNA质粒，用Nano-1000微量分光光度计测定DNA浓度后，可进行下一步酶切反应，多余部分置于-20度冰箱内备用。

C）双酶切鉴定重组质粒：重组质粒（以pMD-H1举例）的双酶切反应组成如下;

反应液经混匀后置于37度水浴中3小时，进行酶切反应。反应结束后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，能够切出基因产物并且大小是与目标基因片段一致者是为阳性克隆，保存质粒；此前的过夜菌为甘油菌：1.5菌液离心收集后，弃上清加入不含抗生素的含15-25%甘油，优先地20%的LB培养基，悬浮后作为冻存甘油管备用（冻2管）。

D）重组质粒的序列测定：将冻存的甘油管送测序公司（如上海美季生物工程有限公司）进行M13正向测序，获得测序结果与设计的基因序列及Genebank序列进行比对。

实施例2丙型肝炎病毒核心抗原各区段编码基因表达载体构建及鉴定

1、基因片段的准备：

经过测序验证的重组克隆pMD-H1、pMD-H2、pMD-H3、pMD-H4与pET41a分别采用NcoI/XhoI双酶切，和pET41a的Xho I单酶切,酶切条件：

反应混合后置于37度水浴中，温育3小时。

酶切完成后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，并分别回收各个片段（方法同实施例1-2.）：pMD-H1酶切获得编码N端60个氨基酸殘基的Nco I-Xho I片段（178bp）（取名为N）和编码分子中部60个氨基酸殘基的Xho I-Xho I(182bp)（取名为M）,pMD-H2酶切获得编码C端70个氨基酸殘基Nco I-Xho I片段（213bp）,pMD-H3酶切获得编码全长191氨基酸殘基Nco I-Xho I片段（573bp）(取名为191)，pMD-H4酶切获得编码N端120个氨基酸殘基Nco I-Xho I片段（360bp）以及pET41a载体臂（包括Xho I单酶切及NcoI-Xho I双酶切）。

2、连接反应（方法同实施例1）

连接反应组成：

混匀后，置16度水浴3小时，进行连接反应；

3、大肠杆菌的转化（方法同实施例1）

采用化学感受菌（DH5a,购自Solarbio Inc）进行转化：取3微升连接反应液加到50微升感受态菌中，置于冰上30分，转移到42度水浴90秒进行热冲击后，转移到冰上置5分，加入无抗生长素的LB培养基1ml，转移到37度摇床慢摇45分，5000rpm,4度离心10分，弃去多余的培养基，将留下约200微升的菌轻轻吹吸数后加到含有卡那霉素（50mg/ml）的LB琼脂平板，均匀涂布至干，置于37度培养箱培养过夜。

4、重组克隆的筛选鉴定

A）重组克隆的菌落PCR筛选：从转化平板上挑取10个分离良好的单菌落，接种在10个加有无菌水的PCR管中进行充分混匀，分别吸取5微升加入有含有卡那霉素（50mg/ml）的1ml LB中，作相应的编号离心管用于37度摇床培养；另外10个PCR管中的5微升将被作为菌落PCR的模板，进行PCR反应；

总体积10微升。

PCR反应程序：

进行筛选时，延伸时间可根据所扩目标基因片段长度进行调整，循环次数也可按时间安排调整；PCR结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，扩增出基因产物并且大小是与目标基因片段一致者是为阳性克隆；根据阳性克隆的编号将相应的离心管中菌液转接到加有5ml含卡那霉素（50mg/ml）LB的试管中摇过夜。

C）双酶切鉴定重组质粒：重组质粒（以pET41-HCVCore_191举例）的双酶切反应组成如下;

反应液经混匀后置于37度水浴中3小时，进行酶切反应。反应结束后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，能够切出基因产物并且大小是与目标基因片段一致者是为阳性克隆，保存质粒；此前的过夜菌为甘油菌：1.5菌液离心收集后，弃上清加入不含抗生素的含15-25%甘油，优先地20%的LB培养基，悬浮后作为冻存甘油管备用。

实施例3丙型肝炎病毒核心抗原各区段编码的基因表达

1、丙型肝炎病毒核心抗原各区段编码基因表达菌株的建立

（1）BL21菌感受态菌的转化

将经过亚克隆并PCR和酶切鉴定的各个重组表达载体pET41-HCVCore_N,pET41-HCVCore_M,pET41-HCVCore_C,pET41-HCVCore_120,pET41-HCVCore_191及pET41a空载体转化菌BL21：取前述鉴定准确的各个重组质粒0.5微升，加入50微升BL21感受态菌（Solarbio Inc），置冰上30分，转移至42度水浴热休克90秒后，移至冰上置5分，向转化管中加入无抗生长素的LB培养基1ml，转移到37度摇床慢摇45分，5000rpm,4度离心10分，弃去多余的培养基，将留下约200微升的菌轻轻吹吸数后加到含有卡那霉素（50mg/ml）的LB琼脂平板，均匀涂布至干，置于37度培养箱培养过夜。

（2）转化克隆的培养、自诱导表达

从生长并分离良好的转化平板上，任意挑取6个克隆，接种到含有3ml自诱导表达培养基（0.02%葡萄糖，0.2%的乳糖，50mM Na2HPO4,50mM NaH2PO4,10mM Mg2SO4,10mMMgCl2,2%蛋白胨，1.5%酵母抽提物）中，挑一个转化克隆接种于含卡那霉素（50mg/ml）和2%葡萄糖3ml LB培养基中作为阴性对照，从空载体转化板挑一克隆接种于3ml自诱导表达培养基作阳性载体对照，过夜后收集表达菌体。

（3）重组蛋白表达水平的丙烯酰胺凝胶电泳分析

收集样品处理：向菌体沉淀中100ul PB溶液（50mM Na2HPO4,50mM NaH2PO4，pH7.2）充分悬浮后，加入2*上样缓冲液（2xSDS凝胶加样缓冲液:100mmol/LTris—HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，4%SDS(电泳级)，0.2%溴酚蓝，20%甘油）100微升，混匀后85度以上煮5分钟，样品用于丙烯酰胺电泳上样（或可冻于-20度备用）。丙烯酰胺凝胶电泳：常规配制12%丙烯酰胺凝胶，电泳按蛋白Marker、阴性对照、载体对照、克隆1-6、蛋白Marker上样，60伏稳压电泳30分，调整到90伏稳压90分结束，进行考马氏亮蓝染色及脱色程序后，在凝胶成像***下拍照并扫描分析各蛋白的相对浓度，确凿各相对表达水平，选择表达重组蛋白较高者以保存。

（4）建立高表达种子库

选择重组蛋白表达相对的克隆的培养，转接50ml培养基（卡那霉素（50mg/ml）和2%葡萄糖的LB）在37度摇床培养，待菌体OD600达到1.5左右时无菌离心收集菌，以1/4体积的含15%甘油的LB悬浮充分后，按每管1ml分装，冻存于-80度冰箱，即种子库。

2、重组核心抗原片段融合蛋白表达

（1）自诱导表达发酵培养基配制：按前述自诱导表达培养配制含有0.02%葡萄糖，0.2%的乳糖，50mM Na2HPO4,50mM NaH2PO4,10mM Mg2SO4,10mM MgCl2,2%蛋白胨，1.5%酵母抽提物的发酵培养基，分装后进行常规高压菌。

（2）种子液的培养：取种子一管，接入加有50mg/ml的卡那霉素的100ml LB的烧瓶（500ml瓶），37度，250rpm振荡培养过夜。

（3）按5%接种量接种子液，向培养基加入种子液，26-32度，优选地用28度，300rpm振荡过夜进行自诱导表达，表达结束离心收集菌体，称湦重后进行下一步纯化（或者冻于-20度保存备用）。

实施例4丙型肝炎病毒核心抗原各区段融合蛋白的分离与纯化

1、大肠杆菌BL21表达菌的化学裂解：

经过诱导表达的菌体采用化学裂解法，按每克湿菌加入5-10ml细菌裂解液（2%Triton-X100,10-50ug/ml溶菌酶，1mM DTT,0.2M PBS，优选采用默克公司的BugBuster溶液）充分悬浮菌体，37度慢摇温育1小时;于4度12000转/分高速离心20分，收集上清即用于下一步亲和层析纯化。

2、采用重力法两步亲和层析以纯化目标重组蛋白，纯度大于95%：

A)将上述经过充分离心后上清，Ni2+-NTA亲和层析柱经上样缓冲液（100mMNaH2PO4,10mMTris,10mM2-ME,pH8.0）充分平衡后，滴加裂解的上清，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE分析。用洗脱液I（100mM NaH2PO4,10mM Tris,pH6.3）充分洗柱到流出液的OD280=0.01.分步收集洗脱液，取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE分析。用洗脱液II（100mM NaH2PO4,10mMTris,500mM Imidazole,pH8.0）洗脱目标蛋白：收集每1mL级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE分析。合并各纯组分，以进行GST亲力层析凝胶柱下一步纯化。

B)用10倍柱床体积的磷酸盐缓冲液(4.5mM Na2HPO4.12H2O，1.5mM KH2PO4，0.15MNaCl（pH7.3）)充分平衡柱，加入经过镍柱亲和层析后的样品，收集流穿组分并置于冰上。以10x体积1xGST Bind/Wash Buffer(4.5mM Na2HPO4.12H2O，1.5mM KH2PO4，0.15M NaCl，2.7mM KCl（pH7.3）)洗柱，收集流穿组分并置于冰上。以3x体积1xGSTWash Buffer（4.5mM Na2HPO4.12H2O，1.5mM KH2PO4，0.15M NaCl，2.7mM KCl10mM GST(还原型)（pH7.3））洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续蛋白电泳分析,并合并相同的蛋白组分，冻存于-20度备用。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江家和制药有限公司

<120> 人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用

<160> 10

<170> Patent Version3.5

<210> 1

<211> 347

<212> Prt

<213> GST-HCVCore_N

<400> 1

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Ala Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln

275 280 285

Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe

290 295 300

Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg

305 310 315 320

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser

325 330 335

Gln Leu Glu His His His His His His His His

340 345

<210> 2

<211> 378

<212> Prt

<213> GST-HCVCore_ M

<400> 2

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Phe Cys

275 280 285

Thr Gly Leu Gly Ala Pro Ala Gly Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly

290 295 300

Arg Thr Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu

305 310 315 320

Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn

325 330 335

Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg

340 345 350

Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly

355 360 365

Leu Glu His His His His His His His His

370 375

<210> 3

<211> 362

<212> Prt

<213> GST-HCVCore_C

<400> 3

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Ala Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr

275 280 285

Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro

290 295 300

Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser

325 330 335

Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala

340 345 350

Leu Glu His His His His His His His His

355 360

<210> 4

<211> 410

<212> Prt

<213> GST-HCVCore120

<400> 4

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

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Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

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65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

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Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

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Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

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Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Ala Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln

275 280 285

Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe

290 295 300

Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg

305 310 315 320

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser

325 330 335

Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu

340 345 350

Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn

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370 375 380

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Leu Glu His His His His His His His His

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<210> 5

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<212> Prt

<213> GST-HCVCore191

<400> 5

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

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Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

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Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

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Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Ala Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln

275 280 285

Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe

290 295 300

Pro Gly Gly Val Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg

305 310 315 320

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser

325 330 335

Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu

340 345 350

Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn

355 360 365

Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg

370 375 380

Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly

385 390 395 400

Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr

405 410 415

Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala

420 425 430

His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn

435 440 445

Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Leu Glu His His His His His His His

465 470 475 480

His

<210> 6

<211> 1052 bp

<212> DNA

<213> GST-HCVCore_N DNA

<400> 6

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720

ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtgatg acgacgacaa gagtcccatg 840

gccagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag 900

gacgtcaagt tcccgggtgg cggtcagatc gttggtggag tttacttgtt gccgcgcagg 960

ggccctagat tgggtgtgcg cgcgacgagg aagacttccg agcggtcgca actcgagcac 1020

caccaccacc accaccacca ctaattgatt aa 1052

<210>7

<211>1137bp

<212>DNA

<213>GST-HCVCore_M DNA

<400>7

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ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

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gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720

ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtgatg acgacgacaa gagtcccatg 840

ggatatcggg gatccgaatt ctgtacaggc cttggcgcgc ctgcaggcga gctccgtcga 900

caagcttgcg gccgcactcg aggtagacgt cagcctatcc ccaaggcacg tcggcccgag 960

ggcaggacct gggctcagcc cgggtaccct tggcccctct atggcaatga gggttgcggg 1020

tgggcgggat ggctcctgtc tccccgtggc tctcggccta gctggggccc cacagacccc 1080

cggcgtaggt cgcgcaattt gggtctcgag caccaccacc accaccacca ccactaa 1137

<210>8

<211>1097bp

<212>DNA

<213>GST-HCVCore_C DNA

<400>8

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720

ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtgatg acgacgacaa gagtcccatg 840

gccaaggtca tcgataccct tacgtgcggc ttcgccgacc tcatggggta cataccgctc 900

gtcggcgccc ctcttggagg cgctgccagg gccctggcgc atggcgtccg ggttctggaa 960

gacggcgtga actatgcaac agggaacctt cctggttgct ctttctctat cttccttctg 1020

gccctgctct cttgcctgac tgtgcccgct tcagccctcg agcaccacca ccaccaccac 1080

caccactaat tgattaa 1097

<210>9

<211>1301bp

<212>DNA

<213>GST-HCVCore120DNA

<400>9

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

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ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtgatg acgacgacaa gagtcccatg 840

gccagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag 900

gacgtcaagt tcccgggtgg cggtcagatc gttggtggag tttacttgtt gccgcgcagg 960

ggccctagat tgggtgtgcg cgcgacgagg aagacttccg agcggtcgca acctcgaggt 1020

agacgtcagc ctatccccaa ggcacgtcgg cccgagggca ggacctgggc tcagcccggg 1080

tacccttggc ccctctatgg caatgagggt tgcgggtggg cgggatggct cctgtctccc 1140

cgtggctctc ggcctagctg gggccccaca gacccccggc gtaggtcgcg caatttgggt 1200

ctcgagcacc accaccacca ccaccaccac taattgatta atacctaggc tgctaaacaa 1260

agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag c 1301

<210>10

<211>1514bp

<212>DNA

<213>GST-HCVCore191DNA

<400>10

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720

ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtgatg acgacgacaa gagtcccatg 840

gccagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag 900

gacgtcaagt tcccgggtgg cgttcagatc gttggtggag tttacttgtt gccgcgcagg 960

ggccctagat tgggtgtgcg cgcgacgagg aagacttccg agcggtcgca accacgaggt 1020

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tacccttggc ccctctatgg caatgagggt tgcgggtggg cgggatggct cctgtctccc 1140

cgtggctctc ggcctagctg gggccccaca gacccccggc gtaggtcgcg caatttgggt 1200

aaggtcatcg atacccttac gtgcggcttc gccgacctca tggggtacat accgctcgtc 1260

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ggcgtgaact atgcaacagg gaaccttcct ggttgctctt tctctatctt ccttctggcc 1380

ctgctctctt gcctgactgt gcccgcttca gccctcgagc accaccacca ccaccaccac 1440

cactaattga ttaataccta ggctgctaaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 1500

tgccaccgct gagc 1514

Claims

1.一种人丙型肝炎病毒核心抗原，为多肽或蛋白分子，其特征在于：所述的多肽或蛋白分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

2.一种DNA分子，编码权利要求1所述的多肽或蛋白分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：它编码所述多肽或蛋白分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10所示。

4.一种表达载体，包含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

5.一种原核宿主细胞，它被权利要求4所述的表达载体转化。

6.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于：它是大肠杆菌。

7.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于：它是大肠杆菌BL21。

8.权利要求1所述的人丙型肝炎病毒核心抗原在制备诊断丙型肝炎病毒的试剂或药物中的用途。

9.一种制备权利要求1所述人丙型肝炎病毒核心抗原的方法，其特征在于包括如下步骤：

（2）用步骤（1）所述的表达载体转化原核宿主细胞；

（4）分离纯化获得所述的多肽或蛋白分子抗原。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的表达载体为融合表达载体，该表达载体能表达具有正确折叠的，可溶性的目标蛋白质，并且目标蛋白能够通过两步亲和层析得到有效纯化。