CN101576561A - 检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡及其测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡，其试纸条由背衬、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫组成，背衬上中部设有NC膜，NC膜的两端分别相邻连接结合垫和吸水垫；样品垫设于结合垫的上方；结合垫上喷有金标抗体G－Ab1，所喷涂的金标抗体Ab1为高危型人***瘤病毒HPV16单克隆抗体；NC膜上分别喷有呈直线的抗高危型人***瘤病毒HPV16多克隆抗体Ab2，以及抗金标抗体的抗体即兔抗鼠IgG抗抗体Ab3。本发明首次将免疫胶体金技术应用于高危型人***瘤病毒的快速检测中，可简单快速检测妇女***中的高危型人***瘤病毒；而且该高危型人***瘤病毒快速检测试纸条不需实验设备，方便用于临床的快速诊断，适应于各级医院对***的筛查。

Description

检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡及其测试方法

技术领域

本发明涉及免疫胶体金测试卡技术，具体涉及一种可快速诊断高危型人***瘤病毒感染16型的人***瘤病毒免疫胶体金测试卡及其测试方法。

背景技术

人***状瘤病毒(Human papilloma virus，HPV16)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，HPV感染通常引起生殖器疣、子宫颈及泌尿生殖道癌。HPV病毒几乎是所有***的元凶。男性感染该病毒后不会死亡，但会通过性行为、皮肤接触等传染给女***。感染HPV病毒的初期症状是手上、下腹部或生殖器部位表面出现细而密的疣状***状瘤。病毒的潜伏期有可能长达15年，病变发展缓慢，而且并不是所有的被感染者身体表面都会出现这些症状，因此往往被忽视。一旦女性感染者机体免疫力下降，病毒活动就会加剧，最终导致宫颈恶性肿瘤。据报道，细胞学正常的妇女宫颈HPV感染率为10.2％～40.0％。全世界学者们经过近20年的大量研究表明，宫颈的高危型HPV持续感染是引起***及癌前病变的直接病因。Mattheus等报道，在99.7％的浸润性***中可以检测到13种高危型HPV，其中HPV16(53％)、HPV18(15％)等高危型的感染是引起***变的首要因素。HPV检测广泛应用于与HPV有关的恶性病变自然史和病因学的研究，目前它正在成为***的另一种或是附加的筛检方法，对***的预防及治疗有着非常重要的意义。

目前HPV感染的检测方法有三类：一是传统的检测方法及其改进：由于HPV在体外不能增殖，传统方法主要是通过形态学方法和免疫学方法检测HPV。前者包括巴氏涂片细胞病理学检测、***镜检查、宫颈活检组织病理学检查、电镜技术(直接观察病毒颗粒)、宫颈摄像检查和宫颈荧光检查等；后者包括应用免疫组化法通过抗L1蛋白抗体与外壳蛋白抗体反应检测HPV、采用放射免疫沉淀法测定宫颈上皮细胞内瘤变(CIN)和***患者血清中的HPV16抗体水平，用血清免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的HPV、E6、E7特异性抗体蛋白。目前在***的筛查中应用最多的是巴氏涂片法。在合理应用巴氏涂片法筛查的地区，其***的发生率下降70％，但此方法存在两个问题：(一)是假阴性率高。(二)是巴氏涂片分类目前采用的标准是经修订的Bethesda分类***，该***虽广为接受，但人有一些缺陷，每年有大量巴氏涂片报告为性质未定非典型鳞形细胞，如何妥善处理这类患者、节约资源并提高筛查率是个棘手的问题。

随着一些新技术新方法的引入，出现了改良的巴氏涂片。包括：A、Auto Pap 300QC：将自动显微镜检与计算机分析相结合，通过重新检测初筛中漏检的异常细胞而减少误诊率。B、PAPENT该***包括扫描仪和分析平台两部分。它选择128个最异常的细胞并将其贮存起来，供细胞学家确认后作出诊断。C、Thinprep2000：是半自动的、基于液态的涂片制备***。通过将宫颈拭子收集的标本置于缓冲液中，并转移到实验室制备薄层涂片。它只使用一部分细胞，因而留在缓冲液中的剩余细胞可做HPV-DNA检测。D、CYTORICH：是新的宫颈细胞单层涂片制备***。将传统方法制备完以后的残余脱落细胞悬浮后通过梯度离心沉淀的方法分离上皮细胞成分。以上这些传统方法的特异性和灵敏性均不够理想，存在较高的假阴性率和假阳性率，也不能对HPV分型，所以目前HPV的主要实验诊断技术是应用分子生物学方法进行HPV-DNA的检测。

三、分子生物学检测方法：分子生物学检测方法包括基于核酸杂交的方法和基于PCR的方法。目前用于HPV-DNA检测的核酸杂交方法有多种：(1)Southern blot  被认为是HPV检测的金标准。其过程包括DNA抽提、酶切、电泳、变性、吸印、烤膜、预杂交、杂交、检测分析等步骤。该方法灵敏度高。适于HPV分型、HPV-DNA分子量鉴定、基因组酶切图谱建立及物理状态研究。但费时且必须用新鲜组织标本，现在不便于临床应用。(2)斑点杂交  是简化了的Southern blot，经济实用、灵敏度较高，用于筛选实验。FDA已批准此法用于临床。Digene公司生产的HPV-PROFILE试剂盒，总共有14个HPV型别，分别为低危组的HPV-6、11、42、43、44和高危组的HPV-16、18、31、33、35、45、51、52、56。(3)原位杂交  它应用非放射性探针对石蜡包埋的组织进行检测。优点是能定位，假阳性率低。但灵敏度不高，只能检测到20-50个病毒/细胞，该缺陷大大降低了其临床应用价值，且它的假阴性率很高。(4)杂交俘获DNA分析  是由Digene公司推出的非放射性HPV分析***，联合应用高效液相杂交方法和敏感的化学发光信号扩增***。能检测14种HPV型别，可定量，其灵敏度和特异性均较好，适于HPV-DNA的分型及定量分析，但存在交叉污染问题。

PCR(聚合酶链反应)从特异性和灵敏性看，PCR是目前最好的HPV检测方法，简便易行并可应用型特异性引物进行HPV分型。缺点是容易发生样品间的交叉污染，导致假阳性率高。最近，在原来的L1通用引物PCR基础上，出现很多新的基于PCR的诊断方法：(1)分子信标引物扩增与反向杂交相结合的方法  此法应用一种含有茎环结构的HPV特异性引物，其中的荧光供体和猝灭基团相距很近，从而发生荧光猝灭。此法用于HPV感染的大规模人群调查研究。(2)实时PCR荧光分析  这是最近研发的基于PCR的5’外切核酸酶荧光探针HPV定量分析方法，主要针对HPV6、11、16、18四个型别，其特异性和灵敏性较高，可直接定量检测。(3)间接原位PCR  其优点是所需细胞样本量少，可保存涂片的细胞学特征。

近年来，HPV的检测尤其是HPV-DNA检测进展迅速，在***及癌前病变筛查和癌前预报中发挥了重要作用。但HPV-DNA检测在***筛查中还存在一些局限性，主要表现在：A、HPV感染率很高；B、HPV感染通常为一过性，尤其在应用高度敏感DNA检测方法时该现象更明显；C、只有那些致癌性HPV型别的持续存在以及他们与宿主基因组的整合才是有价值的癌前标志。D、PCR检测法假阴性率较高、进行分型时操作繁琐、一次性检测的样本量有限、不便于鉴定未知型别，因而限制了其在大规模筛查中的应用；E、近年发展的DNA芯片技术具有高度的并行性、多样性、微型化和自动化等优点，已广泛应用于基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断等DNA研究领域。目前采用的HPV检测方法都有各自的优缺点，都有共同的局限：费时和操作程序复杂。因此建立适于各级医院使用的高危型人***瘤病毒的简单高效特异快速的诊断方法迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种对HPV16感染作出简单快速诊断的高危型人***瘤病毒免疫胶体金测试卡，以及使用此测试卡的测试方法，以达到在各级医院使用的快速特异诊断高危型人***瘤病毒16感染的目的。

本发明的目的是这样实现的：检测高危型人***瘤病毒16的免疫胶体金测试卡，包括试纸条和测试卡盒；其特征在于，试纸条由背衬、样品垫、结合垫、NC膜和吸水滤纸组成，背衬上中部设有NC膜，NC膜的两端分别相邻连接结合垫和吸水垫；样品垫设于结合垫的上方；结合垫上喷有金标抗体G-Ab1，所喷涂的金标抗体G-Ab1为高危型人***瘤病毒HPV16单克隆抗体；NC膜上分别喷有呈直线的抗高危型人***瘤病毒HPV16多克隆抗体Ab2，以及抗金标抗体的抗体即兔抗鼠IgG抗抗体Ab3。金标抗体固定于NC膜上作为显色源，兔抗HPV16E6多抗喷画在NC膜上作为捕获线，兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗固定在NC膜上作为质检线。

所述高危型人***瘤病毒HPV16单克隆抗体为30nm的胶体金颗粒，HPV16E6单抗标记量为6ug/ml。

高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡的测试方法，使用上述检测高危型人***瘤病毒16的免疫胶体金测试卡，当金标抗体G-Ab1与样品中的高危型人***瘤病毒HPV16结合后，形成的免疫复合物G-Ab1-Ag随着层析运动，在喷有Ab2的NC上形成一条结合线(简称检测线)，未结合完的G-Ab1继续运动到Ab3的地方，形成第二条结合线(简称质控线)；如果只出现质控线，则为阴性，两条线都出现则为阳性。

相比现有技术，本发明具有如下优点：

本发明首次将免疫胶体金技术应用于高危型人***瘤病毒16的快速检测中，可简单快速检测妇女***中的人***瘤病毒16；而且该人***瘤病毒快速检测试剂条不需实验设备，方便用于临床的快速诊断，适应于各级医院对***的筛查。

本发明通过基因克隆技术获得重组HPV16E6蛋白作为抗原，免疫兔子和BaLb/C小鼠，获得了高效价的单抗与多抗，用鼠IgG免疫兔子获得了兔抗鼠IgG抗抗体，用这三种抗体建立了高危型人***瘤病毒胶体金免疫层析诊断方法。通过制备了性能稳定、免疫学活性好的金标HPV16E6单克隆抗体，并将其将其固定于玻璃纤维膜上作为显色源；抗HPV16E6多克隆抗体结合于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体；兔抗鼠IgG抗抗体结合于硝酸纤维素膜上作为质控线，制成免疫层析试纸条。

本发明检测HPV试纸条具有快速、简单、特异、灵敏、费用低等优点，适用于临床检测高危型人***瘤病毒16；10min左右出结果，敏感性达7.5ng/ml。同样，还适用于基层医院和各大医院进行***早期筛查，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是高危型人***瘤病毒免疫胶体金试纸条结构示意图。

图2是高危型人***瘤病毒16免疫胶体金测试卡结构示意图(剖视图)。

具体实施方式

参见图1和图2，一种检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡，包括试纸条和测试卡盒；试剂条由背衬1、样品垫2、结合垫3、NC膜4和吸水滤纸5组成，背衬1上中部设有NC膜4，NC膜4的两端分别相邻连接结合垫3和吸水滤纸5；样品垫2设于结合垫3的上方；结合垫3上喷有金标抗体G-Ab1，所喷涂的金标抗体G-Ab1为高危型人***瘤病毒HPV16单克隆抗体；NC膜4上分别喷有呈直线的抗高危型人***瘤病毒16多克隆抗体(Ab2)，以及抗金标抗体的抗体即兔抗鼠IgG抗抗体(Ab3)。图2中，6是加样孔，7是塑料测试卡盒。

高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡的测试方法，使用上述检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡，当金标抗体G-Ab1与样品中的高危型人***瘤病毒HPV16结合后，形成的免疫复合物G-Ab1-Ag随着层析运动，在喷有Ab2的NC膜4上形成一条结合线8(简称检测线)，未结合完的G-Ab1继续运动到Ab3的地方，形成第二条结合线9(简称质控线)；如果只出现质控线9，则为阴性，两条线都出现则为阳性。使用该测试卡，具有测试操作方便、快速等特点，而且成本较低；适用于基层或临床检测高危型人***瘤病毒16。在检测样品时只需要5-10分钟即可判断结果，因此可达到快速诊断的目的。人***瘤病毒诊断试纸条10分钟内可以判定结果，敏感性达＜10ng/ml样品，特异性达95％以上。

本发明中，还涉及以下实验内容：1、采用基因克隆技术完成HPV16E6基因的原核表达质粒的构建与表达，目的蛋白的纯化。2、制备和纯化了抗HPV16E6蛋白的多克隆抗体。3、建立了筛选抗HPV16E6蛋白阳性单抗的杂交瘤细胞株的方法-间接ELISA法。4、抗HPV16E6蛋白阳性单抗的制备及其特异性鉴定。5、HPV16E6免疫胶体金试纸条的制备，探索最佳工作条件，提高灵敏度。6、HPV16E6免疫胶体金试纸条质量控制体系和生产流程研究：试纸条的生产加工过程和保存方法。下面加以进一步说明：

1、HPV16E6基因的原核表达质粒的构建与表达，目的蛋白的纯化。

1.1HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

1.1.1材料

菌种：大肠杆菌DH5a和BL21 Star-DE3 PlysS由重庆富进生物公司保存。

试剂盒：组织/细胞DNA(小量)抽提试剂盒，质粒(小量)抽提试剂盒(50次)和胶回收(小量)试剂盒(100次)购于上海华舜生物技术有限公司。

质粒载体：质粒pET-28a(+)由重庆第三军医大学检验系惠赠。

引物：HPV16E6引物委托上海博尚生物有限公司合成。

工具酶及其他：TaqDNA聚合酶、dNTP、Mgcl2(25mM)、10×PCRbuffer、SC0014 pfuDNA(500u/支)聚合酶、限制性内切酶Nco I和HindIII购于上海生工生物工程技术服务有限公司；T4DNA连接酶、Maker(1000)购于TAKARA。

1.1.2方法

1.1.2.1引物的设计

软件分析工程菌及HPV16E6基因的序列后设计引物含有Nco I(碱基序列为ccatgg)和HindHI(碱基序列为aagctt)限制性酶切位点，设计6个组氨酸标签，用Nco I和HindIII限制性酶酶切PCR产物HV16E6基因片段和质粒pET28a(+)，用T4DNA连接酶连接HPV16E6基因和质粒pET28a(+)，构建了重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6。HPV16E6基因特异性引物P1、P2序列如下：

P1：5’-gc-cca tgg tc acc atc acc atc acc acc aaa aga gaa ct-3’；

P2：5’-gc-aag ctt tta cag ctg ggt ttc tct acg tgt tct tga tga-3’。

1.1.2.2CaSki细胞基因组总DNA的提取

用含10％FCS的DMEM营养液培养CaSki细胞于100ml的细胞瓶，长满单层后，用胰酶消化后离心取细胞沉淀，按细胞抽提试剂盒的操作说明抽提CaSki细胞基因组总DNA。

1.1.2.3PCR扩增和胶回收HPV16E6基因

以CaSki细胞基因组总DNA为模板，PCR法扩增HPV16E6基因。

①50ul反应体系如下：

阴性对照加2ul水替代模板DNA，阳性对照为另外的PCR扩增出的引物和模板。

②PCR反应条件如下：

94℃预变性7min

72℃延伸7min

按胶回收试剂盒的说明回收HPV16E6基因片段。

1.1.2.4质粒载体的提取

将pET-28a(+)-DH5α工程菌在LB培养基中37℃培养过夜(16-24h)，接种于含卡拉霉素的LB琼脂平板中，37℃培养16-24h，挑取单个菌落，接种于含卡拉霉素的LB培养液中，37℃振荡培养24h，按质粒DNA小量提取试剂盒说明书提取pET-28a(+)质粒。

1.1.2.5质粒载体的酶切

采用40ul酶切体系，37℃水浴酶切2h。酶切产物按胶回收试剂盒的说明回收，取少量回收物作1％琼脂糖凝胶电泳。

1.1.2.6HPV16E6基因的酶切

采用20ul的酶切反应体系，37℃水浴酶切2h，酶切产物按胶回收试剂盒的说明回收，取少量回收物作1.0％琼脂糖电泳，回收HPV16E6基因片段，用于连接反应。

1.1.2.7质粒与目的基因的连接

采用20ul反应体系在16℃连接过夜。按胶回收试剂盒的说明回收连接产物。

1.1.2.8感受态细胞的制备

选用大肠杆菌DH5α用化学法制作感受态细胞。

1.1.2.9重组质粒的转化

取100ul感受态菌，加入待转化的重组质粒pET-28a(+)-HPV16E6 1ul，混匀冰浴30min(同时设置阴性对照和阳性对照，阳性对照为加入已知量的未重组质粒的感受态菌，用于检测转化效率。阴性对照为完全不加质粒DNA的感受态菌，用于检测感受态细菌有无污染及检测抗生素的活性)。转入42℃水浴90s，再冰浴1-2min，加入培养液(含卡拉霉素的LB)800ul，置于37℃低速振荡培养45min.

1.1.2.10重组质粒阳性克隆子的筛选

主要是利用重组子上带有的卡拉霉素抗性基因进行筛选。

(1)PCR法鉴定

以单个菌落为模板，挑选8个菌落，利用设计的特异引物，PCR法扩增HPV16 E6基因。

(2)酶切鉴定：挑取单个菌落培养工程菌，按质粒提取试剂盒的说明提取质粒，并用Nco I和HindIII双酶切质粒，酶切产物作1％琼脂糖电泳。

1.1.2.11HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

将HPV16 E6阳性克隆的菌株pET-28a(+)-HPV16E6 DH5α培养后，提取质粒，将该质粒转化感受态大肠杆菌BL21 star-DE3 PlysS，挑取多个单菌落经IPTG进行诱导表达，保存能表达目的蛋白的菌落。

1.2HPV16E6基因在大肠杆菌中的表达

1.2.1材料

菌种：大肠杆菌BL21 star-DE3 plyss和DH5a由重庆富进生物公司保存。

试剂盒：组织/细胞DNA(小量)抽提试剂盒，质粒(小量)抽提试剂盒(50次)，胶回收(小量)试剂盒(100次)购于上海华舜生物技术有限公司。

质粒载体：质粒pET-28a(+)由重庆第三军医大学检验系惠赠。

引物：HPV16E6引物委托博尚生物有限公司合成。

工具酶及其他：TaqDNA聚合酶、dNTP、Mgcl2(25mmol/L)、10×PCRbuffer、SC0014 pfuDNA(500u/支)聚合酶、IPTG、卡拉霉素、限制性内切酶Nco I和HindIII、低分子蛋白marker购于上海生工生物工程技术服务有限公司；T4DNA连接酶、Maker(1000)购于TaKara公司。酵母提取物和胰蛋白胨等购于Sigma公司。

1.2.2方法

1.2.2.1pET28a(+)-HPV16 E6重组质粒的构建：根据Seedorf K的关于HPV16E6基因序列设计一对引物，含有Nco I(碱基序列为ccatgg)和HindIII(碱基序列为aagctt)限制性酶切位点，设计6个组氨酸标签。提取CaSki细胞(含HPV16)中的总DNA为模板，PCR扩增HPV16E6基因片段，用Nco I和HindIII限制性酶酶切PCR产物HV16E6基因片段和质粒pET28a(+)，用T4DNA连接酶连接HPV16E6基因和质粒pET28a(+)，将连接物转化大肠杆菌DH5a，通过原位PCR和双酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆质粒转化大肠杆菌BL21 star-DE3 plyss，构建了含原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6的工程菌株pET28a(+)-HPV16E6BL21 star-DE3 plyss。

1.2.2.2重组质粒pET28a(+)-HPV16E6在大肠杆菌中的诱导表达

(1)将含重组质粒pET28a(+)-HPV16E6的工程菌接种到含卡拉霉素(100ug/ml)的LB液体培养基100mL中，37℃振荡过夜。

(2)将转化菌过夜培养物以1∶40的接种量接种到5ml新鲜的卡拉霉素的LB液体培养基中，200转/分钟，37℃剧烈震荡培养2h，使其OD600nm达到0.6-0.8。

(3)无菌吸取1ml培养物，12000转/分钟离心，弃上清，以pH7.4的PBS重悬沉淀，保存于-20℃，作为基础表达对照。

(4)培养基中加入ITPG至终浓度1mmol/Lol/L，继续振荡培养。每隔1h取样一次，12000转/分钟离心，沉淀、上清分开，以pH7.4的PBS重悬沉淀，保存于-20℃。

(5)由于该重组质粒为包涵体表达，故上清中也含蛋白质成分，所以每个对照组分别设有加IPTG的上清、沉淀以及未加IPTG的原样基础对照。每份样品中加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，水浴煮浮3-5min裂解细菌。

1.2.2.3诱导条件的优化

在检验中为了得到E6蛋白质表达的最大量，所以要摸索诱导条件的最优值。而影响E6表达的因素很多，除自身因素外，包括诱导温度，诱导物浓度，培养时间，PH值及溶氧等环境因素是制约E6表达的关键参数。特设置以下几组对照试验来探索优化诱导条件。本实验采用不同ITPG终浓度诱导：分别为0mmol/L(空白对照组)、0.5mmol/L、0.75mmol/L与1mmol/L的IPTG诱导比较

1.2.2.4SDS-PAGE电泳检测菌液中的HPV16E6蛋白

浓度为12％的SDS-PAGE电泳的线性分离范围是12-60Kda，而目标蛋白的分子量约为20KDa，所以选用5％的堆积胶和12％的分离胶。

本实验获取的HPV16E6重组蛋白是作为抗原而制备抗HPV16E6重组蛋白的多抗和单抗用途的，最终研制出HPV16的免疫胶体金试纸条，建立早期筛查***的快速诊断方法。

1.3HPV16E6蛋白的纯化

1.3.1材料

溶菌酶，超声仪，镍柱等。

1.3.2方法

1.3.2.1IPTG诱导表达HPV16E6蛋白

用小型发酵罐培养3L工程菌pET-28a(+)-HPV16E6-BL21 Star(DE3)pLysS，加入IPTG使终浓度为1mmol/L，诱导表达HPV16E6蛋白。离心收集菌体。

1.3.2.2破菌处理

将菌体称重，将菌体70g与700ml缓冲液50mmol/L的Tris-HCL(PH10.0)混合，同时加入溶菌酶0.2mg/ml，和MgCl2 1g/L，搅拌至不黏，超声破碎细菌，高速冷冻离心，分别收集上清和沉淀(即为HPV16E6蛋白包涵体)，作15％SDS-PAGE电泳。

1.3.2.3HPV16E6蛋白包涵体的洗涤

15％SDS-PAGE电泳显示HPV16E6蛋白存在于沉淀中。

(1)用5％乙酸、1％Triton以1∶20的质量体积比洗涤HPV16E6蛋白包涵体50分钟，高速冷冻离心，分别收集上清和沉淀，作15％SDS-PAGE电泳。结果上清无目的蛋白。

(2)又用5％乙酸、1％Triron重复上一步洗涤沉淀一次，结果上清无目的蛋白。

(3)随后用2mol/L尿素、25mmol/LTris、5mmol/LEDTA洗涤沉淀一次，高速冷冻离心，分别收集上清和沉淀，作15％SDS-PAGE电泳。结果上清无目的蛋白。

(4)用20mmol/LTris、0.5mol/L Nacl、50％乙醇，PH7.0洗涤，高速冷冻离心，分别收集上清和沉淀，作15％SDS-PAGE电泳。结果上清无目的蛋白。

用双蒸水洗涤沉淀而去盐。

(5)用2mol/L的尿素，10mmol/L乙醇胺溶解包涵体，调PH值至11.5-12.0，搅拌过夜，次日离心，取上清15％SDS-PAGE电泳，结果显示上清液中有目的蛋白。

1.3.2.3镍柱亲和层析纯化HPV16E6蛋白

(1)装柱后在镍柱中加入100mmol/L的EDTA以去掉镍柱材料位点上已结合的镍离子。

(2)加入8mol/L尿素，100mmol/LNaOH洗涤柱子上的杂蛋白。

(3)加入0.3mol/L，100mmol/LNiSO4直至流出的液体为绿色为止。

(4)水洗直至流出的液体为无色为止。

(5)用8mol/L的尿素，25mmol/LTris-HCL，0.3mol/LNaCL，PH8.0平衡镍柱。

(6)上样：将样品上样前调PH至8.0后才上样。收集穿透峰。

(7)用8mol/L的尿素，25mmol/LTris-HCL，0.3mol/LNaCL，PH8.0复平衡。收集穿透峰。

(8)25mmol/L咪唑，8mol/L的尿素，25mmol/LTris-HCL，0.3mol/LNaCL，PH8.0洗脱。收集洗脱峰。

(9)50mmol/L咪唑，8mol/L的尿素，25mmol/LTris-HCL，0.3mol/LNaCL，PH8.0洗脱。收集洗脱峰。

(10)200mmol/L咪唑，8mol/L的尿素，25mmol/LTris-HCL，0.3mol/LNaCL，PH8.0洗脱。收集洗脱峰。

(11)用EDTA洗脱柱子上的镍离子。再用水洗脱。

1.3.3结果

1.3.3.1用200mmol/L咪唑，8mol/L的尿素，25mmol/LTris-HCL，0.3mol/LNaCL，PH8.0洗脱的洗脱峰在15％SDS-PAGE电泳上出现纯度较高的目的蛋白HPV16E6蛋白。

2、抗HPV16E6蛋白多克隆抗体的制备。

2.1材料：福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂购于Sigma，兔子购于重庆医科大学实验动物中心，HRP标记的羊抗兔IgG购于中杉金桥，酶标板购于Costa，

2.2免疫方案

初次免疫自己制备的HPV16E6蛋白100ug，加福氏完全佐剂充分乳化，皮下肌肉多点注射，一般一只兔子1ml/只，0.2ml/点，2周后进行第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂乳化，皮下或肌肉注射，剂量不宜超过1ml/只，2周后进行第三次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂，皮下或肌肉注射，2周后进行第四次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂，皮下或肌肉注射，7～10天后采血测其效价，检测免疫效果。

用间接ELISA法测定兔抗HPV16E6蛋白多抗的效价。

2.3采集兔抗HPV16E6蛋白血清，56℃水浴灭活30分钟，-20℃冻存。

2.4兔抗HPV16E6蛋白多抗的纯化

采用饱和硫酸铵沉淀法纯化兔抗HPV16E6蛋白多抗。

2.4.1原理

蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子间聚集而沉淀。

2.4.2操作步骤

(1)取兔抗HPV16E6蛋白血清50ml，加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入100mL的饱和硫酸铵，使终浓度为50％。4℃沉淀3小时。3000rpm，4℃，离心20分钟。

(2)弃上清，以生理盐水溶解沉淀至50ml，再加(NH₄)₂SO4饱和溶液25ml，使成33％(NH₄)₂SO4溶液，充分混合后，静置30min。3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。

(3)重复步骤(2)2~3次。

(4)用20ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

(5)透析除盐，在0.005mol/L的NaCl中，4℃下透析2-3天，中间换液数次。

以1％BaCl₂检查透析液中的SO₄ ^2-或以萘氏试剂检查NH4⁺(取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4⁺存在)，直至无SO4^2-或NH4⁺出现为止。

(6)离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提IgG。

分装，-20℃保存备用。

2.4.3 12％SDS-PAGE变性还原电泳鉴定粗提兔抗HPV16E6多抗IgG的纯度。第6道是纯化的多抗，可见25KDa、50KDa和75KDa三条带，这正好与IgG的轻链、重链和一条轻链一条重链结合体的分子量符合，且显示了较高的纯度。

2.4.4Western blot鉴定HPV16E6蛋白

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

操作步骤如下：

转膜：把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质HPV16E6蛋白电泳转移到硝酸纤维膜上。

1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿)，将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。

3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4)将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6)转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

封闭：将薄膜漂在5％脱脂乳液体中，4℃过夜，次日室温下用PBST洗涤薄膜3次。3.加一抗：加入1∶200倍的抗HPV16E6蛋白抗体，37℃孵育1小时或4℃过夜。室温下用PBST洗涤薄膜3次加二抗：将HRP-羊抗鼠IgG以1∶500稀释，37℃孵育1小时，室温下用PBST洗涤薄膜3次显色：DAB显色。

结果判定

在19KDa处明显出现一条棕黄色条带，说明表达的HPV16E6蛋白能与抗HPV16E6蛋白发生特异性反应。

使用本发明快速检测高危型人***瘤病毒的方法，步骤如下：

使用TCT专门的采样器来采集子宫颈移行带出的脱落细胞样本，并将采样器置入装有细胞裂解液的小瓶中进行漂洗。

将裂解的细胞溶液滴入测试卡的加样孔中，10分钟后在阅读框中阅读结果，出现两条红色的条带判定为阳性，出现一条红色的条带判定为阴性。

1、特异性95％以上，与***腺癌组织无交叉反应；

2、操作简便，不需任何仪器，适于妇女宫颈分泌物HPV16感染的普查。

本发明利用基因克隆技术成功构建了含HPV16E6基因原核表达质粒的工程菌pET-28a(+)-HPV16E6-BL21 DE3 Star PlysS，经IPTG诱导成功表达目的蛋白HPV16E6蛋白。大量培养该工程菌并用IPTG诱导，破菌处理后用镍柱亲和层析纯化HPV16E6蛋白。

用获得的HPV16E6蛋白作为抗原多次免疫兔子，用间接ELISA方法检测获得了高效价的兔抗HPV16E6蛋白多克隆抗体，其效价高达1∶256000。

用获得的HPV16E6蛋白作为抗原免疫雌性Balb/C小鼠，用间接ELISA方法检测获得了高效价的鼠抗HPV16E6蛋白多克隆抗体血清，其效价高达1∶64000。将免疫5次高效价的Balb/C小鼠的脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，融合率达96％，经间接ELISA检测、有限稀释法克隆，筛选出了6株能稳定分泌特异性抗鸡传染性支气管炎抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1F9、2F10、3C5、3C6、4D4、5B10。将这6株细胞扩大培养注射Balb/C小鼠各2只，制备腹水单抗，用饱和硫酸铵纯化这些单抗，6株单抗的类型属于IgG类。免疫细胞化学检测时这些单抗仅与Caski细胞(含HPV16型)发生特异性反应，而不与其Hela细胞发生反应，免疫组织化学检测时这些单抗只与***鳞癌组织(含HPV16)发生反应，而不与***腺癌(含HPV18)发生反应。

用鼠单抗IgG作为抗原免疫兔子多次，用间接ELISA方法检测获得了高效价的兔抗鼠单抗IgG的多克隆抗体血清，其效价高达1∶256000。饱和硫酸铵纯化兔抗鼠单抗IgG的抗抗体即二抗。

用获得的单克隆抗体、多克隆抗体和二抗建立了高危型人***瘤病毒HPV16的胶体金免疫层析快速诊断方法。根据实验需求制备了30nm的胶体金颗粒，对单克隆抗体(4D4株)最适稳定标记量进行测定，选择100ml 0.01％金溶胶中的HPV16E6单抗标记量为6ug/ml。通过最适稳定标记量对单克隆抗体进行标记，成功制备了性能稳定、免疫学活性好的金标HPV16E6单克隆抗体，该金标抗体在4℃保存半年未见有沉淀或分层现象。

将制备好的金标抗体、纯化的兔抗HPV16E6多抗和兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗用于免疫胶体金诊断试剂条的制备。反应体系将金标抗体固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将兔抗HPV16E6多抗喷画在硝酸纤维素膜上作为捕获线，兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗固定在硝酸纤维素膜上作为质检线，通过确定各部分最佳喷涂量后制成免疫胶体金诊断试纸条。在检测过程中若待检样品中含有HPV16E6抗原，则在有效的检测试剂条上捕获线和质检线处均出现一条红线，若待检样品中不含HPV16E6抗原则只在质检线处出现一条红线。通过结果的判定，该快速检测测试条灵敏度可达7.5ng/ml。

同时，本发明人将自制的单克隆抗体用于细胞免疫化学检测，这些单抗仅与Caski细胞(含HPV16型)发生特异性反应，而不与Hela细胞发生反应；用于组织免疫化学检测时，这些单抗只与***鳞癌组织(含HPV16)发生反应，而不与***腺癌(含HPV18)发生反应，显示了这些单抗有较强的特异性。因而，本项目研制的高危型人***瘤病毒免疫胶体金试纸条检测HPV16E6蛋白为阳性，检测重组的HPV16L1蛋白为阴性，显示了较强的特异性。

Claims (3)

1、检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡，包括试纸条和测试卡盒；其特征在于，试纸条由背衬、样品垫、结合垫、NC膜和吸水滤纸组成，背衬上中部设有NC膜，NC膜的两端分别相邻连接结合垫和吸水滤纸；样品垫设于结合垫的上方；结合垫上喷有金标抗体G-Ab1，所喷涂的金标抗体G-Ab1为高危型人***瘤病毒HPV16单克隆抗体；NC膜上分别喷有呈直线的抗高危型人***瘤病毒HPV16多克隆抗体Ab2，以及抗金标抗体的抗体即兔抗鼠IgG抗抗体Ab3；

金标抗体固定于NC膜上作为显色源，兔抗HPV16E6多抗喷画在NC膜上作为捕获线，兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗固定在NC膜上作为质检线。

2、根据权利要求1所述的检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡，其特征在于，所述高危型人***瘤病毒HPV16单克隆抗体为30nm的胶体金颗粒，HPV16E6单抗标记量为6ug/ml。

3、高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡的测试方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的检测高危型人***瘤病毒的免疫胶体金测试卡，当金标抗体G-Ab1与样品中的高危型人***瘤病毒HPV16结合后，形成的免疫复合物G-Ab1-Ag随着层析运动，在喷有Ab2的NC上形成一条检测线，未结合完的G-Ab1-Ag抗原抗体复合物继续运动到Ab3的地方，形成第二条质控线；如果只出现质控线，则为阴性；两条线都出现则为阳性。

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