CN113444769B - 一种dna标签序列的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA标签序列的构建方法及其应用，DNA标签序列建立基于PCR的DNA标签文库构建方法；且DNA标签序列包括115个DNA标签序列或相差一个碱基的DNA标签序列中的若干个；本发明通过构建长度为8bp标签序列，通过嵌入引物下游形成包含DNA标签的PCR引物构建单端标签，或将DNA标签序列通过嵌入引物的上游以及引物的下游形成包含DNA标签的PCR引物构建双端标签文库，利用PCR扩增达到标签序列和测序接头同时连接的效果，并且根据不同的测序平台采用不同的引物序列，建立基于2轮PCR即可完成建库的方法，具有高通量、操作简单、成本低等优点。能实现11个样本的并行测序，具有广泛的应用。

Description

一种DNA标签序列的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的DNA标签文库的构建方法，特别涉及一种DNA标签序列的构建方法及其应用。
背景技术
Sanger测序法发展出自动化、平行测序，并最终于2001年完成第一个人全基因组草图。但Sanger测序法具有一定的局限性，它依赖于电泳分离技术，无法进一步扩大和通量化，因此无法进行基因组序列测定的规模化，另外该测序方法的费用十分昂贵。随着测序技术快速发展，涌现出多种新型测序技术，罗氏(Roche)454公司的Genome Sequencer(GS)、Illumina公司的Solexa和ABI公司的SOLID构成了二代测序的主要平台；这些测序技术具有三个共同点：1、不同与需要细菌克隆的DNA片段化，二代测序技术基于无细胞***下的文库准备；2、相对于小规模几百个反应，二代测序技术平行运行成千上百万个反应；3、二代测序结果可以直接读取而不需要电泳。基于以上特点，第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性；完成第一个人全基因组草图耗时十多年，耗费30亿美元，而使用illumina Novaseq 6000使得100美元一个人基因组成为可能。此外，目前也已经发展出以单分子测序为特点的第三代测序技术，如Pacific Biosciences公司的SMRT技术和OxfordNanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术。
随着人类基因组计划的完成以及测序技术的快速发展，测序技术已经越来越广泛应用于医学、健康领域，目前已应用于新生儿筛查、肿瘤个体化医疗、肿瘤早筛、感染精准治疗、遗传病、消费基因检测等方面。高通量测序技术已成为临床研究及应用领域的重要技术手段。而且整个测序过程中，基因文库的构建是至关重要的，但是，现有技术中，仍然需要提供一种DNA标签集合的构建方法并将DNA标签集合进行应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种DNA标签集合的构建方法及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种DNA标签序列，所述DNA标签序列为一套长度为8bp的DNA标签序列，所述DNA标签序列建立基于PCR的DNA标签文库构建方法；且所述DNA标签序列包括表1所示的115个DNA标签序列或相差一个碱基的DNA标签序列中的若干个。
优选地，所述DNA标签序列为DNA Barcode1～DNA Barcode10、DNA Barcode11～DNA Barcode20、DNA Barcode21～DNA Barcode30、DNA Barcode31～DNA Barcode40、DNABarcode41～DNA Barcode50、DNA Barcode51～DNA Barcode60、DNA Barcode61～DNABarcode70、DNA Barcode71～DNA Barcode80、DNA Barcode81～DNA Barcode90、DNABarcode91～DNA Barcode100、DNA Barcode101～DNA Barcode110以及DNA Barcode111～DNABarcode115中的一种或多种的组合。
优选地，所述的相差1个碱基，包括DNA标签序列任意位置上的1个碱基的替换、***和删除。
优选地，所述相差一个碱基的DNA标签序列中的若干个为相差1个碱基的DNA标签序列中的任意5个，或任意10个，或任意15个，或任意20个，或任意25个，或任意30个，或任意35个，或任意40个，或任意45个，或任意50个，或任意55个，或任意60个，或任意65个，或任意70个，或任意75个，或任意80个，或任意85个，或任意90个，或任意95个，或任意100个，或任意105个，或任意110个，或任意115个。
另外，本发明还提供一种DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，所述方法包括将DNA标签序列通过嵌入引物下游构建单端标签，或将DNA标签序列通过嵌入引物的上游以及引物的下游构建双端标签文库。
优选地，所述引物包括正向扩增引物以及反向扩增引物，且在Illumina测序平台采用所述正向扩增引物序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCATACCGTCACGAGGTTGTTCG或AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCATACCGTCACGAGGTTGTTCG，所述反向扩增引物序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7barcode)GTGACTGGACAAGTTGCCAGCACGCAATT。
优选地，在Ion Torrent测序平台采用的所述正向扩增引物序列为：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCAAGTTGCCAGCACGCAATT；所述反向扩增引物序列为：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG[barcode]GATATACCGTCACGAGGTTGTTCG。
优选地，所述方法包括将DNA标签序列通过嵌入引物下游形成包含DNA标签的PCR引物构建单端标签，或将DNA标签序列通过嵌入引物的上游以及引物的下游形成包含DNA标签的PCR引物构建双端标签文库，获得表2以及表3所示的不同平台的标签引物序列。
优选地，所述包含DNA标签的PCR引物至少包括表2所示DNAPCR标签引物中Bar1Primer～bar10 primer,或Bar11 Primer～bar20 primer,或Bar21 Primer～bar30primer,或Bar31 Primer～bar40 primer,或Bar41 Primer～bar50 primer,或Bar51Primer～bar60 primer,或Bar61 Primer～bar70 primer,或Bar71 Primer～bar80primer,或Bar81 Primer～bar90 primer,或Bar91 Primer～bar100 primer,或Bar101Primer～bar110或primer,Bar111 Primer～bar115 primer中的一种或任意组合。
优选地，所述构建方法包括将通用接头序列连接到目标序列上以及将包含标签序列的PCR引物将标签序列连接到目标序列上。
优选地，所述构建方法包括以下步骤：
A.准备N个待检测核酸样本；
B.将各待测核酸样本与PCRpremix、Primer mix、ddH2O混合，得到第一预混PCR反应液；
C.将预混PCR反应液放置于常规PCR仪进行第一轮PCR扩增；
D.对第一轮PCR扩增产物进行分选、纯化；
E.将纯化后的第一轮PCR扩增产物与PCRpremix、含标签序列接头引物P1、ddH2O混合，得到第二预混PCR反应液；
F.将第二预混PCR反应液放置于常规PCR仪进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；
G.将第二轮PCR扩增产物进行分选、纯化，得到带标签序列的目标区域核酸片段。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
1.本发明的构建了长度为8bp标签序列，通过嵌入引物下游形成包含DNA标签的PCR引物构建单端标签，或将DNA标签序列通过嵌入引物的上游以及引物的下游形成包含DNA标签的PCR引物构建双端标签文库，利用PCR扩增达到标签序列和测序接头同时连接的效果，并且根据不同的测序平台采用不同的引物序列，建立基于2轮PCR即可完成建库的方法，具有高通量、操作简单、成本低等优点。
2.本发明的DNA标签及其引物序列能基于多重PCR的文库构建过程，115个标签序列可应用与DNA标签文库构建及基因测序，从而实现11个样本的并行测序，基于DNA标签文库适用于叶酸代谢能力、肿瘤风险评估、肤质相关基因检测，但不限于此的广泛应用。
具体实施方式
下面为本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
需要说明的是，本发明中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
制备标签的方法：
(1)基于4种碱基排列组合方法生成8bp的所有核苷酸序列，产生待选标签集合，一共65种、536种；
(2)剔除3’、5’端连续GG或连续CC；
(3)剔除碱基GC含量不在40％-60％之间的标签，以及5’、3’端GC含量不平衡标签；
(4)剔除连续3个相同碱基的标签；
(5)对筛选后的待选标签进行两两比较，筛选不同标签之间少于2个碱基差异标签；
(6)将待选标签集合经过条件过滤，得到一组包含115个标签的标签集合。
实施例2：
基于PCR的DNA标签文库构建方法与标签引物筛选：
(1)任选实施例1获得标签序列115个，采用人基因组为模板，进行模拟样本测试，将标签序列引物稀释到100um，等体积(ul)混合i7引物构建标签引物mix，按照以下流程进行测序文库构建：
基于多重PCR技术的第二代高通量测序文库构建及纯化：
a.对以上获得的标签引物P1 mix，采用肤质基因检测panel进行文库构建；按表6的体系，配置第一轮PCR扩增体系，将待测核酸(50ng)、Panel mix、3XEnzymeHT、ddH2O混合；
b.预混好多的重PCR反应液mix放置于Bio-rad T100，进行按以下参数进行第一轮PCR扩增，程序如下：先98℃3min，然后98℃20sec 60℃6min进行17-20个循环，然后72℃2min，最后10℃直至收取PCR产物；
c.然后将上述经过扩增的PCR反应液加入0.5倍体积的AMpure XP Beads，使用移液器上下吹打，以使扩增产物与AMPure XP Beads充分混匀，室温静置3分钟；
d.将步骤c经过静置处理的混合物基于磁力架上，静置3min，待磁珠完全被吸附后，用移液器吸取上清液至新的EP管/96孔板中，保留上清液并避免吸到磁珠；
e.将上述保留上清液中加入0.6倍PCR体积AMPureXP Beads，使用移液器上下吹打，以使扩增产物与AMPure XP Beads充分混匀。室温静置3分钟；
f.将步骤e经过静置处理的合物置于磁力架上，静置3min，待磁珠完全被吸附后，溶液完全澄清，用移液器小心移除上清液，保留磁珠；
g.将上述保留的磁珠加入50ul磁珠洗液1，悬浮磁珠，室温静置2分钟。用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止，用移液器吸弃上清，留磁珠；
h.将上述所得磁珠加入100ul 80％乙醇，用磁力架反复在不同两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠以洗涤；
i.将上述所得充分重悬的第四混合液置于磁力架上，室温静置3分钟，直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清液，避免吸到磁珠；
j.将步骤i所得的磁珠，室温放置5分钟，直至乙醇挥发干净，本步骤亦可放于50℃烘箱3-5分钟左右；
k.将步骤j所得到的磁珠，按照表7体系配置第二轮PCR扩增体系；
l.按表7体系预混好的PCR反应液放置Bio-rad T100，按以下参数进行第二轮PCR扩增，程序如下：先98℃2min，然后98℃15sec 60℃15sec72℃30sec进行6-9个循环，然后72℃2min，最后10℃直至收取PCR产物；
m.将步骤l经过梯度扩增的PCR反应液加入0.8-1.0倍体积的AMpure XP Beads，使用移液器上下吹打，以使PCR产物与AMPure XP Beads充分混匀，室温静置3分钟
n.将步骤m得到的混合液置于磁力架吸附磁珠，静置2分钟，直至溶液澄清为止。用移液器小心吸弃上清液，保留磁珠；
o.将步骤n得到的磁珠加入100ul 80％乙醇，使用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠以洗涤，使用移液器小心吸弃上清，保留磁珠；
p.将步骤o得到的磁珠室温放置5分钟，直至乙醇挥发干净。本步骤亦可放于50℃烘箱3-5分钟左右；
q.将步骤p得到的磁珠加入20ul Elution Buffer，充分悬浮磁珠，得到混合液七，室温静置2min以洗脱DNA；
r.将上述磁珠置于磁力架静置5分钟，直至溶液完全澄清为止，将上清吸至一新的1.5/0.5/0.2ml离心管/96孔PCR管。
将上述得到的文库采用illumin Novaseq测序平台进行测序，测序结果数据质控结果如表4所示。并由表4数据结果显示，采用等摩尔混合标签引物进行平行测试，相对平均reads相对丰度最大和最小值分别为0.05与2.86，相对丰度中位数为0.94，显示115个标签序列适用于生产。
实施例3：
基于标签文库肤质基因检测方法：
1)选取30例体积为2ml的唾液样品，采用天根TIANamp Swab DNA kit(DP322-01)试剂盒进行核酸提取，对提取的基因组采用Nanodrop 2000进行纯度检测，采用Qubit4.0测定浓度；
2)将步骤1)中30例唾液样本，采用肤质基因检测panel，该panel包含XX对肤质相关特异性引物对，特异性引物对组主要包括：抗氧化相关超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase2，SOD2)、制造明胶酶的基质金属蛋白酶(MMPs)，以及维生素E代谢、叶酸代谢相关基因等，结合肤质基因检测方法(具体方法参照实施例2)，进行文库构建，经过第一轮特异性引物对扩增后，第二轮PCR不同样本的反应体系添加不同的标签引物，对PCR产物纯化后得到待上机文库；
3)将30个纯化后DNA文库样品按照等摩尔数混合为文库mix，经Agilent2100检测合格后，采用Illumina Novaseq平台进行测序；测序下机数据进行标签识别，用于区分不同样本的测序数据集，数据结果显示，本实施例30组标签的识别率100％，如表5所示；通过对下机的测序得到的序列进行比对、过滤、去重等质控处理，对样本的目标区域靶向捕获的有效覆盖深度进行统计及单碱基突变分析。
表1
Figure BDA0002429952060000091
表2
Figure BDA0002429952060000101
Figure BDA0002429952060000111
Figure BDA0002429952060000121
Figure BDA0002429952060000131
/>
Figure BDA0002429952060000141
/>
Figure BDA0002429952060000151
表3
Figure BDA0002429952060000152
/>
Figure BDA0002429952060000161
/>
Figure BDA0002429952060000171
表4
Figure BDA0002429952060000172
/>
Figure BDA0002429952060000181
/>
Figure BDA0002429952060000191
/>
Figure BDA0002429952060000201
表5
Figure BDA0002429952060000202
表6
组分 一个反应体积
Nuclease-FreeH2O To30ul
Panelmix 8ul
gDNA(50ng) 10ul
3xEnzymeHT 10ul
表7
组分 一次反应体积
Nuclease-FreeH2O 18ul
3xEnzymeHT 10ul
P1mix 2ul
总体积 30ul
综合上，本发明的DNA标签及其引物序列能基于多重PCR的文库构建过程，115个标签序列可应用与DNA标签文库构建及基因测序，从而实现11个样本的并行测序，基于DNA标签文库适用于叶酸代谢能力、肿瘤风险评估、肤质相关基因检测，但不限于此的广泛应用。
以上实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种DNA标签序列，其特征在于：所述DNA标签序列为一套长度为8bp的DNA标签序列，所述DNA标签序列建立基于PCR的DNA标签文库构建方法；且所述DNA标签序列包括表1所示的115个DNA标签序列。
2.一种如权利要求1所述的DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，其特征在于:所述方法包括将DNA标签序列通过嵌入引物下游构建单端标签，或将DNA标签序列通过嵌入引物的上游以及引物的下游构建双端标签文库。
3.根据权利要求2所述的DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，其特征在于：所述引物包括正向扩增引物以及反向扩增引物，且在Illumina测序平台采用所述正向扩增引物序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCATACCGTCACGAGGTTGTTCG或AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCATACCGTCACGAGGTTGTTCG，所述反向扩增引物序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7barcode)GTGACTGGACAAGTTGCCAGCACGCAATT。
4.根据权利要求2所述的DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，其特征在于：所述引物包括正向扩增引物以及反向扩增引物，在Ion Torrent测序平台采用的所述正向扩增引物序列为：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCAAGTTGCCAGCACGCAATT；所述反向扩增引物序列为：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG[barcode]GATATACCGTCACGAGGTTGTTCG。
5.根据权利要求2所述的DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，其特征在于：所述方法包括将DNA标签序列通过嵌入引物下游形成包含DNA标签的PCR引物构建单端标签，或将DNA标签序列通过嵌入引物的上游以及引物的下游形成包含DNA标签的PCR引物构建双端标签文库，获得表2以及表3所示的不同平台的标签引物序列。
6.根据权利要求2所述的DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括将通用接头序列连接到目标序列上以及通过包含标签序列的PCR引物将标签序列连接到目标序列上。
7.根据权利要求2所述的DNA标签序列应用在DNA标签文库的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：
A.准备N个待检测核酸样本；
B.将各待测核酸样本与PCR premix、Primer mix、ddH2O混合，得到第一预混PCR反应液；
C.将预混PCR反应液放置于常规PCR仪进行第一轮PCR扩增；
D.对第一轮PCR扩增产物进行分选、纯化；
E.将纯化后的第一轮PCR扩增产物与PCR premix、含标签序列接头引物P1、ddH2O混合，得到第二预混PCR反应液；
F.将第二预混PCR反应液放置于常规PCR仪进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；
G.将第二轮PCR扩增产物进行分选、纯化，得到带标签序列的目标区域核酸片段。
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