CN105749268A - 一种灭活的寨卡病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种灭活的寨卡病毒疫苗，是将寨卡病毒液灭活后进行超滤浓缩，浓缩的病毒液采用蔗糖密度区带离心，离心产物进行离子交换、浓缩除菌得到寨卡病毒疫苗原液，疫苗原液稀释至总蛋白含量不超过20μg/ml，加入佐剂得到疫苗半成品。本发明制备该疫苗的方法简便易操作，成本节约，生产的疫苗适用于亚洲人种，单位剂量寨卡病毒液免疫原性高，杂蛋白含量低，注射后副作用小，安全性高，适用于育龄妇女孕前接种，避免感染寨卡病毒导致新生儿巴西小头症，社会价值和市场效益显著。

Description

一种灭活的寨卡病毒疫苗
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及一种灭活的寨卡病毒疫苗。
背景技术
寨卡病毒病(ZikaVirusDisease)是由寨卡病毒(ZikaVirus)引起并通过蚊媒传播的一种自限性急性传染性疾病。寨卡病毒于1947年首次在乌干达恒河猴体内被发现，1952年在乌干达和坦桑尼亚的人体中被分离。2007年以前，全球仅报告14例寨卡病毒病散发病例，2007年首次在太平洋岛国密克罗尼西亚的雅普岛发现寨卡病毒暴发疫情，其后发现寨卡病毒感染病例和暴发疫情的国家及地区有增加趋势。2015年5月，巴西报告首例寨卡病毒病病例，截至2016年1月底，巴西等24个美洲国家和地区均发现了本地感染病例。同时，欧洲、北美等地的多个国家发现输入性病例，台湾也报告1例来自泰国的输入性病例。
寨卡病毒属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，呈球形，直径约为40-70nm，有包膜。基因组为单股正链RNA，长度约为10.8Kb，分为亚洲型和非洲型两个基因型，目前在南美地区流行的病毒为亚洲型。
感染寨卡病毒的主要表现为发热(多为中低度发热)、皮疹(多为斑丘疹)，并可伴有非化脓性结膜炎、肌肉和关节痛、全身乏力以及头痛，少数患者可出现腹痛、恶心、腹泻、粘膜溃疡、皮肤瘙痒等。约80％的人为隐性感染，仅有20％的人出现上述临床症状，一般持续2-7天后自愈，重症和死亡病例少见。有与寨卡病毒感染相关的格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征，Guillain-BarreSyndrome)病例的报道，但二者之间的因果关系尚未明确。小儿感染病例还可出现神经***、眼部和听力等改变。孕妇感染寨卡病毒可能导致新生儿小头畸形甚至胎儿死亡。寨卡病毒疫情中，巴西等国新生儿小头畸形病例数显著增加，疫情的快速蔓延以及与小头畸形之间的因果关系，引起了国际社会的广泛关注。
我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。特别是我国南方地区夏秋季节伊蚊密度较高，一旦有病例输入，不排除在局部地区发生本地传播扩散的可能。
目前全球范围内尚无有效的治疗手段对寨卡病毒病进行治疗，即使通过防止蚊虫来预防寨卡病毒侵染，在实施过程中也存在极大难度，尤其随着夏季的到来，蚊虫密度增加，根本无法完全防范蚊虫叮咬，因此，通过疫苗进行预防成为未来消灭寨卡病毒的有效手段。
2016年3月1日WHO发布寨卡风险通报，关于寨卡病毒传播和潜在并发症方面的风险提供暂行指南。虽然1952年已经在人类中首次发现了寨卡病毒，但很少有关于疫情的记录。自2015年来寨卡病毒主要在美洲暴发疫情，传播加剧，而且这一期间的小头症和吉兰-巴雷综合征等神经***并发症比率也出现上升。自2015年来巴西出现数十例小头症新生儿，为了尽量减少疫情的扩大和对人群的危害，WHO提出应加强对寨卡病毒疫苗的研发。然而目前为止尚无寨卡疫苗问世，疫苗的免疫原性和稳定性有待研究。
由于寨卡病毒在本次疫情中突然暴发，虽然自上世纪50年代就已经分离出寨卡病毒，但是鲜有文献描述寨卡病毒，其培养工艺、纯化工艺以及制剂工艺尚为空白。
发明内容
为了能够最大程度地预防寨卡病毒侵染，同时更好的实现优生优育的目标，本发明的目的在于提供了一种灭活的寨卡病毒疫苗，适用于各个年龄阶段人群接种，尤其对于育龄妇女，以有效防范寨卡病毒的侵袭。
本发明的另一目的在于提供一种制备灭活寨卡病毒疫苗的方法。
本发明提供的灭活的寨卡病毒疫苗中寨卡病毒抗原含量为100-1600U/ml，且总蛋白含量低于20μg/ml。
优选地本发明，寨卡病毒疫苗中寨卡病毒抗原含量为800U/ml。
本发明的灭活的寨卡病毒疫苗通过以下步骤制备得到：
(1)利用为载体培养细胞技术培养Vero细胞，当细胞生长成致密单层时，接种寨卡病毒工作种子，培养，
(2)将培养液澄清过滤后收获病毒液，灭活；
(3)灭活的病毒液超滤浓缩，浓缩后的病毒液采用蔗糖密度区带离心；
(4)离心产物超滤脱糖，得到脱糖液；将脱糖液进行离子交换，得到层析液；层析液进行浓缩、除菌即为原液；
(5)将原液稀释，加入佐剂，得到疫苗半成品。
本发明提供的寨卡病毒培养基为M199与DMEM/F12按照1:1等体积混合。
另一方面，本发明提供了一种制备灭活的寨卡病毒疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)利用为载体培养细胞技术培养Vero细胞，当细胞生长成致密单层时，接种寨卡病毒工作种子，培养；
(2)将培养液澄清过滤后收获病毒液，灭活；
(3)灭活的病毒液超滤浓缩，浓缩后的病毒液采用蔗糖密度区带离心；
(4)离心产物超滤脱糖，得到脱糖液；将脱糖液进行离子交换，得到层析液；层析液进行浓缩、除菌即为原液；
(5)将原液稀释，加入佐剂，得到疫苗半成品。
其中，步骤(1)当细胞生长成致密单层时，按照MOI为0.05-0.3接种寨卡病毒工作种子，培养温度为35-37℃，培养时间为72-96小时，病毒的培养基为M199与DMEM/F12按照1:1等体积混合。
本发明方法中，步骤(2)中灭活方法为单次收获液中加入终浓度为200μg/ml的甲醛，37℃，灭活4-7天。
其中，步骤(3)病毒液浓缩倍数为10-100倍，膜包可截留分子质量为100-300KD。
进一步地，步骤(3)的蔗糖密度区带离心方法为：依次从离心机边孔以50-100rpm依次泵入超离缓冲液，超滤浓缩后的病毒液,低浓度蔗糖溶液，最后以50-150rpm泵入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体离心转速为28000-35000rpm，离心时间为：6-20小时，离心温度为2-8℃；
优选地，离心转速为30000rpm，离心时间为：14小时，离心温度为4℃。
低浓度蔗糖溶液蔗糖质量百分比为25％-45％，高浓度蔗糖溶液蔗糖质量百分比为55％-60％，超离缓冲液为0.01-0.05MPBS，pH值为：6.0-7.5。
本发明方法中，步骤(5)佐剂为氢氧化铝佐剂，与稀释后的原液体积为1:1
本发明方法中，步骤(5)是将原液稀释到200-3200U/ml，按照1:1体积比与铝佐剂混匀。
本发明具备以下有益效果：
(1)本发明首次制备出有效防护寨卡病毒的疫苗，能够很大程度缓解本次寨卡病毒疫情，极大的减少病患，为优生优育提供了良好的保障，育龄妇女在孕前接种本疫苗能够保护孕期寨卡病毒的侵袭，避免巴西小头症等类似新生儿疾病的发生，从而减轻社会和家庭的负担。本发明采用的毒株为国内输入性寨卡病毒患者血液分离而来的，以病毒为抗原制得的疫苗适用于亚洲人种免疫。本发明为国内首次大规模培养寨卡病毒，并制备寨卡病毒疫苗。
(2)本发明使用的细胞为Vero细胞，该细胞具有生长迅速，能够形成致密单层的优势，其安全性得到国际广泛认证。使用Vero细胞可以实现多次收获的目的，能极大的减少操作步骤和降低成本。本发明采用的是微载体技术培养Vero细胞，经过研究人员的筛选，制备出适合寨卡病毒生产的培养基，从而更加简便快速的培养出高数量级高密度适于接种病毒的细胞，节约生产成本，提高生产效率，适合于产品的产业化生产。
(3)本发明对病毒液的纯化方案为：通过DOE进行试验设计，通过大量实验数据得出寨卡病毒最优培养基，病毒液超滤浓缩、密度梯度离心、离子交换等纯化方法步骤简单同时能够利用密度梯度的优势简便快捷的纯化出具有免疫原性的完整病毒，有效地将含有E蛋白、M蛋白和C蛋白的完整寨卡病毒颗粒，此方法较层析方法即简便又经济，不仅提高了单位剂量寨卡病毒液的免疫原性而且降低了以此病毒液制备得到的疫苗使用后的副反应，同时降低了生产成本，且蔗糖密度梯度离心简便的操作过程和低廉的生产成本具有产业化可行性，同时相比层析方法能较好地去除杂质蛋白，保证了疫苗的安全性。
附图说明
图1为实施例3病毒液密度梯度离心后的SDSPAGE电泳结果图。1-9泳道分别代表密度梯度离心收集的第10、11、12、13、14、15、16、17、18管离心液。其中第10-16管主要为杂质蛋白，包括牛血清残留蛋白，宿主细胞蛋白，而第17-18管为目标病毒，包含有寨卡病毒的3个结果蛋白E、M、C蛋白。
图2为寨卡病毒原液HPLC检测结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
本发明寨卡病毒来自浙江省疾病预防控制中心。
实施例1细胞工作种子的制备与病毒液的制备
1、高密度细胞工作种子制备
使用199培养液稀释Vero主细胞种子稀释比例为60:1，接种到175cm2细胞方瓶中培养，培养温度为36.0℃±1℃。待细胞铺满细胞瓶，按1:4～1:6继续传代4代。最后一代传至5个40层细胞工厂，进行胰酶消化，离心去上清。使用含10％DMSO的冻存液进行重悬，混合后细胞浓度为2.5×107个/ml。将细胞种子在程序降温仪进行梯度降温，保持每分钟下降1℃。温度降至-196℃后移至液氮中保存，工作细胞种子的有效期为10年。
2、Vero细胞培养
(1)一级细胞培养称取微载体，用0.01MPBS溶胀过夜，用适量的PBS漂洗2次，置于高压蒸汽灭菌柜121℃灭菌。将细胞种子从液氮中取出，在39±1℃的水浴中迅速摇动融化，计数后，加入生长液中，进行一级细胞培养，培养体积约为5L。调整各培养参数，温度为36.5℃、pH值为7.20、溶氧为50％、转速为30rpm。细胞培养至平台期时2.5×106cells/ml，进行消化传代。
(2)二级细胞培养将步骤(1)培养完成的细胞经消化制备成细胞悬液，接种至20L细胞反应器，调整各培养参数，温度为36.5℃、pH值为7.20、溶氧为50％、转速为30rpm，开始培养。细胞培养至平台期时5×106cells/ml，准备进行消化。
(3)三级细胞培养步骤(2)培养完成后的细胞制备成细胞悬液，接种至工作体积120L细胞反应器中，设置温度为36.5℃、pH值为7.20、转速为30rpm、溶氧为50％。细胞密度培养至1.5×106cells/ml准备接种病毒。
3、病毒液培养按MOI0.05寨卡病毒工作种子接种，将培养参数调整为转速：30rpm，温度：36.5℃，pH值：7.30，溶氧：50％。培养3天，收获细胞上清，即为寨卡病毒收获液。
实施例2培养基的筛选
选择市面销售的MEM，M199，DMEM，DMEM/F12培养基，采用Minitab17的DOE软件进行试验设计，按照设计出的培养基配方进行病毒培养，比较病毒滴度、病毒免疫原性结果，选择最优培养基。试验设计的培养基配方如表1所示，其中“1”代表添加该培养基，“-1”代表不添加该培养基。配方中有几个“1”就进行几等分，每一种培养基分别为一等分。病毒滴度和免疫原性结果如表2，表3所示，其中M199与DMEM/F12按照1:1等体积混合的培养基生产的病毒免疫原性和滴度显著高于其它培养基。
表1DOE试验培养基配方
表2病毒滴度结果
配方 滴度结果(CCID50/ml)
① 7.0
② 6.5
③ 6.9
④ 7.3
⑤ 7.1
⑥ 6.8
⑦ 7.9
表3免疫原性结果
配方 GMT(1：)
① 512
② 384
③ 512
④ 768
⑤ 768
⑥ 512
⑦ 1024
根据免疫原性和滴度结果选择⑦号培养基，作为寨卡病毒培养基。
实施例3寨卡病毒灭活和纯化
1、寨卡病毒灭活寨卡病毒收获液中添加终浓度为200μg/ml甲醛，置37℃灭活7天。即完成寨卡病毒的灭活。
2、寨卡病毒纯化
(1)澄清将病毒液经连续3级孔径为3-0.8μm、0.8-0.65μm、0.65-0.22μm的滤芯过滤或离心(包括连续流离心)转速为2000-5000rpm，离心时间为0.5-4个小时，得到病毒澄清液；
(2)浓缩病毒澄清液经300KD截留分子量的Pall切向流膜过滤***进行浓缩，浓缩倍数为100倍。
(3)密度梯度离心蔗糖溶液的低、高浓度分别为25％，55％。密度梯度离心缓冲液为0.05mol/LPBS缓冲液，其pH值为：6.5。使用日立CP70MX/ME超速离心机，依次从边孔以100rpm泵入100ml超离心缓冲液，约700ml的实施例1超滤浓缩获得的寨卡病毒超滤液,低浓度蔗糖溶液500ml，最后以100rpm泵入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体，在4℃经30000rpm超滤离心10h。离心完成后，第一管收集500ml，之后用50ml离心管收集，50ml/管，可以收集25-27管。检测每管的抗原含量和蛋白质含量，通过蛋白电泳结果合并含有E、M、C蛋白的离心液。各管的SDSPAGE电泳结果见图1，证明密度梯度离心可以将含有E、M、C蛋白的寨卡病毒有效分离。
(4)脱糖步骤(3)中的密度梯度离心液经100KD截留分子量的Pall切向流膜过滤***进行脱糖。
(5)离子交换离子交换层析介质为DEAEFF，平衡缓冲液为0.02MPBS溶液，洗脱缓冲液为0.02MPBS，上样流速和清洗流速分别为15ml/min、80ml/min。收集流穿峰时以抗原峰向下出现拐点为界限，前后分为两段收集，即为层析液。
(6)纯化浓缩步骤(5)中的层析液经100KD截留分子量的Pall切向流膜过滤***进行浓缩，浓缩100倍后经0.22um过滤即为原液。原液通过HPLC检测纯度如图2所示，纯度达到98.6％。
实施例4寨卡病毒原液制备成疫苗的各项指标评价
1、杂质含量此步骤产品即为寨卡病毒原液
将实施例2获得的寨卡病毒原液根据抗原含量稀释至600U/ml，最终半成品的抗原含量为800U/ml，且总蛋白含量低于20μg/ml。随后加入；铝佐剂备成寨卡病毒疫苗成品。疫苗成品的杂质含量结果见表4。
表46批寨卡病毒疫苗成品主要杂质残留量结果*
*计算P值时如果数值为小于(<)值，按照该值进行计算。如果数值为范围值，按照范围上下限的平均值进行计算。
2、免疫原性
将疫苗成品复融后进行3倍系列稀释，共4个稀释度；每个稀释度样品分别进行单次两后肢肌肉免疫大鼠，0.5ml/只，10只(雌雄各半)每稀释度，免疫后21天采血，分离血清，分别检测血清中抗寨卡病毒的中和抗体滴度，计算血清阳转率。血清阳转率和中和抗体几何平均值GMT水平见表5。
表5寨卡疫苗成品免疫原性结果
批次 1 2 3 4 5 6
原倍阳转率 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
GMT(1：) 768 2048 1024 1536 1024 768
3、稳定性
将疫苗成品储存在37℃环境下，按时间点取样检测抗原含量、外观、pH值、渗透压摩尔浓度、细菌内毒素、BSA含量、HCP含量、DNA含量等。记录数据至8周，结果表6-11。
表637℃成品-抗原含量检测结果(标示量的百分比)
*标示量的百分比值是较0月值的百分比值。
表737℃DNA含量检测结果
表837℃BSA含量检测结果
表937℃HCP含量检测结果
表1037℃渗透压摩尔浓度检测结果
表1137℃细菌内毒素检测结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种灭活的寨卡病毒疫苗，其特征在于，寨卡病毒抗原含量为100-1600U/ml，且总蛋白含量低于20μg/ml。
2.如权利要求1所述的灭活的寨卡病毒疫苗，其特征在于，寨卡病毒抗原含量为800U/ml。
3.如权利要求1所述的灭活的寨卡病毒疫苗，其特征在于，通过以下步骤制备得到：
(1)利用为载体培养细胞技术培养Vero细胞，当细胞生长成致密单层时，接种寨卡病毒工作种子，培养；
(2)将病毒培养液澄清过滤后收获病毒液，灭活；
(3)灭活的病毒液超滤浓缩，浓缩后的病毒液采用蔗糖密度区带离心；
(4)离心产物超滤脱糖，得到脱糖液；将脱糖液进行离子交换，得到层析液；层析液进行浓缩、除菌即为原液；
(5)将原液稀释，加入佐剂，得到疫苗半成品。
4.如权利要求3所述疫苗，其特征在于，步骤(2)所述的病毒培养液为M199与DMEM/F12按照体积比1：1混合得到。
5.一种制备灭活的寨卡病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用为载体培养细胞技术培养Vero细胞，当细胞生长成致密单层时，接种寨卡病毒工作种子，培养；
(2)将病毒培养液澄清过滤后收获病毒液，灭活；
(3)灭活的病毒液超滤浓缩，浓缩后的病毒液采用蔗糖密度区带离心；
(4)离心产物超滤脱糖，得到脱糖液；将脱糖液进行离子交换，得到层析液；层析液进行浓缩、除菌即为原液；
(5)将原液稀释，加入佐剂，得到疫苗半成品。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)当细胞生长成致密单层时，按照MOI为0.05-0.3接种寨卡病毒工作种子，培养温度为35-37℃，培养时间为72-96小时。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中灭活方法为单次收获液中加入终浓度为100-400μg/ml的甲醛，37℃，灭活4-7天。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)病毒液浓缩倍数为10-100倍，膜包可截留分子质量为100-300KD。
9.如权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)的蔗糖密度区带离心方法为：依次从离心机边孔以50-100rpm依次泵入超离缓冲液，超滤浓缩后的病毒液,低浓度蔗糖溶液，最后以50-150rpm泵入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体离心转速为28000-35000rpm，离心时间为：6-20小时，离心温度为2-8℃；
低浓度蔗糖溶液蔗糖质量百分比为25％-45％，高浓度蔗糖溶液蔗糖质量百分比为55％-60％，超离缓冲液为0.01-0.05MPBS，pH值为：6.0-7.5。
10.如权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于，将原液稀释至200-3200U/ml，与佐剂按照1:1等体积混匀。
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