CN108410759B - 一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌及其应用 - Google Patents

一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌及其应用。本发明以传统发酵过程中微生物资源为研究对象，筛选得到针对烟草等农作物种植过程中使用较多、残留量大、降解周期长的氯氟氰菊酯的降解菌，该降解菌为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5菌株，来源于汾酒大曲，该菌株安全性高，可以高效降解浓度为5mg/kg的氯氟氰菊酯，对烟叶等农作物低浓度氯氟氰菊酯农药残留的降解具有一定的应用前景，为提高烟草制品的质量与安全，解决烟叶等农作物农药残留问题提供安全、有效的生物降解途径。

Description

一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效降解氯氟氰菊酯玫瑰色红球菌的功能与特性。
背景技术
随着农业的集中化发展，农药在世界范围内广泛使用，一方面农药的使用可以提高农作物的产量；另一方面，农药残留到产品中对健康造成潜在的危害，并导致环境污染。近几年来，利用微生物降解农药残留的研究取得了较大的进展。但是目前农药降解菌主要是从农药污染严重的土壤以及水体污泥中进行筛选，主要用于解决土壤及水体中的农药污染，筛选得到的菌株大多数为假单胞菌和克雷伯菌等，菌株的安全性受到质疑，其应用也受到一定的限制。因此，寻求安全可靠的菌株来源成为降解农药残留的关键。
有研究报道，在食品发酵过程中的一些菌株具有较强的农药降解能力。中国传统发酵食品历史悠久，种类繁多，其中蕴含着丰富的食品微生物资源。有些微生物在发酵过程中可以将农药作为碳源和氮源进行生长，从而起到降解农药的作用，如酵母菌和其它一些微生物可以降解拟除虫菊酯、有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂等农药。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5。
本发明提供的玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5的保藏编号为CGMCCNo.15232。
本发明提供的玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5的分类命名为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous，该菌株已于2018年01月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15232。
本发明的另一个目的是提供玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous或其菌悬液或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其培养液的新用途。
本发明提供了玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous或其菌悬液或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其培养液在降解拟除虫菊酯类农药中的应用。
本发明还提供了玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous或其菌悬液或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其培养液在制备降解拟除虫菊酯类农药的产品中的应用。
上述应用中，所述拟除虫菊酯类农药为氯氟氰菊酯。
上述应用中，所述玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5CGMCC No.15232。
本发明还有一个目的是提供一种用于降解拟除虫菊酯类农药的产品。
本发明提供的用于降解拟除虫菊酯类农药的产品的活性成分为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous或其菌悬液或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其培养液。
上述产品中，所述拟除虫菊酯类农药为氯氟氰菊酯。
上述产品中，所述玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5CGMCC No.15232。
本发明的最后一个目的是提供一种降解拟除虫菊酯类农药的方法。
本发明提供的降解拟除虫菊酯类农药的方法包括用玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous或其菌悬液或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其培养液处理含有拟除虫菊酯类农药的物质。
上述方法中，所述拟除虫菊酯类农药为氯氟氰菊酯。所述含有拟除虫菊酯类农药的物质具体可为残留氯氟氰菊酯的烟叶等农作物。
上述方法中，所述玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5CGMCC No.15232。
本发明以传统发酵过程中的微生物资源为研究对象，筛选得到针对烟草等农作物种植过程中使用较多、残留量大、降解周期长的氯氟氰菊酯的降解菌，该降解菌为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5菌株，来源于汾酒大曲，该菌株安全性高，可以高效降解浓度为5mg/kg的氯氟氰菊酯，对烟叶等农作物低浓度氯氟氰菊酯农药残留的降解具有一定的应用前景，为提高烟草制品的质量与安全，解决烟叶等农作物农药残留问题提供安全、有效的生物降解途径。
附图说明
图1为氯氟氰菊酯标准品色谱图。
图2为氯氟氰菊酯标准曲线。
图3为氯氟氰菊酯降解率测定结果。
图4为玫瑰色红球菌生长曲线和氯氟氰菊酯降解动态曲线。注：▲，未接种玫瑰色红球菌组中氯氟氰菊酯浓度变化；■，接种玫瑰色红球菌组中氯氟氰菊酯浓度变化；○，未添加氯氟氰菊酯组中玫瑰色红球菌的生长变化；□，添加氯氟氰菊酯组中玫瑰色红球菌的生长变化。
保藏说明
菌种名称：玫瑰色红球菌
拉丁名：Rhodococcus rhodochrous
菌株编号：L5
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年01月17日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15232
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的发酵剂是山西杏花村汾酒股份有限公司的产品，为传统食品发酵剂(汾酒大曲)，其包含乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、霉菌以及放线菌等丰富的菌种资源。
下述实施例中的农药标准品氯氟氰菊酯是百灵威J&K的产品。
下述实施例中的基础无机盐培养基(MSM)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别如下：NH4NO3，1.5g/L；KH2PO4，0.5g/L；K2HPO4，1.5g/L；NaCl，1.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；配制MSM固体培养基时添加15-20g/L的琼脂。
下述实施例中的LB肉汤培养基(合成干粉培养基)和LB营养琼脂培养基(合成干粉培养基)均是北京奥博星生物技术有限公司的产品。
下述实施例中的稀释农药时所用溶剂为乙腈，色谱级，是西陇化工股份有限公司的产品。
实施例1、L5菌株的分离、鉴定与保藏
一、农药降解菌的富集与驯化及分离与纯化
1、农药降解菌的富集与驯化
以汾酒厂新鲜大曲为来源进行菌株筛选。具体步骤如下：称10g汾酒大曲于90mL生理盐水的三角瓶中，于30℃、180rpm培养40min，然后取1mL转接到含有50mg/kg氯氟氰菊酯的9mL MSM培养基中，于30℃、180rpm培养7d，再吸取1mL转接到含有100mg/kg氯氟氰菊酯的9mL MSM培养基中，于30℃、180rpm培养7d，按上述操作连续转接，并逐步提高氯氟氰菊酯的浓度至200-400mg/kg。
2、农药降解菌的分离与纯化
降解菌的富集与驯化实验前期历时28d，后期将第四次转接的浓度为400mg/kg氯氟氰菊酯培养28d的菌进行原液、10-1、10-2、10-3涂布在含有100mg/kg氯氟氰菊酯的MSM固体培养基上，在37℃的恒温培养箱中培养2-5d。挑取生长较快、生长状况较好的不同形态的菌落，在含有100mg/kg氯氟氰菊酯的MSM固体培养基上连续纯化培养3次。培养完成后，挑取划线后生长旺盛、菌落较大的单菌落于LB固体培养基平板，最终得到一株农药耐受菌株，将其命名为L5菌株。
二、L5菌株的鉴定
1、L5菌株的理化鉴定
L5菌株的理化特性如表1所示。
表1、L5菌株的理化特性
菌株名称 属名 菌落颜色 细胞形状 革兰氏染色结果 异化作用方式
玫瑰色红球菌 红球菌属 微红色 球状 阳性(+) 需氧
2、L5菌株的分子鉴定
对分离纯化的L5菌株进行菌落PCR。PCR反应体系为25μL，PCR反应条件如下：94℃保持5min；主循环94℃30s；54℃30s；72℃1min，循环35次；终延伸72℃7min；4℃保存。在菌落PCR后，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后将PCR产物送华大基因(北京)有限公司进行纯化并测序，并将双向测序结果应用Vector NTI 11.5软件处理，再登陆NCBI进行BLAST比对，确定菌株的种属。菌株L5的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
综合上述鉴定结果，确定L5菌株名称为玫瑰色红球菌，其分类命名为玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous，该菌株已于2018年01月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15232。
实施例2、玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5在降解氯氟氰菊酯中的应用
一、菌悬液的制备
从LB固体培养基中挑取玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5转接至含有LB肉汤培养基的小瓶中，在30℃的条件下摇床(150rpm)培养至菌落OD600＝1.0±0.1；然后将菌液在5000×g条件下离心5min，弃去上清液，用MSM液体培养基洗涤菌体沉淀后混匀，重复洗涤2次后加入MSM液体培养基，用漩涡振荡仪振荡重悬，使菌体充分混匀制备成菌悬液，菌悬液的菌浓度为107cfu/mL。
二、降解氯氟氰菊酯实验
1、根据中国烟草总公司的烟叶农残标准YQ 50-2014，规定烟草中氯氟氰菊酯农药的最大限量标准为1mg/kg，又参考上海烟草公司反馈信息中提及的2倍农药限量值，本实验选取了烟叶农残标准YQ 50-2014中农残限量值的2、5、10倍进行实验。
将氯氟氰菊酯与MSM液体培养基混匀，使氯氟氰菊酯在MSM液体培养基中的浓度分别为2mg/kg、5mg/kg和10mg/kg，得到含有不同浓度氯氟氰菊酯的MSM液体培养基。
2、将步骤一制备的菌悬液按照体积分数为5％的添加量，葡萄糖按照质量分数为1％的添加量加入到含有不同浓度氯氟氰菊酯的MSM液体培养基中，得到含有不同浓度氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌-氯氟氰菊酯体系，其体积大小为10mL。
3、将步骤二制备的玫瑰色红球菌-氯氟氰菊酯体系在30℃，180rpm条件下摇床培养7d作为处理组，同时以不加入菌悬液的含有不同浓度氯氟氰菊酯的MSM培养基作为对照组，对照组及处理组各做3个平行。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定7d后含有不同浓度氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌-氯氟氰菊酯体系中氯氟氰菊酯浓度，并计算降解率。氯氟氰菊酯标准曲线的制作方法如下：配制如下浓度的氯氟氰菊酯标准曲线工作液：1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg。采用GC-MS对不同浓度的标准曲线工作液进行定量检测，并以氯氟氰菊酯浓度作横坐标，以特征峰处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，绘制标准曲线。其中，GC-MS定量检测方法如下：样品前处理过程：吸取2mL样品于12000×g的条件下离心5min。收集上清液1.5mL，加入等体积乙腈，剧烈震荡1min，加入1.5g氯化钠震荡1min，并以3800rpm的转速离心5min，取1mL上清液于装有150mg无水硫酸镁的2mL离心管中，震荡1min后以10000rpm的转速离心1min，取上清液过0.22μm有机滤膜于进样小瓶，待GC-MS检测。色谱条件：载气：氦气，柱流速1.0mL·min-1；进样口温度280℃，不分流进样模式，进样时间1.0min，进样量1μL；柱升温程序：初始温度100℃，以30℃·min-1升至250℃，保持0min，再以20℃·min-1升至310℃，保持10min。质谱条件：载气：氦气；碰撞器：氩气；传输线温度290℃；离子源E1源；离子源温度250℃；电子能量70eV；溶剂延迟时间2.5min；扫描方式：多选择离子存储检测(SIS)。
氯氟氰菊酯的三个特征离子分别为152，181和208。根据其特征离子可以从色谱图中分离出特征峰，响应度最高的特征离子峰用于定量，其他两个特征离子峰用于定性，并计算出代表农药特征峰的峰面积，进而计算出降解率。降解率计算公式如下：
Figure BDA0001589040470000051
三、实验结果
1、降解率
氯氟氰菊酯标准品色谱图、氯氟氰菊酯标准曲线如图1、图2所示。按照标准品GC-MS色谱、质谱方法测定每组样品，所绘得的特征离子为152，181，208的峰面积基本吻合，说明该峰代表物质为氯氟氰菊酯。响应度最高的181特征离子峰用于定量，152，208两个特征离子峰用于定性，用SPSS软件对不同浓度氯氟氰菊酯的降解率进行差异性分析，得出玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)对浓度为2mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的氯氟氰菊酯的降解率结果。
结果如图3所示。由图3可以看出，玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5对浓度为2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的氯氟氰菊酯均有一定的降解率。其中，玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5对浓度为5mg/kg的氯氟氰菊酯降解率为71.44％，达到对不同浓度氯氟氰菊酯降解率的峰值，对浓度为2mg/kg的氯氟氰菊酯降解率为28.87％，对浓度为10mg/kg的氯氟氰菊酯降解率为40.85％。对玫瑰色红球菌-氯氟氰菊酯进行组内数据差异性分析可知，玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5对浓度为5mg/kg的氯氟氰菊酯降解率最高，浓度为10mg/kg的氯氟氰菊酯降解率次之，浓度为2mg/kg的氯氟氰菊酯降解率最低，且浓度为2mg/kg和10mg/kg组的降解率与浓度为5mg/kg组的降解率存在显著性差异。说明玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous L5是氯氟氰菊酯的有效降解菌。
2、农药浓度动态变化曲线和菌株生长动态变化曲线
为了探究氯氟氰菊酯与降解菌间的相互作用以及氯氟氰菊酯在0-7d的降解速度变化，测定氯氟氰菊酯在有无降解菌存在条件下0-7d的浓度变化及降解菌在有无氯氟氰菊酯存在条件下0-7d的生长变化曲线。具体步骤如下：
(1)将氯氟氰菊酯与MSM液体培养基混匀，使氯氟氰菊酯在MSM液体培养基中的浓度为5mg/kg，得到含有氯氟氰菊酯的MSM液体培养基；
(2)将步骤一制备的菌悬液按照体积分数为5％的添加量，葡萄糖按照质量分数为1％的添加量加入到步骤(1)制备的含有氯氟氰菊酯的MSM液体培养基中，得到玫瑰色红球菌-氯氟氰菊酯体系；同时以未接种菌悬液的含有氯氟氰菊酯的MSM液体培养基和接种菌悬液的不含有氯氟氰菊酯的MSM液体培养基作为对照；
(3)分别在培养第0、1、2、3、4、5、6、7d时测定氯氟氰菊酯浓度以及菌液OD600nm。
结果如图4所示。由图中可以看出：在没有接种玫瑰色红球菌的对照组中，含有浓度为5mg/kg的MSM液体培养基中的氯氟氰菊酯浓度的变化量很小，在接种玫瑰色红球菌的氯氟氰菊酯实验组中，氯氟氰菊酯浓度不断降低。另外，与没有添加氯氟氰菊酯的对照组相比，添加浓度为5mg/kg的氯氟氰菊酯的实验组中，玫瑰色红球菌株生长明显受到促进作用。说明氯氟氰菊酯的降解率与菌株生长密度有关。氯氟氰菊酯可以促进玫瑰色红球菌的生长，同时玫瑰色红球菌也提高了氯氟氰菊酯的降解率。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌及其应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1400
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gtcgaacgat gaagcccagc ttgctgggtg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60
ggtgatctgc cctgcactct gggataagcc tgggaaactg ggtctaatac cggatatgac 120
ctcttgctgc atggcgaggg gtggaaagtt tttcggtgca ggatgagccc gcggcctatc 180
agcttgttgg tggggtaatg gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg 240
accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 360
ttgtaaacct ctttcagcag ggacgaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcaccg 420
gccaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttgtc cggaattact 480
gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg cgtcgtctgt gaaatcccgc agctcaactg 540
cgggcttgca ggcgatacgg gcagactcga gtactgcagg ggagactgga attcctggtg 600
tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcggg tctctgggca 660
gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc 720
cacgccgtaa acggtgggcg ctaggtgtgg gtttccttcc acgggatccg tgccgtagcc 780
aacgcattaa gcgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga 840
cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta 900
cctgggtttg acatgtaccg gacgactgca gagatgtggt ttcccttgtg gccggtagac 960
aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1020
gcgcaaccct tgtcctgtgt tgccagcacg tgatggtggg gactcgcagg agactgccgg 1080
ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gtccagggct 1140
tcacacatgc tacaatggtc ggtacagagg gctgcgatac cgtgaggtgg agcgaatccc 1200
ttaaagccgg tctcagttcg gatcggggtc tgcaactcga ccccgtgaag tcggagtcgc 1260
tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320
cgtcacgtca tgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ctaacccctt gtgggaggga 1380
gccgtcgaag gtgggatcgg 1400

Claims (7)

1.一株玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)L5，其保藏编号为CGMCC No.15232。
2.玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)或其菌悬液或其菌剂在降解拟除虫菊酯类农药中的应用；
或，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)或其菌悬液或其菌剂在制备降解拟除虫菊酯类农药的产品中的应用；
所述玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15232的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述拟除虫菊酯类农药为氯氟氰菊酯。
4.一种用于降解拟除虫菊酯类农药的产品，其活性成分为玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)或其菌悬液或其菌剂；
所述玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15232的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述拟除虫菊酯类农药为氯氟氰菊酯。
6.一种降解拟除虫菊酯类农药的方法，包括用玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)或其菌悬液或其菌剂处理含有拟除虫菊酯类农药的物质；
所述玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15232的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述拟除虫菊酯类农药为氯氟氰菊酯。
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