CN108409858A - 一种番茄果实转录因子cnr多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种番茄果实转录因子CNR多克隆抗体及其制备方法，本方法包括：(1)构建含有SEQ ID No：1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得CNR蛋白抗原；(2)将所述CNR蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得番茄CNR蛋白多克隆抗体，利用本发明所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别番茄果实的CNR蛋白，而不能识别番茄果实的其他蛋白，在CNR蛋白的检测和功能鉴定、及其研究中具有广泛用途。CNR蛋白抗体的制备为检测番茄转录因子CNR在果实成熟过程中的表达情况及研究CNR蛋白的功能具有重要意义。

Description

一种番茄果实转录因子CNR多克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种番茄果实转录因子CNR多克隆抗体及其制备方法。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum Mill.)栽培历史悠久，因其基因组小(950Mb)，生长周期短(坐果到成熟约60d)，且与拟南芥、水稻、玉米等模式植物亲缘关系较远而成为研究肉质果实发育和成熟的模式生物。现已获得大量番茄种质资源、突变体库、高密度遗传图谱、EST资源，且瞬时表达和稳定转化技术成熟。此外，2012年5月完成的栽培番茄全基因组精细序列分析极大地推动了番茄功能基因组学及分子遗传学研究。果实成熟过程涉及到大量代谢途径的调节以及生理生化属性的显著改变，需要对一系列基因的时序性表达进行精密转录调控，因此番茄成熟相关转录因子的功能研究成为植物学领域的研究热点之一。
果实的成熟过程是由许多转录因子单独或协同调控特定的下游基因来完成的(Giovannoni 2007)，其中一类转录因子是SBP box家族。SBP box转录因子参与了植物发育的许多方面(彭华2016)，包括相转变、花器官的建成、果实成熟，植物激素信号转导和铜的体内平衡等(高英2009)。CNR是SBP box转录因子家族中一个比较特殊的成员，它可以在果实的发育、成熟过程中发挥重要作用。目前，关于番茄转录因子CNR的研究主要在转录水平，然而蛋白合成后存在翻译后水平的修饰，蛋白水平才是转录因子CNR发挥作用的水平，而目前关于CNR蛋白的抗体未见报道。
因此有必要提供一种针对番茄CNR蛋白的多克隆抗体，从而为研究和利用该蛋白的生物学功能提供有力工具。
发明内容
本发明的目的在于填补现有对于CNR蛋白的抗体研究的空白，开发一种针对番茄CNR蛋白的多克隆抗体及其制备方法。
一种番茄果实转录因子CNR多克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)构建含有SEQ ID No：1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；
(2)将所述CNR蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得番茄CNR蛋白多克隆抗体。
其中，所述SEQ ID No：1所示核苷酸序列为发明人根据GenBank中已发表的番茄CNR基因mRNA序列(NM_001319308.1)设计引物，并在上游引物与下游引物的5’端分别***EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点，以品种为Lycopersicon esculentum cv.Ailsa Craig的番茄果实提取mRNA后反转录得到的cDNA为模板，经PCR扩增得到的。
可选的，所述重组表达载体是将含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得的。
可选的，所述CNR蛋白抗原含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明对于所使用的大肠杆菌感受态细胞的种类没有特别的限制，只要能够适合重组表达载体在细胞中有效表达即可，优选的情况下，为了获得更好的表达效果，大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌Rosetta感受态细胞。
在本发明中，可以利用本领域常规适合于重组蛋白抗原的原核表达载体，优选的情况下，当所述原核表达载体为pET-30a时，重组蛋白抗原的表达效果更好。
在本发明所提供的方法中，免疫动物的步骤包括3次免疫，首先将纯化的重组蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫动物，而后将纯化的重组蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-3次免疫，每次免疫的时间间隔为14d。
在本发明中，免疫动物时所使用的免疫剂量及与佐剂的混合比例都可以按照本领域常规的方法进行。免疫的动物包括但不限于小鼠。
在第3次免疫后第10d，取动物血液，收集抗血清，利用纯化试剂获得纯度不低于80％的番茄CNR蛋白多克隆抗体。
本发明还提供了利用本发明所述的方法制备的番茄CNR蛋白多克隆抗体。所述多克隆抗体能够特异性的识别CNR蛋白中的特异性氨基酸片段SEQ ID No.2，为CNR蛋白的特异性抗体。
本发明还提供了所述的番茄CNR蛋白多克隆抗体的应用。所述应用包括制备含有所述番茄CNR蛋白多克隆抗体的试剂或试剂盒，用于检测番茄转录因子CNR在果实成熟过程中的表达情况或进行功能鉴定。
本发明所提供的方法通过PCR方法克隆得到编码CNR蛋白的DNA序列，从而获得特异性的多克隆抗体。利用本发明所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别番茄CNR蛋白，而不能识别番茄其他蛋白，在CNR蛋白的检测和功能鉴定、以及研究中具有广泛用途。CNR蛋白抗体的制备为在番茄中检测转录因子CNR的表达情况及研究CNR蛋白的功能具有重要意义。
附图说明
图1为番茄果实总RNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为携带有表达载体pET-30a-CNR的工程菌菌液PCR凝胶电泳图。M：Marker；1：目的片段。
图3为重组质粒pET-30a-CNR的酶切鉴定凝胶电泳图，M：Marker；1：质粒双酶切。
图4为CNR蛋白的小量诱导表达蛋白凝胶电泳图，M：Marker；1-3：单克隆；4：未诱导，采用15％的SDS-PAGE。
图5为诱导温度为37℃的CNR蛋白表达凝胶电泳图，M：marker；1-4：细胞裂解液的上清部分；5-8：细胞裂解液的沉淀部分：1和50.1mmol/L IPTG诱导；2和6：0.4mmol/L IPTG诱导；3和7：0.8mmol/L IPTG诱导；4和8：1mmol/L IPTG诱导。
图6为带有His标签的CNR蛋白的亲和纯化凝胶电泳图1，M：marker；1：1.0mmol/LIPTG诱导的菌体裂解液上清为纯化样品；2-7：分别为结合缓冲液、漂洗缓冲液、洗脱缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ洗脱缓冲液过柱后洗脱下来的蛋白。
图7为带有His标签的CNR蛋白的亲和纯化凝胶电泳图2，M：marker；1-8：咪唑浓度500mmol/L洗脱缓冲液过柱后洗脱下来的蛋白。
图8为带有His标签的CNR蛋白的亲和纯化凝胶电泳图3，M：marker；1-7：咪唑浓度500mmol/L洗脱缓冲液过柱后洗脱下来的蛋白。
图9为带有His标签的CNR蛋白的亲和纯化凝胶电泳图4，M：marker；1-8：咪唑浓度500mmol/L洗脱缓冲液过柱后洗脱下来的蛋白。
图10为重组载体转化不同感受态细胞的蛋白表达凝胶电泳图，M：marker；1和2：单克隆(BL21 plysS)；3：未诱导(BL21 plysS)；4和5：单克隆(Codon plus)；6：未诱导(Codonplus)；7和8：单克隆(Rosetta)；9：未诱导(Rosetta)。
图11为CNR蛋白多克隆抗体的效价图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
图12为Western blot检测血清特异性电泳图，1：纯化后的CNR蛋白。
图13为番茄果实不同时期总蛋白的凝胶电泳图，M：Marker；1：未熟期；2：绿熟期；3：破色期；4：粉红期；5：红熟期。
图14为番茄果实成熟过程中CNR蛋白表达量的蛋白印迹分析图，1：未熟期；2：绿熟期；3：破色期；4：粉红期；5：红熟期。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
1、番茄果实总RNA的提取
番茄品种为Lycopersicon esculentum cv.Ailsa Craig，保存于本实验室。采用TRIzol法提取番茄果实总RNA，然后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测提取的番茄果实总RNA的质量，由图1所示，可以看出，提取的番茄总RNA的完整性特别好，没有降解，也未受到DNA的污染，能够作为下一步理想的反转录模板。
2、反转录
以上一步骤得到的番茄总RNA作为模板进行反转录得到cDNA。
3、CNR基因引物的设计与合成
根据GenBank中已发表的番茄CNR基因mRNA序列(NM_001319308.1)在Premier5.0中设计一对引物，在上游引物与下游引物的5’端分别***引物EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点。本试验所用的引物由上海生工生物公司进行合成。
引物核苷酸序列具体如下：
上游引物：GGAATTCATGGAAACTAACAAATGGGAAGGG(SEQ ID NO.3)
下游引物：CCGCTCGAGGCCCAAATTTTCTCCATGAGAGTC(SEQ ID NO.4)
4、RT-PCR获取目的基因
以反转录得到的cDNA为模板，利用上述引物获取目的CNR，CNR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
GACTACGATAGGGCGATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTGGAATTCATGGAAACTAACAAATGGGAAGGGAAGAGAAGCATTACTGAAGCTGAAAAGGAAGAGGATGAACATGGAAGTGTTGAAGAGGATAGCAAAAGAAAAAGGGTATTGACTCTCTCTGGTAGGAAGCTAGTTGGTGAAGGGTCGGCACATCCTTCTTGCCAGGTCGATCAGTGCACTGCAGATATGGCAGATGCCAAGCCATACCATCGCCGCCACAAGGTGTGTGAGTTCCATTCAAAGTCTCCAATAGTACTTATTAGTGGACTCCAGAAGCGATTCTGTCAGCAATGTAGCAGATTTCATCTGTTAGCAGAGTTTGATGATGCTAAGAGGAGTTGCCGAAGGCGTTTGGCAGGTCACAATGAGCGCCGCCGTAAAATTACATATGACTCTCATGGAGAAAATTTGGGCCTCGAGCGGAAGGGCAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGG
5、EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切
将RT-PCR得到的产物与表达载体pET-30a均用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切。
6、凝胶电泳与胶回收
(1)将上一步骤中的酶切产物进行凝胶电泳，根据目的片段的分子量大小并参照Marker，用刀片将琼脂糖凝胶中包含的目的条带的凝胶块切下，将用刀片切下的胶块取出，小心的移到新的干净离心管中。
(2)胶块重量的称量，称取200g左右，转移到合适的离心管中，向离心管中加入400μL的Bingding Buffer溶液，将离心管放入水浴锅中进行水浴(55-60℃)，直到琼脂糖凝胶完全融化。
(3)将融化完全的溶液用移液枪转移到收集管UNIQ-10柱中，在常温下离心2min。
(4)将UNIQ-10柱取下，倒掉收集管底部的废弃液体，将UNIQ-10柱放回到倒掉废液的收集管，并向管中加入500μL的Washing Solution，进行离心(10000rpm、30s)。
(5)重复步骤(3)一次。
(6)将UNIQ-10柱取下，把管底部废弃的液体全部倒掉，然后将该柱放回到收集管，进行离心(10000rpm、15s)。
(7)取下UNIQ-10柱，放置于新的离心管，然后向柱子的膜中央加入ElutionBuffer，30μL左右，在室温条件下放置2min。
(8)在室温条件下进行离心，此时离心管中留下的液体为本次回收的DNA片段。
7、连接
将纯化、回收的RT-PCR产物定向重组至表达载体pET-30a中，连接体系如下：
反应条件：16℃连接4h。
8、转化
(1)将在-80℃超低温冰箱保存的感受态细胞Rosetta取出，放在冰上，缓慢进行解冻。
(2)取200μL的感受态细胞放入1.5ml离心管，然后向管中加入连接产物10μL，再用移液枪混匀，然后放置在冰上30min。
(3)将该离心管放入水浴锅进行水浴(42℃、90s)，取出，立即将离心管放到冰上2min。
(4)取800μL没有加卡那的LB液体培养基，加入该离心管，上下颠倒混匀，放到37℃恒温振荡培养箱培养中45min。
(5)离心(5000rpm、3min)，弃掉大部分的上清溶液，留下约10μl左右，进行菌体的重悬，然后进行涂板(含有卡那抗性的LB固体培养基平板)。
(6)晾干后放置在37℃的培养箱中，先正着放置30min，然后再倒置过来培养过夜。
9、菌液PCR
在转化完成的工程菌平板上挑取单克隆，转接到15ml离心管，在37℃恒温振荡培养箱中进行过夜培养(12-14h)，然后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段的大小。如图2所示，可以看出目的片段的大小与试验预期结果大小相符。
10、重组质粒pET-30a-CNR的酶切鉴定
从转化完成的工程菌中提取质粒，将重组质粒pET-30a-CNR，采用Xho I和EcoR I双酶切，然后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，得到大小约420bp的条带，该条带的大小与实验预期CNR基因的大小相符，可以初步确定pET-30a-CNR重组载体构建成功。同时进行测序分析，并用生物软件DNAMAN将测序结果与已发表的CNR序列(NM_001319308.1)进行比对，比对结果完全相符。
11、CNR蛋白的小量表达
在培养有工程菌的平板上挑单克隆，并将挑取的单克隆转至1.5ml的离心管(管中加有含100mg/L卡那的LB液体培养基)，过夜培养，然后进行扩培，至OD值为0.5-0.7时，加入IPTG诱导剂诱导，离心，去上清，冰浴超声波破碎，然后对蛋白进行定量，用15％的SDS-PAGE电泳对蛋白的表达结果进行分析，如图4，加入IPTG诱导剂诱导后的菌液在27KD处有蛋白表达，而没有加IPTG诱导剂的菌液在27KD处没有蛋白表达，且表达的蛋白大小与试验预期结果相符，表达情况较好。
CNR蛋白的氨基酸序列具体如下(如SEQ ID NO.2所示)：
METNKWEGKRSITEAEKEEDEHGSVEEDSKRKRVLTLSGRKLVGEGSAHPSCQVDQCTADMADAKPYHRRHKVCEFHSKSPIVLISGLQKRFCQQCSRFHLLAEFDDAKRSCRRRLAGHNERRRKITYDSHGENLG
12、IPTG诱导表达
挑取含有重组质粒pET-30a-CNR的Rosetta单个阳性菌落至含有Kan(100mg/mL)LB液体培养基中过夜培养，第二天转接扩培后进行蛋白表达。IPTG的诱导浓度分别是0.1、0.4、0.8和1.0mmol/L，37℃表达3h后分别收集菌体，超声波裂解后，保留上清和沉淀。采用BCA试剂盒法对蛋白定量后，用12％SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达情况，每个样品总蛋白上样量均为15μg。如图5所示，菌体裂解液上清中在分子量27kD处，蛋白表达量明显增加，在沉淀中表达不明显。表达出的蛋白的分子量与实验设计表达的CNR融合蛋白分子量相符。当IPTG诱导浓度为1.0mmol/L时，CNR蛋白在菌体裂解液的上清中含量明显提高(图5，泳道4)，说明IPTG诱导剂的最佳诱导浓度为1.0mmol/L。
13、CNR蛋白的纯化
诱导表达后收集的菌体用PBS(含溶菌酶)进行重悬，超声波裂解菌体，经0.22μm滤膜过滤的上清溶液加入Ni SepharoseTM6Fast Flow亲和层析柱中进行纯化。如图6所示，上清上柱后，蛋白全部与亲和柱结合，在流出液中没有27kD的蛋白。经过咪唑浓度为20mmol/L的漂洗缓冲液洗涤，蛋白没有被洗脱下来，可以看出CNR蛋白依然与Ni柱结合较牢靠；加入咪唑浓度为50mmol/L的漂洗缓冲液和100-400mmol/L的洗脱缓冲液Ⅰ-Ⅳ时，杂蛋白仍然没有被洗脱下来(图7，泳道3-7)。再用咪唑浓度(咪唑浓度为500mmol/L)最高的洗脱缓冲液Ⅴ对样品进行洗脱并收集，200μl/管。由图8可以看出，杂蛋白开始被洗脱下来，随着洗脱缓冲液的不断洗脱收集，杂蛋白含量开始减少；如图9所示，大量的杂蛋白已经被洗去，CNR蛋白条带开始变得单一，杂蛋白含量越来越少；继续洗脱，杂蛋白被完全洗脱掉，目的蛋白条带变得单一，说明收集到了纯度很高的CNR蛋白。
对比例1
所用方法同实施例1，不同之处在于，选用BL21 plysS作为感受态细胞，蛋白的表达量见图10，图中经过诱导及未经诱导的转化子中目的蛋白(位于27KD处)的表达量均低于Rosetta作为感受态细胞的转化子的表达量，为此选用Rosetta作为感受态细胞进行转化可提高CNR蛋白的表达量。
对比例2
所用方法同实施例1，不同之处在于，选用Codon plus作为感受态细胞，蛋白的表达量见图10，图中经过诱导及未经诱导的转化子中目的蛋白(位于27KD处)的表达量均低于Rosetta作为感受态细胞的转化子的表达量，为此选用Rosetta作为感受态细胞进行转化可提高CNR蛋白的表达量。
14、抗血清的制备
未经处理的小鼠，从鼠尾取静脉血10μl，用PBS稀释，离心(1500rpm、10min)，取上清，-20℃保存备用。
(1)抗原的制备：取纯化后的蛋白，进行12％SDS-PAGE电泳，取条带单一的收集管用BCA法测定蛋白浓度，且以蛋白浓度≥1.0μg/μl的纯化蛋白作为抗原。
(2)基础免疫：用纯化后的蛋白与完全弗氏佐剂等量混合乳化，分别免疫、接种到四只小鼠(同一批次)体内。接种方式为腹部皮下注射，每只小鼠注射100μg抗原与等体积的完全弗氏佐剂的混合液。
(3)加强免疫：经初次免疫2周后，取50μg纯化后的蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂等量混合，乳化，接种到小鼠体内，接种方式为腹部皮下注射。
(4)二次加强免疫：方法同(3)
(5)三次加强免疫：方法同(3)
(6)血清采集：在第三次加强免疫注射10d后，取小鼠全血，采集完毕，37℃放置2h，然后4℃过夜，离心，取上清。然后进行分装，-80℃保存备用。
15、间接ELISA法测定抗体效价
(1)包被抗原：用浓度为0.05mol/L，pH 9.6的磷酸盐包被缓冲液将CNR蛋白抗原稀释为1μg/mL。在每个96孔酶标板的反应孔中用移液枪加入0.1mL抗原，4℃过夜。
(2)次日，将4℃的酶标板取出，甩去孔内溶液，拍干净，用移液枪加洗涤缓冲液清洗，每孔200μl，3min/次，共4次。
(3)封闭：将洗涤缓冲液甩尽，用3％牛血清白蛋白封闭，每孔加入0.1mL进行孵育，37℃，2h。
(4)洗涤：将孔内的封闭液甩尽，用移液枪加洗涤缓冲液清洗，每孔200μl，3min/次，共4次。
(5)倍比稀释抗CNR蛋白的特异性抗体：用稀释液倍比稀释(1:4×10，1:8×103，1:1.6×104，1:3.2×104，1:6.4×104，1:1.28×105，1:2.56×105，1:5.12×105，1:1.024×106)抗CNR蛋白的特异性抗体。
(6)将倍比稀释的抗CNR蛋白的特异性抗体加入96孔酶标板，100μl/孔，每个梯度重复4次。孵育：37℃，1h。
(7)洗涤：将孔内的抗体甩尽，用移液枪加洗涤缓冲液清洗，200μl/孔，3min/次，共4次。
(8)加酶标二抗：用稀释液1000倍稀释酶标二抗，将稀释好的酶标二抗加入96孔酶标板，100μl/孔，孵育37℃，1h。
(9)洗涤：将孔内的酶标二抗甩尽，用移液枪加洗涤缓冲液清洗，200μl/孔，3min/次，共3次；甩尽，加蒸馏水清洗，200μl/孔，3min/次，共1次。
(10)加底物显色液：于96孔酶标板加入底物显色液，100μl/孔，避光孵育，15min。
(11)终止反应：于96孔酶标板加入2mol/L硫酸，50μl/孔，终止反应。
(12)结果测定：将96孔酶标板置于酶标仪，在450nm处，以空白孔作为对照后进行调零，测定各孔OD值。
按照上述步骤，将抗血清从1:4000-1:2048000倍比稀释，通过间接ELISA的方法对抗血清效价进行检测，每个稀释梯度做4个重复。结果显示，四只小鼠的效价在梯度1:128000之前均呈现阳性(稀释后所测OD值与阴性对照OD值之比>2)。由图11可以看出，1号、2号小鼠的效价为1:128000，3号、4号小鼠的效价均可以达到1:256000。说明制得的CNR蛋白的多克隆抗体的效价较高。
16、多克隆抗体的Western blot检测
(1)电泳
(2)转模：A、电泳结束，关开关，取下胶板。将胶板放于白瓷盘另一边，用绿色刮板的尖端轻轻推入，起开小玻璃板，去浓缩胶，根据Marker的27KDa条带，用绿色刮板切目的凝胶条带，将PVDF膜左上角剪去；B、将三明治放于电转槽，黑色板对黑面放。转膜条件：300mA转膜2h。
(3)封闭：转膜快结束的前半小时制作封闭液(称取5g奶粉，加TBS至小瓶刻度，电磁搅拌)和TBST溶液(800μL土温20+35mLTBS+700mL水)，待转膜结束，取下三明治，将膜放入盛有封闭液的培养皿中，封闭1h。
(4)孵育一抗：A、用TBST按1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000稀释CNR蛋白的多克隆抗体溶液；B、去除封闭液，将PVDF膜放入用TBST稀释的多克隆抗体溶液中，将膜封到杂交袋中，杂交袋标记好，封口，4℃过夜，使抗原抗体发生免疫反应。
(5)孵育二抗：A、用TBST依照说明书稀释二抗-羊抗鼠IgG；B、将杂胶袋中的PVDF膜取出，放入倒好TBST的培养皿中，洗膜3次，每次10min；洗完后将PVDF膜放入稀释好的二抗反应液——羊抗鼠IgG，置于摇床上，室温下孵育反应1h。
(6)曝光：孵育完毕，将PVDF膜用TBST溶液清洗三次，每次10min；清洗的同时，配好ECL Plus超敏发光液(A液:B液＝1:1)，清洗完毕，将PVDF膜转至凝胶成像仪，拍照，保存。
如图12所示，结果表明多克隆抗体与CNR蛋白可以发生特异性抗原抗体反应，检测到的条带与实验预期的分子量大小相符，而且条带单一，由此可以看出CNR蛋白的多克隆抗体的特异性较好。
17、番茄果实总蛋白的提取
取出未熟期、绿熟期、破色期、粉红期、红熟期番茄冻样，用液氮预冷研钵与杵，称取1g样品放入研钵，加入液氮研磨至粉末状，将粉末移至已经预冷的1.5ml离心管(注：样品始终保持冷冻状态)。
(1)加入1ml已配置好的提取液，振荡混匀，使样品溶解充分。
(2)离心(12000rpm、15min)，取出上清溶液。
(3)再离心一次(12000rpm、15min)，取出上清溶液。
(4)从离心后的上清中取出100μL用于蛋白的定量，其余的上清溶液进行分装，-20℃保存。
按照上述步骤分别提取未熟期、绿熟期、破色期、粉红期、红熟期番茄果实的总蛋白，取部分进行SDS-PAGE电泳检测其质量，如图13所示，上样量均为15μg/孔；然后进行CNR蛋白的免疫印记实验，上样量均为20μg/孔。结果如图14所示，CNR蛋白在番茄果实的破色期表达量最高，而在红熟期几乎没有表达。由此可知CNR蛋白的积累与番茄果实的发育和成熟关系密切。
结论：上述实验结果表明，本发明中制备的番茄CNR蛋白多克隆抗体能够识别番茄中的CNR蛋白，能够检测CNR蛋白，而不与番茄体内的其他蛋白发生作用。该多克隆抗体，可以用于番茄转录因子CNR在果实成熟过程中表达情况的检测，对CNR蛋白的功能鉴定及研究具有重要的意义。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种番茄果实转录因子CNR多克隆抗体及其制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 949
<212> DNA
<213> 番茄（Lycopersicon esculentum cv.Ailsa Craig）
<400> 1
gactacgata gggcgattgg gccctctaga tgcatgctcg agcggccgcc agtgtgatgg 60
atatctgcag aattgccctt ggaattcatg gaaactaaca aatgggaagg gaagagaagc 120
attactgaag ctgaaaagga agaggatgaa catggaagtg ttgaagagga tagcaaaaga 180
aaaagggtat tgactctctc tggtaggaag ctagttggtg aagggtcggc acatccttct 240
tgccaggtcg atcagtgcac tgcagatatg gcagatgcca agccatacca tcgccgccac 300
aaggtgtgtg agttccattc aaagtctcca atagtactta ttagtggact ccagaagcga 360
ttctgtcagc aatgtagcag atttcatctg ttagcagagt ttgatgatgc taagaggagt 420
tgccgaaggc gtttggcagg tcacaatgag cgccgccgta aaattacata tgactctcat 480
ggagaaaatt tgggcctcga gcggaagggc aattccagca cactggcggc cgttactagt 540
ggatccgagc tcggtaccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 600
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 660
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 720
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 780
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 840
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 900
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagg 949
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> 番茄（Lycopersicon esculentum cv.Ailsa Craig）
<400> 2
METNKWEGKR SITEAEKEED EHGSVEEDSK RKRVLTLSGR KLVGEGSAHP SCQVDQCTAD 60
MADAKPYHRR HKVCEFHSKS PIVLISGLQK RFCQQCSRFH LLAEFDDAKR SCRRRLAGHN 120
ERRRKITYDS HGENLG 136
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaattcatg gaaactaaca aatgggaagg g 31
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgctcgagg cccaaatttt ctccatgaga gtc 33

Claims (8)

1.一种番茄果实转录因子CNR多克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)构建含有SEQ ID No：1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得CNR蛋白抗原；
(2)将所述CNR蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得番茄CNR蛋白的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体是将含有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得的。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CNR蛋白抗原含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌Rosetta感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达载体为pET-30a。
6.根据权利要求1、2、3、4和5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，免疫动物的步骤包括3次免疫，首先将纯化的CNR蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫动物，而后将纯化的CNR蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-3次免疫，每次免疫的时间间隔为14天。
7.利用权利要求1-6中任意一项所述的方法制备的番茄CNR蛋白多克隆抗体。
8.权利要求7所述的番茄CNR蛋白多克隆抗体的应用。
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