CN105177016A - 抗氯霉素scFv的抗体基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗氯霉素scFv的抗体基因及应用，涉及特异性单链抗体基因的筛选、特异性单链抗体基因的序列测定、单链抗体的制备、抗体的活性测定，该抗体基因包含编码重链可变区(117个氨基酸)、柔性链接区(15个氨基酸)和轻链可变区(108个氨基酸)的核苷酸序列，如序列表SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示，将该抗体基因与碱性磷酸酶进行融合表达后，获得了具有活性的单链抗体，活性检测结果显示该抗体对氯霉素的检测灵敏度为2.97(g/kg。该抗体在氯霉素的检测中具有重要的应用价值。

Description

抗氯霉素scFv的抗体基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域和免疫学检测领域，具体涉及一种抗氯霉素scFv的抗体基因及应用。

技术背景

氯霉素是一种广谱抗生素，最早是从土壤中的委内瑞拉放线菌中发现的，但现在主要靠化学合成的手段生产。氯霉素不仅能够有效的作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，对立克次氏体、支原体和衣原体也具有抑制作用。该药的抑菌机理，是通过与细菌的核糖体50s亚基的可逆结合，阻止氨基酰-tRNA与核糖体结合，抑制肽酰基转移酶的作用，从而达到抑菌、杀菌的效果。由于氯霉素价格便宜且药效显著，因此在畜牧业生产中被广泛用于治疗败血症、肺、消化***及泌尿***感染。在水产养殖领域，由于氯霉素的广谱、高效的杀菌能力，也曾广泛地用于治疗气一单胞菌等引起的鱼类疾病。自1949年氯霉素应用于临床后，在一些感染性疾病，尤其是伤寒流行中取得良好疗效，但也于1950年发现本品可造成严重致死性血液***毒性。

目前，越来越多的国家都开始高度重视氯霉素兽药的残留问题。欧盟、美国等均在相关法规中限定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，日本于2006年实施的《肯定列表制度》中关于氯霉素的残留量也规定为不得检出，为此，我国农业部己将氯霉素从2000年的《中国兽药典》中删除，而《动物性食品兽药残留规定》中则明确规定氯霉素在食品当中不得检出，一旦发现其残留量超标，一律禁止出口。农业部公告第193号(2002-4-27)发布的《食品动物禁用兽药及其化合物清单》中，将氯霉素列为禁用药。

因为这类抗生素的含量极微，因此要求高度灵敏的检测技术。已报道的氯霉素残留量测定方法有气相色谱(GC)法、酶联免疫吸附(ELISA)等。GC法使用高灵敏度的电子捕获检测器，因而对样品的净化要求严格，并增加了分析流程时间。这就迫切需一种新的快速检测的方法；普通的酶联免疫法虽灵敏度高、样品容量大，却存在实验动物需量大、饲养周期长，不同动物个体对农兽药敏感程度不同，造成抗体差异大等问题；单克隆抗体作为第二代抗体，由于制备和筛选过程繁琐，且对操作技术要求很高，克隆后的细胞遗传容易不稳定等原因，不利于广泛应用。

基因工程抗体的优势表现在节省实验动物及饲养时间、技术简便、易于投入生产、遗传信息具有可操作性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种针对性强、稳定性高、制备方便的抗氯霉素的scFv抗体及编码该抗体的基因序列。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种抗氯霉素scFv的抗体基因，其包括重链基因和轻链基因，该基因由714个核苷酸组成，所述重链基因的序列见序列1，轻链基因的基因序列见序列2。

由抗氯霉素scFv的抗体基因编码的抗氯霉素scFv的抗体。

而且，重链可变区由117个氨基酸组成，柔性链接区由15个氨基酸，轻链可变区由108个氨基酸组成。

含有抗氯霉素scFv的抗体基因的载体。

含有抗氯霉素scFv的抗体基因的基因工程菌。

含有抗氯霉素scFv的抗体基因的基因工程菌或含有抗氯霉素scFv的抗体基因的载体在制备抗氯霉素scFv抗体中的应用。

一种氯霉素抗体基因重链可变区和轻链可变区的筛选方法，步骤如下

⑴将抗体基因的重链可变区、轻链可变区进行PCR扩增，与T载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆后进行大规模测序，利用序列比对软件对测序后的结构进行序列比对分析；

⑵将氯霉素单克隆抗体进行酶解，获得Fab水解片段，并将水解后的重链和轻链分别进行质谱鉴定；

⑶将大规模测序结果转换为氨基酸序列，与质谱鉴定结果所获得的氨基酸片段进行序列比对分析，从测序结果中筛选与质朴鉴定结果一致的序列，从而获得目标抗体基因的重链可变区和轻链可变区。

本发明的优点和积极效果：

(1)本申请通过查阅大量NCBI数据设计了兼并引物，该引物能全面地覆盖鼠源抗体重链和轻链的多样性，尤其是轻链引物除了包括一般的kappa轻链引物，还包括了lambda轻链引物，以防止部分目的基因的丢失。

(2)本发明选用杂交瘤细胞作为制备抗氯霉素scFv抗体的基因来源，省去了免疫、饲养动物带来的繁琐，针对性更强；

(3)本发明建立了一种新的、可靠性强的获得特异性抗体基因的方法，将抗体的质谱鉴定和大规模测序相比对，从而获得目标抗体基因；

(4)本发明的制备方法节省时间、技术简便、易于发展下游生产、遗传信息可操作且稳定。

附图说明

图1为氯霉素抗体可变区的扩增。图中1：VL片段；2：VL片段；M：DNAMarkerDL2000。

图2为氯霉素Fab的检测。图中M：ProteinMolecularWeightMarker；1、2、3：纯化后的氯霉素Fab。

图3为轻链可变区测序结果与质谱的比对。图中Sequence为VL的氨基酸序列，1、2、3、4为质谱测序结果。

图4为重链可变区测序结果与质谱的比对。图中Sequence为VH的氨基酸序列，1、2、3、4、5、6为质谱测序结果。

图5为单链抗体基因(scFv)的扩增。1、2：scFv；M：DNAMarkerDL2000。

图6为PCR筛选scFv-pMD18-T阳性克隆。1-18：PCR筛选结果；M：DNAMarkerDL2000。

图7为PCR筛选重组表达质粒。M：DNAMarkerDL2000；1-10：PCR筛选结果。

图8为重组表达质粒的酶切验证。M1：DNAMarkerDL2000；M2：DNAMarker1kb；1-4：重组表达质粒的酶切。

图9为氯霉素单链抗体的诱导表达。M：标准蛋白分子量；1：CAPscfv-pLIP6/GN-BL21诱导前；2、3、4、5、6：CAPscfv-pLIP6/GN-BL21不同克隆菌株诱导后

图10为单链抗体表达形式的检测。M：ProteinMolecularWeightMarker；1：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号诱导前；2：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号诱导后；

3：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号破碎后上清；4：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号破碎后沉淀；

5：CAPscfv-pLIP6/GN-BL215号诱导后；6：CAPscfv-pLIP6/GN-BL215号破碎后上清；

7：CAPscfv-pLIP6/GN-BL215号破碎后沉淀。

图11为单链抗体纯化后的检测。M：ProteinMolecularWeightMarker；1：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号诱导前；2：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号诱导后；2：CAPscfv-pLIP6/GN-BL211号纯化后。

图12为单链抗体的活性检测。

具体的实施方式

为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

为了实现本发明目的，申请人利用重组DNA技术，将针对氯霉素具有广谱特异性的鼠源杂交瘤细胞株10A3B6E的抗体重链、轻链可变区基因进行体外扩增，经过大量测序后，将测序结果与Fab形式抗体的质谱结果进行序列比对，筛选出目标基因。

本发明利用融合表达技术，获得了具有氯霉素特异识别活性的单链抗体(scFv)。经过重叠延伸PCR，用15个氨基酸(氨基酸序列(GGGGS)₃，基因序列GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG))组成的柔性连接肽将筛选到的重链、轻链连接成scFv抗体基因片段，并将所得的scFv基因片段***到pLIP6/GN表达载体上，构建重组质粒并化学转化至表达型宿主菌中，获得了融合表达的抗氯霉素scFv抗体。

本发明还提供了氯霉素抗体基因重链可变区和轻链可变区序列，分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；以及scFv重链、轻链的氨基酸序列，如序列18和序列19。

本发明还提供了借助NCBI设计的兼并引物，用于扩增上述基因。其中轻链扩增引物除了常用的kappa链引物还引入了lambda链引物，以覆盖抗体可变区的多样性。

本发明还提供了含有上述基因的载体和载体的宿主细胞。本发明还提供了上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞在制备抗氯霉素scFv抗体中的应用。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中使用的试剂材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

以下实施例中由于氯霉素通用半抗原在合成时简称为CAP，所以以下相应细胞、基因、菌种等提到有关了氯霉素时均简称为CAP。

实施例1：CAP单克隆细胞总RNA的提取及cDNA的合成

1、CAP单克隆细胞株10A3B6E总RNA的提取

取通过本实验室筛选得到的新鲜单克隆细胞株10A3B6E，利用QigenRneasyMiniKit提总RNA，细胞株10A3B6E可产生抗CAP的单克隆抗体。

⑴培养细胞至3-4×10⁶个，300×g离心5min，移去上清；

⑵配制裂解液：BufferRLT:β-巯基乙醇＝1ml:10μl；

⑶向离心后的细胞中加入350μlBufferRLT裂解缓冲液，轻弹管壁，用移液枪吹打，使缓冲液与细胞充分接触；

⑷加入同等体积的70％的乙醇溶液，移液枪轻轻吸打混匀，注意不要离心；

⑸取QigenRneasyMiniKit中的硅胶柱，装入2ml收集管上，转移所有的样品到柱子中，室温下12000rpm离心15s，弃去废液；

⑹加入700μlBufferRW1到柱中，室温下12000rpm离心15s，弃去流出液；

⑺加入500μl用乙醇稀释的RPE缓冲液，洗涤柱子，10000rpm，离心15s，弃上清；

⑻加入500μlRPE缓冲液移入柱子，轻盖盖子，室温下10000rpm，离心2min，冲洗柱子；

⑼把柱子放入一个试剂盒提供的新2ml收集管中，全速离心1min；

⑽把柱子转移到QigenRneasyMiniKit提供的1.5ml离心管中，取50μl的无RNA酶水(试剂盒提供)小心悬空滴加到柱子的膜上，静置3-5min，轻轻盖上盖子，室温下10000rpm离心1min，洗脱RNA；

⑾洗脱的RNA分装、标记后，冻存于-80℃。

2、CAP-cDNA的合成

⑴添加以下组分到1.5ml离心管：

⑵合好盖，将离心管放入70℃水浴5min，然后立即放到冰上，至少5min，离心10s收集浓缩物保持原始体积，一直放冰上；

⑶准备反转录体系，各组分一直放冰上；

⑷上一步准备的反应体系与第一步的反应体系混合，终体积20μl；

⑸退火：25℃，5min；

⑹延伸：42℃，1h；

⑺分装，-80℃冻存。

实施例2：CAP-scFv表达质粒的构建

1、PCR扩增V_H、V_L

所用引物：(VL后引物和scFv后引物为引物在使用时均为等量使用)

其中K为kappa引物，L为lambda引物，用kappa前引物也能扩增lambda链，所以没有单独的lambda前引物。

PCR体系(50μl):

PCR程序：

经PCR扩增，产物利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

2、利用Qiagen凝胶纯化试剂盒胶回收目的片段

⑴准备干净的离心管，称重；

⑵用干净的刀片切下琼脂糖凝胶上的目的片段，放入离心管中；

⑶称重，计算切下的胶重量，加入3倍体积的BufferQG到1倍体积凝胶中；

⑷50℃孵育，10min，直至胶完全溶解，每隔2-3min颠倒一次；

⑸胶完全溶解后，检查溶液颜色是否为黄色，如溶液颜色成橘黄色或紫色，加10ul3M醋酸钠混匀；

⑹加一倍凝胶体积异丙醇到溶液中，混匀(100mg-100ul异丙醇)；

⑺将试剂盒中的硅胶柱子放到2ml收集管；

⑻结合DNA：将溶液加到柱子上，离心1min，13000rpm(溶液体积超过800ul再离心一次)；

⑼倒尽流出液，将柱子再放回到离心管中；

⑽加0.5mlBufferQG到柱子上，离心1min，13000rpm；

⑾洗脱：倒尽流出液，加入750ulBufferPE到柱子上，离心1min；

⑾倒尽流出液，离心1min，13000rpm；

⑿将柱子放到一个干净的1.5ml离心管；

⒀洗提DNA，加50ulBufferEB或pH为7.0-8.5水到膜中间，离心1min；

3、利用eppendorfBio-PhotoMeterplus测定V_H和V_L浓度

4、序列的测定与分析

(1)抗体的质谱鉴定

将氯霉素单克隆抗体进行纯化，利用木瓜蛋白酶进行水解后，利用ProteinA吸附抗体恒定区，获得纯化的Fab，利用SDS-PAGE进行检测(图2)，分别将重链和轻链切割下来进行质谱鉴定。

(2)抗体基因可变区的序列测定

将重链可变区和轻链可变区连接到T载体中，进行规模化测序，每种片段测序20-30个克隆，将测序获得的核酸序列翻译成氨基酸序列，与质谱测序结果，进行比对(图3、4)。根据比对结果，选择与质谱测序结果最相近的V_H15号和V_L1号继续后续实验。

5、CAP-scFv合成

(1)预拼接体系：

PCR程序：

所得PCR产物用于scFv的正式拼接。

(2)scFv正式拼接体系

PCR程序：

经PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。切取约750bp左右的目的条带，用Qiagen凝胶纯化试剂盒胶回收，eppendorfBio-PhotoMeterplus测定浓度，-20℃保存。

6、亚克隆实验

A.scFv连接pMD18-Tvector

连接体系：

16℃连接16h。

B.连接产物转化JM109感受态细胞

(1)将100μLJM109感受态细胞放置冰上解冻。

(2)将连接产物10μL加入到50μL感受态细胞中，轻轻混匀后放置冰上30min。

(3)将混合物42℃水浴60s，然后迅速放置冰上冷却2min，注意不可晃动。

(4)加入800μLLB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h。

(5)5000rpm，离心5min，倒掉培养基，大约留100μL涂布含有抗生素Amp的LB固体培养基平板上，37℃生长过夜。

C.验证阳性克隆

挑取Amp平板上的单克隆菌落于10μL无菌水中重悬，用M13通用引物做菌落PCR实验。结果见图6。

(1)PCR体系：

(2)PCR扩增程序：

(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

D.获得重组质粒scFv-pMD18-T

(1)挑取Amp平板上的单克隆，转接到LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。

(2)天根质粒小提试剂盒提取重组质粒scFv-T，步骤如下：

①柱平衡步骤：将吸附柱放入收集管，向吸附柱中加入500μL平衡液BL，13000rpm离心1min，吸弃收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。

②取1-5mL过夜培养的菌液，加入到离心管中，13000rpm离心1min，尽量吸弃上清，菌液较多，可分多次离心后将菌体收集到同一离心管中。

③向含有菌体沉淀的离心管中加入250μLBufferP1(BufferP1在使用之前要确保已加入RNaseA)，使用移液器吹打或涡旋彻底悬浮细菌沉淀，如果菌体为彻底混匀，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

④继续向离心管中加入250μLBufferP2，上下翻转混匀6-8次，操作要温和，确保菌体充***解，此时菌液会变得清亮粘稠，所用时间不要超过5min，以免质粒受到损伤。

⑤向离心管中加入350μLBufferP3，立即温和地上下翻转6-8次，此时会出现白色絮状沉淀，13000rpm离心10min。

⑥小心吸取上清，注意不要吸到沉淀，将上清加入到吸附柱中

⑦13000rpm离心1min，吸弃收集管中废液，吸附柱放回收集管。

⑧向吸附柱中加700μLBufferPW(BufferPW使用之前要加入无水乙醇)，13000rpm离心1min，吸弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑨向吸附柱中加入500μLBufferPW(请检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心1min，吸弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管。

⑩13000rpm离心2min，吸弃收集管中废液。将吸附柱开盖置于室温10min，以彻底晾干吸附膜上残余的BufferPW。

⑾取吸附柱放置于干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL无菌水，室温放置1-2min，13000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存质粒。

7、CAP-scFv-pLIP6/GN表达质粒的构建

A.scFv-pMD18-T重组质粒与pLIP6/GN空质粒的双酶切。

(1)用限制性内切酶SfiI酶切scFv-T，酶切体系如下：

50℃水浴温育过夜。

(2)用限制性内切酶NotI继续酶切scFv-T，将上一步酶切体系取

出水浴锅，冷却至室温，向体系中加入1μLNotI，37℃水浴温育1.5h。

(3)scFv连接pLIP6/GN

连接体系：

16℃连接16h。

B.连接产物转化JM109感受态细胞

(1)将100μLJM109感受态细胞放置冰上解冻。

(2)将连接产物10μL加入到50μL感受态细胞中，轻轻混匀后放置冰上30min。

(3)将混合物42℃水浴60s，然后迅速放置冰上冷却2min，注意不可晃动。

(4)加入800μLLB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h。

(5)5000rpm，离心5min，倒掉培养基，大约留100μL涂布含有抗生素Amp的LB固体培养基平板上，37℃生长过夜。

C.验证阳性克隆

(1)菌落PCR验证

①挑取Amp平板上的单克隆菌落于10μL无菌水中重悬，用phoA通用引物做菌落PCR实验。

②PCR体系：

③PCR扩增程序：

④琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果见图7。

(2)酶切验证

提取菌落PCR验证为阳性的单克隆的质粒，用SfiI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。结果见图8。

(3)测序

验证正确的菌种接种于LB-Amp中过夜培养。菌液送至北京金维智生物公司测序，所用引物为phoA。最后利用MEGA5软件将测序结果同已知的V_H15号、V_L1号和Linker序列进行对比，scFv基因序列一致的菌株即为CAPscFv-pLIP6/GN-BL21菌株。

实施例3：CAP-scFv-pLIP6/GN表达载体的重组表达

1、BL21(DE3)感受态细胞的制备

(1)将-80℃保存的BL21(DE3)菌种在LB固体平板上划线，37℃倒置培养过夜。

(2)挑取单克隆，接种于5mLLB液体培养基中，37℃，180rpm，培养过夜。

(4)取100μL过夜培养的菌液，转接至100mLPsi培养基中，37℃振荡培养3h左右，至OD600为0.4-0.5左右。

(5)将菌液转至100mL无菌离心管中，冰上放置30min。4℃，4000rpm离心3min。

(6)弃上清，加入80mLtfbⅠ，用移液器轻轻吹打，充分重悬细胞，置于冰上20min。4000rpm4℃离心3min。

(7)弃上清，加入10mLtfbⅡ，用移液器轻轻吹打，充分重悬细胞，置于冰上20min。在冰盒上100μL分装，液氮速冻，存于-80℃冰箱备用。

2、表达菌株的制备

将6个重组质粒CAPscFv1、2、3、4、5、6-pLIP6/GN分别转入表达菌大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。挑取转化平板上生长的单克隆，接种于LB-Amp培养基中进行37℃过夜培养。

3、诱导表达及SDS-PAGE检测

A.CAPscFv-pLIP6/GN-BL21的诱导表达

取50μL过夜培养的菌液，按1:100比例转接到新的5mLLB培养液(含100μg/mLAmp)中，培养3h左右，至OD600达到0.8-1.0时加入IPTG至终浓度为0.1mM，25℃180rpm培养过夜，进行scFv诱导表达。

B.进行超声破碎和SDS-PAGE检测。

为了检测CAPscFv在大肠杆菌BL21(DE3)中是否能进行正常表达，利用SDS-PAGE进行检测，并探究了目的蛋白的表达位置及是否形成包涵体。SDS-PAGE步骤如下：

(1)样品前处理

取诱导前的500μL菌液，5000rpm离心5min，取200μL用PBS重悬，作为诱导前对照；剩余4.5mL诱导后培养物，5000rpm离心5min，去上清，菌体用2.5mLPBS进行重悬。取其中500μL菌液保存于4℃，即诱导后全蛋白。剩余2mL在冰水混合物中进行超声破碎。条件：超声1s、间歇3s，全程99次，功率250W。

将超声破碎的菌液在4℃，13000rpm离心8min，收集上清和沉淀，沉淀用2mLPBS重悬。分别取15μL诱导前后菌液、破碎上清和沉淀于PCR管中，加入12μL2×SDS-PAGE上样缓冲液和3μLβ-巯基乙醇，混匀，用沸水煮5min，备用。

(2)聚丙烯酸胺凝胶的制备：

12％分离胶：水1.6mL，30％丙烯酰胺2mL，1.5MTris-HCl(pH＝8.3)1.3mL，10％SDS50μL，10％过硫酸铵50μL，TEMED4μL。各组分添加后迅速混匀，加入组装好的制胶板中，待加到胶板约2/3高度时，在其上层用异丙醇封住，封至整个胶板顶端。室温放置1h左右(视室温而定)，将胶板整体倾斜，观察是否凝固，若凝固去除异丙醇，用滤纸吸干，取干净的梳子***制胶板缝隙。

6％浓缩胶：水1.4mL，30％丙烯酰胺0.33mL，1.5MTris-HCl(pH＝6.8)0.25mL，10％SDS20μL，10％过硫酸铵20μL，TEMED4μL。各组分添加后立即混匀，沿着梳子缝隙灌胶，到胶快装满时轻轻压下梳子，赶走气泡，室温放置40min。轻轻晃动梳子，观察浓缩胶是否凝固，待凝固后拔去梳子，即完成制胶过程。

(3)SDS-PAGE：

按照电泳仪说明书将凝胶板固定在支架上，放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液。负极处加电泳液至没过上样孔，正极处至没过正极，用上样针将3个菌体的诱导前、后，破碎上清、沉淀样品依次加入上样孔中，各15μL。在样品左侧上10μL蛋白Marker。将电泳装置与电源连接，先用80V电压将溴酚蓝条带跑过浓缩胶和分离胶的交界处，然后用100V电压跑胶至溴酚蓝条带离胶板底部0.5cm处，停止电泳。

(4)染色和脱色

电泳完毕后将装置小心拆卸，凝胶置于200mL考马斯亮蓝R-250染色液中染色，室温轻摇过夜。转天，将凝胶用无菌水冲洗干净，脱色两次。每次用100mL脱色液(甲醇7mL，乙醇30mL，水63mL)脱色10min，至条带清晰后利用成像仪成像。结果见图9、10。

C.纯化CAPscFv抗体

用Ni-NTA柱纯化超声破碎后的上清。步骤如下:

(1)所用试剂在使用之前均需超声15分钟，以去除溶液中的气泡。

(2)10mL1*BindBuffer缓慢加入柱子中，4℃下静置30分钟。

(3)打开两端的塞子，让液体缓慢流出，加入超声破碎后的上清液5mL，4℃下静置60分钟。

(4)打开两端的塞子，让液体缓慢流出，加入10mL1*washingbuffer，收集流出液。

(5)加入4mL1*elutionbuffer，收集流出液。

D.SDS-PAGE检测纯化后的蛋白。结果见图11。条带单一的泳道对应的蛋白样品在4℃下，用PBS透析3天。

实施例4：间接竞争ELISA检测CAPscFv

利用间接竞争ELISA对纯化后的CAPscFv活性进行初步鉴定。包被原为CAP-OVA，封闭液为0.5％的乳粉，氯霉素作为标准品。计算IC50值。间接竞争ELISA步骤如下：

(1)包被：取CAP-OVA，0.1μg/孔包被96孔酶标板12-16h。

(2)洗板：倾去包被液，PBST洗3次，拍干。

(3)封闭：每孔加入200μL，0.5％的乳粉，37℃封闭1h。

(4)洗板：倾去封闭液，PBST洗3次，拍干。

(5)向酶标板中分别加入标准品50μL。

(6)加抗体：将纯化后的CAPscFv稀释6倍，取50μL加入到各浓度标准品的酶标板中，37℃孵育1h。

(7)洗板：倾去scFv抗体上清液，PBST洗4次，拍干。

(8)显色：加AP显色底物pNPP，100μL/孔，37℃显色20min。

(9)终止：加3MNaOH终止液，50μL/孔，在405nm波长下用酶标仪读取OD₄₀₅数值。

经过间接竞争ELISA，CAPscFv用PBS稀释6倍，显色20min。ELISA结果如下：

氯霉素标准溶液从500ng/mL向下四倍稀释六个浓度，用间接竞争ELISA法进行测定。根据吸光度值计算抑制率，建立了如图12所示的ELISA方法的标准抑制曲线，由四个点可得到一个线性回归方程y＝15.733ln(x)+32.868(R²＝0.9988)，通过计算得到检测灵敏度(IC50值)为2.97±0.52ng/mL、检测限(IC15值)为0.33±0.11ng/mL，这一检测灵敏度可用于食品样品中氯霉素残留的初步筛查。

Claims (7)

1.一种抗氯霉素scFv的抗体基因，其特征在于：其包括重链基因和轻链基因，该基因由714个核苷酸组成，所述重链基因的序列见序列1，轻链基因的基因序列见序列2。

2.由权利要求1所述基因编码的抗氯霉素scFv的抗体。

3.根据权利要求2所述的抗氯霉素scFv的抗体，其特征在于：重链可变区由117个氨基酸组成，柔性链接区由15个氨基酸，轻链可变区由108个氨基酸组成。

4.含有权利要求1所述的抗体基因的载体。

5.含有权利要求1所述的抗体基因的基因工程菌。

6.权利要求4所述的载体或权利要求5所述的基因工程菌在制备抗氯霉素scFv抗体中的应用。

7.一种氯霉素抗体基因重链可变区和轻链可变区的筛选方法，其特征在于：步骤如下

⑴将抗体基因的重链可变区、轻链可变区进行PCR扩增，与T载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆后进行大规模测序，利用序列比对软件对测序后的结构进行序列比对分析；

⑵将氯霉素单克隆抗体进行酶解，获得Fab水解片段，并将水解后的重链和轻链分别进行质谱鉴定；

⑶将大规模测序结果转换为氨基酸序列，与质谱鉴定结果所获得的氨基酸片段进行序列比对分析，从测序结果中筛选与质朴鉴定结果一致的序列，从而获得目标抗体基因的重链可变区和轻链可变区。