CN110343752A - 一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法 - Google Patents

一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，涉及生物技术领域，所述方法通过体内外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用、分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集、检测组蛋白甲基化/去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号的响应、检测组蛋白去甲基化修饰酶对β‑Catenin与靶基因启动子结合位点的结合能力的影响；根据检测结果判断在PGCs分化过程中，Wnt信号联合组蛋白作用于靶基因的作用机制。利用本发明所述方法对PGCs形成过程中Wnt信号协同组蛋白作用于靶基因进行研究，有利于渗入了解PGCs形成的网络机制。

Description

一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基 因机制的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法。
背景技术
众所周知，Wnt信号通路中β-Catenin和TCFs对靶基因转录的调控主要通过改变染色质状态来实现，而染色质是由细胞核中组蛋白与紧密缠绕其上的DNA组成的核小体经过多级压缩形成的。组蛋白和DNA的动态修饰(表观遗传修饰)影响了染色质的结构致密度，也影响了基因的转录状态，因此我们有理由相信WNT信号可能协同表观遗传因子调控靶基因的转录。但是目前并没有对Wnt信号通路与表观遗传因子是否协同调控靶基因转录的研究方法。
发明内容
本发明提供了一种对Wnt信号通路与表观遗传因子之间是否协同调控靶基因转录的研究方法，本发明所述方法将Wnt信号与表观遗传修饰联系在一起，为PGCs形成的网络调控机制研究提供了新的思路。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，包括以下步骤：
(1)通过体内和体外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用；
(2)通过CHIP-seq分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程所述组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集；
(3)检测所述组蛋白甲基化与去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号通路的响应；
(4)检测所述组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与受组蛋白调控的Wnt信号的转录因子在靶基因启动子结合位点的结合能力的影响，以研究是否存在组蛋白去甲基化修饰酶与Wnt信号转录因子之间的竞争结合关系；
根据步骤(1)～(4)的结果判断在ESCs向PGCs分化过程中，Wnt信号通路联合所述组蛋白作用于靶基因的作用机制。
优选的，步骤(1)所述体外实验的方法，包括以下步骤：
A1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
A2、将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体分别侵染ESCs，侵染48h后以BMP4诱导ESCs向PGCs分化，收集诱导2d、4d、6d后的细胞，检测收集的细胞中的基因表达情况。
优选的，步骤(1)所述体内实验的方法，包括以下步骤：
B1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
B2、分别将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体转入至孵化48～58h的早期胚胎中，继续孵化4.5d后，测定胚胎的生殖组织中靶基因的表达变化。
优选的，若步骤(2)的结果为所述组蛋白在ESCs、PGCs和SSCs三个过程中能在靶基因的启动区差异性富集，则检测组蛋白甲基化以及去甲基化对靶基因启动子区的影响，其方法包括以下步骤：
C1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
C2、在PGCs中分别转染组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体后，利用CHIP-qPCR检测靶基因启动子区组蛋白甲基化状态的变化。
优选的，步骤(3)所述检测方法包括以下步骤：
D1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子全长载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体
D2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子全长载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；
D3、向共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。
优选的，步骤(3)所述的检测方法还包括以下步骤：
E1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体
E2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；
E3、向共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。
优选的，步骤(4)所述检测方法包括以下步骤：
F1、检测组蛋白去甲基化酶与β-Catenin、受组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子之间的互作关系；
F2、检测组蛋白去甲基化酶、β-Catenin对步骤F1所述转录因子在靶基因启动子上结合位点是否存在竞争关系。
优选的，所述组蛋白包括H3K4me2，所述靶基因包括Lin28A/B，受H3K4me2调控的Wnt信号的转录因子包括TCF7L2。
优选的，所述组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体包括LSD1慢病毒干扰载体，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体包括MLL2慢病毒干扰载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，包括以下步骤：通过体内和体外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用、通过CHIP-seq分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程所述组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集、检测所述组蛋白甲基化与去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号通路的响应、检测所述组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与受组蛋白调控的Wnt信号的转录因子在靶基因启动子结合位点的结合能力的影响，以研究是否存在组蛋白去甲基化修饰酶与Wnt信号转录因子之间的竞争结合关系；根据上述检测的结果判断在ESCs向PGCs分化过程中，Wnt信号通路联合所述组蛋白作用于靶基因的作用机制。Wnt信号与组蛋白甲基化均广泛参与多种动物的生物学过程，不仅在生殖细胞形成过程中发挥重要作用，在哺乳动物的发育过程也是必不可少的。利用本发明所述方法对PGCs形成过程中Wnt信号协同组蛋白作用于靶基因进行研究，有利于渗入了解PGCs形成的网络机制。本发明所述方法操作简单、切实可行、应用广泛。
如本发明具体实施例所示，按照本发明所述的方法对鸡ESCs向PGCs分化过程中Wnt信号联合H3K4me2组蛋白作用于靶基因Lin28的机制，结果表明，鸡的PGCs分化过程中Wnt信号通路与表观遗传修饰对靶基因转录的协同调控作用，还验证了在此过程中H3K4me2组蛋白的去甲基化修饰酶LSD1对β-Catenin与TCF7L2结合能力的影响。对鸡PGCs形成过程中Wnt信号协同H3K4me2作用于靶基因机制的研究更有利于深入了解PGCs形成的网络机制。
附图说明
图1为Wnt信号与组蛋白H3K4me2联合作用于靶基因Lin28的作用机制图；
图2为qRT-PCR检测诱导过程中各组细胞Lin28A/B的表达情况；其中，A为诱导不同时间Lin28A的表达变化图；B为诱导不同时间Lin28B的表达变化图；
图3为qRT-PCR检测体内Lin28A/B基因的表达变化图；
图4为ChIP-qPCR检测PGCs中H3K4me2在Lin28A/B的富集情况；其中，A为PGCs中H3K4me2在Lin28A启动子区的富集情况；B为PGCs中H3K4me2在Lin28B启动子区的富集情况；
图5为β-Catenin和TCF7L2编码区扩增产物电泳图；其中，A：β-Catenin编码区扩增产物电泳图M：DL 5000 marker，1：β-Catenin扩增条带；B：TCF7L2编码区扩增产物电泳图，M：DL 5000 marker，1：TCF7L2扩增条带；
图6为oeβ-Catenin和oeTCF7L2-Myc酶切电泳分析图；其中，A：oeβ-Catenin酶切电泳分析；M：DL5000 marker；1：未酶切；2：BamHI+EcoRI双酶切；3：BamHI单酶切；4：ddH2O；B：oeTCF7L2-Myc酶切电泳分析；M：DL5000 marker；1：未酶切2：Xho I；单酶切；3：XhoI+EcoR I双酶切；4：ddH2O；
图7为oeβ-Catenin和oeTCF7L2-Myc载体测序图谱；其中，A：oeβ-Catenin载体测序图谱；B：oeTCF7L2-Myc载体测序图谱；
图8为慢病毒干扰载体质粒与双链oligo测序检测；其中，A：β-Catenin-siRNA 1；B：β-Catenin-siRNA 2；C：β-Catenin-siRNA 3；D：β-Catenin-siRNA 4；E:NC-siRNA；
图9为慢病毒干扰载体侵染DF细胞系(100×)的图；注：4个β-Catenin慢病毒干扰载体和对照载体转染DF148h后，稳定表达绿色荧光；
图10为qRT-PCR检测β-Catenin基因表达水平及干扰效率的图；
图11为Lin28A-PGL3-basic重组载体鉴定及命名；
图12为Lin28B-PGL3-basic重组载体鉴定及命名；
图13为真核表达载体pEGFP-Lin28A和pEGFP-Lin28B的构建；其中，A，Lin28A启动子长片段扩增；M：5000bp Maker；1，Lin28A启动子长片段PCR产物；B，Lin28B启动子长片段扩增；M：5000bp Marker；1，Lin28A启动子长片段PCR产物；C：pEGFP-Lin28A载体测序图；D：pEGFP-Lin28B载体测序图；
图14为Lin28A/B启动子活性检测(100×)；注：pEGFP-N1转染DF1细胞显示大面积荧光；pEGFP-Lin28A和pEGFP-Lin28B转染DF1细胞显示较弱的绿色荧光；Blank不显示绿色荧光；
图15为Lin28A/B基因启动子各缺失片段克隆及重组载体双酶切；其中，A为Lin28A各缺失片段PCR扩增；M:DL5000 Marker；1-4分别为启动子2028bp、1600bp、1162bp、684bp；B为Lin28B各缺失片段PCR扩增；M:DL5000 Marker；1-4分别为启动子1962bp、1530bp、1133bp、591bp；C为Lin28A基因启动子各缺失克隆载体酶切验证；M:DL5000 Marker；1-4分别为pLin28A/2028、pLin28A/1600、pLin28A/1096、pLin28A/684；D为Lin28B基因启动子各缺失克隆载体酶切验证；M:DL5000 Marker；1-4分别为pLin28B/1962、pLin28B/1530、pLin28B/1133、pLin28B/591；
图16为pLin28A重组载体构建测序结果；
图17为pLin28B重组载体构建测序结果；
图18为转录因子TCF7L2结合位点序列图；
图19为转录因子TCF7L2结合位点缺失载体酶切验证；其中，A为pLin28A/684-mut载体酶切凝胶电泳图；M:DL5000 Maker；1：pGL3.0质粒；2：KpnI单酶切；3：KpnI、HindⅢ双酶切；B为pLin28B/1530-mut载体酶切凝胶电泳图M:DL5000 Maker；1：pGL3.0质粒；2：KpnI单酶切；3：KpnI、HindⅢ双酶切；
图20为转录因子结合位点缺失载体测序图谱；其中，A.pLin28A/684-mut测序图谱B.pLin28B/1530-mut测序图谱；
图21为双荧光素报告基因检测不同处理下Lin28A/B启动子活性；其中A为不同处理下Lin28A启动子活性；B为不同处理下Lin28B启动子活性；
图22为双荧光素报告基因检测不同处理下Lin28A/B核心启动子活性；其中，A为不同处理下Lin28A核心启动子活性；B为不同处理下Lin28B核心启动子活性；
图23为免疫共沉淀检测LSD1和β-Catenin之间的相互作用；注：Input：没有用抗体进行COIP；IP:利用β-Catenin抗体或Flag抗体进行COIP；
图24为免疫共沉淀检测LSD1和TCF7L2之间的相互作用；注：Input：没有用抗体进行COIP；IP:利用Myc抗体或Flag抗体进行COIP；
图25为免疫共沉淀检测LSD1、β-catenin和TCF7L2之间的互作关系；注：Input：没有用抗体进行COIP；IP:利用Myc抗体或Flag抗体进行COIP。
具体实施方式
本发明提供了一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，包括以下步骤：
(1)通过体内和体外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用；
(2)通过CHIP-seq分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程所述组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集；
(3)检测所述组蛋白甲基化与去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号通路的响应；
(4)检测所述组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与受组蛋白调控的Wnt信号的转录因子在靶基因启动子结合位点的结合能力的影响，以研究是否存在组蛋白去甲基化修饰酶与Wnt信号转录因子之间的竞争结合关系；
根据步骤(1)～(4)的结果判断在ESCs向PGCs分化过程中，Wnt信号通路联合所述组蛋白作用于靶基因的作用机制。
在本发明中，通过体内和体外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用，若结果为所述组蛋白对Wnt信号通路的靶基因有调控作用，则组蛋白可能能与Wnt信号共同调节靶基因表达；若结果为所述组蛋白对Wnt信号通路的靶基因没有调控作用，则Wnt信号对靶基因的调控不存在组蛋白调控。
在本发明中，所述体外实验的方法，包括以下步骤：
A1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
A2、将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体分别侵染ESCs，侵染48h后以BMP4诱导ESCs向PGCs分化，收集诱导2d、4d、6d后的细胞，检测收集的细胞中的基因表达情况。
在本发明中，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体的构建方法参照论文《组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究》(何娜娜.组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究[D].2018.)进行构建。
在本发明中，所述BMP4诱导用到的培养基包括：在DMEM高糖培养基中添加10％FBS，2.5％鸡血清，2mmol/L谷氨酰胺，0.4μmol/L MEM非必需氨基酸，2mmol/L丙酮酸钠，0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，5ng/mLhSCF，10ng/μLbFGF，10ng/μL鼠LIF，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，40ng/μl的BMP4。在本发明中，所述步骤A2中检测的方法优选为qRT-PCR法。在本发明中，所述DMEM高糖培养基优选为DMEM High Glucose(Gibco)。
在本发明中，所述体内实验的方法，包括以下步骤：
B1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
B2、分别将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体转入至孵化48～58h的早期胚胎中，继续孵化4.5d后，测定胚胎的生殖组织中靶基因的表达变化。
在本发明中，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体的构建方法如体外实验部分所示，在此不再赘述。
在本发明中，所述步骤B2中同时设置阴性对照进行对比，所述阴性对照是指靶基因中不存在的序列，参照论文《组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究》(何娜娜.组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究[D].2018.)进行设计即可。在本发明中，所述步骤B2中检测的方法优选为qRT-PCR法。
在本发明中，通过CHIP-seq分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程所述组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集；若所述检测的结果为组蛋白在ESCs、PGCs和SSCs三个过程的靶基因启动子区差异性富集，则表明组蛋白可能能与Wnt信号共同调节靶基因表达；若所述检测的结果为组蛋白在ESCs、PGCs和SSCs三个过程的靶基因启动子区并非差异性富集，则表明Wnt信号对靶基因的调控不存在组蛋白调控。在本发明中，差异性富集是指在ESCs和PGCs以及SSCs阶段中显著高富集的阶段。
在本发明中，所述CHIP-seq分析的方法具体包括以下步骤：
步骤一：细胞交联与破碎
将各组达到1×107个的细胞收集于15ml离心管中，加10ml培养基悬浮，加入625μL16％甲醛，混匀，室温孵育10min进行交联；
加1ml 10×Glycine，混匀，室温孵育5min终止交联，4℃700g离心5min，收集各组细胞沉淀；
加10ml预冷的PBS洗涤细胞，4℃700g离心5min，弃滤液；重复(3)步骤；
将各组细胞沉淀重悬于1ml SDS Lysis Buffer(包含5μL Protease InhibitorCocktail II)；
准备1.5ml离心管，每管细胞裂解300～400μL，以30％功率，破碎5s，间歇10s，共5min条件下超声波破碎；破碎产物4℃15000g离心10min，去除不溶物质，将上清转至新的离心管中。
步骤二：交联蛋白/DNA的免疫沉淀
IP实验分组：每个处理样本各分2组，分别：阴性对照组(IgG组)和目的抗体组(组蛋白组)，每组包含100μL细胞破碎产物，并于冰上放置；
每个IP需要添加900μL Dilution Buffe(包含4.5μL Protease InhibitorCocktail II)；
加60μL Protein GAgarose，4℃旋转孵育1h，用于预清除非特异性结合的蛋白质(注意Protein G Agarose要混匀)；5000g离心1min，沉淀琼脂糖；
收集上清至新的离心管中，每组取10μL上清液作为Input组，在4℃保存；用于步骤三；
将免疫沉淀抗体加入到上清液中，4℃旋转过夜孵育，其中IgG抗体1μg/组；组蛋白抗体10μg/组；
加60μL Protein G Agarose，4℃旋转孵育1h，用于收集抗体/DNA复合物，5000g离心1min，除去上清部分，留下沉淀Protein G Agarose；
Low Salt Immune Complex Wash Buffer，4℃旋转孵育5min；
High Salt Immune Complex Wash Buffer，4℃旋转孵育5min；
LiCl Immune Complex Wash Buffer，4℃旋转孵育5min；
TE Buffer，4℃旋转孵育5min；重复(10)。
步骤三蛋白质/DNA复合物洗脱
制备洗脱缓冲液Elution Buffer：对于每组，准备200μL的Elution Buffer包含10μL 20％SDS，20μL 1M NaHCO3和170μL ddH20，根据分组数量，可配置混合液；
对于Input组，各加入200μL Elution Buffer并置于室温下，用于步骤四；
对于含有抗体/琼脂糖复合物的IP组，每个管中加入100μL L Elution Buffer。通过轻弹混合，在室温下孵育15min，5000g，离心1min沉淀琼脂糖，并将上清液收集到新的离心管；重复步骤上述步骤，各组合并洗脱液至总体积为200μL。
步骤四：蛋白质/DNA复合物与游离的DNA解交联
向所有IP和Input中各加入8μL 5M Nacl，65℃过夜孵育；
各管中各加1μL RNase A37℃孵育30min；
各管加入4μL 0.5M EDTA，8μL 1M Tris-Hcl，1μL Proteinase K，45℃2h。
步骤五离心柱纯化回收DNA
将所有试管中各加1ml Bind Reagen A，充分混合；
移至吸附柱(吸附柱放入收集管中)，15000g离心30s，弃滤液；
重复(2)步骤，直至混合物全部过滤至吸附柱上；
空离，15000g离心30s，吸附柱放入新的离心管中，晾干；
向吸附膜中间加入50μL ddH20，15000g离心30s，即可进行ChIP-qPCR或-20保存。将ChIP富集的DNA进行qPCR检测各组组蛋白和β-Catenin启动子片段的相对表达情况。
在本发明中，若CHIP-seq分析的结果为所述组蛋白在ESCs、PGCs和SSCs三个过程中能在靶基因的启动区差异性富集，则优选的进一步检测组蛋白甲基化以及去甲基化对靶基因启动子区的影响，其方法包括以下步骤：
C1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
C2、在PGCs中分别转染组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体后，利用CHIP-qPCR检测靶基因启动子区组蛋白甲基化状态的变化。
在本发明中，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体的构建方法如体外实验部分所示，在此不再赘述。在本发明中，步骤C2的CHIP-qPCR检测方法与步骤(2)相同，在此不再赘述。
在本发明中，检测所述组蛋白甲基化与去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号通路的响应；若检测结果为组蛋白甲基化与去甲基化影响靶基因对Wnt信号通路的响应，则说明组蛋白甲基化的水平变化能够影响靶基因对Wnt信号的响应，组蛋白甲基化可能协同Wnt信号调节靶基因表达；若检测结果为组蛋白甲基化与去甲基化不影响靶基因对Wnt信号通路的响应，则靶基因的表达不受组蛋白甲基化调控。
在本发明中，所述检测方法优选的包括以下步骤：
D1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子全长载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体
D2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子全长载体以总质粒:转染试剂Fμgene＝1μg:3μL转染，同时保证载体总量与pRL-SV40的质量比为30:1。共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；
D3、向共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。
在本发明中，所述β-Catenin过表达载体的构建方法优选的包括以下步骤：根据β-Catenin的基因序列进行引物设计，以待测动物的生殖器官cDNA为模板进行PCR扩增，得到β-Catenin片段。将扩增得到的β-Catenin片段连接到质粒载体上，得到β-Catenin过表达载体。在本发明中，所述PCR扩增的条件优选的包括：98℃3min；98℃25s、64℃30s、72℃1min，35个循环；72℃7min。
在本发明中，所述靶基因启动子全长载体的构建方法包括以下步骤：将靶基因启动子全长基因与表达载体连接，得到靶基因启动子全长载体。
在本发明中，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体的构建方法如体外实验部分所示，在此不再赘述。
进一步优选的，所述的检测方法还包括以下步骤：
E1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体
E2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；
E3、向共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。
在本发明中，所述步骤E1～E3中，除了靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体的构建外，其余步骤的条件均与步骤D1～D3相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体的构建方法优选的包括以下步骤：
G1、利用双荧光素酶报告基因检测***筛选靶基因的启动子的核心区域；
G2、将所得启动子核心区域的基因片段与载体连接，得到靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体。
在本发明中，所述以双荧光素酶报告基因检测***筛选靶基因的启动子的核心区域的方法，包括以下步骤：
S1、预测靶基因5’UTR区域前2000bp的片段进行引物设计，设计缺失不同启动子片段的上游引物，再设计一个下游引物，分别利用设计的各上游引物和下游引物对动物基因组进行PCR扩增，得到缺失不同片段的靶基因启动子序列，再连接到含有荧光素酶报告载体上，得到缺失不同片段的靶基因启动子载体；
S2、将缺失不同片段的靶基因启动子载体与pRL-SV40共转染DF1细胞，转染48h后，检测荧光素酶相对活性，计算缺失不同片段的靶基因启动子的活性高低，确定靶基因的启动子TCF7L2结合位点的核心区域。
在本发明中，所述含有荧光素酶报告载体优选为pGL3-basic。在本发明中，所述步骤S2中共转染时，缺失片段的靶基因启动子载体与pRL-SV40的质量比优选为30:1。
在本发明中，所述步骤S2中，启动子的活性值为荧光素酶相对活性值，即双荧光素酶报告基因检测***中的萤火虫荧光素酶活性值与海肾荧光素酶活性值之比。
在本发明中，检测所述组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与受组蛋白调控的Wnt信号的转录因子在靶基因启动子结合位点的结合能力的影响，以研究是否存在组蛋白去甲基化修饰酶与Wnt信号转录因子之间的竞争结合关系；添加组蛋白去甲基化修饰酶后，β-Catenin对靶基因的启动活性减少，说明组蛋白甲基化修饰酶会影响β-Catenin对靶基因的调节，反之，组蛋白去甲基化酶不影响β-Catenin对靶基因的调节。
在本发明中，所述检测方法具体的包括以下步骤：
F1、检测组蛋白去甲基化酶与β-Catenin、受组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子之间的互作关系；
F2、检测组蛋白去甲基化酶、β-Catenin对步骤F1所述转录因子在靶基因启动子上结合位点是否存在竞争关系。
在本发明中，步骤F1所述检测的方法，优选的包括以下步骤：
H1、检测受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子在靶基因启动子上的结合位点附近，是否发生组蛋白的动态修饰；
H2、若步骤H1检测结果为在所述结合位点附近发生组蛋白的动态修饰，则通过CO-IP检测β-Catenin、所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子以及组蛋白去甲基化酶之间的互作关系；
若步骤H1检测结果为在所述结合位点附近未发生组蛋白的动态修饰，则说明Wnt信号转录因子对靶基因的调节不受组蛋白调控。
在本发明中，步骤H2所述CO-IP检测的方法，优选的包括以下步骤：
J1、构建带有flag标签的组蛋白去甲基化酶过表达载体、带有Myc标签的受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子过表达载体和β-Catenin过表达载体；
J2、将步骤J1构建的组蛋白去甲基化酶过表达载体和β-Catenin过表达载体分别和共同转入DF1细胞，各细胞培养48h后，提取蛋白，得到组蛋白去甲基化酶抗体、β-Catenin抗体和组蛋白去甲基化酶与β-Catenin的复合抗体；
J3、Western Blot法检测组蛋白去甲基化酶抗体、β-Catenin抗体和组蛋白去甲基化酶与β-Catenin的复合抗体是否能够与其相应的抗原共沉淀；
J4、将步骤J1构建的组蛋白去甲基化酶过表达载体和转录因子过表达载体分别和共同转入DF1细胞，各细胞培养48h后，提取蛋白，得到组蛋白去甲基化酶抗体、转录因子抗体和组蛋白去甲基化酶与转录因子的复合抗体；
J5、采用CO-IP检测组蛋白去甲基化酶抗体、转录因子抗体和组蛋白去甲基化酶与转录因子的复合抗体是否能够与其相应的抗原共沉淀；
根据步骤J3和J5的检测结果判断β-Catenin、所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子以及组蛋白去甲基化酶之间的互作关系。
在本发明中，F2、检测组蛋白去甲基化酶、β-Catenin对步骤F1所述转录因子在靶基因启动子上结合位点是否存在竞争关系。
在本发明中，步骤F2所述检测的方法，优选的包括以下步骤：
K1、构建带有flag标签的组蛋白去甲基化酶过表达载体、带有Myc标签的受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子过表达载体和β-Catenin过表达载体；
K2、将步骤K1构建的组蛋白去甲基化酶过表达载体和β-Catenin过表达载体共同转入DF1细胞，得到共转染细胞；
K3、将β-Catenin过表达载体转入共转染细胞，设置空载体作为对照转入共转染细胞，各细胞培养48h，提取蛋白，得到组蛋白去甲基化酶与β-Catenin的复合抗体；
K4、采用CO-IP检测组蛋白去甲基化酶与β-Catenin的复合抗体是否能够与其相应的抗原共沉淀；
根据步骤K4的检测结果判断β-Catenin与组蛋白去甲基化酶在所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的结合位点的作用机制。
本发明所述的靶基因是指受该待研究的组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子在靶基因启动子区有相应结合位点的靶基因。
在本发明中，所述组蛋白为调控表观遗传修饰的组蛋白，所述组蛋白包括但不限于H3K4me2，所述靶基因包括但不限于Lin28A/B，受H3K4me2调控的Wnt信号的转录因子包括但不限于TCF7L2。
在本发明中，所述组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体优选的包括LSD1慢病毒干扰载体，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体优选的包括MLL2慢病毒干扰载体。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
发明人研究表明，Wnt/β-catenin/Tcf7l2的靶基因为Lin28A/B，以此为基础，研究这一调节过程中的组蛋白甲基化的参与。
1.H3K4me2调控Lin28A/B转录的研究
(1)体外验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录
发明人研究表明，组蛋白甲基化酶MLL2(又称为Kmt2d)和组蛋白去甲基化酶LSD1能够调控H3K4me2的甲基化状态，分别利用构建好的MLL2和LSD1慢病毒干扰载体(shMLL2和shLSD1慢病毒载体)进行后续实验，构建方法参照参照论文《组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究》(何娜娜.组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究[D].2018.)的方法进行构建，慢病毒包装由上海吉满公司完成。
将稳定侵染shMLL2和shLSD1慢病毒载体48h后的各组ESCs进行BMP4诱导(在DMEM高糖培养基(Gibco)中添加10％FBS，2.5％鸡血清，2mmol/L谷氨酰胺，0.4μmol/LMEM非必需氨基酸，2mmol/L丙酮酸钠，0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，5ng/mLhSCF，10ng/μLbFGF，10ng/μL鼠LIF，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，40ng/μl的BMP4)，收集诱导2d、4d、6d的各组细胞，采用qRT-PCR检测Lin28A和Lin28B的基因表达情况。
将稳定侵染shMLL2和shLSD1慢病毒载体48h后的各组ESCs进行BMP4诱导，收集诱导2d、4d、6d的各组细胞，采用qRT-PCR检测Lin28A和Lin28B的基因表达情况。结果如图2和表1所示：与BMP4诱导组相比，H3K4me2甲基化(干扰LSD1)0～4天Lin28A和Lin28B表达量由1±0持续上调至1.65±0.057和1.829±0.063，第6dLin28B表达有所下调，但均显著高于BMP4诱导组；而H3K4me2去甲基化(干扰MLL2)，Lin28A和Lin28B表达由1±0持续上调至1.31±0.017和1.152±0.058，但均显著低于BMP4诱导组，说明H3K4me2在体外能正向调控Lin28A/B的转录。
表1不同分组中Lin28A/B基因表达qRT-PCR检测结果
(2)体内验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录
体内通过对孵化48-58h的早期胚胎(13-17HH)在无菌条件下进行血管注射shMLL2和shLSD1慢病毒载体，并设置阴性对照sh(参照论文《组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究》(何娜娜.组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究[D].2018.)进行设计)，待鸡胚正常孵化至4.5d时，分离鸡胚生殖嵴组织，Trizol法提取组织总RNA，反转录成cDNA，以qRT-PCR检测各组Lin28A/B的表达变化。
体内通过对孵化48～58h的早期胚胎(13-17HH)在无菌条件下进行血管注射shMM2和shLSD1慢病毒载体，并设置阴性对照，待鸡胚正常孵化至4.5d时，分离鸡胚生殖嵴组织，Trizol法提取组织总RNA，反转录成cDNA，以qRT-PCR检测各组Lin28A/B的表达变化。结果如图3和表2所示：与对照组(Blank和Control组)相比，H3K4me2去甲基化(干扰MLL2)极显著降低Lin28A和Lin28B的表达(0.53±0.032和0.63±0.041，P<0.01)，而H3K4me2甲基化(干扰LSD1)能极显著提高Lin28A和Lin28B的表达(2.44±0.132和1.84±0.081，P<0.01)。总之，以上结果表明H3K4me2甲基化/去甲基化能促进/抑制Lin28的转录，即Lin28A/B是受H3K4me2调控的靶基因。
表2不同分组中Lin28A/B基因表达qRT-PCR检测结果
2.H3K4me2富集于Lin28A/B的启动子区并差异性调节Lin28A/B转录
本发明通过CHIP-seq结果进行分析发现在ESCs、PGCs、SSCs三个过程中H3K4me2能在Lin28的启动区差异性富集。进一步在PGCs中分别转染shMLL2和shLSD1后进行ChIP-qPCR检测Lin28A/B启动子区H3K4me2甲基化状态的变化。
发明人前期在探究H3K4me2对生殖细胞分化的功能及机制的过程中，对shMLL2和shLSD1转染的SSC进行转录组测序，分析筛选了差异性靶基因Lin28，并进一步在RNA水平进行了验证；此外，通过CHIP-seq实验发现H3K4me2能在Lin28的启动区差异性富集。本发明同样发现在ESCs向SSCs分化过程中，H3K4me2能够正向调控Lin28A/B的mRNA表达，为了进一步验证H3K4me2是否在Lin28A/B启动子区富集，本次实验通过在PGCs中分别转染shMLL2和shLSD1后进行ChIP-qPCR。
结果如图4和表3所示：与Control组相比，干扰MLL2后，H3K4me2在Lin28A启动子富集水平极显著下调至4.16±0.827和5.79±0.325(P<0.01)，在Lin28B启动子富集水平极显著下调至2.24±0.041和0.32±0.025(P<0.01)；干扰LSD1后，H3K4me2在Lin28A启动子富集水平显著上调至19.29±1.18和22.13±2.01(P<0.05)，在Lin28B启动子区富集水平极显著上调至5.49±0.013和10.96±1.42(P<0.01)。该结果进一步证明MLL2和LSD1能够改变H3K4me2在Lin28A/B启动子区的富集水平，说明H3K4me2可能通过差异富集Lin28A/B的启动子区，进而调控这些基因的表达，影响PGCs的形成，作为H3K4me2的修饰酶LSD1、MLL2似乎发挥着不可或缺的作用。
表3不同分组中组蛋白H3K4me2富集的ChIP-qPCR检测结果
3.H3K4me2甲基化/去甲基化影响Lin28A/B对WNT信号的响应
为了探究LSD1和MLL2介导的Lin28A/B启动子区的H3K4me2修饰是否影响Lin28A/B对WNT信号的响应，本发明利用前期构建的β-catenin、TCF7L2过表达载体、Lin28的启动子全长的pGL3-baisc载体和核心启动区的pGL3-baisc载体进行后续实验。
载体构建(β-Catenin过表达和TCF7L2过表达融合载体)
(1)根据NCBI提供的β-Catenin基因(NM_205081.1)CDS序列设计β-Catenin克隆引物F1，R1用于构建β-Catenin过表达载体oeβ-Catenin；根据NCBI提供的TCF7L2基因(NM_001206510.4)CDS序列设计TCF7L2克隆引物F2，R2，其中在下游引物中突变终止密码子用于构建TCF7L2融合表达载体Myc-TCF7L2(表4)
表4载体构建引物设计
注：下划线为酶切位点，小写字母是载体同源臂
(2)利用限制性内切酶BamHI、EcoR I和Xho I、EcoR I分别对真核表达载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-Myc进行双酶切消化。酶切体系：l载体1ug，限制性内切酶各1μL，10×Buffer 2μL，ddH20补足至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，将线性载体条带切下，用DNA纯化回收试剂盒回收线性载体及基因基因克隆产物。
(3)目的基因与线性载体进行连接：连接体系：2×SoSoo Mix 5μL，线性载体100ng；目的片段100ng，ddH2O补足至10μL。50℃连接15min。将10μL的连接产物加入到50μL感受态DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热击90s，迅速放入冰中3min，加入1ml不含抗生素的LB液体培养基，置于摇床中37℃，180r/min复苏1h；取100μL涂布于添加卡那抗生素的固体LB培养基(详细配置见附录)平板中，于37℃倒置培养12-14h。
(4)待LB固体平板培养基中长出菌落后，无菌枪头挑取单个菌落置于1ml LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃恒温摇床，180rpm，摇菌14-16h。根据质粒小提试剂盒说明书提取质粒，并进行双酶切鉴定。酶切体系见步骤二，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切鉴定正确的载体质粒送南京擎科生物有限公司进行测序。
(5)将测序正确的载体菌液，以1:1000的比例添加的10ml的LB液体培养基中，37℃恒温摇床，180rpm摇菌14-16h，收集菌液。根据天根去内毒中量小提试剂盒说明书提取载体质粒，测定浓度后置于-20℃备用。
结果：
分别采用F1、R1和F2、R2引物克隆β-Catenin和TCF7L2的CDS区，长度分别为2346bp和1794bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测发现：2000bp附近出现特异性条带，大小与预期相符，表明β-Catenin和TCF7L2克隆成功。克隆产物分别与pcDNA3.1和pcDNA3.1-Myc载体连接、转化、摇菌、提质粒后，经BamHI、EcoRI和XhoI、EcoRI双酶切，电泳分别出现2346bp、5400bp和1794bp和5423bp两条条带。测序结果表明2346bp克隆产物与β-Catenin在编码区5’侧翼序列匹配度为99％，1794bp克隆产物与TCF7L2在编码区5’则翼序列匹配度为99％，表明pcDNA3.1-β-Catenin和pcDNA3.1-Myc-TCF7L2载体构建成功，分别命名为oeβ-Catenin和oeTCF7L2-Myc(图5～7)。
β-Catenin慢病毒干扰载体构建及活性验证：
根据NCBI中鸡β-Catenin基因序列(NM_205081.1)分别设计4条β-Catenin干扰靶点，同时设计一条阴性对照序列，靶点序列如表5，将各靶点克隆连接到piLenti-siRNA-GFP慢病毒干扰载体中。干扰载体构建服务由镇江爱必梦生物科技有限公司完成。
将构建成功的干扰载体分别转染DF1细胞，具体步骤如下：提前一天以每孔2×105的DF1细胞接种24孔板，当DF1细胞覆盖率达到50％～60％时，将干扰载体以质粒(质量m)：FuGENE HD(体积v)为1:3的比例转染(一孔为例)：Opti-MEM稀释1μg质粒至50μL作为A液；Opti-MEM稀释3μL FuGENE HD至50μL作为B液。将A、B液混合，轻轻吹打，37℃孵育10～15min。将混合液100μL缓缓加入含有400μL完全培养基的孔内混匀，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，48h后进行嘌呤霉素筛选，24h后观察拍照，收集细胞，通过Trizol裂解法抽提总RNA，并反转录合成cDNA，以β-actin为内参检测β-Catenin的表达变化，引物见表3-2。PCR反应体系为：cDNA 2μL，TB Green Premix Ex TaqII 10μL，上下游引物(10uM)各0.8μL，ddH2O 6.4μL，总体积20μL。PCR反应程序参照Takara公司TB GreenTMPremix Ex TaqTMII说明书。
表5β-Catenin-siRNA干扰载体的引物序列
表6 qRT-PCR引物序列及扩增长度
通过qRT-PCR检测筛选干扰效率最高的β-Catenin干扰载体，送至镇江爱必梦生物科技有限公司进行慢病毒包裹及滴度测定，将包裹成功的β-Catenin干扰载体命名为：siβ-Catenin。
结果：
以piLenti-siRNA-GFP为慢病毒干扰载体载体骨架，构建β-Catenin慢病毒干扰载体，测序结果显示β-Catenin慢病毒干扰载体构建成功(图8)。最终成功获得连接正确的的4个干扰载体和1个阴性对照载体，分别命名为β-Catenin-siRNA 1、β-Catenin-siRNA 2、β-Catenin-siRNA 3、β-Catenin-siRNA 4、NC-siRNA。
通过干扰载体对DF1细胞进行转染，结果显示干扰载体侵染DF1效率能够稳定达到70％以上(图9)。以侵染NC-siRNA的DF1细胞系为对照，qRT-PCR检测结果显示β-Catenin-siRNA 3和β-Catenin-siRNA 4慢病毒干扰载体能均能极显著降低β-Catenin基因mRNA的表达(P<0.01)，降低幅度分别为80％和71％(图10，表7)，而β-Catenin-siRNA 1和β-Catenin-siRNA 2对β-Catenin的表达没有显著影响，其中β-Catenin-siRNA 3干扰载体能够高效干扰内源β-Catenin基因的表达，所以将β-Catenin-siRNA 3干扰载体送往镇江爱必梦生物有限公司进行慢病毒包裹，获得滴度5×108的慢病毒干扰载体，并将其命名为siβ-Catenin。
表7目的基因β-Catenin基因干扰效率检测
注：不同肩标表示差异显著
本研究以β-catenin、TCF7L2和pLin28启动子全长的pGL3-baisc载体共转染DF1细胞作为Lin28A/B对WNT信号响应的基础，分别在此基础上将shMLL2和shLSD1载体转入DF1细胞中，通过双荧光素酶报告基因检测Lin28A/B的启动活性。
进一步，用同样的方式对Lin28A/B核心启动子区H3K4me2修饰和Lin28A/B对WNT信号的响应能力的关系进行检测。为了探究LSD1和MLL2介导的Lin28A/B启动子区的H3K4me2修饰是否影响Lin28A/B对WNT信号的响应，本发明以β-catenin、TCF7L2和pLin28相关缺失载体共转染DF1细胞作为Lin28A/B对WNT信号响应的基础，分别在此基础上将shMLL2和shLSD1载体转入DF1细胞中，通过双荧光素酶报告基因检测Lin28A/B的启动活性。
根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UCSC(http://genome.ucsc.edu/)提供的Lin28A/B序列，确定CDS序列前后2000bp基因组。根据启动子核心启动子原件TATA盒和CAAT盒在编码区5’端确定启动子区域以及转录起始位点。以转录起始位点为+1位设计引物扩增相应片段。设计引物P0并引入酶切位点AseI、SnaBI和HindIII克隆启动子最长片段(2028bp和1962bp)并置换pEGFP-N1载体中的CMV启动子。固定下游引物，分别设计Pl，P2，P3，P4引物，引入酶切位点KpnI，克隆不同长度缺失片段并连入PGL3-basic载体中。引物由南京擎科生物有限公司合成。具体引物序列详见表8。
表8 Lin28A/B启动子区不同长度片段PCR扩增引物
注：下划线部分为限制性酶切位点，小写字母为载体同源臂
Lin28A/B启动子活性分析
pLin28A-EGFP、pLin28B-EGFP的构建
(1)以鸡胚基因组DNA为模板，表8中P0引物克隆Lin28A和Lin28B启动子区，反应体系：Prime STAR Max DNA Polymerase 10μL，上下游引物各lμL，DNA模板1μL，ddH20补足至20μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃25s，62℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃最后延伸7min。扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(2)利用限制性内切酶AseI、HindIII和SnaBI、HindIII分别对真核表达载体pEGFP-Nl进行双酶切消化。酶切体系：pEGFP-Nl载体1ug，限制性内切酶各1μL，10×Buffer2μL，ddH20补足至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，将线性载体条带切下，同时将大量扩增的两个基因的启动子片段，分别用DNA纯化回收试剂盒回收线性载体和目的片段。
(3)目的基因与线性载体进行连接：连接体系：2×SoSoo Mix 5μL，线性载体100ng；目的片段100ng，ddH2O补足至10μL。50℃连接15min。将10μL的连接产物加入到50μL感受态DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热击90s，迅速放入冰中3min，加入1ml不含抗生素的LB液体培养基，置于摇床中37℃，180r/min复苏1h；取100μL涂布于添加卡那抗生素的固体LB培养基(配置见附录)平板中，于37℃倒置培养12-14h。LB培养基：Trypton 1.0g；Yeast Extract 0.5g；NaCl 1.0g；Agar 1.5g(固体培养基添加)；去离子水溶解，调节pH＝7.2，定容至1L，高压灭菌后备用。
(4)待LB固体平板培养基中长出菌落后，无菌枪头挑取单个菌落置于1ml LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃恒温摇床，180rpm，摇菌14-16h。根据质粒小提试剂盒说明书提取质粒，并进行双酶切鉴定。酶切体系见步骤二，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切鉴定正确的载体质粒送南京擎科生物有限公司进行测序。
(5)将测序正确的载体菌液，以1:1000的比例添加的10ml的LB液体培养基中，37℃恒温摇床，180rpm摇菌14-16h，收集菌液。根据天根去内毒中量小提试剂盒说明书提取载体质粒，测定浓度后置于-20℃备用。
Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建：
参照如皋黄鸡Lin28A/B基因启动子生物学信息学分析的结果，固定下游引物，不断改变上游引物，设计了4对不同大小缺失片段引物，引物序列见表8。具体方法参照上述过表达载体构建方式。
PGL3-basic重组载体鉴定与命名
利用限制性内切酶KpnI和HindIII对构建的不同缺失片段PGL3-basic载体进行双酶切，并送南京擎科公司测序。相应载体分别命名为:pLin28A/684、pLin28A/1164、pLin28A/1600、pLin28A/2028、和pLin28B/591、pLin28B/1133、pLin28B/1530、pLin28B/1962(图11～12)。
Lin28A/B启动子核心区域筛选
以双荧光素酶报告基因检测***检测目的基因Lin28A/B启动子的启动活性，具体步骤如下：将包含不同启动子片段的重组质粒和pRL-SV40以质量比为30:1的比例共转染DF1细胞，同时设置阴性对照(pGL3-basic质粒与pRL-SV40质粒以质量比为30:1的比例共转染DF1细胞)。每次转染3个孔，重复3次。转染48h后收集细胞，每管加70μL细胞裂解液，轻轻混匀，每孔细胞中加入等体积即70μL荧光液，轻轻混匀，放入酶标仪中读取萤火虫荧光值，然后加入70μL STOP终止液，轻轻吹打混匀，再放入酶标仪中读取海肾荧光值。启动子活性值为荧光素酶相对活性值(Relative Luciferase activity)即萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。相对荧光活性的数值为3次重复试验结果的“平均值±标准差。具体操作参照Promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书。通过双荧光素报告酶检测各缺失片段启动子活性高低以筛选核心启动子区域。
结果：
真核表达载体pEGFP-Lin28A、pEGFP-Lin28B的构建
以鸡胚基因组DNA为模板，表8引物分别扩增Lin28A和Lin28B基因启动子片段，长度分别为2028bp和1962bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测发现2000bp附近出现特异性条带，大小与预期相符(图13的A，B)，将克隆产物与相应的线性pEGFP-N1载体连接、转化、经测序鉴定正确后命名为pEGFP-Lin28A和pEGFP-Lin28B(图13的C、D)。
Lin28A/B启动子活性分析
为了检测Lin28A/B基因启动子长片段是否具有启动活性，分别将pEGFP-Lin28A、pEGFP-Lin28B载体转染DF1细胞，48小时后在荧光倒置显微镜下观察，结果发现：与阴性对照Blank组相比，pEGFP-Lin28A、pEGFP-Lin28B组均能表达绿色荧光蛋白，但是荧光强度较阳性对照pEGFP-N1组弱。总之，本实验结果说明pEGFP-Lin28A和pEGFP-Lin28B载体的Lin28A和Lin28B启动子均具有启动下游基因转录的能力(图14)。
Lin28A/B启动子核心区域筛选：
(1)Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建
以鸡胚基因组DNA为模板，PCR分别扩增Lin28A和Lin28B启动子不同长度的缺失片段2028bp、1600bp、1162bp、684bp和1962bp、1530bp、1133bp、591bp。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，所获得的PCR产物片段大小与预期设计的结果一致，说明Lin28A和Lin28B启动子的不同长度缺失片段克隆成功(图15A、B)。根据同源重组法将不同缺失片段连接至线性化PGL3-basic载体上，经转化、筛选、挑选阳性克隆后进行摇菌提质粒，对构建好的不同长度的PGL3.0重组载体进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示Lin28A/B启动子不同长度片段和载体片段两条清晰条带(图15C、D)，测序结果正确(图16～17)，说明载体构建成功可以用于启动子核心区域筛选实验。
TCF7L2结合位点缺失的启动子报告基因载体的构建
根据生物信息学预测结果，对Lin28A/B的启动子核心区TCF7L2的结合位点(图18)进行点突变。具体的：Lin28A的“ggagcctttgaaaaaac(SEQ ID NO.28)”序列突变“ggagcctgtgaaaaaac(SEQ ID NO.29)”；Lin28B的“ggaccatttgatgggct(SEQ ID NO.30)”序列突变为“ggaccatgtgatgggct(SEQ ID NO.31)”点突变载体构建服务由武汉金开瑞生物科技有限公司完成，构建的载体经酶切和测序鉴定成功后分别命名为：pLin28A/684-mut，pLin28B/1530-mut。
结果：
转录因子TCF7L2结合位点突变的启动子报告基因载体的构建
利用The JASPAR database(http://jaspardev.genereg.net/)在线数据库对Lin28A/B启动子区转录因子TCF7L2结合位点进行预测，发现Lin28A核心启动子区(-584～+100bp)和Lin28B核心启动子区(-1431bp～-1034bp)均存在TCF7L2结合位点，针对该区域分别对Lin28A和Lin28B核心启动子区进行TCF7L2结合位点点突变，并构建至pGL3.0-Basic载体上，经双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示发现在500bp左右出现特异性条带(图19的A和B)，测序结果显示Lin28A/B核心启动子区转录因子结合位点确实被突变，原保守性“T”碱基被突变为“G”碱基(图20)，载体构建成功，我们将构建成功的载体分别命名为pLin28A/684-mut和pLin28B/1530-mut。
通过双荧光素酶报告基因检测Lin28A/B的启动活性的结果如图21和表9～10所示：对于pLin28A/2028，与对照组(4.99±0.34)相比，添加shMLL2极显著降低pLin28A/2028启动活性(2.16±0.14，P<0.01)，而添加shLSD1则极显著提高pLin28A/2028启动活性(13.16±1.21，P<0.01)；对于pLin28B/1962，与对照组(22.53±2.04)相比，添加shMLL2显著降低pLin28B/1962启动活性(18.16±1.64，P<0.05)，而添加shLSD1则极显著提高pLin28B/1962启动活性(35.32±3.04，P<0.01)。以上结果说明H3K4me2甲基化能增强Lin28A/B对WNT信号的响应，而H3K4me2去甲基化能降低Lin28A/B对WNT信号的响应。
表9不同处理下Lin28A启动子活性相对荧光值
表10不同处理下Lin28B启动子活性相对荧光值
进一步，对Lin28A/B核心启动子区H3K4me2修饰和Lin28A/B对WNT信号的响应能力的关系进行了检测，结果如图22和表11～12所示：对于pLin28A/684，与对照组(14.62±1.24)相比，添加shMLL2极显著降低pLin28A/684启动活性(9.44±0.64，P<0.01)，而添加shLSD1则极显著提高pLin28A/684启动活性(22.31±2.41，P<0.01)；对于pLin28B/1530，与对照组(22.80±2.16)相比，添加shMLL2显著降低pLin28B/1530启动活性(16.80±1.81，P<0.05)，而添加shLSD1则极显著提高pLin28B/1530启动活性(46.49±3.89，P<0.01)。以上结果说明H3K4me2甲基化能增强Lin28A/B核心启动子区对WNT信号的响应，而H3K4me2去甲基化能降低Lin28A/B核心启动子区对WNT信号的响应。本研究前面证实Lin28A/B核心启动子区存在TCF7L2结合位点，且该区域存在H3K4me2修饰，提示H3K4me2的修饰酶LSD1、MLL2与WNT信号的β-catenin/TCF7L2复合物之间似乎存在某种联系。
表11不同处理下Lin28A核心启动子活性相对荧光值
表12不同处理下Lin28B核心启动子活性相对荧光值
4.β-catenin与LSD1竞争TCF7L2结合位点促进Lin28A/B的转录
由于鸡上LSD1没有抗体，本发明根据NCBI提供的LSD1基因(XM_417719.5)CDS序列，共2541bp，将LSD1的CDS区克隆至pcDNA3.1-3Flag质粒，构建LSD1的融合表达载体，用于带标签过表达LSD1，载体构建服务由镇江爱必梦生物科技有限公司完成。该步可由现成抗体代替。TCF7L2以上述方法与Myc标签融合。
(1)LSD1与TCF7L2互作而不是β-Catenin
根据第3部分的研究结果，发现Lin28A/B启动子区TCF7L2结合位点附近发生H3K4me2动态修饰，因此，我们猜想β-catenin/TCF7L2可能通过招募H3K4me2修饰酶，差异性调节Lin28基因启动子区的H3K4me2富集水平，从而影响了靶基因的转录。
为此，我们通过CO-IP检测β-Catenin、TCF7L2和LSD1之间的互作关系，将LSD1-flag、β-Catenin分别单独和共同转染DF1细胞系48h后，提取蛋白，利用抗体沉淀蛋白及其相互作用的复合物，进行Western Blot检测。结果发现共转染β-Catenn和LSD1-flag组中，Flag抗体不能拉取β-Catenn蛋白，利用β-Catenn抗体同样拉取不出LSD1-flag，说明LSD1不能与β-Catenn互作。
利用抗体沉淀蛋白及其相互作用的复合物，进行Western Blot检测的方法包括如下步骤：
(1)收集细胞样品，去除细胞中的培养基，用改良型杜氏PBS清洗细胞一次。将冰上预冷的500μL IP裂解/洗涤缓冲液加入细胞中，冰上孵育5min并定期混匀将细胞裂解液转移到微量离心管中，～13000×g离心10min沉淀细胞碎片。将上清转移到一个新的微量离心管中，进行蛋白浓度测定。
(2)抗体固定化：20μLAminoLink偶联树脂树脂浆液加入离心柱中，1000×g离心1min，弃掉流穿液体；200μL 1×交联缓冲液洗涤树脂，1000×g离心1min，弃掉流穿液体，***底盖；200μL 1×交联缓冲液稀释10μg抗体，加入树脂中，加入3μL的氰基硼氢化钠溶液；盖上螺旋盖，在室温条件下于旋转器上孵育2h，确保浆液在孵育过程中处于悬浮状态；1000×g离心1min，保存流穿液体以验证抗体结合效率；加200μL的1×交联缓冲液，1000×g离心1min，弃掉流穿液；重复操作一次。加200μL淬灭缓冲液至离心柱，1000×g离心1min，弃掉流穿液，向树脂中加入200μL淬灭缓冲液，3μL氰基硼氢化钠溶液并盖上螺旋帽，轻轻摇匀，孵育15min；卸下底塞，拧松螺旋帽，将离心柱放回收集管中，1000×g离心1min，弃掉流穿液体；用200μL 1×交联缓冲液洗涤树脂两次，1000×g离心1min，弃掉流穿液体；用150μL洗涤缓冲液洗涤树脂六次，1000×g离心1min，弃掉流穿液体；
(3)使用对照琼脂糖树脂预处理细胞裂解液：取80μL对照琼脂糖树脂浆液(40μL固相树脂)到离心柱中，1000×g离心1min，去除贮存储缓冲液；加入100μL 1×交联缓冲液，1000×g离心1min，弃掉流穿液；将1mg的细胞裂解液加入含有树脂的离心柱中，4℃旋转孵育1h，1000×g离心1min，弃掉含有树脂的离心柱，保留流穿液体，即为实处理样本。
(4)免疫共沉淀：用200μL的IP裂解/洗涤缓冲液洗涤树脂两次，1000×g离心1min，弃掉流穿液，在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体，***底盖；将处理样本加入到含有抗体的树脂中，盖上螺旋盖，4℃过夜；去掉底盖，松开螺旋盖，将离心柱放入收集管中，1000×g离心1min，弃掉流穿液；取下螺旋盖，将离心柱放入到一个新的收集管中，加200μL的IP裂解/洗涤缓冲液并离心；200μL的IP裂解/洗涤缓冲液洗样品两次，1000×g离心1min，弃掉流穿液；
(5)免疫共沉淀洗脱：将离心柱置于一个新的收集管中，加10μL洗脱缓冲液并离心；保持离心柱于收集管中，加50μL洗脱缓冲液，室温静置5min；1000×g离心1min，收集流穿液；
SDS-PAGE分析的样品制备：将5×泳道标记上样缓冲液平衡至室温。通过颠倒5-10次轻轻混合样品缓冲液；向样品中加入5×上样缓冲液至终浓度为1×；在95-100℃下孵育样品约5min，进行SDS-PAGE电泳。
接下来将LSD1-Flag和TCF7L2-Myc分别单独和共同转染DF1细胞，进行CO-IP检测，结果如图23～24所示，在Myc抗体进行免疫共沉淀下来的TCF7L2-Myc相互作用蛋白复合物中，单独转染LSD1-Flag或TCF7L2-Myc的情况下，没有检测出LSD1蛋白的表达，只有LSD1-Flag和TCF7L2-Myc共转染后，检测到LSD1蛋白的表达；同样，在Flag抗体进行免疫共沉淀下来的LSD1相互作用蛋白复合物中，单独转染LSD1-Flag或TCF7L2-Myc的情况下，没有检测出TCF7L2-Myc蛋白的表达，只有LSD1-Flag和TCF7L2-Myc共转染后，检测到TCF7L2-Myc蛋白的表达，说明LSD1蛋白和TCF7L2蛋白之间具有相互作用。总之，以上结果表明LSD1与TCF7L2互作而不是β-Catenin。
(2)β-catenin与LSD1竞争TCF7L2结合位点
本方法发现LSD1与TCF7L2互作而不是β-Catenin，而TCF7L2与β-Catenin同样互作，因此我们提出假设β-catenin可能与LSD1竞争TCF7L2结合位点。
为了验证这个猜测，我们选取生长状态良好的DF1细胞，在LSD1-Flag和TCF7L2-Myc共转染DF1的基础上，分两组，一组添加β-Catenin，一组添加pcDNA3.1作为对照，通过CO-IP验证我们的猜想。结果显示：在Flag抗体进行免疫共沉淀下来的LSD1互作蛋白中，同时转染LSD1-Flag和TCF7L2-Myc组中能够检测出LSD1-Flag和TCF7L2-Myc蛋白表达，然而，在此基础上添加β-Catenin的组中，没有TCF7L2-Myc和β-Catenin的表达，说明β-Catenin的存在阻止了LSD1/TCF7L2复合体的形成；在用Myc抗体进行免疫沉淀来的TCF7L2互作蛋白中，同时转染LSD1-Flag和TCF7L2-Myc组中能够检测出LSD1-Flag和TCF7L2-Myc蛋白表达，然而，在此基础上添加β-Catenin的组中，没有LSD1-Flag蛋白的表达，却存在TCF7L2-Myc和β-Catenin的表达，说明此时β-Catenin代替LSD1与TCF7L2形成了复合体。总之，以上结果表明β-catenin与LSD1竞争TCF7L2结合位点。
综上所述，为研究Wnt信号联合H3K4me2如何联合调节Lin28A/B的表达，首先通过qRT-PCR检测H3K4me2对Lin28A/B的转录调节，再通过Chip-qPCR(结合位点分析法)研究H3K4me2在Lin28A/B的启动子区的富集。在此基础上，通过双荧光素酶报告***研究H3K4me2是否影响Lin28A/B对Wnt信号的响应。同时Wnt信号常以核心效应因子β-catenin/TCF7L2复合形式调节靶基因的表达，在前期验证成功的前提下，通过Co-IP实验验证在此过程中H3K4me2组蛋白去甲基化修饰酶LSD1对β-catenin与TCF7L2结合能力的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgagctcg gatccatggc aacccaagct gacttgatg 39
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgtggtgg aattcttaca ggtcagtatc gaaccaggcc a 41
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctctagac tcgagatgcc gcagctgaac ggc 33
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatcctttg aattcttcta aggacttggt tacgagggag agc 43
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaagttgc tgatattgat ggccaatat 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgaggtctcc tcaaatggta tctgcaatt 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtggattctg tgttgttcta tgccattac 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agagagtagc tgcgggtgta ctttgtgaa 29
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggtgaactc acgtcagaac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagccatctt tcttgggtat 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgtgatctc cttctgcatc c 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcaatcaag aaagtaagc 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaggtggagt cctaaagc 18
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgccatgcat tagttattaa ctacacatcc ctatccgaat tactcctcaa a 51
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgactgcaga attcgaagct tactcgcttg caaattccg 39
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acttggcagt acatctacgt agaatgggtt ctgtgagggc atc 43
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgactgcag aattcgaagc ttgtgctctt ctgctttaac ccaacatc 48
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttctctat cgataggtac cctacacatc cctatccgaa ttactcctca aa 52
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atttctctat cgataggtac catccccgtt gtcattggtg taaagat 47
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atttctctat cgataggtac cacagtgcgc acttcagcac cac 43
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atttctctat cgataggtac cagctgggac aaagtcgggg tc 42
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agtaccggaa tgccaagctt actcgcttgc aaattccg 38
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atttctctat cgataggtac cgaatgggtt ctgtgagggc atc 43
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atttctctat cgataggtac caaggttggg accatttgat ggg 43
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atttctctat cgataggtac caagccgctc gccgaagtaa 40
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atttctctat cgataggtac caacaatcgc cgccgcc 37
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agtaccggaa tgccaagctt gtgctcttct gctttaaccc 40
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggagcctttg aaaaaac 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggagcctgtg aaaaaac 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggaccatgtg atgggct 17

Claims (9)

1.一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，包括以下步骤：
(1)通过体内和体外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用；
(2)通过CHIP-seq分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程所述组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集；
(3)检测所述组蛋白甲基化与去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号通路的响应；
(4)检测所述组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与受组蛋白调控的Wnt信号的转录因子在靶基因启动子结合位点的结合能力的影响，以研究是否存在组蛋白去甲基化修饰酶与Wnt信号转录因子之间的竞争结合关系；
根据步骤(1)～(4)的结果判断在ESCs向PGCs分化过程中，Wnt信号通路联合所述组蛋白作用于靶基因的作用机制。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体外实验的方法，包括以下步骤：
A1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
A2、将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体分别侵染ESCs，侵染48h后以BMP4诱导ESCs向PGCs分化，收集诱导2d、4d、6d后的细胞，检测收集的细胞中的基因表达情况。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体内实验的方法，包括以下步骤：
B1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
B2、分别将组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体转入至孵化48～58h的早期胚胎中，继续孵化4.5d后，测定胚胎的生殖组织中靶基因的表达变化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，若步骤(2)的结果为所述组蛋白在ESCs、PGCs和SSCs三个过程中能在靶基因的启动区差异性富集，则检测组蛋白甲基化以及去甲基化对靶基因启动子区的影响，其方法包括以下步骤：
C1、构建组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
C2、在PGCs中分别转染组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体后，利用CHIP-qPCR检测靶基因启动子区组蛋白甲基化状态的变化。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述检测方法包括以下步骤：
D1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子全长载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体
D2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子全长载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；
D3、向所述共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测方法还包括以下步骤：
E1、构建β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体、靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体、组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体和组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体；
E2、将β-Catenin过表达载体、受所述组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子的过表达载体和靶基因启动子组蛋白相关核心启动区载体共转染至DF1细胞，得到共转染后的细胞；
E3、向共转染后的细胞中分别转入组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体或组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体，通过双荧光素酶报告基因检测靶基因的启动活性。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述检测方法包括以下步骤：
F1、检测组蛋白去甲基化酶与β-Catenin、受组蛋白调控的Wnt信号通路的转录因子之间的互作关系；
F2、检测组蛋白去甲基化酶、β-Catenin对步骤F1所述转录因子在靶基因启动子上结合位点是否存在竞争关系。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，所述组蛋白包括H3K4me2，所述靶基因包括Lin28A/B，受H3K4me2调控的Wnt信号的转录因子包括TCF7L2。
9.根据权利要求2～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶慢病毒干扰载体包括LSD1慢病毒干扰载体，所述组蛋白甲基化酶慢病毒干扰载体包括MLL2慢病毒干扰载体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826430A (zh) * 2020-07-24 2020-10-27 扬州大学 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106279390A (zh) * 2015-05-12 2017-01-04 复旦大学 蛋白Bach1在制备细胞Wnt信号通路抑制剂中的用途
CN108220422A (zh) * 2018-01-05 2018-06-29 武汉大学 组蛋白去甲基化酶在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用
CN109182508A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 北京华夏时代生物工程有限公司 Tcf7l2基因单核苷酸多态性的荧光原位杂交测序方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106279390A (zh) * 2015-05-12 2017-01-04 复旦大学 蛋白Bach1在制备细胞Wnt信号通路抑制剂中的用途
CN108220422A (zh) * 2018-01-05 2018-06-29 武汉大学 组蛋白去甲基化酶在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用
CN109182508A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 北京华夏时代生物工程有限公司 Tcf7l2基因单核苷酸多态性的荧光原位杂交测序方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NANA HE等: "Wnt signaling pathway regulates differentiation of chicken embryonic stem cells into spermatogonial stem cells via Wnt5a", 《J CELL BIOCHEM.》 *
何娜娜: "组蛋白H3K4me2对鸡SSCs形成的作用机制研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
曹贵玲等: "Lin28对哺乳动物生殖调控的研究进展", 《农业生物技术学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826430A (zh) * 2020-07-24 2020-10-27 扬州大学 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法

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