CN107488732A

CN107488732A - 检测辣椒转基因成分的三重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法

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Publication number: CN107488732A
Application number: CN201710929979.4A
Authority: CN
Inventors: 孙端方; 罗绍楠; 戴奕杰; 董睿; 李春宇; 田志强; 刘廷菊; 陈梅
Original assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE
Current assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE
Priority date: 2017-10-09
Filing date: 2017-10-09
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-10-09
Also published as: CN107488732B

Abstract

本发明公开了检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组，包括针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的三重引物组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物组B，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.12所示。本发明属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对辣椒转基因成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于辣椒产品的转基因成分检测。

Description

检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于基因工程检测技术领域，尤其涉及检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法。

背景技术

民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱之一。1983年，世界上首例转基因作物(烟草)在美国研发成功；1994年，美国Monsanto公司的延熟保鲜转基因西红柿在美国批准上市。目前，转基因作物的品种和产量正在迅速增长：欧盟基本禁止了转基因作物的种植，但进口、加工、销售较多，如玉米、油菜、大豆、甜菜均在市场流通和食用；美国大量种植、生产和销售大豆、玉米、棉花、马铃薯等多种转基因作物。我国农业部批准发放了7种转基因作物安全证书，分别是耐储存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、转植酸酶玉米、抗虫水稻，每种转基因作物均包含若干具体获证品系，并允许种植、生产、加工、销售。

转基因作为一种新兴的生物技术手段，科研界大多持肯定态度，而民间大多持观望或否定态度；虽然相关争论在近年内难见分晓，但世界大多数国家，包括我国，均已通过法律法规的形式，要求其产品或食品上应具有明晰的转基因标识，确保消费者的知情权和选择权。目前，PCR技术是检测和鉴定转基因产品的主流方法，通过在样品DNA中检测某外源基因，从而判定样品是否含有该转基因成分。

样品中DNA的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。原料和粗加工品的样品，DNA损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常DNA纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.6至1.8，浓度在ng/μL级，可略作稀释或直接用于PCR检测。深加工的样品，DNA损失大且碎片化，自动化、半自动化、商品化试剂盒等模式方法得率较低已不适用；通常采用手动提取中自制试剂的方法。因为样品种类、研究方式区别很大，自制试剂的方法也种类广泛、差异显著，效果也参差不齐。

第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。

涉及转基因成分检测的PCR技术，已有较广泛的报道，但多为普通PCR方法。多重荧光PCR方法在转基因成分检测方面的应用较少，涉及转基因大豆和转基因番茄等，具体包括：中国专利申请201410843991.X《转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组和方法》、中国专利申请201310248783.0《利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法》、中国专利申请201410033119.9《一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒》等。

现有技术并未报道检测辣椒转基因成分的多重荧光PCR方法，已报道的大豆转基因和番茄转基因的检测等，与辣椒转基因成分的检测在核心引物和探针序列及荧光标记等方面存在显著的差异。因此，提供一种检测辣椒转基因成分的多重荧光PCR方法具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明将辣椒转基因品系的内源和特定外源基因(包括转基因通用元件和外源功能基因)同时用于设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对辣椒转基因成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，有利于不同品系辣椒转基因成分的充分检出。此外，通过设置三重引物组A和三重引物组B，在三重引物组A中CaATL1基因扩增检测结果为阴性的情况下，可避免三重引物组B的扩增，节约试剂和检测时间。

本发明选定的具体内源和外源基因包括：

①内源基因CaATL1：英文全称Capsicum annuum L.Bukang AT-hook-like gene1，中文名编码辣椒AT-hook 1蛋白基因。

②外源基因CaMV35S：英文全称35promoter form cauliflomer mosaic virus，中文名花椰菜花叶病毒35S启动子。

③外源基因NPT II：英文全称Neomycin phosphotransferase II，中文名新霉素-3’-磷酸转移酶。

④外源基因NOS：英文全称Nopaline synthase terminator，中文名胭脂碱合成酶3’转录终止子。

⑤外源基因CMV：英文全称Cucumber mosaic virus，中文名黄瓜花叶病毒。

⑥外源基因TMV：英文全称Tobacco mosaic virus，中文名烟草花叶病毒。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物及探针组如表1和表2，包括针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的三重引物及探针组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物及探针组B。

表1检测基因的引物及探针组

表2探针修饰基团

进一步地，本发明提供检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照和阴性对照。所述荧光PCR试剂为常规市售产品，如Path-ID^TM qPCR Master Mix、TaqMan^TMEnvironmental Master Mix 2.0、Multiplex PCR Kit、TaKaRa Premix ExTaq^TM(Probe qPCR)等常见荧光PCR试剂。采用本发明提供的三重荧光PCR试剂盒，可进行方便快捷地检测。

优选地，所述阳性对照为用所述的引物组进行扩增，并用所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为10⁵copies/μL级。优选地，所述阴性对照为非转基因源性且非辣椒源性DNA。还可以进一步包括空白对照，空白对照为三蒸水。

优选地，所述CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV和TMV基因的上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/L。

此外，本发明还提供检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR方法，包括如下步骤：

S1进行样品处理，提取样品DNA；

S2建立包括权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2所述的PCR探针组的三重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃20-120s或10-15min；95℃5-60s，60℃20-120s，40个循环，收集荧光信号；

多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50μL体系进行反应体系的配制，分别配制针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的反应体系A和针对NOS、CMV、TMV基因的反应体系B，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定。为便于理解判断条件，先简要阐述相关定义。

荧光信号检测阳性：FAM或HEX或TAMRA有荧光对数增长且Ct值≤30.0；或30.0<Ct值<40.0且复检后Ct值<40.0，此两种情况均为该荧光信号检测阳性。

荧光信号检测阴性：FAM或HEX或TAMRA有荧光对数增长且Ct值≥40.0；或30.0<Ct值<40.0且复检后Ct值≥40.0，此两种情况均为该荧光信号检测阴性。

荧光信号检测基因：体系A中FAM、HEX、TAMRA荧光信号分别检测CaATL1、CaMV35S、NPT II，体系B中FAM、HEX、TAMRA荧光信号分别检测NOS、CMV、TMV。

所述判断条件包括：

①质控标准：阳性对照的CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行②、③的辣椒成分检测。

②：当①成立时，样品CaATL1检测阴性，表明该样品中不含辣椒DNA，或辣椒DNA含量不足以进行转基因成分检测和判定。

③：当①成立时，样品CaATL1检测阳性，表明该样品中含有辣椒DNA，可进行④、⑤的转基因成分判定。

④：当③成立时，CaMV35S或/和NPT II或/和NOS检测阴性，表明该样品未检出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS转基因成分。

⑤：当③成立时，CaMV35S或/和NPT II或/和NOS检测阳性，表明该样品检出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS转基因成分，可再进行⑥、⑦的品系鉴定。

⑥：当⑤成立时，CMV或/和TMV检测阴性，表明该样品未检出CMV品系基因或/和TMV品系基因。

⑦：当⑤成立时，CMV或/和TMV检测阳性，表明该样品为CMV抗性品系或/和TMV抗性品系。

样品DNA提取方法，根据样品种类的不同，包括：原料和粗加工品可使用自检工作站、核酸提取仪、商品化试剂盒、CTAB法、SDS法等提取样品DNA。深加工品可参考下述步骤提取DNA：

①水态样品通过冻干浓缩后收集残渣、油态样品直接取样、半固体和固体样品用球磨机粉碎，处理后质量应≥10g；

②根据样品特性和状态增大初始质量，优选地，水溶状态食品的冻干残渣质量≥100g，油脂类的取样量≥2.5L，半固体和固体样品的粉碎后质量≥500g；

③加入等质量正己烷、20mL CTAB抽提液，在空气摇床中100rpm速度以上、匀质5h以上，间或颠倒混匀；

④静止至水相和有机相明显分层；或通过转速≥3krpm、时间≥10min离心使水相和有机相明显分层，移去有机相并移取水相；

⑤将所得水相在离心机中转速≥6krpm、时间≥10min离心，移取上清水相；用商品化的柱膜法或磁珠法的大体积DNA提取试剂盒进行DNA提取，再通过真空浓缩仪或柱膜浓缩管浓缩DNA样品至10–100μL以作后续检测。

发明人根据当前文献报道和标准制修订情况及相关研究情况，筛选出CaMV35S、NPT II、NOS为转基因作物的通用元件或标靶基因，检测范围可覆盖当前绝大多数商业转基因作物及产品。在品系鉴定上，CMV和TMV为辣椒最常见且危害大的病害，因此当前转基因辣椒品系主要为CMV抗性品系、TMV抗性品系、CMV和TMV抗性品系，本申请件就通过CMV和TMV基因检测可进行品系鉴定。由于转基因技术发展迅速、处于实验研究中的转基因辣椒品系众多，本发明通过采用上述通用元件和抗性基因相结合，有利于不同品系辣椒转基因成分的充分检出。

此外，需要指出的是：本方法中阴性对照标明为非转基因源性且非辣椒源性DNA，其中非转基因源性且非辣椒源性DNA，如非转基因动物DNA、除辣椒外的非转基因植物DNA等，来源广泛、便于制备。但需要注意：CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV基因是分别从自然界中的几种常见病毒和细菌中获得后应用于基因工程的，若选用非转基因源性且非辣椒源性DNA作为阴性对照，请勿故意使用相关病毒反转录DNA或被其感染的生物提取的DNA，导致实验失败。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明将辣椒转基因品系的内源和特定外源基因(包括转基因通用元件和外源功能基因)同时用于设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，特异性好、检测灵敏度高。

(2)本发明提供的检测方法有利于不同品系辣椒转基因成分的充分检出，相对多重PCR方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为10⁵级时，定量标准误差在10⁴级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μL级)的优点；相对荧光PCR方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通PCR方法，兼具上述两种优点。

(3)本发明的试剂盒在选用适于三重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装时，选择带热敏Taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；所述荧光PCR试剂中包括ROX染料，对于需要ROX染料的多重荧光PCR仪可提升检测准确性。

(4)本发明提供的引物、探针、试剂盒和方法已应用于贵州省产品质量监督检验院日常相关检测中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间2/3以上、节约试剂成本2/3以上，具有较好的实用价值。

附图说明

图1：本发明实施例一的检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中，所涉及的试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。

实施例一检测辣椒转基因成分的三重荧光试剂盒的构建及验证

①引物组及探针组：如表1和表2所示，可通过具有引物和探针合成能力的公司合成，本实施例选择上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物1至12的序列分别如Seq.ID No.1至Seq.ID No.12所示，探针13至18的序列分别如Seq.ID No.13至Seq.IDNo.18所示。将引物和探针干粉稀释至100μmol/L作为储备液，按照表3配制成10μmol/L作为使用液。

表3 100μmol/L储备液配制为10μmol/L使用液

②荧光PCR试剂：常见市售荧光PCR试剂，本实施例选择Path-ID^TM qPCRMaster Mix。

③阳性对照：取全部引物储备液，分别稀释至10μmol/L。提取CMV品系和TMV品系的转基因辣椒DNA，用相应引物和普通PCR试剂在普通PCR仪上分别对CaATL1、CaMV35S、NOS、NPT II、CMV、TMV基因进行扩增，将目的条带切胶回收后转入Takara T-vector pMD^TM20载体，转化E.coli JM109感受态细胞；提取pMD-20T质粒，稀释至10⁶copies/μL级浓度后各取10μL定容至100μL，终浓度为10⁵copies/μL级。

④阴性对照：选择非转基因且非辣椒源性DNA。

⑤空白对照：3d H₂O。

⑥多通道荧光PCR仪选用ABI Quantstudio 5，验证样品特征如表4、按表5进行反应液配制、按表6进行反应。

表4样品特征

表5反应体系

表6反应条件

⑦反应结果如图1和表7所示：

图1中曲线1至6、7至12、13至18、19至24分别为阳性对照、阴性对照、加标对照、空白对照的CaATL1(FAM)、CaMV35S(HEX)、NPT II(TAMRA)、NOS(FAM)、CMV(HEX)、TMV(TAMRA)荧光信号曲线。

表7样品检测结果

⑧验证结果：与按照SN/T 2271-2009《青椒中转基因成分定性PCR检测方法》对样品进行转基因辣椒成分检测的结果相符。通过阳性对照、加标对照、阴性对照、空白对照的设置，表明试剂盒成分有效，且特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本。

实施例二CMV和TMV双抗品系线辣椒样品的检测

从贵州省农科院获赠CMV和TMV双抗品系线辣椒。将样品球磨粉碎后使用外购DNA提取试剂盒(ABI Magmax^TM DNA Isolation Kit)在ABI Magmax^TM Express-96磁珠抽提仪上提取样品DNA；DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.80、浓度为107.86ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物组、探针组、荧光试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为Step one plus)。

检测结果见表8：①质控标准：阳性对照的CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行辣椒成分检测。②样品CaATL1检测阳性，表明该样品中含有辣椒DNA，可进行转基因成分判定。③样品CaMV35S和NPT II和NOS阳性，表明该样品检出CaMV35S和NPT II和NOS转基因成分，可再进行品系鉴定。④样品CMV和TMV检测阳性，表明该样品为CMV和TMV抗性品系。⑤比对结果：与按照SN/T 2271-2009《青椒中转基因成分定性PCR检测方法》对样品进行转基因辣椒成分检测的结果相符。

表8实验结果(实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线)

实施例三CMV抗性品系辣椒样品的检测

购买CMV抗性品系辣椒，将样品球磨粉碎后使用外购DNA提取试剂盒(QiagenMagAttract Hmw DNA kit)在小型磁力架(Qiagen MagAttract Magnetic Rack)上提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.79、浓度为126.97ng/μL，-20℃保存。引物组、探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光PCR试剂为Multiplex PCR Kit，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为Step one plus)。

检测结果见表9：①质控标准：阳性对照的CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行辣椒成分检测。②样品CaATL1检测阳性，表明该样品中含有辣椒DNA，可进行转基因成分判定。③样品CaMV35S和NPT II和NOS阳性，表明该样品检出CaMV35S和NPT II和NOS转基因成分，可再进行品系鉴定。④样品CMV检测阳性，表明该样品为CMV抗性品系。⑤比对结果：与按照SN/T 2271-2009《青椒中转基因成分定性PCR检测方法》对样品进行转基因辣椒成分检测的结果相符。

表9实验结果(实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线)

实施例四TMV抗性品系辣椒样品的检测

购买TMV抗性品系辣椒，将样品球磨粉碎后使用外购DNA提取试剂盒(TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.80、浓度为133.67ng/μL，-20℃保存。引物组、探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光PCR试剂为TaKaRa Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为Step one plus)。

检测结果见表10：①质控标准：阳性对照的CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行辣椒成分检测。②样品CaATL1检测阳性，表明该样品中含有辣椒DNA，可进行转基因成分判定。③样品CaMV35S和NPT II和NOS阳性，表明该样品检出CaMV35S和NPT II和NOS转基因成分，可再进行品系鉴定。④样品TMV检测阳性，表明该样品为TMV抗性品系。⑤比对结果：与按照SN/T 2271-2009《青椒中转基因成分定性PCR检测方法》对样品进行转基因辣椒成分检测的结果相符。

表10实验结果(实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线)

实施例五国家监督抽查风险检测样品--油辣椒的检测

配料表为：菜籽油、辣椒、花生、味精、食用盐、白砂糖、花椒。按下述步骤提取DNA：

①将样品过滤去油后用球磨机粉碎，粉碎后取500g转入3L三角瓶。

②加入500mL正己烷、20mL CTAB抽提液，在空气摇床中150rpm速度、匀质5h，间或颠倒混匀。

③用500mL离心瓶在Beckman coulter Allegra 25R离心机上5krpm、10min离心使水相和有机相明显分层，移去有机相并移取水相。

④将所得水相用50mL离心管在Beckman coulter Allegra 25R离心机中转速10krpm、10min离心，移取上清水相。

⑤用大体积DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Plant Maxi Kit)进行DNA提取。

⑥再通过柱膜浓缩管(Millipore Microcon DNA fast flow(PCR grade))浓缩DNA样品至10μL，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.71、DNA浓度为14.05ng/μL，-20℃保存。

引物组、探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光PCR试剂为ABI TaqMan^TMEnvironmental Master Mix 2.0，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

检测结果见表11：①质控标准：阳性对照的CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行辣椒成分检测。②样品CaATL1检测阳性，表明该样品中含有辣椒DNA，可进行转基因成分判定。③样品CaMV35S和NPT II和NOS阴性，表明未检出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS转基因成分。④无需再进行品系鉴定。⑤比对结果：与按照SN/T2271-2009《青椒中转基因成分定性PCR检测方法》对样品进行转基因辣椒成分检测的结果相符。

表11实验结果(实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线)

综上所述，本发明提供的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法仅对辣椒和转基因辣椒的目的基因进行特异性扩增，并在扩增中产生荧光信号，可有效适用于辣椒相关产品的转基因成分检测，与相关标准检测方法的结果相符，节约了检测时间，降低了检测成本，具有较好的实用价值。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵州省产品质量监督检验院

<120> 检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法

<130> /

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 1

aaatgggttc agtatttcgt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 2

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<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 4

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<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

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<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

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<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

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<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

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gaagcttgtt tcgcgcatt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

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<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 11

ggtattagac ccgctagtca c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

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tctaacgttt cggcagtc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 13

tagctggccc acaaggtc 18

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 14

tggaccccca cccacgagga gcatc 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 15

cacccagccg gccacagtcg at 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 16

catcgcaaga ccggcaacag g 21

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 17

tgtccgtcgc cgccat 16

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(RenGongXuLie)

<400> 18

ttgaaaatca ggcgaacccc 20

Claims

1.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的三重引物组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物组B；CaATL1基因的上游引物为Seq.ID No.1，下游引物为Seq.ID No.2；CaMV35S基因的上游引物为Seq.IDNo.3，下游引物为Seq.ID No.4；NPT II基因的上游引物为Seq.ID No.5，下游引物为Seq.IDNo.6；NOS基因的上游引物为Seq.ID No.7，下游引物为Seq.ID No.8；CMV基因的上游引物为Seq.ID No.9，下游引物为Seq.ID No.10；TMV基因的上游引物为Seq.ID No.11，下游引物为Seq.ID No.12。

2.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR探针组，其特征在于：包括针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的三重探针组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重探针组B；CaATL1基因的探针为Seq.ID No.13，5’端用FAM荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；CaMV35S基因的探针为Seq.ID No.14，5’端用HEX荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；NPT II基因的探针为Seq.ID No.15，5’端用TAMRA荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；NOS基因的探针为Seq.ID No.16，5’端用FAM荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；CMV基因的探针为Seq.ID No.17，5’端用HEX荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；TMV基因的探针为Seq.ID No.18，5’端用TAMRA荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰。

3.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为用权利要求1所述的引物组进行扩增，并用权利要求2所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为10⁵copies/μL级。

5.根据权利要求3所述的检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为非转基因源性且非辣椒源性DNA。

6.根据权利要求3所述的检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV和TMV基因的上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/L。

7.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：

①进行样品处理，提取样品DNA；

②建立包括权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2所述的PCR探针组的三重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃20-120s或10-15min；95℃5-60s，60℃20-120s；40cycle并收集荧光信号，根据扩增循环数进行辣椒转基因成分检测结果的判断。

8.根据权利要求7所述的检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR方法，其特征在于：所述检测结果的判断包括：

①质控标准：阳性对照的CaATL1、CaMV35S、NPT II、NOS、CMV、TMV均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，进行②、

③的辣椒成分检测；

②：当①成立时，样品CaATL1检测阴性，表明该样品中不含辣椒DNA，或辣椒DNA含量不足以进行转基因成分检测和判定；

③：当①成立时，样品CaATL1检测阳性，表明该样品中含有辣椒DNA，进行④、⑤的转基因成分判定；

④：当③成立时，CaMV35S或/和NPT II或/和NOS检测阴性，表明该样品未检出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS转基因成分；

⑤：当③成立时，CaMV35S或/和NPT II或/和NOS检测阳性，表明该样品检出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS转基因成分，再进行⑥、⑦的品系鉴定；

⑥：当⑤成立时，CMV或/和TMV检测阴性，表明该样品未检出CMV品系基因或/和TMV品系基因；