CN108374027A - 一种r-3-氨基丁酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种R‑3‑氨基丁酸的制备方法，该方法是以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH，然后加入重组天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R‑3‑氨基丁酸。该方法通过控制反应体系的铵根离子，控制逆反应并减少副产物的生成；利用微滤和纳滤截留菌泥、酶蛋白、硫酸根离子以及色素等杂质，通过连续浓缩结晶，获得高手性纯度以及高杂质纯度的优质产品。

Description

一种R-3-氨基丁酸的制备方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及天冬氨酸酶催化巴豆酸制备R-3-氨基丁酸的方法。

背景技术

R-3-氨基丁酸(R-3-aminobutyric acid)，CAS：3775-73-3，主要作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物。R-3-氨基丁醇(R-3-amino-1-butanol)，CAS：61477-40-5，是一种用于治疗艾滋病药物度鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。度鲁特韦是人类免疫缺陷病毒类型I(HIV-1)整合酶抑制药，其化学合成所需原料较多，R-3-氨基丁酸是其重要原料之一。R-3-氨基丁酸的分子结构式如式(I)所示：

R-3-氨基丁酸经一步还原反应即可得到度鲁特韦关键中间体R-3-氨基丁醇。R-3-氨基丁醇的手性纯度决定了后续合成中间体的纯度，因此，对制备高纯度的度鲁特韦起着举足轻重的作用。目前，国内对于R-3-氨基丁醇的制备主要还是传统的化学方法，包括：化学拆分法、化学诱导法、手性原料合成法和制备色谱法等。但采用以上方法制备R-3-氨基丁醇易对环境造成较大的污染且收率不高，不利于企业的节能减排。

开发具有高效、低成本的路线合成高纯度的R-3-氨基丁酸是降低度鲁特韦原料药成本，推广其应用范围的关键步骤。相对于化学法，生物催化具有反应条件温和、高度选择性、产物纯度高等优点，利用生物酶法催化技术是一种可行的方案，但目前未见关于生物酶法制备R-3-氨基丁酸的相关报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种适用于工业生产级别的生物酶催化合成R-3-氨基丁酸的方法。

技术方案：一种R-3-氨基丁酸的制备方法，以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH；加入重组天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下进行生物酶催化反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R-3-氨基丁酸。

该生物酶催化反应如式(II)所示：

巴豆酸即丁烯酸，有顺式和反式两种异构体，本发明所述R-3-氨基丁酸为反式丁烯酸。在该反应中，氨水作为调节pH的碱性物质，又提供了部分铵根离子，在铵盐的作用下，使得该反应能得到充足的铵根离子，同时在反应过程中，pH控制在碱性条件，进一步保证底物巴豆酸能够完全转化为产物R-3-氨基丁酸。

其中，所述重组天冬氨酸酶的获得方法是：将来源于芽孢杆菌的天冬氨酸酶编码基因进行克隆，获得重组质粒，加入感受态宿主细胞进行转化获得工程菌株；然后依次经发酵培养、细胞破碎处理获得；所述重组质粒的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所述基因序列。

其中，所述重组天冬氨酸酶的获得方法是：以芽孢杆菌菌液为模板，按照GenBank上公开的芽孢杆菌天冬氨酸酶基因序列设计一对引物，随后进行PCR扩增，将PCR扩增片段和载体进行双酶切并纯化，随后按适量的比例将目的片段和载体进行连接构成重组质粒，加入感受态细胞进行转化构成重组菌株，将重组菌株涂布在相应抗性的平板中进行培养。

其中，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种。大肠杆菌细胞生长繁殖速度快且BL21(DE3)适用于高效表达外源基因，因此优选大肠杆菌作为宿主细胞。所述重组质粒选用包括但不限于pET、pGEX、pMAL的任意一种作为载体，优选pET-28质粒。

其中，所述的氨水作为调节pH的碱性物质，在中和巴豆酸的酸性时，又提供了铵根离子，在反应初期只有底物巴豆酸的反应液中，当氨水的加入量至反应体系的pH为7.5时，铵根离子的加入量与底物巴豆酸的摩尔比为1∶1。当pH继续调至8.5-9.5，使得体系中有少量富余的铵根离子，有助于充分反应。后续再补充少量铵盐，该反应体系中的铵根离子过量，以及在镁离子的共同作用下，使得底物巴豆酸的转化率大于98％。

进一步地，所述生物酶催化反应中，铵盐中的铵根离子与巴豆酸的摩尔比为0.2～0.4∶1，优选为0.3∶1。所述铵盐选用包括但不限于硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵的任意一种或多种的组合，优选为硫酸铵。甲酸铵和乙酸铵虽然也能作为稳定的铵根离子来源，但对后续的分离纯化要求较高。

所述重组天冬氨酸酶与底物质量比为0.03～0.05∶1，优选为0.04∶1。进一步地，所述巴豆酸的浓度为100～400g/L，优选230～270g/L。

所述的镁离子浓度为0.01～0.03mol/L，优选为0.02mol/L。镁离子有助于提高酶的活性，提高了反应速率，且促使反应向正方向进行。提供镁离子的试剂可选用包括但不限于硝酸镁、氯化镁、硫酸镁的任意一种或多种的组合，优选用硫酸镁。

本发明在生物酶催化反应前，先通过加入氨水调节pH至8.5～9.5，其目的在于使该反应液处于碱性条件，相对来说氨水的加入量更加充分，进一步保证后续底物巴豆酸能够完全转化为产物R-3-氨基丁酸。加入生物酶催化剂后，维持催化反应在碱性条件下，优选的pH为6.5～10.0，更优选的为8.5～9.5。

所述生物酶催化反应的适宜温度为30℃～50℃，优选反应温度为35℃～45℃。在此温度下，该反应能够顺利进行，且转化率在98％以上。若温度低于30℃或者高于50℃，酶活受到影响，反应后有大量的底物残留，转化率远远低于98％。

生物酶催化反应后的分离步骤采用膜过滤工艺，先选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，对微滤膜清液再选用截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。微滤可选用陶瓷微滤膜，主要用于截留重组天冬氨酸菌泥及大部分酶蛋白；纳滤膜的材质选用聚酰胺或醋酸纤维素，主要用于截留硫酸根等二价离子以及部分色素等杂质。

微滤和纳滤分离后，将清液浓缩至大量晶体形成，料液直接通过离心甩滤，并用少量纯水淋洗，得到R-3-氨基丁酸产品，同时离心出来的母液经过精密过滤器过滤后，可继续回到浓缩器内进一步浓缩结晶，再通过离心分离，得到成品，该步骤不断循环操作。经此浓缩结晶方式可以提高产品的收率，同时可以得到高品质的产品。

有益效果：本发明所述的制备方法选用巴豆酸作为反应底物实现一次反应获得R-3-氨基丁酸。通过体系中过量的铵根离子和特定的温度与pH，控制逆反应并减少副产物的生成。该方法利用微滤和纳滤截留菌泥、酶蛋白、硫酸根离子以及色素等杂质，通过连续浓缩结晶，获得高手性纯度以及高杂质纯度的优质产品。由于该酶具有高度的选择性，产物纯度高等优点，再结合较优的提取工艺，因此可获得的R-3-氨基丁酸手性纯度不低于99.95％，杂质纯度不低于99％，含量不低于99％，产品收率不低于85％。

附图说明

图1为本发明所构建的重组表达质粒pET-28a(+)-Asp；

图2为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-Asp诱导表达后重组天冬氨酸酶的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准品，1号是诱导前的破碎上清液，2号是诱导后的破碎上清液；

图3、图4、图5是实施例2中酶催化反应过程中底物和产物HPLC液相图，其中，图3是反应0h时的液相图，图4是反应4h时的液相图，图5是反应12h时的液相图；

图6为实施例2的R-3-氨基丁酸杂质纯度的液相图谱；

图7为实施例4的R-3-氨基丁酸杂质纯度的液相图谱；

图8为实施例2的R-3-氨基丁酸手性纯度的液相图谱；

图9为实施例4的R-3-氨基丁酸手性纯度的液相图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

1.天冬氨酸酶克隆菌株的构建

将冻存的芽孢杆菌进行复苏培养传代后，以该菌液为DNA模板，按照NCBI上公开的芽孢杆菌天冬氨酸酶基因(如GenBank：AB028242.1)序列设计一对引物：

正向引物(ASP-P-BamH I)：5’-CGCGGATCCATGAATACCGATGTTCGT-3’；

反向引物(ASP-R-Xho I)：5’-CCGCTCGAGTATTTTCTTCCAGCAATTCCCGG-3’；

然后进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性5min，然后30个循环(94℃30s，59℃30s，72℃1.5min)，72℃再延伸10min。

PCR完毕后进行凝胶验证和产物回收。随后将目的片段与pET-28a(+)质粒分别进行由BamH I和Xho I组成的双酶切体系进行酶切，反应结束后进行酶切产物的回收，然后将酶切后的目的片段和pET-28a(+)载体按一定比例混合，加入含有DNA连接酶的溶液于16℃进行连接反应。

将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，冰浴30min后迅速转移至水浴锅中42℃热激60s，冰浴2min后于超净台中加入500μL无菌无抗性的LB液体培养基进行孵育。孵育后取适量菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上培养，挑取单克隆菌落至4mL卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养14h，以该菌液为模板进行PCR验证。PCR验证成功后进行重组质粒抽提，提取的质粒分别进行酶切和测序，验证获得重组天冬氨酸酶克隆菌株如图1所示，其含有如SEQ ID NO.1所述基因序列。

2.天冬氨酸酶表达菌株的构建

将提取的重组质粒1μL加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30min后，45℃水浴热激90s，再冰浴2min后将菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上，37℃培养18h后挑取单克隆菌落至4mL卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养14h。即获得天冬氨酸酶表达菌株BL21(DE3)/pET-28a(+)-Asp。

3.重组菌株进行发酵生产天冬氨酸酶

将BL21(DE3)/pET-28a(+)-Asp表达菌株菌体接入4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养16h后，按菌液全部接种至600mL TB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600至4时加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，25℃诱导16h。然后5000rpm离心20min收集含天冬氨酸酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

细胞破碎：菌体浆状物用0.05M的磷酸缓冲液(pH 7.0)重悬，超声破碎后即得到粗酶液。图2说明重组天冬氨酸酶在大肠杆菌中获得了正确表达。

实施例2 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，58kg硫酸铵，再用氨水将pH调至9.0，40℃搅拌，加入上述实施例1获得的天冬氨酸酶菌泥10kg，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达294g/L，转化率达到98％以上。

请进一步参考图3至图5所示，图3为加完底物调好pH时液相图谱，图4为反应4h的液相图谱，反应速度很快。图5为反应12h时的液相图谱，从该图可以看出底物已经基本被反应完了，底物残留很低。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到255kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.98％，杂质纯度为99.54％，含量为99.7％，产品收率为88％。杂质纯度液相图谱见图6，手性纯度液相图谱见图8。

实施例3 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入270kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，72.5kg乙酸铵，再用氨水将pH调至9.2，38℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥11kg，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达319g/L，转化率达到98％以上。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到235kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.97％，杂质纯度为99.1％，含量为99.2％，产品收率为74％。

由于本实施例中，使用的铵盐是乙酸铵，在后分离过程中，纳滤膜对乙酸根离子的截留没有明显效果，大量的乙酸根离子对浓缩结晶产生影响，降低了产品收率。

实施例4 15000L体系生物催化反应

在15000L催化体系中，加入3900kg巴豆酸，36kg硫酸镁，870kg硫酸铵，用氨水将pH调至8.8，42℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥170kg，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达307g/L，转化率达到98％以上。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到4154kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.99％，杂质纯度为99.60％，含量为99.6％，产品收率为90.2％。杂质纯度液相图谱见图7，手性纯度液相图谱见图9。

实施例5 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，58kg硫酸铵，再用氨水将pH调至7.0，40℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥10kg，开始反应。反应24h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达207g/L，转化率达到69.1％。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到155kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.26％，杂质纯度为98.03％，含量为98.8％，产品收率为74.9％。由于反应时间较长，在反应过程中容易受杂菌的影响，会影响产品的手性纯度。故在此实施例中，产品的手性纯度为99.26％。

实施例6 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，再用氨水将pH调至9.0，40℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥10kg，开始反应。反应24h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达241g/L，转化率达到80.5％。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到172kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.73％，杂质纯度为98.47％，含量为99.1％，产品收率为71.4％。

实施例7 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，58kg硫酸铵，再用氨水将pH调至9.0，40℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥10kg，开始反应。反应24h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达263g/L，转化率达到87.8％以上。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到195kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.65％，杂质纯度为99.12％，含量为98.4％，产品收率为74.1％。

实施例8 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，58kg硫酸铵，再用氨水将pH调至9.0，25℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥10kg，开始反应。反应24h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达184g/L，转化率达到61.4％以上。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到123.3kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.47％，杂质纯度为99.54％，含量为99.7％，产品收率为67％。

实施例9 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，47kg氯化铵，再用氨水将pH调至9.0，25℃搅拌，加入天冬氨酸酶菌泥10kg，开始反应。反应24h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达187g/L，转化率达到62.6％以上。

反应结束后，反应液经微滤膜处理截留天冬氨酸酶菌泥以及大部分酶蛋白，清液经纳滤膜去除SO₄ ^2-以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到127.5kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.51％，杂质纯度为99.43％，含量为99.6％，产品收率为69％。

试验例

从上述实施例2、3、6可以看出，加入除硫酸铵以外的铵盐或者不加铵盐，将对转化率、收率以及产品的品质产生很大的影响，如不加硫酸铵生物酶催化反应的转化率只有80.5％。

从上述实施例2、5、8可以看出不同的pH和温度，将对转化率、收率以及产品的品质产生很大的影响。实施例5中在酶催化反应在pH为7.0的环境下，最终转化率只有69.1％，实施例8中当反应温度只有25℃时转化率只有61.4％。

通过上述实施例2、7可以看出不加硫酸镁，也会对转化率、收率以及产品的品质产生很大的影响。

序列表

<110> 长兴制药股份有限公司

<120> 一种R-3-氨基丁酸的制备方法

<130> 18WS2V0070028

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaataccg atgttcgtat tgagaaagac tttttaggtg aaaaggagat tccgaaagac 60

gcttattatg gcgtacaaac aattcgtgca acggaaaatt ttccaattac aggttatcgt 120

attcatccag aattaattaa atcactgggc attgtaaaaa aatcagccgc attagcaaac 180

atggaagttg gcttactgga taaagaagtt ggccaatata tcgtaaaagc tgctgacgaa 240

gtgattgaag gtaaatggaa tgatcaattt attgttgacc caattcaagg cggcgcaggt 300

acttccatta atatgaatgc aaatgaagtg attgctaacc gcgcattaga attaatgggt 360

gaggaaaaag gtaactattc aaaaattagt ccaaactccc atgtaaatat gtctcaatca 420

acaaacgatg ctttccctac tgcaacgcat attgctgtgt taagtttatt aaatcaatta 480

attgaaacta caaaatacat gcaacaagaa ttcatgaaaa aagcagatga attcgctggc 540

gttattaaaa tgggtcgttg ccacttgcaa gacgctgttc ctattttatt aggtcaagag 600

tttgaagcat atgctcgtgt aattgcccgc gatattgaac gtattgccaa tacgcgtaac 660

aatttatacg acatcaacat gggtgcaaca gcagtcggca ctggcttaaa tgcagatcct 720

gaatatatta gcatcgtaac agaacattta gcaaaattca gcggtcatcc attacgtagt 780

gcacaacatt tagtggacgc aactcaaaat acagactgct atacagaagt ttcttctgca 840

ttaaaagttt gcatgatcaa catgtctaaa attgccaatg atttacgctt aatggcatct 900

ggtccacgcg caggcttatc agaaatcgtt cttcctgctc gtcaacctgg ttcttctatc 960

attcctggta tggtgtgccc tgttatgcca gaagtgatga accaagtggc attccaagtg 1020

ttcggtaatg atttaacaat tacatctgct tctgaagcag gccaatttga attaaatgtg 1080

atggaacctg tgttattctt caatttaatt caatcgattt cgattatgac taatgtcttt 1140

aaatccttta cagaaaactg cttaaaaggt attaaggcaa atgaagaacg catgaaagaa 1200

tatgttgaga aaagcattgg tatcattact gcaattaacc cacatgtagg ctatgaaaca 1260

gctgcaaaat tagcacgtga agcatatctt acaggcgaat ccatccgtga actttgcatt 1320

aagtatggcg tattaacaga agaacagtta aatgaaatct taaatccata tgaaatgaca 1380

catccgggta ttgctggtcg taaa 1404

Claims (16)

1.一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH；加入重组天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下进行生物酶催化反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R-3-氨基丁酸。

2.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述铵盐中的铵根离子与巴豆酸的摩尔比为0.2～0.4∶1。

3.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述的镁离子浓度为0.01～0.03mol/L。

4.根据权利要求1或2所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述重组天冬氨酸酶与底物巴豆酸质量比为0.03～0.05∶1。

5.根据权利要求4所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述生物酶催化反应中，所述巴豆酸的浓度为100～400g/L。

6.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述铵盐为硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵的任意一种或多种的组合。

7.根据权利要求6所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述铵盐为硫酸铵。

8.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：加入氨水后pH调节至8.5-9.5。

9.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：加入生物酶催化剂后，生物酶催化反应的pH为6.5～10.0。

10.根据权利要求9所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：加入生物酶催化剂后，生物酶催化反应的pH为8.5～9.5。

11.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述生物酶催化反应的温度为30℃～50℃。

12.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述重组天冬氨酸酶的获得方法是：将来源于芽孢杆菌的天冬氨酸酶编码基因进行克隆，获得重组质粒，加入感受态宿主细胞进行转化获得工程菌株；然后依次经发酵培养、细胞破碎处理获得；所述重组质粒的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所述基因序列。

13.根据权利要求12所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种。

14.根据权利要求12所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述重组质粒选用pET、pGEX、pMAL的任意一种作为载体。

15.根据权利求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：生物酶催化反应后的分离步骤采用膜过滤工艺，先选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，对微滤膜清液再选用截留相对分子质量大于120～200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。

16.根据权利要求1所述的一种R-3-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：该方法获得的R-3-氨基丁酸手性纯度不低于99.95％，杂质纯度不低于99％，含量不低于99％，产品收率不低于85％。