CN113957065B - 一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用 - Google Patents
一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用，该蔗糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。使用时，取蔗糖母液，加入PB、纯水，加入该蔗糖异构酶的粗酶液，30℃反应。其中，酶的最高底物浓度≤700g/L，底物：粗酶液投比≤100：1。本发明的高转化率蔗糖异构酶比野生型蔗糖异构酶具有更高的底物浓度，更快的反应速度，投酶量低，可有效缩减成本；转化率高，大于95％。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种高转化率的蔗糖异构酶。
背景技术
蔗糖是一种常用的甜味剂。一旦摄取，蔗糖降解为葡萄糖和果糖，从而升高血糖水平。过量摄入蔗糖很容易导致肥胖，并与健康问题有关，例如心脏病和2型糖尿病。随着生活水平和健康意识的提高，人们开始关注可以替代蔗糖的、更健康的功能性甜味剂。
随着生活水平的提高和健康意识的发展，人们更加注重饮食。在甜味剂方法，人们更喜欢低热量和保健功能产品，如D-塔格糖、阿洛酮糖、异麦芽酮糖和低聚果糖等。作为蔗糖的替代品，异麦芽酮糖具有许多健康优势，例如，延长能量释放、减慢消化、更高的稳定性、降低胰岛素水平、防止蛀牙和血糖指数。因此，异麦芽酮糖被认为是的肠胃外治疗糖尿病营养物。另外，异麦芽酮糖作为一种还原性功能二糖，是目前唯一没有用量限定的甜味剂。
异麦芽酮糖，俗称帕拉金糖，由d-葡萄糖和d-果糖通过α-1,6-糖苷键连接而成，不同于蔗糖中的α-1,2-糖苷键。异麦芽酮糖具有与蔗糖相似的物理和感官特性。然而，与蔗糖相比，它有几个优点：由于异麦芽酮糖的甜度低于蔗糖(约为甜度的50％)，是一种低热量的非致龋营养糖；此外，异麦芽酮糖被酶缓慢水解并以葡萄糖和果糖的形式被吸收到机体中，从而降低胰岛素水平和血糖指数。因此，异麦芽酮糖有潜力成为肥胖症和糖尿病的蔗糖替代品。
异麦芽酮糖的合成通常涉及化学或酶促方法。化学法总是伴随着某些副产物的形成，颜色呈褐色，增加了产品的分离纯化难度；此外，这些困难增加了生产成本和能源消耗。因此，利用生物转化技术以蔗糖为底物合成异麦芽酮糖成为研究热点。此外，作为高效、绿色的生物催化剂，酶具有更温和的反应条件、更容易加工和更高的产品收率等优势，使得酶法在各个行业中越来越重要。
在工业上，异麦芽酮糖主要由蔗糖经细菌发酵制得。这些异麦芽酮糖生产菌株可以合成蔗糖异构酶，该酶负责将蔗糖异构化为异麦芽酮糖和其他副产物，如海藻糖、果糖和葡萄糖。但蔗糖底物浓度有限，使得发酵过程中异麦芽酮糖产量降低。
目前，蔗糖异构酶已有多种微生物来源得到披露，但根据文献报道，用蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖存在以下问题：
(1)随反应时间延长，杂糖比例增多，如葡萄糖、海藻酮糖等总计占比在10％-20％不等。极端的情况下，曾经有过海藻酮糖占比高达50％的结果出现。
(2)高浓度底物的反应体系可以有效增加时空生产效率，减小能耗，并且有文献报道在800g/L蔗糖的高渗透压下微生物无法生长，故可以在开放式设备中生产。
因此，开发一种高转化率的蔗糖异构酶或突变体，使得反应时间缩短，进而在一定程度上减小杂糖占比，具有很大的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种高转化率的蔗糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的蔗糖异构酶的底物浓度和反应速度均高于野生型蔗糖异构酶的底物浓度和反应速度。其转化率大于95％。
本发明高转化率的蔗糖异构酶可用于催化生产异麦芽酮糖中，使用方法为：取蔗糖母液，加入PB、纯水，加入蔗糖异构酶的粗酶液，30℃反应。
经过大量实验验证，该蔗糖异构酶的最高底物浓度≤700g/L；底物：粗酶液投比≤100：1。
其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存；
(3)分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，初级接种菌种制备200mL培养物，OD2.0时接入；在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％正磷酸和30％氨水维持在7.0；
发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为35.0时，用0.2mM IPTG诱导16小时；取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存。
进一步的，步骤(2)中所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
进一步的，步骤(3)中所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的高转化率蔗糖异构酶比野生型蔗糖异构酶具有更高的底物浓度，更快的反应速度，投酶量低，可有效缩减成本；转化率高，大于95％；尤其适用于工业大规模生产异麦芽酮糖，可取得较好的社会效益和经济价值。
附图说明
图1为实施例2的TLC检测图谱；从左至右依次为蔗糖标品，异麦芽糖标品，反应样品；
图2为20g/L异麦芽酮糖标品检测图谱；其中，出峰时间为8.8min；
图3为实施例3的检测结果，8.7min为目标产物。
图4为实施例9的检测结果，8.7min为目标产物，8.3min为残余底物峰。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中涉及到的检测条件如下：
(1)液相检测条件
流动相：乙腈：水＝70：30
检测器：示差检测器
流速：1mL/min
柱温：40℃
示差检测器池温度：40℃
使用250mm*4.6um氨基柱。
(2)TLC检测条件
展开剂：将正丁醇：丙酮：水按4:3:1混合再加一滴乙酸，跑2次(跑一次吹干再跑一次)。
显色剂：将4％苯胺-4％二苯胺-85％磷酸按体积比5:5:1混合使用，显色温度85℃，显色时间10分钟。
实施例1粗酶液的制备
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达，并命名为PD1。具体操作如下：
将引物PD1-1～PD1-48(如SEQ ID NO：3-50所示)加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
| 2mM dNTP mix(2mM each dNTP) | 5μl |
| 10×Pfu buffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化克隆并测序。
同样的，将对照野生型蛋白SEQ ID NO：2的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，命名为PD2。所用的引物PD2-1～PD2-48如SEQ ID NO：51-98所示。
(2)摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100mL高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存。
(3)分批补料发酵：
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。初级接种菌种制备200mL培养物，OD2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为35.0(湿重约为60g/L)时，用0.2mM IPTG诱导16小时。取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存。
实施例2 700g/L蔗糖催化反应
先配制蔗糖母液(800g/L)，取800g蔗糖，加水定容至1L加热助溶，待用。
取1.75mL蔗糖母液(800g/L)，加入1M pH5.8的PB缓冲液0.1mL，加入粗酶液PD1用量为56μL，补水至2mL。反应24小时，点板显示，底物已反应完成。TLC结果见图1。
实施例3 700g/L蔗糖催化反应
取1.75mL蔗糖母液(800g/L)，加入1M pH5.8的PB缓冲液0.1mL，加入粗酶液PD1用量为28μL，补水至2mL。反应24小时，点板显示，底物已反应完成。
即在底物浓度700g/L时，底物：粗酶液投量为50:1时可实现24小时完全转化底物，无蔗糖残余。且目的产物的转化率大于95％。液相结果见图3。
实施例4 700g/L蔗糖催化反应
取1.75mL蔗糖母液(800g/L)，加入1M pH5.8的PB缓冲液0.1mL，加入粗酶液PD1用量为14μL，补水至2mL。反应24小时，点板显示，底物仍有明显残余。
实施例5 500g/L蔗糖催化反应
500g/L蔗糖反应体系：取1.25mL蔗糖母液(800g/L)，加入0.1mL 1M PB缓冲液(pH5.8)，加入0.55mL纯水，最后加入粗酶液PD1 0.04mL，此时总体系约为2mL，30℃摇床反应。反应24小时取样点板TLC检测底物剩余情况。结果显示已无蔗糖残余。
实施例6 500g/L蔗糖催化反应
500g/L蔗糖反应体系：取1.25mL蔗糖母液(800g/L)，加入0.1mL 1M PB缓冲液(pH5.8)，加入0.55mL纯水，最后加入粗酶液PD1 0.02mL，此时总体系约为2mL，30℃摇床反应。反应24小时取样点板TLC检测底物剩余情况。结果显示已无蔗糖残余。
实施例7 500g/L蔗糖催化反应
500g/L蔗糖反应体系：取1.25mL蔗糖母液(800g/L)，加入0.1mL 1M PB缓冲液(pH5.8)，加入0.55mL纯水，最后加入粗酶液PD1 0.01mL，此时总体系约为2mL，30℃摇床反应。反应24小时取样点板TLC检测底物剩余情况。结果显示已无蔗糖残余。
即在底物浓度500g/L时，底物：粗酶液投量为100:1时可实现24小时完全转化底物，无蔗糖残余，且目的产物的转化率大于95％。
实施例8 500g/L蔗糖催化反应
500g/L蔗糖反应体系：取1.25mL蔗糖母液(800g/L)，加入0.1mL 1M PB缓冲液(pH5.8)，加入0.55mL纯水，最后加入粗酶液PD1 5μL，此时总体系约为2mL，30℃摇床反应。反应24小时取样点板TLC检测底物剩余情况。结果显示底物未反应完全。
实施例9 700g/L蔗糖对照实验
取1.75mL蔗糖母液(800g/L)，加入1M pH5.8的PB缓冲液0.1mL，加入SEQ ID NO：2的对照粗酶液28μL，补水至2mL。反应24小时，点板显示，底物未反应完全。
由此可知，即在底物浓度700g/L时，底物：PD2对照粗酶液投量为50:1时无法实现24小时完全转化底物。液相结果见图4。
通过上述实验结果的对比可以看出，本发明的蔗糖异构酶比野生型蔗糖异构酶具有更高的底物浓度；比野生型蛋白在高浓度底物时反应速度更快，而且投酶量低，可有效缩减成本；转化率高，大于95％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南京诺云生物科技有限公司
<120> 一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用
<160> 98
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 578
<212> PRT
<213> 高转化率蔗糖异构酶(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile Ala Ala Thr Asn
1 5 10 15
Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys Gln Ala Val Phe
20 25 30
Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Met Leu
50 55 60
Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu Ser Pro Asn Thr
65 70 75 80
Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr
85 90 95
Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met Asn Lys Arg
100 105 110
Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asp Arg
115 120 125
His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp Asn Pro Tyr Arg
130 135 140
Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln Ala Pro Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu Asp Lys Gln Thr
165 170 175
Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln Pro Asp Leu Asn
180 185 190
Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp Ile Leu Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr
210 215 220
Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Lys Gly Pro Asn Ile His Lys Tyr Ile
245 250 255
His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn Val Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Val Ser Ala Met Pro Asp Tyr Phe Asp
275 280 285
Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg
290 295 300
Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys Pro Trp Thr Leu
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg Ala Ala Gly Glu
325 330 335
Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Ala
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu Arg Ser Ala
355 360 365
Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile
370 375 380
Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Asn Ile
385 390 395 400
Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Asn Asp Tyr Val
405 410 415
Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met
420 425 430
Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Asp Ser Val
435 440 445
Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His Leu Asn Pro Asn
450 455 460
Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Pro Asp Ser Val
465 470 475 480
Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His Gln Ile Pro Ala
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn Asn Gln Val
500 505 510
Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr Leu Val Val Val
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Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro Asp Asn Leu Thr
530 535 540
Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser Leu Gln Glu
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Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gly Ile Tyr Lys
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<211> 578
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<213> 野生型蔗糖异构酶(Artificial Sequence)
<400> 2
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Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Met Leu
50 55 60
Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu Ser Pro Asn Thr
65 70 75 80
Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr
85 90 95
Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met Asn Lys Arg
100 105 110
Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asp Arg
115 120 125
His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp Asn Pro Tyr Arg
130 135 140
Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln Ala Pro Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu Asp Lys Gln Thr
165 170 175
Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln Pro Asp Leu Asn
180 185 190
Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp Ile Leu Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr
210 215 220
Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile His Lys Tyr Ile
245 250 255
His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn Val Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Val Ser Ala Met Pro Asp Tyr Phe Asp
275 280 285
Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg
290 295 300
Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys Pro Trp Thr Leu
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg Ala Ala Gly Glu
325 330 335
Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Gln
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu Arg Ser Ala
355 360 365
Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile
370 375 380
Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Asn Ile
385 390 395 400
Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Asn Asp Tyr Val
405 410 415
Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met
420 425 430
Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Asp Ser Val
435 440 445
Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His Leu Asn Pro Asn
450 455 460
Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Pro Asp Ser Val
465 470 475 480
Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His Gln Ile Pro Ala
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn Asn Gln Val
500 505 510
Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr Leu Val Val Val
515 520 525
Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro Asp Asn Leu Thr
530 535 540
Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gly Ile Tyr Lys
565 570 575
Leu Asn
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatac 37
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcagaccag cagcagcggt cggcagcagg tatttcatat gtatatctcc ttcttaaagt 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgctgctg gtctgctgct cctcgctgcc cagccggcga tggccatggc ttctccgctg 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttctggatg ttggtagcag cgatcggggt agacggtttg gtcagcggag aagccatggc 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgctacca acatccagaa atctgctgac ttcccgatct ggtggaaaca ggctgttttc 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accgttagag tctttgaaag aacgcgggta gatctggtag aaaacagcct gtttccacca 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgttctttca aagactctaa cggtgacggt atcggtgaca tcccgggtat catcgaaaaa 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagatagcgt caacacccag cattttcagg tagtccagtt tttcgatgat acccgggatg 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgggtgttg acgctatctg gatcaacccg cactacgaat ctccgaacac cgacaacggt 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accgtattct ttcatgattt tacggtagtc agagatgtcg taaccgttgt cggtgttcgg 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgtaaaatc atgaaagaat acggttctat ggctgacttc gaccgtctgg ttgctgaaat 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gataacgatg tcgatcatca gacgcatacc acgtttgttc atttcagcaa ccagacggtc 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtctgatgat cgacatcgtt atcaaccaca cctctgaccg tcaccgttgg ttcgttcagt 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaagtagtag tcacggtacg ggttgtcttt accagaacga gactgaacga accaacggtg 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccgtaccgt gactactact tctggcgtga cggtaaacag ggtcaggctc cgaacaacta 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tttgtccagc tgccaagcag aaccaccgaa gaaagacggg tagttgttcg gagcctgacc 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcttggcagc tggacaaaca gaccgaccag tactacctgc actacttcgc tccgcagcag 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acagttcagc acgaactttc gggttgtccc agttcaggtc cggctgctgc ggagcgaagt 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgaaagttcg tgctgaactg tacgacatcc tgcgtttctg gctggacaaa ggtgtttctg 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gggattttag agaaggtagc aacggtgtcg aaacgcagac cagaaacacc tttgtccagc 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttgctacct tctctaaaat cccgggtttc ccggacctgt ctaaagctca gctgaaaaac 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtggatgttc ggacctttgg tgtaagcttc agcgaagttt ttcagctgag ctttagacag 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccaaaggtcc gaacatccac aaatacatcc acgaaatgaa ccgtcaggtt ctgtctaaat 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggaacaccga agatttcacc agcggtagca acgttgtatt tagacagaac ctgacggttc 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggtgaaatc ttcggtgttc cggtttctgc tatgccggac tacttcgacc gtcgtcgtga 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tccagacgga tcaggtcgaa ggtgaaagcg atgttcagtt cttcacgacg acggtcgaag 60
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcgacctgat ccgtctggac cgttacccgg accagcgttg gcgtcgtaaa ccgtggaccc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agcacggtcg gtctgagaga taacctgacg gaactgagac agggtccacg gtttacgacg 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tctcagaccg accgtgctgc tggtgaattc ggttggaacg ctttcttcct ggacaaccac 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agagtcgtca ccgaagtgag aaacagcacg cgggttgtcg tggttgtcca ggaagaaagc 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctcacttcgg tgacgactct ccgcagtggc gtgaacgttc tgctaaagct ctggctaccc 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccctggaaga tgaacggggt agcacgctgg gtcagcagca gggtagccag agctttagca 60
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccccgttcat cttccagggt gctgaactgg gtatgaccaa ctacccgttc aaaaacatcg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttccagaaac ctttaacttc gatgtcgtcg aattcttcga tgtttttgaa cgggtagttg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
catcgaagtt aaaggtttct ggaacgacta cgttgcttct ggtaaagtta acgctgctga 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gagttgtcac gagaggtcat acgaacttcc tgcaggaatt cagcagcgtt aactttacca 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtatgacctc tcgtgacaac tctcgtaccc cgatgcagtg gaacgactct gttaacgctg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcgggttcag gtggaaccac ggtttaccct gggtgaaacc agcgttaaca gagtcgttcc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggttccacct gaacccgaac tacaaacaga tcaacgctgc tcgtgaagtt aacaaaccgg 60
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caggttgatc agctgacggt agtaagagaa aacagagtcc ggtttgttaa cttcacgagc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccgtcagctg atcaacctgc gtcaccagat cccggctctg acctctggtg aataccgtga 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgggtgtaag cgtaaacctg gttgttctgc gggtccaggt cacggtattc accagaggtc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caggtttacg cttacacccg tatcctggac aacgaaaaat acctggttgt tgttaacttc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtccggcaga gcgtagtgca gctgttccgg tttgaagtta acaacaacca ggtatttttc 60
<210> 47
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
actacgctct gccggacaac ctgaccatcg cttcttctct gctggaaaac gttcaccagc 60
<210> 48
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggagccaggg tcagggtaga agcgttttcc tgcagagacg gctggtgaac gttttccagc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
accctgaccc tggctccgtg gcaggctggt atctacaaac tgaactaact cgagcaccac 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttagttc ag 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatac 37
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agcagaccag cagcagcggt cggcagcagg tatttcatat gtatatctcc ttcttaaagt 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gctgctgctg gtctgctgct cctcgctgcc cagccggcga tggccatggc ttctccgctg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tttctggatg ttggtagcag cgatcggggt agacggtttg gtcagcggag aagccatggc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctgctacca acatccagaa atctgctgac ttcccgatct ggtggaaaca ggctgttttc 60
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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accgttagag tctttgaaag aacgcgggta gatctggtag aaaacagcct gtttccacca 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgttctttca aagactctaa cggtgacggt atcggtgaca tcccgggtat catcgaaaaa 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cagatagcgt caacacccag cattttcagg tagtccagtt tttcgatgat acccgggatg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctgggtgttg acgctatctg gatcaacccg cactacgaat ctccgaacac cgacaacggt 60
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgtaaaatc atgaaagaat acggttctat ggctgacttc gaccgtctgg ttgctgaaat 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gataacgatg tcgatcatca gacgcatacc acgtttgttc atttcagcaa ccagacggtc 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtctgatgat cgacatcgtt atcaaccaca cctctgaccg tcaccgttgg ttcgttcagt 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaagtagtag tcacggtacg ggttgtcttt accagaacga gactgaacga accaacggtg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccgtaccgt gactactact tctggcgtga cggtaaacag ggtcaggctc cgaacaacta 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccccgttcat cttccagggt gctgaactgg gtatgaccaa ctacccgttc aaaaacatcg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ttccagaaac ctttaacttc gatgtcgtcg aattcttcga tgtttttgaa cgggtagttg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
catcgaagtt aaaggtttct ggaacgacta cgttgcttct ggtaaagtta acgctgctga 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gagttgtcac gagaggtcat acgaacttcc tgcaggaatt cagcagcgtt aactttacca 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gtatgacctc tcgtgacaac tctcgtaccc cgatgcagtg gaacgactct gttaacgctg 60
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<400> 88
tcgggttcag gtggaaccac ggtttaccct gggtgaaacc agcgttaaca gagtcgttcc 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ccgtcagctg atcaacctgc gtcaccagat cccggctctg acctctggtg aataccgtga 60
<210> 92
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
cgggtgtaag cgtaaacctg gttgttctgc gggtccaggt cacggtattc accagaggtc 60
<210> 93
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
caggtttacg cttacacccg tatcctggac aacgaaaaat acctggttgt tgttaacttc 60
<210> 94
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gtccggcaga gcgtagtgca gctgttccgg tttgaagtta acaacaacca ggtatttttc 60
<210> 95
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
actacgctct gccggacaac ctgaccatcg cttcttctct gctggaaaac gttcaccagc 60
<210> 96
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ggagccaggg tcagggtaga agcgttttcc tgcagagacg gctggtgaac gttttccagc 60
<210> 97
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
accctgaccc tggctccgtg gcaggctggt atctacaaac tgaactaact cgagcaccac 60
<210> 98
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttagttc ag 42
Claims (7)
1.一种高转化率的蔗糖异构酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述高转化率的蔗糖异构酶在催化生产异麦芽酮糖中的应用。
3.根据权利要求2所述高转化率的蔗糖异构酶在催化生产异麦芽酮糖中的应用，其特征在于：取蔗糖母液，加入PB缓冲液、纯水，加入权利要求1所述蔗糖异构酶的粗酶液，30℃反应。
4.根据权利要求3所述高转化率的蔗糖异构酶在催化生产异麦芽酮糖中的应用，其特征在于：酶的最高底物浓度≤700g/L。
5.根据权利要求3所述高转化率的蔗糖异构酶在催化生产异麦芽酮糖中的应用，其特征在于：底物：粗酶液投比≤100：1。
6.根据权利要求3所述高转化率的蔗糖异构酶在催化生产异麦芽酮糖中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存；
(3)分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，初级接种菌种制备200mL培养物，OD2.0时接入；在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％正磷酸和30％氨水维持在7.0；
发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为35.0时，用0.2mM IPTG诱导16小时；取2克菌体加入6mL纯水超声破碎后进行SDS-PAGE检测，并将粗酶液-20℃保存。
7.根据权利要求6所述高转化率的蔗糖异构酶在催化生产异麦芽酮糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法的步骤(3)中所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
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- 2021-11-30 CN CN202111448646.2A patent/CN113957065B/zh active Active
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A Novel Sucrose Isomerase Producing Isomaltulose from Raoultella terrigenaMT翻译;Liu Li 等;Applied Sciences;第11卷(第12期);5521 * |
| 蔗糖异构酶催化生产异麦芽酮糖研究进展;唐文竹 等;微生物学通报;第39卷(第9期);1314-1322 * |
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