JP6914920B2 - ステージ特異的な上皮の生理機能、形態形成、および疾患をモデル化する、胚盤葉上層スフェロイドの腎臓オルガノイドへの三次元分化 - Google Patents
ステージ特異的な上皮の生理機能、形態形成、および疾患をモデル化する、胚盤葉上層スフェロイドの腎臓オルガノイドへの三次元分化 Download PDFInfo
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Description
ヒト幹細胞は三次元培養で培養することができ、組織特異的上皮の形態形成、生理機能、および疾患を再現することができる。
未分化幹細胞および最終分化体細胞はどちらも上皮を形成する。これらは、胚において分化の軸を確立するように機能すること、または腎臓などの成体器官において障壁および輸送の役割を果たすように機能することができる。インビトロでの3D細胞培養は上皮の形態形成、生理機能、および疾患を調べるための強力なツールであり、顕微鏡検査、化学的処理、および実験操作に容易に利用することができる。例えば、メイディン・ダービー(Madin-Darby)イヌ腎臓(MOCK)細胞などの上皮細胞株の研究により、管腔形成に機構的に寄与する極性およびアポトーシス経路が明らかになっている。しかし、従来の上皮細胞株は系譜拘束的であり、遺伝的多様性を欠く。その結果、生じる3D構造は比較的単純になり、同じ遺伝的背景を持つ異なる上皮または異なる遺伝的背景を持つ同じ上皮の対照比較を行うことは困難であった。これらの制約にも関わらず、細胞微小環境および3D培養系への関心は、特に幹細胞応用のために、着実に増加し続けてきた。組織特異的上皮機能、特に、種特異的な毒性学および疾患病態生理学が生物医学的に重要な、ヒトにおける組織特異的上皮機能を正確に再構成する、遺伝的に多様な細胞培養プラットフォームが、大いに必要とされている。
[本発明1001]
ある量のヒト多能性幹細胞(hPSC)を用意する工程、
胚盤葉上層スフェロイドを形成させるために培養培地中でhPSCを培養する工程、および
胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程
を含む、ヒトオルガノイドを生成させる方法。
[本発明1002]
胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、hPSCが、白血病抑制因子(LIF)およびドキシサイクリンの非存在下で培養される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、hPSCが、Y27632の存在下で培養される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
培養培地がマトリゲルを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
培養培地がコラーゲンIを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
hPSCを培養する工程が、ある表面に培養培地の第1層を堆積させることと、堆積させた培養培地上にhPSCを置くことと、hPSCの上に培養培地の第2層を加えることとを含む、本発明1004の方法。
[本発明1007]
培養培地中でhPSCを培養する工程が約1日、2日、またはそれ以上の日数を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
1つまたは複数の作用物質がCHIR99021を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
1つまたは複数の作用物質がB27を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程が、約7日、8日、9日、10日、11日、12日、もしくは13日、またはそれ以上の日数を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
胚盤葉上層スフェロイドが、ポドカリキシン(PODXL)、閉鎖帯(ZO-1)、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
胚盤葉上層スフェロイドに空洞が形成される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
オルガノイドが細管状である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
オルガノイドが腎臓オルガノイドである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
オルガノイドが、ポドカリキシン(PODXL)、閉鎖帯(ZO-1)、およびシカクマメ(lotus tetragonolobus)レクチン(LTL)のうちの1つまたは複数を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1016]
本発明1001の方法によって作られる、ある量のオルガノイド。
[本発明1017]
ある量の胚盤葉上層スフェロイドを用意する工程、および
胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程
を含む、細管オルガノイドを生成させる方法。
[本発明1018]
1つまたは複数の作用物質がCHIR99021を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
1つまたは複数の作用物質がB27を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、本発明1017の方法。
[本発明1021]
腎臓オルガノイドが、ポドカリキシン(PODXL)、閉鎖帯(ZO-1)、およびシカクマメレクチン(LTL)のうちの1つまたは複数を発現する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程が、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中でさらに培養することを含む、本発明1020の方法。
[本発明1023]
胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程が、
CHIR99021、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中で約24時間にわたってさらに培養することと、
CHIR99021、RPMI、B27およびインスリンを含む第3分化培地で第2分化培地を置き換え、かつ約48時間にわたってさらに培養することと、
IWP2を加え、かつ約48時間にわたって培養を継続することと、
第3分化培地を第2分化培地でさらに置き換えることと
を含む、本発明1020の方法。
[本発明1024]
ある量の細管オルガノイドを用意する工程、
1つまたは複数の化合物を細管オルガノイドに加える工程、
細管オルガノイドの表現型または活性の変化を判定する工程、および
前記変化を細管オルガノイドに対する前記化合物の効果と相関させる工程であって、それによって、細管オルガノイドに対する効果に関して前記1つまたは複数の化合物をスクリーニングする、工程
を含む、細管オルガノイドに対する効果に関して化合物をスクリーニングする方法。
[本発明1025]
表現型または活性の変化を判定する工程が、細管オルガノイドにおいて1つまたは複数のマーカーを検出することを含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
1つまたは複数のマーカーが腎臓傷害分子(KIM-1)を含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
KIM-1発現の増加が前記化合物の毒性効果と相関する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、本発明1024の方法。
本明細書において言及する参考文献はすべて、参照によりその全体が、あたかも完全に記載されたかのように、本明細書に組み入れられる。別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press(September 15, 2012)、Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press(2008)、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons(New York, NY 2006)、Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons(New York, NY 2013)、Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley-Blackwell(November 28, 2012)、ならびにGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY 2012)は、本願において使用する用語の多くについて、一般的な指針を当業者に与える。抗体を調製する方法については、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY, 2013)、Koehler and Milstein, Derivation of specific Antibodies-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9、Queen and Selick, Humanized immunoglobulins、米国特許第5,585,089号(1996 Dec)、ならびにRiechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7を参照されたい。
3D培養
細胞株には、H9(WA09)、BJ、HDFn、hLR5、hfib2-iPS4、およびhfib2-iPS5(ヒト)、ならびにJ1、R1、およびv6(マウス)を含めた。細胞は、3%成長因子低減GeiTrex(Life Technologies)上で、少なくとも1代は、培地(hPSCにはmTeSR1、mESCにはN2/827サプリメント+2i in、hLR5 iPSCにはhESC条件培地(CM)+白血病抑制因子(LIF)+dox)において、フィーダーフリーで維持し、AccutaseまたはTrypLEを使って解離した。LD-iPSCは、ネイティブ型(native)hLR5 iPSCから、LIFおよびドキシサイクリンを除去し、FGF2で置換することによって誘導した。薄層ゲルサンドイッチコロニーの場合は、10μM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632(StemGent)を補足した培地中、GeiTrexがプレコートされた24ウェルプレートまたは4ウェルチャンバースライドのウェル1つにつき、60,000個(プライム型)または30,000個(ネイティブ(native)型)の細胞を、プレーティングした。翌日、培地を、mTeSR1中の1.5%GeiTrex 500μLで置き換えた。24時間後に培地を変えた。厚層ゲル培養の場合は、96ウェルプレートのウェル1つにつき、20,000個(胚盤葉上層期)または6,000個(ナイーブ(narve)型)の細胞を、75ulの緩衝コラーゲンI(10mM HEPESおよび1×DMEMを含有するもの)、成長因子低減マトリゲル(BD Biosciences)、またはそれら2つの1:1混合物のいずれかに再懸濁し、37度で45分にわたってインキュベートしてから、100ulの培地+Y27632を重層した。薄層ゲルにおける連続継代の場合は、3D培養中の管腔を持つコロニーをプレーティングの72時間後に解離し、6ウェルプレートのウェル1つあたり300,000細胞の密度で再プレーティングし、2D条件または3D条件のいずれかで72時間培養した後、解離、細胞数の計数、および再プレーティングを行った。懸濁培養の場合は、低接着性6ウェルプレートの1つのウェルでmTeSR1培地に20,000個の解離hPSCをプレーティングした。どの細胞についても培地は毎日変えた。
細管オルガノイド分化
散在した孤立スフェロイドコロニーを生産するのに十分な60,000〜120,000個のH9 hPSCをプレーティングした。サンドイッチ化の48時間後に、hPSCスフェロイドを12μM CHIRで36時間にわたって処理してから、RB(Advanced RPMI+Glutamax+B27サプリメント)に変え、その後は3日ごとに置き換えた。あるいは、2D心筋細胞分化について記載されているように、スフェロイドを、インスリンを除いたRB(RBNI)中、12μM CHIRで24時間、RBNIで48時間、5μM IWP2で48時間、RBNIで48時間、その後は3日ごとにRBで処理した。2D腎臓分化の場合は、細胞を一晩プレーティングしてから、APEL培地(StemCell Technologies)中の8μM CHIRで48〜72時間、APEL培地中の30ng/ml FGF2+1μg/mlヘパリンで96時間にわたって処理し、次にAPEL培地中で10〜15日にわたって培養した。確率的分化の場合、2D培養中または3D培養中のhPSCを、DMEM+P/S中の10%ウシ胎児血清(FBS)で処理し、19日にわたって観察した。
3Dアーキテクチャーを保存しつつ固定するために、室温で15分間、等体積の8%パラホルムアルデヒドを培養培地に加えた(最終濃度4%)。固定後に、試料をPBS中で洗浄し、5%ロバ血清(Millipore)/0.3%Triton-X-100/PBS中でブロッキングし、一次抗体と共に3%ウシ血清アルブミン/PBS中で一晩インキュベートし、洗浄し、Alexa-Fiuor二次抗体(Invitrogen)と共にインキュベートし、洗浄し、DAPIで染色するか、Vectashield H-1000にマウントした。一次抗体には、OCT4(sc-5279、Santa Cruz)、NANOG(RCAB0004PF、Cosmobio)、ブラキュリ(sc-17745、Santa Cruz)、TRA-1-60(MAB4360、Millipore)、TRA-1-81(MAB4381、Millipore)、アセチル化o-チューブリン(051M4770、Sigma)、ZO-1(339100、Invitrogen)、ポドカリキシン(AF1658およびAF1556、R&D)、CDX2(-88、Biogenex)、AQP1(AB2219、Millipore)、WT-1(sc-192、Santa Cruz)、LHX1(Developmental Studies Hybridoma Bank)、mPODXL(AF1556、R&D)、hPODXL(AF1658、R&D)、HNA(MAB1281、Millipore)、LTL(FL-1321、Vector Labs)、SYNPO(sc-21537、Santa Cruz)、CD31(555444、BD)、crumbs 3(HPA013835、Sigma)、Na,K-ATPase(ab7671、Abeam)、および切断型カスパーゼ3(MAB835、R&D)を含めた。蛍光像は、ニコン落射蛍光90-1(正立)、Eclipse Ti(倒立)、または共焦点C1顕微鏡を使ってキャプチャした。電子顕微鏡法の場合は、5分間の固定後に構造物をプレートから擦過し、300gで4分間ペレット化し、4%ホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒドを含有するカコジル酸緩衝液中にピペッティングすることによって、そのペレットを静かに剥がし、四酸化オスミウムで後固定し、エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。準超薄切片を1mmで切断し、光学顕微鏡検査によって明白な管腔を持つ細管構造を同定するために、トルイジンブルーで染色した。超薄切片(75nm)を切断し、200メッシュ銅グリッドにマウントし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、JEOL JEM-1010透過型電子顕微鏡で調べた。
透過性アッセイ
透過性を試験するために、培地に20mM HEPES+ルシファーイエローカルボヒドラジドカリウム塩(Invitrogen、38μM)およびローダミン-8イソチオシアネートデキストラン(Sigma、0.5μM)を補足し、共焦点顕微鏡法によって撮像した。マイクロインジェクションの場合は、可視化のために、mTeSR1中の5μMローダミンコンジュゲートデキストラン溶液をフェノールレッド溶液(0.5%、Sigma)で1:1希釈した。Nanoject-2マイクロマニピュレーターでプルドガラスキャピラリーマイクロニードルから2nlをマイクロインジェクションし、広視野落射蛍光により、リアルタイムでモニタリングした。TEERの場合は、希釈マトリゲルがプレコートされた24ウェルトランスウェルプレート(Corning)に、50,000個のhPSCをプレーティングした。細胞が完全にコンフルエントになるまで培地は10日にわたって静かに交換した。TEERはEVOM2デバイス(World Precision Instruments)を使って測定した。
KIM-1誘導
24ウェルプレートの、同様にプレーティングされたウェル中のオルガノイドを、一連の濃度のゲンタマイシンおよびシスプラチンで、36〜48時間にわたって処理し、固定し、KIM-1抗体AKG7.9(Bonventre laboratory)または1400(Biogen)による免疫蛍光のために加工した。KIM-1に関する免疫蛍光は、大規模な細管崩壊を誘発しない中等度の準毒性用量で観察された。
RNA干渉
プレーティングの16時間後に、抗生物質を含まないmTeSR1中で、PODXL、OCT4、またはスクランブル対照に対するDharmacon Smartpool siRNAを、hPSCにトランスフェクトした。10時間後に、培地を変えて、細胞を2Dで培養するか、3D培養のためにサンドイッチ化した。
Cas9/CRISPR変異導入
緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きCas9(Addgene 44719)およびPODXLの第2エクソン
、PKD2の第1エクソン
、またはPKD1の第36エクソン
を標的とするガイドRNA(Addgene 64711)をコードするコンストラクトをH9 hESCに一過性にトランスフェクトし、GFP発現細胞をフローサイトメトリーソーティングによって単離し、クローン拡大し、両アレル機能喪失型インデルを持つクローンをスクリーニングした。6ウェルプレートのウェル1つにつき約200,000個のソートされたhESCを、hESC条件付けmTeSR1+Y27632に入れてプレーティングした。翌朝、Y27632なしで培地を置き換え、細胞をクローン拡大し、PODXL gRNA領域をPCRで増幅した。クロマトグラム配列を手作業で分析し、イムノブロットおよび免疫蛍光によって変異を確認した。
トランスクリプトームプロファイリング
2Dまたは3DでプレーティングされたhPSCを、RNEasy Mini Kit(Qiagen)を使って、並べて調製した。試料をAgilent BioanalyzerでQCすることで、高品質試料のチェックを行った。次に、TruSeq stranded mRNAライブラリーキット(Illumina)を使って、適格試料を調製した。シーケンシングはIllumina NextSeq500 75×75ペアエンドハイアウトプットランで行った。Tophat2を使って試料をhg19リファレンス配列に整列し、Cuffdiffを使って差異的発現を算出した。
RT-PCR
分化時間経過中は、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使って、プレーティング後の2日目、10日目、14日目、および21日目に、RNAを調製した。M-MLV Reverse Transcription System(Promega)を使って、すべての時点からのRNAを並べて逆転写した。定量RT-PCR反応は、eDNA(希釈1:10)、300nMプライマー、およびiQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)とiQ5 Multi-Color Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)とを使用し、P-アクチンをハウスキーピング遺伝子として、二連で行った。
定量および統計的解析
蛍光強度定量では、1回のイメージングセクションにおいて同じ露出で画像を撮影し、同様に加工した。固定試料より容易に管腔が見分けられる生細胞の位相差像において、空洞形成したコロニー(管腔を持つ楕円体)と平坦なコロニー(非楕円体または管腔を持たないもの)とを手作業でスコア化した。アポトーシスについては、切断型カスパーゼ3発現を手作業でスコア化し、核凝縮によって確認し、広視野落射蛍光像あたりの核の総数によって割った。ZO-1面積については、ZO-1を発現している個々のコロニーまたは小領域を手作業でトレースし、NIS Elements(ニコン)を使って表面積を算出した。各コロニーについて、合計したZO-1発現面積を総表面積のパーセンテージとして表してから、それらを平均した。強度を定量するために、NIS Elementsソフトウェア(ニコン)において、生蛍光値を得るために同じ露出で撮像した無作為に選択した構造物を通って、同じ長さのライン走査を行った。平均したライン走査値をエラーバーと共にプロットした。CHIR誘導分化については、Cell Profiler 2.0を使って低倍率免疫蛍光像中に約6000個の個々の細胞を同定し、蛍光強度を自動的に測定した。統計比較には、不当分散(異分散)である2つの試料について両側I検定を利用した。イムノブロットはImageJ Gel Analyzerを使って定量した。
hPSCの連続3D培養における空洞および細管形態形成
未分化hPSCおよびそれらの体細胞子孫からヒト上皮を再構成するために、本発明者らは、まず中空スフェロイドを生産し、次に細管を生産するhPSCのための接着3D培養系を開発した(図1a〜b)。2層の希釈マトリゲル(0.2mg/mL)の間にサンドイッチされた解離未分化hPSCはコンパクトなボール様コロニーを形成し、48時間までに、これらは内部空洞を形成した(図1bおよび図11a〜b)。スフェロイド空洞形成は、コロニー融合事象および回転運動を特徴とする著しく動的なプロセスであり、インキュベーション時間およびコロニーサイズに鋭敏であった(図11a〜e)。類似の希釈ゲル条件下でMOCKスフェロイドには空洞が観察されなかった(図11f)。hPSCは、空洞形成スフェロイドを、無希釈のマトリゲル、マトリゲル:コラーゲン混合物、および懸濁培養でも形成したが、コラーゲン単独では形成しなかった(図12a〜f)。成熟スフェロイドは中空の管腔を取り囲む単層円柱上皮からなり、ポドカリキシンは管腔表面に、閉鎖帯(ZO)-1は頂端細胞間ジャンクションに、そしてβ-カテニンは主に基底外側膜に、極性化されて局在している(図1c〜e)。類似する頂底極性化パターンが未分化hPSCの単層コロニーに観察された(図1fおよび図13a)。同じhPSCから子孫上皮を生成させるために、空洞形成したスフェロイドをグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤CHIR99021(CHIR)で36時間にわたって処理した後、既知組成成長培地中でインキュベートした(図1a〜b)。CHIR処理に続いて、スフェロイド細胞は上皮間葉移行(EMT)を起こしてコンフルエントな単層を形成し、それが集まって10日目までにひだ状になり、曲半透明細管オルガノイドへの間葉上皮移行(MET)を開始した(図1a〜b)。細管はシカクマメレクチン(LTL)と強く反応した。これは腎臓近位尿細管などの一定の成体上皮の性質である。一方、並べて調べた胚盤葉上層スフェロイドはLTLに対してごくわずかなアフィニティーしか有しなかった(図1gおよび図13b)。広く発現する上皮マーカーであるNa,KATPaseは、胚盤葉上層スフェロイドにも細管オルガノイドにも発現した(図13c)。共焦点顕微鏡法により、LTL+細管は管腔ZO-1および基底外側β-カテニンを敷石状に発現し、かすかな頂端ポドカリキシンを伴うことが明らかになった(図1g〜h)。細管に隣接して、第2のZO-1+上皮細胞集団がクラスター化した凝集体を形成し、それはポドカリキシンを強く発現したが、LTLには結合しなかった(図1g)。これらLTL陰性凝集体の共焦点分析により、明白な管腔形成を伴わない、丸い細胞形態および細胞層間のジッパー様構造におけるZO-1とβ-カテニンの強い共局在が明らかになった(図1i)。このように、この方法は、分化中のhPSCの単一接着培養内での、相異なる上皮細胞集団および組織化された構造の生成を可能にした。
空洞形成スフェロイドは未分化胚盤葉上層に相当する
本発明者らは、hPSCスフェロイドを、未分化hPSCの重要な機能的特徴である多能性および自己複製能について試験した。空洞形成スフェロイドを繰り返し解離し、再プレーティングし、サンドイッチ培養した(図2a)。9回の連続継代において、解離した空洞裏打ち細胞は、サンドイッチ培養後に新しい空洞形成スフェロイドを生成するか、あるいは単層条件への最終形態時に平坦なコロニーを生成した(図2b)。3D培養への/からの長い連続継代後でさえ、免疫不全マウスに移植された空洞裏打ち細胞は、3つすべての胚性胚葉に由来する奇形腫組織を効率よく生産した(図2c)。2D培養および3D培養は類似する成長速度を呈し、多能性マーカーは、オクタマー結合転写因子4(OCT4)、性決定領域Yボックス2(SOX2)、NANOG、およびTRA-1-60を含めて、連続サンドイッチ培養細胞において、同一のパターンで発現し続けた(図2d〜f)。このように、スフェロイドは分化したサブタイプではなく未分化の自己複製多能性細胞に相当した。
CHIR処理はスフェロイドを細管オルガノイドに分化させる
先の実験において本発明者らは5~M CHIRが、3D培養では並べてプレーティングした2D培養よりも高レベルのBRY発現を誘導することを観察した(図2j〜k)。多能性持続(mTeSR1)培地における2Dコロニーおよび3Dスフェロイドは、CHIR処理前はほぼ同じ網羅的遺伝子発現プロファイルを有し、3D培養だけが自発的分化を引き起こすわけではないことを示唆した(図16a)。3D培養に対するCHIRの効果をさらに調べるために、本発明者らは、元々は2D培養からの心筋細胞生成のために設計された定方向分化レジメンを応用した。注目すべきことに、3D培養では、結果として得られる間葉が、収縮性心筋細胞ではなく曲細管オルガノイドへと上皮化した(図3a〜b、図1a〜b参照)。これらの効果がCHIR処理に特異的であるかどうかを調べるために、本発明者らは2D培養および3D培養を血清で確率的に分化させた。そのような培養は、ZO-1+LTL-上皮細胞のコンフルエントな単層を生産したが、細管も心筋細胞も生産しなかったことから、CHIR処理はこれらの細胞運命にとって必要であることが示唆された(図16b)。続いてこのプロトコールを最適化することにより、スフェロイド系性、CHIR処理、およびそれに続く827補足培地におけるインキュベーションは、細管分化を誘導するのに十分であることが明らかになり、一方、インスリンおよびWnt阻害工程は、必要でなかった(図16c〜e;最適化されたプロトコールを図1aに示す)。逆に、低CHIR濃度による胚盤葉上層スフェロイドの処理は、より高いCHIR濃度で2D培養において観察されたものと同様に、収縮性心筋細胞の分化をもたらした(図16l)。これらの結果から、3D培養ではCHIR用量応答性が異なり、心筋細胞から細管オルガノイドへのシフトをもたらすことが示唆された。
細管オルガノイドは腎臓の発生およびアーキテクチャーを再現する
新しいプロトコールによる本発明者らの収量は、H9(WA09)hESCから出発して、24ウェルプレートのウェル1つにつきおよそ90の細管凝集体であった(図3a〜b)。腎臓近位尿細管のマーカーであるLTLは、細管構造と強く反応し、細管管腔中に濃縮されて現れた(図3c〜d)。LTLは腎臓細管と強く反応するが、他の上皮とも反応するので、本発明者らは、腎臓および他の器官のマーカーを使って、これらのオルガノイドの、より徹底的な特徴づけを行った。細管または隣接する間葉は、sine oculisホメオボックスホモログ2(SIX2)、LIMホメオボックス1(LHX1)、神経系細胞接着分子1(NCAM)、およびペアードボックス遺伝子2(PAX2)を含む、ネフロン前駆体および後腎胞マーカーを発現する(図3cおよび図17a)。エンドサイトーシス受容体である低密度リポタンパク質関連タンパク質2(LRP2/メガリン)およびキュビリンは、細管セグメントでは頂端に共発現し、LTLと共局在した(図3d)。フローサイトメトリーによる定量および共局在は、LTL+細胞が全培養の約25%に相当し、キュビリンは細管長の約60%に沿ってLTL+細管の約70%において発現していることを示した(図17b〜e)。さらにまた、電子顕微鏡法により、細管には、頂端微絨毛およびタイトジャンクションが観察された(図3e)。さらにまた、本発明者らは、遠位尿細管ネフロンセグメントのマーカーであるE-カドヘリン(EGAD)の発現について、これらの構造を検査した。
細管オルガノイドは長期間生き残り、腎臓生理機能をモデル化する
このプロトコールを使うと、H9 hESCおよび3つの異なるhiPSC株は、近位尿細管、内皮細胞、およびポドサイトを腎臓様の配置で組み込んだオルガノイドを生産し、hESCが最も高い分化効率を示した(図4a〜bおよび図19f)。LTL+細管は、少なくとも120日にわたる長期培養中、安定なままであった(図4c)。生オルガノイドを蛍光性のLTLおよび抗CD31で標識することにより、細管コンパートメントおよび内皮コンパートメントの動態をリアルタイムで視覚化することができた。オルガノイドを解離してサンドイッチ条件で再プレーティングしたところ、1週間後に、SIX2+ネフロン前駆細胞のパッチに近接して、元の細管より小さな新しいLTL+上皮が生じた(図4d〜e)。制限されたネフロン前駆細胞の自己複製能と合致して、継代培養はおよそ3代に限られた。腎毒性薬シス-ジアミンジクロロ白金(II)(シスプラチン)またはゲンタマイシンで処理すると、細管は、近位尿細管傷害の臨床バイオマーカーである頂端腎臓傷害分子1(KIM-1)を発現した(図4f〜g)。KIM-1免疫蛍光は、処理後のオルガノイドの約80%に検出され、2つの異なる抗体を使って確認された(図4g〜h)。対照的に、胚盤葉上層スフェロイドは、シスプラチンに対しても、ゲンタマイシンに対しても、用量依存的な感受性を呈したものの、処理後にKIM-1をアップレギュレートしなかったことから、この特徴は腎臓オルガノイドに特異的であることが示された(図11Oa)。オルガノイド培養はハイスループット実験に馴染む96ウェルフォーマットに小型化することもできた(図4i)。細管オルガノイド培養をさらに解離し、新生児免疫不全マウスの腎臓に移植した。3週間後に、本発明者らは、マウス腎臓皮質内にヒト核抗原陽性(HNA+)上皮構造を同定し、LTL強度は隣接するマウス細管と同等であった(図4j)。ヒトPODXL+、vwF、およびSIX2+細胞も観察されたが、本発明者らは、脈管化された糸球体の形成を認めなかった(図4kおよび図21a)。総合すると、これらの結果により、細管オルガノイドは腎臓細管の微小生理学および移植に関連するインビボおよびインビトロ研究に利用できることが証明された。
腎臓細管と胚盤葉上層空洞における相異なる透過性
多能性上皮および子孫上皮の障壁機能を試験するために、本発明者らは、サイズが異なる蛍光化合物を使って管腔内外への分子拡散動態を視覚化するためのリアルタイムアッセイを開発した。胚盤葉上層スフェロイドでは、2〜4時間にわたって培地に添加されたルシファーイエロー(LY、521Da)が空洞内に徐々に蓄積したのに対し、ローダミンコンジュゲートデキストラン(RD、10,000Da)は管腔から排除され、その代わりに頂端細胞間領域に蓄積して、管腔の周囲に明るいハローを形成した(図5a)。逆に、空洞にマイクロインジェクションされたRDは数時間にわたって検出可能なままであった(図5b)。蛍光化合物をスフェロイドと共に数時間にわたってインキュベートしてから洗い流すと、それらの化合物は最初はそれぞれの分布を保つが、時間と共に強度が衰えたことから、それらは動的な状態を保っており、その場に固定されているわけではないことが示された(図5c〜d)。これらの知見により、胚盤葉上層スフェロイド上皮の頂端細胞間ジャンクションにある、機能的でサイズ選択的な高分子透過性障壁が明らかになった。本発明者らは、分化した細管オルガノイドにおける蛍光高分子の輸送を評価する並行実験を行った。胚盤葉上層スフェロイドとは対照的に、RDは、2〜4時間のインキュベーション後に、オルガノイドの約80%において細管管腔に局在し、24時間の洗い流しチェイス中も会合したままであり、対応するLYの濃縮を伴わなかった(図5e〜f)。アクチン重合およびエンドサイトーシスの阻害剤であるラトランクリン(Lat)Bとの同時インキュベーションはRDの蓄積を著しく低減した(図5g)。輸送カーゴ・フルオレセインメトトレキサート(MTX、979Da)も、RDと同様に、腎臓細管に明るく蓄積したが、洗い流し後はRDより動的に見えた(図5h)。MTXがhPSCスフェロイド空洞に同様に濃縮されることはなかった(図5i)。RDが負荷されたオルガノイドを、タイトジャンクションを破壊するために1時間にわたって0.5mM EDTAで処理したところ、管腔ROシグナル強度が減少したことから、ROは可動性を保っていることが示唆された(図22a)。48時間後、新たに添加したROは同じ細管に元の分布パターンで局在した(図22a)。固定および共局在により、ROはLRP2/メガリンを欠く細管セグメントには濃縮されるが、隣接するLRP2/メガリン+セグメントには濃縮されないことが明らかになったことから、局在化したLRP2/メガリン媒介再吸収が示唆された(図22b)。このように細管オルガノイドは、胚盤葉上層スフェロイドとは異なる、近位尿細管に典型的な輸送特徴を呈した。
ポドカリキシンは胚盤葉上層およびポドサイト形態形成を調節する
本発明者らは、胚盤葉上層および腎臓の両方において上皮細胞分化、極性および管腔形態形成を調節すると提唱されている頂端シアロムチン・ポドカリキシンの役割を明確にするために、この系をさらに応用した。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/Cas9ゲノム編集系を使って、ポドカリキシンノックアウト(PODXL-/-.)hPSCを生成させ、クロマトグラム分析によってクローンを選択した(図6a〜d)。ポドカリキシンに関するイムノブロットでは、約220および80kOaに、PODXL-/-.hPSCには全く存在しない2つの主要バンドが明らかになった(図6eおよび図23a)。ポドカリキシンに関連する2つの多能性マーカーTRA-1-60およびTRA-1-81はノックアウト細胞では約40%低減した(図23b〜e)。PODXL-/-. hPSCは、他の点では同質遺伝子型の無修飾hPSCと識別不可能な奇形腫形成、成長速度、およびコロニーサイズを呈したことから、多能性および自己複製性を保っていることが示された(図6f〜h)。際立ったことに、他の点では同一の遺伝的背景を持つ無修飾対照と比較して、3Dサンドイッチ培養中のPODXL-/-. hPSCは、中空管腔を生産する能力の激しい(約85%)減少を呈し、位相差顕微鏡法ではむしろ中実スフェロイドのように見えた(図6i〜j)。PODXL-/-.スフェロイドが目に見える管腔を形成する稀な例では、その直径が約70%低減した(図6k)。これらの結果は、ポドカリキシンは多能性の維持にとっては必要でないが、胚盤葉上層スフェロイド管腔形成には必要であることを明らかにした。
ゲノム修飾腎臓オルガノイドはPKD特異的嚢胞を形成する
最後に本発明者らは、腎臓細管の拡大による嚢胞の形成を特徴とする多発性嚢胞腎(PKD)を機能的にモデル化する腎臓オルガノイドの潜在能力を調べた。PKD1またはPKD2における両アレル機能喪失型変異は、PKD嚢胞形成に強く寄与すると提唱されている。そこで本発明者らは、CRISPR/Cas9ゲノム編集系を応用することで、hPSC中のPKD1またはPKD2に両アレル短縮型変異を導入した(図8a〜b)。クロマトグラム分析およびイムノブロット法により、ターゲット部位におけるフレームシフト変異が確認され、対応する完全長タンパク質は存在しないことが証明された(図8e〜d)。PKD hPSCは同質遺伝子型対照と同等の自己複製および奇形腫形成を示した(図8e〜f)。PKD hPSCは、対照と類似する形態および管腔直径を持つ空洞形成胚盤葉上層スフェロイドを形成した(図8g)。さらにまた、これらのスフェロイドは同等な効率で細管オルガノイドに分化した(図8h)。これらの実験により、PKD1およびPKD2は多能性の維持にとって必要でなく、胚盤葉上層スフェロイドの空洞形成または形態形成に検出可能な影響を及ぼさないことが明らかになった。
考察
hPSCおよび派生する体細胞系譜の上皮特徴はほとんどわかっていない。未分化hPSCとそれらの分化子孫との両方における上皮の生理機能および形態形成の再構成は、ヒト実験モデルおよび再生治療薬としてのそれらの潜在的可能性を推進する上で重要である。本明細書に記載する培養系およびアッセイは、三次元で未分化hPSCおよび子孫上皮を生成させ、それらを機能的にプロファイリングするための枠組みを確立する。hPSCは、患者特異的な免疫適合性iPSCを含む、よく特徴づけられた、均一で、遺伝的に多様な細胞タイプである。それゆえに、正しく機能する上皮は再生医学への利用可能性を有しうる。
3D培養
細胞株には、H9(WA09)、BJ、HDF、hLR5、hfib2-iPS4、およびhfib2-iPS5(ヒト)、ならびにJ1、R1、およびv6(マウス)を含めた。細胞は、3%成長因子低減GelTrex(Life Technologies)上で、少なくとも1代は、培地(hPSCにはmTeSR1、mESCにはN2/B27サプリメント+2i in、hLR5 iPSCにはhESC条件培地(CM)+白血病抑制因子(LIF)+dox)において、フィーダーフリーで維持し、AccutaseまたはTrypLEを使って解離した。LD-iPSCは、ナイーブ型hLR5 iPSCから、LIFおよびドキシサイクリンを除去し、FGF2で置換することによって誘導した。薄層ゲルサンドイッチコロニーの場合は、10μM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632(StemGent)を補足した培地中、GelTrexがプレコートされた24ウェルプレートまたは4ウェルチャンバースライドのウェル1つにつき、60,000個(プライム型)または30,000個(ナイーブ型)の細胞を、プレーティングした。翌日、培地を、mTeSR1中の1.5%GelTrex 500μLで置き換えた。24時間後に培地を変えた。厚層ゲル培養の場合は、96ウェルプレートのウェル1つにつき、20,000個(胚盤葉上層期)または6,000個(ナイーブ型)の細胞を、75ulの緩衝コラーゲンI(10mM HEPESおよび1×DMEMを含有するもの)、成長因子低減マトリゲル(BD Biosciences)、またはそれら2つの1:1混合物のいずれかに再懸濁し、37度で45分にわたってインキュベートしてから、100ulの培地+Y27632を重層した。薄層ゲルにおける連続継代の場合は、3D培養中の管腔を持つコロニーをプレーティングの72時間後に解離し、6ウェルプレートのウェル1つあたり300,000細胞の密度で再プレーティングし、2D条件または3D条件のいずれかで72時間培養した後、解離、細胞数の計数、および再プレーティングを行った。懸濁培養の場合は、低接着性6ウェルプレートの1つのウェルでmTeSR1培地に20,000個の解離hPSCをプレーティングした。どの細胞についても培地は毎日変えた。
細管オルガノイド分化
散在した孤立スフェロイドコロニーを生産するのに十分な60,000〜120,000個のH9 hPSCをプレーティングした。サンドイッチ化の48時間後に、hPSCスフェロイドを12μM CHIRで36時間にわたって処理してから、RB(Advanced RPMI+Glutamax+B27サプリメント)に変え、その後は3日ごとに置き換えた。あるいは、2D心筋細胞分化について記載されているように、スフェロイドを、インスリンを除いたRB(RBNI)中、12μM CHIRで24時間、RBNIで48時間、5μM IWP2で48時間、RBNIで48時間、その後は3日ごとにRBで処理した。2D腎臓分化の場合は、細胞を一晩プレーティングしてから、APEL培地(StemCell Technologies)中の8μM CHIRで48〜72時間、APEL培地中の30ng/ml FGF2+1μg/mlヘパリンで96時間にわたって処理し、次にAPEL培地中で10〜15日にわたって培養した。確率的分化の場合、2D培養中または3D培養中のhPSCを、DMEM+P/S中の10%ウシ胎児血清(FBS)で処理し、19日にわたって観察した。
免疫蛍光および電子顕微鏡法
3Dアーキテクチャーを保存しつつ固定するために、室温で15分間、等体積の8%パラホルムアルデヒドを培養培地に加えた(最終濃度4%)。固定後に、試料をPBS中で洗浄し、5%ロバ血清(Millipore)/0.3%Triton-X-100/PBS中でブロッキングし、一次抗体と共に3%ウシ血清アルブミン/PBS中で一晩インキュベートし、洗浄し、Alexa-Fluor二次抗体(Invitrogen)と共にインキュベートし、洗浄し、DAPIで染色するか、Vectashield H-1000にマウントした。一次抗体には、OCT4(sc-5279、Santa Cruz)、NANOG(RCAB0004PF、Cosmobio)、ブラキュリ(sc-17745、Santa Cruz)、TRA-1-60(MAB4360、Millipore)、TRA-1-81(MAB4381、Millipore)、アセチル化□-チューブリン(051M4770、Sigma)、ZO-1(339100、Invitrogen)、ポドカリキシン(AF1658およびAF1556、R&D)、CDX2(-88、Biogenex)、AQP1(AB2219、Millipore)、WT-1(sc-192、Santa Cruz)、LHX1(Developmental Studies Hybridoma Bank)、mPODXL(AF1556、R&D)、hPODXL(AF1658、R&D)、HNA(MAB1281、Millipore)、LTL(FL-1321、Vector Labs)、SYNPO(sc-21537、Santa Cruz)、CD31(555444、BD)、crumbs 3(HPA013835、Sigma)、Na,K-ATPase(ab7671、Abcam)、および切断型カスパーゼ3(MAB835、R&D)を含めた。蛍光像は、ニコン落射蛍光90-I(正立)、Eclipse Ti(倒立)、または共焦点C1顕微鏡を使ってキャプチャした。電子顕微鏡法の場合は、5分間の固定後に構造物をプレートから擦過し、300gで4分間ペレット化し、4%ホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒドを含有するカコジル酸緩衝液中にピペッティングすることによって、そのペレットを静かに剥がし、四酸化オスミウムで後固定し、エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。準超薄切片を1mmで切断し、光学顕微鏡検査によって明白な管腔を持つ細管構造を同定するために、トルイジンブルーで染色した。超薄切片(75nm)を切断し、200メッシュ銅グリッドにマウントし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、JEOL JEM-1010透過型電子顕微鏡で調べた。
透過性アッセイ
透過性を試験するために、培地に20mM HEPES+ルシファーイエローカルボヒドラジドカリウム塩(Invitrogen、38μM)およびローダミン-Bイソチオシアネートデキストラン(Sigma、0.5μM)を補足し、共焦点顕微鏡法によって撮像した。マイクロインジェクションの場合は、可視化のために、mTeSR1中の5μMローダミンコンジュゲートデキストラン溶液をフェノールレッド溶液(0.5%、Sigma)で1:1希釈した。Nanoject-2マイクロマニピュレーターでプルドガラスキャピラリーマイクロニードルから2nlをマイクロインジェクションし、広視野落射蛍光により、リアルタイムでモニタリングした。TEERの場合は、希釈マトリゲルがプレコートされた24ウェルトランスウェルプレート(Corning)に、50,000個のhPSCをプレーティングした。細胞が完全にコンフルエントになるまで培地は10日にわたって静かに交換した。TEERはEVOM2デバイス(World Precision Instruments)を使って測定した。
KIM-1誘導
24ウェルプレートの、同様にプレーティングされたウェル中のオルガノイドを、一連の濃度のゲンタマイシンおよびシスプラチンで、36〜48時間にわたって処理し、固定し、KIM-1抗体AKG7.9(Bonventre laboratory)または1400(Biogen)による免疫蛍光のために加工した。KIM-1に関する免疫蛍光は、大規模な細管崩壊を誘発しない中等度の準毒性用量で観察された。
RNA干渉
プレーティングの16時間後に、抗生物質を含まないmTeSR1中で、PODXL、OCT4、またはスクランブル対照に対するDharmacon Smartpool siRNAを、hPSCにトランスフェクトした。10時間後に、培地を変えて、細胞を2Dで培養するか、3D培養のためにサンドイッチ化した。
Cas9/CRISPR変異導入
緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きCas9(Addgene 44719)およびPODXLの第2エクソン
、PKD2の第1エクソン
、またはPKD1の第36エクソン
を標的とするガイドRNA(Addgene 64711)をコードするコンストラクトをH9 hESCに一過性にトランスフェクトし、GFP発現細胞をフローサイトメトリーソーティングによって単離し、クローン拡大し、両アレル機能喪失型インデルを持つクローンをスクリーニングした。6ウェルプレートのウェル1つにつき約200,000個のソートされたhESCを、hESC条件付けmTeSR1+Y27632に入れてプレーティングした。翌朝、Y27632なしで培地を置き換え、細胞をクローン拡大し、PODXL gRNA領域をPCRで増幅した。クロマトグラム配列を手作業で分析し、イムノブロットおよび免疫蛍光によって変異を確認した。
トランスクリプトームプロファイリング
2Dまたは3DでプレーティングされたhPSCを、RNEasy Mini Kit(Qiagen)を使って、並べて調製した。試料をAgilent BioanalyzerでQCすることで、高品質試料のチェックを行った。次に、TruSeq stranded mRNAライブラリーキット(Illumina)を使って、適格試料を調製した。シーケンシングはIllumina NextSeq500 75×75ペアエンドハイアウトプットランで行った。Tophat2を使って試料をhg19リファレンス配列に整列し、Cuffdiffを使って差異的発現を算出した。
RT-PCR
分化時間経過中は、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使って、プレーティング後の2日目、10日目、14日目、および21日目に、RNAを調製した。M-MLV Reverse Transcription System(Promega)を使って、すべての時点からのRNAを並べて逆転写した。定量RT-PCR反応は、cDNA(希釈1:10)、300nMプライマー、およびiQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)とiQ5 Multi-Color Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)とを使用し、β-アクチンをハウスキーピング遺伝子として、二連で行った。
定量および統計的解析
蛍光強度定量では、1回のイメージングセクションにおいて同じ露出で画像を撮影し、同様に加工した。固定試料より容易に管腔が見分けられる生細胞の位相差像において、空洞形成したコロニー(管腔を持つ楕円体)と平坦なコロニー(非楕円体または管腔を持たないもの)とを手作業でスコア化した。アポトーシスについては、切断型カスパーゼ3発現を手作業でスコア化し、核凝縮によって確認し、広視野落射蛍光像あたりの核の総数によって割った。ZO-1面積については、ZO-1を発現している個々のコロニーまたは小領域を手作業でトレースし、NIS Elements(ニコン)を使って表面積を算出した。各コロニーについて、合計したZO-1発現面積を総表面積のパーセンテージとして表してから、それらを平均した。強度を定量するために、NIS Elementsソフトウェア(ニコン)において、生蛍光値を得るために同じ露出で撮像した無作為に選択した構造物を通って、同じ長さのライン走査を行った。平均したライン走査値をエラーバーと共にプロットした。CHIR誘導分化については、Cell Profiler 2.0を使って低倍率免疫蛍光像中に約6000個の個々の細胞を同定し、蛍光強度を自動的に測定した。統計比較には、不当分散(異分散)である2つの試料について両側t検定を利用した。イムノブロットはImageJ Gel Analyzerを使って定量した。
hPSCは3D培養において空洞形成スフェロイドを形成する
未分化hPSCおよび子孫hPSC-KCの組織特異的機能を評価するために、本発明者らは、まず胚盤葉上層スフェロイドを生産し、次に腎臓細管を生産する、hPSCのための接着3D培養系を開発した(図25a)。2層の希釈マトリゲル(0.2mg/mL)の間にサンドイッチされた解離未分化hPSCはコンパクトなボール様コロニーを形成し、48時間までに、これらは内部空洞を形成した(図25b)。成熟スフェロイドは中空の管腔を取り囲む単層円柱上皮からなった(図25b〜c)。スフェロイド細胞では、ポドカリキシン(PODXL)が管腔表面に、閉鎖帯-1(ZO-1)が頂端細胞間ジャンクションに、そしてβ-カテニンが主に基底外側膜に、極性化されて局在した(図25c)。類似する頂底極性化パターンが単層hPSCに観察された(図32a)。
GSK3β阻害はスフェロイドを細管オルガノイドに分化させる
胚盤葉上層スフェロイドを子孫上皮に分化させるために、本発明者らは、元々は2D培養からの心筋細胞生成のために設計された、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)およびWingless関連組込み部位(WNT)シグナリングの逐次的阻害を伴う定方向分化レジメンを応用した。注目すべきことに、スフェロイド細胞は、心筋細胞を形成するのではなく、上皮間葉移行(EMT)を起こしてコンフルエントな単層を形成し、それが集まって10日目までにひだ状になり、曲半透明細管オルガノイドへの間葉上皮移行(MET)を開始した(図26a、図34a〜b)。この新しいプロトコールを最適化することにより、スフェロイド形成、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤CHIR99021による処理、およびそれに続くB27補足培地におけるインキュベーションは、細管分化を誘導するのに十分であることが明らかになり、一方、インスリンおよびWNT阻害工程は、必要でなかった(図34c〜d;最適化されたプロトコールを図265aに示す)。
腎臓オルガノイドは組織特異的な傷害および輸送を再現する
hPSC-KCでは組織特異的な機能または疾患表現型がまだ実証されていない。そこで本発明者らは、近位尿細管傷害の臨床バイオマーカーである腎臓傷害分子1(KIM-1)をアップレギュレートする腎臓オルガノイドの潜在能力を調べた。腎毒性薬シスジアミンジクロロ白金(II)(シスプラチン)またはゲンタマイシンで処理すると、KIM-1免疫蛍光が、オルガノイドの約80%において細管の管腔表面に検出され、それを2つの異なる抗体を使って確認した(図27a〜c)。対照的に、胚盤葉上層スフェロイドは、シスプラチンに対しても、ゲンタマイシンに対しても、用量依存的な感受性を呈したものの、処理後にKIM-1をアップレギュレートしなかったことから、この応答は腎臓オルガノイドに特異的であることが示された(図27d)。注目すべきことに、LTL+細管は、少なくとも120日にわたる長期培養中、安定なままであり、培養を96ウェルフォーマットに小型化することもできた(図27e〜f)。それゆえに、腎臓オルガノイドは、ヒト腎毒性を評価するための長期ハイスループットモデル系になりうる。
ポドカリキシンはタイトジャンクションとは無関係に胚盤葉上層空洞形成を促進する
ポドカリキシンは胚盤葉上層でも腎臓ポドサイトでも高度に発現する頂端シアロムチンである。これらの細胞タイプにおけるポドカリキシンの機能的役割を調べるために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/Cas9ゲノム編集系を使って、ポドカリキシンノックアウト(PODXL-/-)hPSCを生成させた(図36a)。ポドカリキシンに関するイムノブロットでは、約220kDaおよび80kDaに、PODXL-/- hPSCには全く存在しない2つの主要バンドが明らかになった(図29a)。ポドカリキシンに関連する2つの多能性マーカーTRA-1-60およびTRA-1-81はノックアウト細胞では約40%低減した(図36b)。PODXL-/- hPSCは、他の点では同質遺伝子型の無修飾hPSCと識別不可能な奇形腫形成、成長速度、および3Dコロニーサイズを呈したことから、多能性および自己複製性を保っていることが示された(図36c〜e)。際立ったことに、他の点では同一の遺伝的背景を持つ無修飾対照と比較して、3Dサンドイッチ培養中のPODXL-/- hPSCは、中空管腔を生産する能力の激しい(約85%)減少を呈し、位相差顕微鏡法ではむしろ中実スフェロイドのように見えた(図29b〜c)。さらにまた、ポドカリキシン発現は、ポドカリキシン裏打ち空洞を形成する胚盤葉上層期のhPSCおよびmEpiSCでは、空洞を形成しないICM期の細胞よりはるかに高かった(図29d〜e)。これらの結果は、ポドカリキシンは多能性の維持にとっては必要でないが、胚盤葉上層スフェロイド管腔形成には必要であることを明らかにした。
ポドカリキシンはポドサイト様細胞におけるジャンクションを調節する
本発明者らは、次に、ヒト腎臓細胞タイプにおけるポドカリキシンの機能を調べた。成体ヒト腎臓からの組織切片では、ポドカリキシンが糸球体中で高度に発現するが、細管では検出されなかった(図30a)。同様に、hPSC由来の腎臓オルガノイドでは、ポドサイト様細胞だけが高レベルのポドカリキシンを発現した(図30b)。本発明者らは、これらの細胞におけるポドカリキシンおよびジャンクションマーカーの局在パターンを共焦点顕微鏡法によって決定した。ポドカリキシンともう一つのポドサイトマーカーCrumbs3がどちらもポドサイト様凝集体の外側の形質膜を明るく被覆したのに対し、ZO-1、SYNPO、およびβ-カテニンは逆のパターンで共局在して、隣接細胞間に内部ジッパー様軌道を形成した(図30c〜d)。PODXL、Crumbs3、ZO-1、SYNPO、β-カテニン、およびWT1の複合的発現(図26f参照)は、腎臓ポドサイトを除けばどの集団でも起こることが知られておらず、そのような細胞が他の器官においてLTL+細管細胞に沿って現れると予想されることもないだろう。これらの結果はさらに、hPSC-KCポドサイト様細胞が、インビボでのポドサイトの生化学的分析および顕微鏡分析と合致して、Crumbs3などのジャンクションコンポーネントをZO-1から隔離する極性化されたドメインを形成することを明らかにしている。
ゲノム修飾腎臓オルガノイドはPKD特異的嚢胞を形成する
最後に本発明者らは、腎臓細管の拡大による嚢胞の形成を特徴とする多発性嚢胞腎(PKD)を機能的にモデル化する腎臓オルガノイドの潜在能力を調べた。PKD1またはPKD2における両アレル機能喪失型変異は、PKD嚢胞形成に強く寄与すると提唱されている。そこで本発明者らは、CRISPR/Cas9ゲノム編集系を応用することで、hPSC中のPKD1またはPKD2に両アレル短縮型変異を導入した(「PKD hPSC」)。クロマトグラム分析およびイムノブロット法により、ターゲット部位におけるフレームシフト変異が確認され、対応する完全長タンパク質は存在しないことが証明された(図31a〜b)。PKD hPSCは同質遺伝子型対照と同様の奇形腫に分化し、類似するサイズの管腔を持つ胚盤葉上層スフェロイドを形成した(図31c)。これらの実験により、PKD1およびPKD2は多能性の維持にとって必要でなく、胚盤葉上層スフェロイドの空洞形成または形態形成に検出しうる影響を及ぼさないことが明らかになった。
考察
hPSCおよび派生する腎臓細胞の上皮特徴はほとんどわかっていない。これらの細胞タイプにおける上皮の生理機能および形態形成の再構成は、ヒト実験モデルおよび再生治療薬としてのそれらの潜在的可能性を推進する上で重要である。本明細書に記載する培養系およびアッセイは、三次元で未分化hPSCおよび子孫hPSC-KCを生成させ、それらを機能的にプロファイリングするための枠組みを確立する。hPSCは、患者特異的な免疫適合性iPSCを含む、よく特徴づけられた、均一で、遺伝的に多様な細胞タイプである。それゆえに、正しく機能するhPSC由来上皮は、再生医学への利用可能性を有しうる。
Claims (18)
- (i)ある量のヒト多能性幹細胞(hPSC)を用意する工程、
(ii)Y27632を含む第1の培養培地中で該hPSCを少なくとも24時間にわたって培養し、次にマトリゲルの2つの層の間にサンドイッチされた該hPSCを培養して胚盤葉上層スフェロイドを形成させる工程、
(iii)工程(ii)の該胚盤葉上層スフェロイドを少なくとも12 μMのCHIR99021を含む第2の培養培地と少なくとも24時間にわたって接触させる工程、および
(iv)工程(iii)の該胚盤葉上層スフェロイドをB27を含む第3の培養培地で少なくとも48時間にわたって培養する工程
を含む、
細管ヒトオルガノイドをインビトロで生成させる方法であって、
工程(i)〜(iv)の該hPSCは、外因性の線維芽細胞成長因子2(FGF2)、アクチビン、または骨形成タンパク質(Bmp)と接触されず、それによって該胚盤葉上層スフェロイドを細管オルガノイドに分化させる、方法。 - 胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、hPSCが、白血病抑制因子(LIF)およびドキシサイクリンの非存在下で培養される、請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)のhPSCが、約1日、2日、またはそれ以上の日数にわたって、前記第1の培養培地中で前記hPSCを培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(iii)が、約7日、8日、9日、10日、11日、12日、もしくは13日、またはそれ以上の日数にわたって、前記第2の培養培地中で前記hPSCを培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 胚盤葉上層スフェロイドが、ポドカリキシン(PODXL)、閉鎖帯(ZO-1)、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する、請求項1に記載の方法。
- 胚盤葉上層スフェロイドに空洞が形成される、請求項1に記載の方法。
- 細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、請求項1に記載の方法。
- オルガノイドが、ポドカリキシン(PODXL)、閉鎖帯(ZO-1)、およびシカクマメ(lotus tetragonolobus)レクチン(LTL)のうちの1つまたは複数を発現する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって作られる、ある量のオルガノイド。
- (a)マトリゲルの2つの層の間にサンドイッチされたある量の胚盤葉上層スフェロイドを用意する工程、および
(b)該胚盤葉上層スフェロイドを少なくとも12 μMのCHIR99021を含む第1の培養培地と少なくとも24時間にわたって接触させる工程、および次に
(c)該胚盤葉上層スフェロイドをB27を含む第2の培養培地で少なくとも48時間にわたって培養する工程
を含む、細管オルガノイドを生成させる方法であって、
該胚盤葉上層スフェロイドまたはその分化子孫は、外因性の線維芽細胞成長因子2(FGF2)、アクチビン、または骨形成タンパク質と接触されず、それによって該胚盤葉上層スフェロイドを細管オルガノイドに分化させる、方法。 - 細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、請求項10に記載の方法。
- 腎臓オルガノイドが、ポドカリキシン(PODXL)、閉鎖帯(ZO-1)、およびシカクマメレクチン(LTL)のうちの1つまたは複数を発現する、請求項11に記載の方法。
- 胚盤葉上層スフェロイドをIWP2を含む培地で少なくとも48時間にわたって培養する、工程(c)に続く工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 請求項1記載の方法によって生成されたある量の細管オルガノイドを用意する工程、
1つまたは複数の化合物を細管オルガノイドに加える工程、
細管オルガノイドの表現型または活性の変化を判定する工程、および
前記変化を細管オルガノイドに対する前記化合物の効果と相関させる工程であって、それによって、細管オルガノイドに対する効果に関して前記1つまたは複数の化合物をスクリーニングする、工程
を含む、細管オルガノイドに対する効果に関して化合物をスクリーニングする方法。 - 表現型または活性の変化を判定する工程が、細管オルガノイドにおいて1つまたは複数のマーカーを検出することを含む、請求項14に記載の方法。
- 1つまたは複数のマーカーが腎臓傷害分子(KIM-1)を含む、請求項15に記載の方法。
- KIM-1発現の増加が前記化合物の毒性効果と相関する、請求項16に記載の方法。
- 細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、請求項14に記載の方法。
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