CN108342463B - 一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒 - Google Patents
一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒，属于分子生物学和基因诊断技术领域。本发明提供的试剂盒包括：样本稀释液、抗干扰PCR反应液、抗干扰聚合酶、引物探针混合液、阳性对照品和阴性对照品；所述样本稀释液为包括氢氧化钠和氯化钠的水溶液；所述抗干扰PCR反应液包括荧光PCR缓冲液、dNTPs和抗干扰剂。采用本发明的试剂盒进行基因的检测，无需对样本进行核酸提纯，检测快速、简便、大大缩短了检测周期，有效提高了检测效率与检测通量。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因诊断技术领域，具体涉及一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)，由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。PCR是以一段特定的核酸分子为模板、通过引物延伸重复性地合成双链DNA的过程，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术非常敏感，理论上仅需要一个核酸分子即可扩增。PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
目前核酸纯化依然是在整个分子诊断领域的最大的瓶颈，正由于该步骤严重制约了分子诊断试剂的发展，传统的核酸提取从收集的待分析样本中纯化和浓缩核酸，即样本制备是成功进行PCR反应的首要步骤。通常分子生物学实验室进行血液样本中DNA检测时，在PCR扩增前，均需要血液样本中的DNA进行提取。以常规使用的酚氯仿提取法为例，整个DNA提取过程耗时近2h；如果使用商品化的DNA提取试剂盒，一个提取过程也需花费1h左右的时间。常规DNA提取除了各种试剂以外，还需要配备一些仪器设备，如恒温水浴锅，高速离心机等。如果使用商品化试剂盒进行DNA提取，则成本还要提高。此外，常规的DNA提取过程需要反复打开管盖，吸去弃液，加入新的试剂，最后还需要将上清转移至另外的试管中。人工操作步骤多且繁琐。平行提取多份样本时，交叉污染的几率更大。即使不提取核酸而使用高温前处理步骤释放血液样本中DNA，也存在浓缩及开管等易引起交叉污染的步骤。样本DNA的提取步骤繁琐，操作时间长且容易造成污染，现有技术并没有解决样本DNA的提取问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒。采用本发明的试剂盒进行基因的检测，无需对样本进行核酸提纯，检测快速、简便、大大缩短了检测周期，有效提高了检测效率与检测通量。
本发明提供了一种免于核酸纯化的荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：
样本稀释液、抗干扰PCR反应液、抗干扰聚合酶、引物探针混合液、阳性对照品和阴性对照品；
所述样本稀释液为包括氢氧化钠和氯化钠的水溶液；
所述抗干扰PCR反应液包括荧光PCR缓冲液、dNTPs和抗干扰剂。
优选的是，所述样本稀释液中，氢氧化钠的浓度为0.01～0.2M，氯化钠的浓度为20～200mM。
优选的是，所述荧光PCR缓冲液包括100～600mM的Tris、10～50mM的MgCl2、300～600mM的KCl和0.3～0.7mg/mL的BSA。
优选的是，所述抗干扰剂包括山梨糖醇、氯化四甲铵、二甲基亚砜和吐温-20中的一种或多种。
优选的是，所述抗干扰剂在抗干扰PCR反应液中的质量浓度为1～5％。
优选的是，所述抗干扰聚合酶为经过化学修饰的DNA聚合酶；所述化学修饰为采用酸酐对赖氨酸的氨基进行修饰。
优选的是，所述酸酐包括宁康酸酐或马来酸酐。
本发明提供了一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒。采用本发明的试剂盒进行基因的检测，无需对样本进行核酸提纯，直接使用样本稀释液进行稀释后即可对样本进行直接核酸扩增检测。本发明具有快速、简便、有效地进行人基因组的检测，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，有效提高了检测效率与检测通量。利用本发明进行血液样本扩增，省略了DNA提取纯化这一繁琐的过程，从收到样本到上机扩增、电泳、检测出结果，整个过程可控制在1h以内，极大地提高了检测效率，节约了实验时间。使用本发明试剂盒直接进行样本的扩增，无需提取纯化DNA。其配制的试剂成本低，全部检测成本是荧光PCR扩增成本的三分之一。与起始模板为DNA的PCR反应相比，本发明提供的试剂盒可直接对血液样本进行扩增，不需浓缩，也不需进行DNA提取，仅在PCR反应液配制时将样本加入即可，大大降低了污染的可能。本发明提供的试剂盒中，强电解质氢氧化钠能够和样本中的蛋白质产生反应，可以使蛋白质发生凝聚现象，可以使蛋白干扰物沉淀下来，初步去除对PCR反应的抑制；抗干扰剂的添加能使样本中残留的蛋白进一步得到变性或失活，可完全去除了干扰物对于PCR反应的抑制；本发明的抗干扰聚合酶对上述抗干扰PCR反应液中的组分不敏感，酶活性高；本发明试剂盒各成分的联合使用，能够实现对检测用样本直接扩增、操作简便易行，省略了传统的DNA提取步骤，节约了检测成本，降低了样本的需要量，具体地，当所述样本为血液样本时，本发明血液样本仅需5μL以内。本发明提供的试剂盒减少了样本交叉污染的可能，缩短检测时间，提高了检测效率，无需特殊仪器设备，仅需PCR实验室最基本的仪器即可开展检测，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例4提供的ALDH2纯和突变样本曲线分析图；
图2为本发明实施例4提供的ALDH2纯和野生样本曲线分析图；
图4为本发明实施例5提供的HPV16型样本曲线分析图；
图3为本发明实施例5提供的HPV18型样本曲线分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种免于核酸纯化的荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：
样本稀释液、抗干扰PCR反应液、抗干扰聚合酶、引物探针混合液、阳性对照品和阴性对照品；
所述样本稀释液为包括氢氧化钠和氯化钠的水溶液；
所述抗干扰PCR反应液包括荧光PCR缓冲液、dNTPs和抗干扰剂。
在本发明中，所述样本包括人体外周血样本、脐血样本、羊水样本、口腔脱落细胞样本或生殖道分泌物样本。在本发明中，所述样本稀释液对样本的稀释倍数优选为10～500倍，更优选为15～40倍。本发明所述人体外周血样本、脐血样本、羊水样本、口腔脱落细胞样本或生殖道分泌物样本直接加入到样本稀释液中即可。本发明对所述样本的获取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的人体外周血样本、脐血样本、羊水样本、口腔脱落细胞样本或生殖道分泌物样本采取方法即可。
在本发明中，所述试剂盒检测的基因包括人类基因，所述人类基因包括：人类HLA-B*5801基因、人类HLA-B*27基因、人类MHTFR基因、人类MTRR基因、人类CYP2D6*10基因、人类CYP2C9*3基因、人类ADRB1(1165G>C)基因、人类AGTR1(1166A>C)基因、人类CYP3A5*3基因、人类NPPA(T2238C)基因或人类ACE(I/D)基因等。
在本发明中，所述样本稀释液中，氢氧化钠的浓度为0.01～0.2M，更优选为0.08～0.15M，最优选为0.1M；氯化钠的浓度为20～200mM，更优选为50～100mM，最优选为80mM。在本发明中，所述样本稀释液中的氢氧化钠是强电解质，能够和样本中的蛋白质产生反应，可以使蛋白质发生凝聚现象，使蛋白干扰物沉淀下来，初步去除干扰物对PCR反应的抑制。在本发明中，所述氯化钠能够影响样本中蛋白质的溶解度，使大部分干扰物发出聚集沉淀。
在本发明中，所述抗干扰PCR反应液包括荧光PCR缓冲液、dNTPs和抗干扰剂。在本发明中，所述荧光PCR缓冲液包括100～600mM的Tris、10～50mM的MgCl2、300～600mM的KCl和0.3～0.7mg/mL的BSA。在本发明中，所述Tris的浓度优选为200～500mM，更优选为450mM；在本发明中，所述MgCl2的浓度优选为20～35mM，更优选为30mM；在本发明中，所述KCl的浓度优选为450～550mM，更优选为520mM；在本发明中，所述BSA的浓度优选为0.4～0.6mg/mL，更优选为0.5mg/mL。本发明对所述dNTPs的来源和浓度没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PCR反应中常规dNTPs的来源和浓度即可。在本发明中，所述荧光PCR缓冲液、dNTPs和抗干扰剂混合后作为抗干扰PCR反应液。
在本发明中，所述抗干扰剂包括山梨糖醇、氯化四甲铵、二甲基亚砜和吐温-20中的一种或多种。在本发明中，所述抗干扰剂能够使样本中残留的蛋白进一步得到变性或失活，可完全去除干扰物对于PCR反应的抑制。本发明对所述山梨糖醇、氯化四甲铵、二甲基亚砜和吐温-20的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的山梨糖醇、氯化四甲铵、二甲基亚砜和吐温-20常规市售产品即可。在本发明中，所述抗干扰剂在抗干扰PCR反应液中的质量浓度为1～5％，更优选为2～4％。本发明对山梨糖醇、氯化四甲铵、二甲基亚砜和吐温-20的组合方式和用量比例没有特殊的限定。
在本发明中，所述抗干扰聚合酶为经过化学修饰的DNA聚合酶；所述化学修饰为采用酸酐对赖氨酸的氨基进行修饰。本发明对所述DNA聚合酶的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA聚合酶即可。在本发明中，所述酸酐包括宁康酸酐或马来酸酐。在本发明中，所述抗干扰聚合酶对抗干扰反应液中的组分不敏感，在含有山梨糖醇、氯化四甲铵、二甲基亚砜、吐温-20等成分的反应液中不会失活，能够有效地抵抗这些物质的影响。在本发明中，所述样本稀释液、抗干扰PCR反应液和抗干扰聚合酶的联合使用能够使样本免于提取，提高检测效率，降低污染的风险。
本发明对所述引物探针混合液中引物和探针的序列和来源没有特殊的限定。本发明所述和探针根据所检测的样本、基因进行常规设计即可。本发明所述引物、探针采用本领域技术人员熟知的生物公司进行常规合成即可。
在本发明中，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：
1)采用样本稀释液对样本进行稀释，得到稀释样本；
2)将抗干扰PCR反应液、引物探针混合液、阳性对照和阴性对照混合配制成荧光PCR反应液；
3)取步骤1)所述稀释样本与荧光PCR反应液混合，直接在荧光PCR仪上进行扩增并检测。
在本发明中，所述试剂盒检测的反应程序优选为98℃3min；95℃15sec，62℃30sec，40个循环。
在本发明中，所述试剂盒在检测过程中，每20μL反应体系优选包括10×PCR缓冲液2μL、2mM dNTPs 1μL、10μM引物和探针各0.5～1μL、抗干扰剂1～2μL和抗干扰聚合酶0.4～0.6μL。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
试剂盒的配制：
样本稀释液1：
0.1M氢氧化钠、100mM氯化钠
PCR反应液1如表1所示：
表1 PCR反应液组分1
当所述试剂盒用于B5801基因检测时，所使用的引物和探针序列如表2所示：
表2 B5801基因检测用引物和探针
实施例2
样本稀释液2：
0.04M氢氧化钠200mM氯化钠
PCR反应液2如表3或表4所示：
表3 PCR反应液组分2-1
表4 PCR反应液组分2-2
| 组分 | (μl) |
| 10×PCRBuffer | 2 |
| 2mMdNTPs | 1 |
| 10μM引物1 | 1 |
| 10μM引物2 | 1 |
| 10μM荧光探针2 | 1 |
| 内参基因引物1 | 1 |
| 内参基因引物2 | 1 |
| 内参基因荧光探针 | 1 |
| DMSO(二甲基亚砜) | 1 |
| 吐温-20 | 1 |
| 山梨糖醇 | 2 |
| 抗干扰聚合酶 | 0.6 |
当所述试剂盒用于ALDH2基因检测时，所使用的引物和探针序列如表5所示：
表5 ALDH2基因检测用引物和探针
实施例3
本发明试剂盒进行核酸扩增主要包括如下几个步骤：
人外周血样本的采集
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血1～2毫升，注入含有EDTA抗凝剂的采血管中，立即轻轻颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。
样本的稀释
样本稀释液：
0.1M氢氧化钠、100mM氯化钠
取10μL采集好的人外周血样本加入到290μL样本稀释液中，充分震荡混匀，瞬时离心收集液体至管底。
反应液配制
抗干扰PCR反应液、引物探针混合液、阳性对照和阴性对照混合配制成荧光PCR反应液，震荡混匀并分装至八连管。
加模板及核酸扩增
在反应液中直接加入4μL稀释后的样本，充分混匀，瞬时离心收集液体至管底。
按表6所示程序进行核酸扩增：
表6 PCR扩增程序
检测荧光选择：FAM和VIC(HEX)，内标CY5。淬灭基团选择none，参比荧光选择none。
结果分析
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阳性对照品FAM和VIC(HEX)通道Ct值均应小于35.0，且呈典型的S型曲线；阴性对照品FAM和VIC(HEX)通道Ct值无数值，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。FAM通道和VIC(HEX)通道有一个通道无ct值且内标CY5通道ct值≤38.0，即判断为HLA-B*5801基因阴性；如内标CY5通道无ct值，此样本需重检。FAM通道和VIC(HEX)通道ct值均≤38.0，则判断为HLA-B*5801基因阳性；FAM通道和VIC(HEX)通道有一个通道38.0＜Ct＜40.0，此样本建议重做。重做结果若FAM通道和VIC(HEX)通道均满足Ct≤38.0，则为HLA-B*5801阳性；否则为HLA-B*5801阴性。
实施例4
利用人口腔脱落细胞检测ALDH2基因型
(1)人口腔脱落细胞样本的采集
撕开口腔拭子外包装，小心取出口腔拭子(注意：整个取出过程中手或其他部位不能接触棉头部分)。握住手柄，将拭子伸进左侧口腔，使棉头部充分接触左侧脸颊内部/左侧上下牙床处粘膜，用刷牙的力度上下擦动，同时，旋转拭子，让棉头部充分接触口腔粘膜，重复此动作20次以上。打开采集管盖，然后按压拭子另一头，使棉头从拭子上分离下来，装回采集管并盖紧，完成取样。
(2)样本的稀释
将棉头直接放入样本稀释液中，充分混匀备用。
(3)反应液配制
根据需要检测样本数量计算所需8联管孔数n[n＝测试数*2+对照数]，可根据测试需要剪取所需要的8联管，相邻2孔为一个完整检测(如：1和2、3和4、5和6、7和8)，然后转移到样本处理区。
(4)加模板及核酸扩增
在8联管中加入2μl上述口腔脱落细胞、2μl阳性对照和2μl阴性对照，盖紧8联管管盖，振荡混匀后微离心，最后将8联管转移至PCR检测区。
按表7所示程序进行核酸扩增：
表7 PCR扩增程序
检测荧光选择：FAM和VIC(HEX)，内标CY5。淬灭基团选择none，参比荧光选择none。
(5)结果分析
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阳性对照Ct值应小于30，阴性对照Ct无数值，样本的内标通道检测Ct值应小于或等于38，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。样本结果解释如表8和图1、2所示：
表8样本检测结果
请对从表8和图1、图2能够得出的结论进行文字上的总结。从检测结果来看，图1样本反应液1的CT值＞38，而反应液2的CT值≤38，因此可以判定该检测结果为ALDH2-GG纯合突变，图2样本反应液1的CT值≤38，反应液2的CT值＞38，因此可以判定该检测结果为ALDH2-AA纯合野生型(图1为ALDH2-GG纯合突变，图2为ALDH2-AA纯合野生)
实施例5
利用人生殖道分泌物检测HPV病毒基因型
(1)人生殖道分泌物样本的采集
采样前先用棉拭子将宫颈口过多的分泌物轻轻擦拭干净，更换棉拭子，用细胞保存液浸润的棉拭子或宫颈脱落细胞采样毛刷紧贴宫颈口粘膜，顺时针转动3～5周，以取得宫颈脱落细胞。慢慢取出棉拭子或毛刷，将其放入备有细胞保存液的样品管中，在样品管上标记样本名称及类型。
(2)样本的稀释
取1mL上述细胞保存液12000rpm离心10分钟后，去除上清，在沉淀中加入100微升样本稀释液，充分混匀备用。
(3)反应液配制
从试剂盒中取出HPV主反应液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数[n＝样本数+2(对照品数)]。每人份反应体系配制如表9所示：
表9反应体系
| 试剂 | HPV抗干扰反应液 | 抗干扰聚合酶 |
| 用量 | 35.6μl | 0.4μl |
按n人份计算上述各试剂的用量，加入一适当体积的离心管中，充分混匀后，按36μl量分装到PCR反应管中，转移至样本处理区。
(4)加模板及核酸扩增
按一定顺序向反应液中分别加入4μl的阴性对照、HPV阳性对照、样品稀释液，盖紧反应管，转移至PCR扩增区。
按表10所示程序进行核酸扩增：
表10 PCR反应程序
检测荧光选择：FAM和VIC(HEX)，内标CY5。淬灭基团选择none，参比荧光选择none。
(5)结果分析
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阳性对照Ct值应小于32，阴性对照Ct无数值，样本的内标通道检测Ct值应小于或等于38，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。样本结果解释如表11和图3、4所示：
表11样本检测结果
请对由表6和图1、2能够得出的结论进行文字上的总结。从检测结果来看，图3的反应液VIC通道检测结果Ct≤38而FAM通道检测结果Ct＞38，因此可以判断该样本为HPV 18型，图4的反应液FAM通道检测结果Ct≤38而VIC通道检测结果Ct＞38，因此可以判断该样本为HPV 16型，(图3为HPV18型，图4为HPV16型)
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州泰领生物技术有限公司
<120> 一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒
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Claims (1)
1.一种免于核酸纯化的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成为：
样本稀释液、抗干扰PCR反应液、抗干扰聚合酶、引物探针混合液、阳性对照品和阴性对照品；
所述样本稀释液为包括氢氧化钠和氯化钠的水溶液；所述样本稀释液中，氢氧化钠的浓度为0.01～0.2M，氯化钠的浓度为20～200mM；
所述抗干扰PCR反应液包括荧光PCR缓冲液、dNTPs和抗干扰剂；
所述荧光PCR缓冲液为100～600mM的Tris、10～50mM的MgCl2、300～600mM的KCl和0.3～0.7mg/mL的BSA；
所述抗干扰剂为山梨糖醇、二甲基亚砜和吐温-20；
所述抗干扰剂在抗干扰PCR反应液中的质量浓度为1～5％；
所述抗干扰聚合酶为经过化学修饰的DNA聚合酶；所述化学修饰为采用酸酐对赖氨酸的氨基进行修饰；所述酸酐为马来酸酐。
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