JP2022537823A - 共有結合型多重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、高い安定性を有する新規二重特異性抗体および三重特異性抗体、ならびにその治療の用途を提供する。
Description
本発明は、高い安定性を有する新規共有結合多特異性抗体およびその治療の用途に関する。
本願は、２０１９年６月２０日に出願され、出願番号が２０１９１０５３５７０３．７であり、発明の名称が「共有結合型多重特異性抗体」である中国特許出願の優先権を主張するものであり、そのすべての内容が援用により本明細書に組み込まれる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、癌や他の疾患に対する臨床的な実用面で広範な診断と治療の可能性を持っている。モノクローナル抗体は、裸の抗体の形をとるか、細胞毒性物質（例えば、放射性同位元素、薬物、毒素またはプロドラッグ変換酵素）と結合する結合物の形をとるかにかかわらず、癌免疫療法において重要な役割を果たす。これらの方法はいずれも治療効果の評価過程にあり、ある程度の発展があり、そしてある程度の臨床的な成功を得ている。裸のｍＡｂは、癌細胞上で過剰発現した細胞表面蛋白質に結合した後、細胞毒性作用を誘導することにより、臨床的応答を達成できる。これらの治療作用は、プログラム細胞死（アポトーシス）を介した腫瘍増殖の制御または抗腫瘍免疫反応の誘導により達成されることが研究で示されている。
抗体は特異的に標的化し、エフェクター機能を媒介するという独特な性質により、１９７５年、Ｃｅｓａｒ ＭｉｌｓｔｅｉｎとＧｅｏｒｇｅｓ Ｊ．Ｆ．Ｋｏｈｌｅｒの単クローン抗体技術の発明以降、すでに疾病に対する標的免疫療法の抗体薬物が研究開発されている。現在６０超の抗体ベースのバイオ医薬品が承認されており、その世界年間売上が５０億ドルを超えている。現在の抗体薬物の成功的な応用はすでに薬物産業を形成し、公共健康を大いに改善させた。新しい標的に対する抗体薬物の研究開発以外に、最適な併用療法と革新的な二重特異性抗体の研究開発にも広大な将来性がある。
治療用抗体は２０年以上臨床的に使用されている。現在、臨床で使用されている抗腫瘍抗体薬には、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（１９９７））、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（１９９８））、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（２０００）、Ｃａｍｐａｔｈ（２００１）、Ｚｅｖａｌｉｎ（２００２）、Ｂｅｘｘｅｒ（２００３）、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ（２００４））、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ（２００４））、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（２００６）；Ａｒｚｅｒｒａ（２００９）；Ｂｅｎｌｙｓｔａ（２０１１）；Ｙｅｒｖｏｙ（２０１１）；Ａｄｃｅｔｒｉｓ（２０１１）；Ｐｅｒｊｅｔａ（２０１２）；Ｋａｄｃｙｌａ（２０１３）、Ｏｐｄｉｖｏ（２０１４）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（２０１４）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（２０１６）が含まれる。これらの抗体は、主にＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０またはＶＥＧＦ、および最近発見されたＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１を標的とする。
多機能抗体は、複雑な設計と分子工学により、複数の抗原の結合能力を有する従来の抗体に基づいて構築される。実際的な応用面から言えば、単一の多機能抗体分子による治療効果は、いくつかの従来の抗体の組み合わせによる治療効果と同じである。ただし、多機能抗体の利点は、いくつかの従来の抗体の単純な重ね合わせをはるかに超えている。新規でかつただ１つのメカニズムにより、選択した複数の標的の同時接合は、従来の抗体より優れた有益な作用をもたらすことができる。例えば、ＣＤ３とＣＤ１９を標的とするブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、ＣＤ３×ＣＤ１９、Ａｍｇｅｎ）は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞を殺傷する面で、そのＣＤ３－でＦｖを認識することによってＴ細胞を有効に接合し、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）などの適応症において、従来の抗体を超える著しい治療効果を示した。ブリナツモマブは２０１４年に米国ＦＤＡよりＡＬＬ治療薬として発売が許可された。
二重特異性抗体は、化学的架橋、ハイブリドーマまたはトランスフェクション腫瘍のハイブリッド、あるいは２つの異なるＦａｂ’のヒンジにおけるジスルフィドの交換によって生成される。１番目の方法では、異種でかつ定義が難しい製品を生成する。２番目の方法では、複数のハイブリッド抗体の副産物から得られた二重特異抗体を大量に精製する必要があり、この精製ステップは細胞架橋活性に影響を及ぼす可能性がある。ジスルフィド交換法は、実質的にはＦ（ａｂ’）２にのみ適用され、また、これによりモノクローナル抗体の酵素消化分解の影響を受けやすいという制限がある。そして、Ｆａｂ’同士は親和性がほとんどないため、Ｆａｂ’間のジスルフィド結合を形成するには非常に高いタンパク質濃度が必要である。ジスルフィド交換法は、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いることによって改良され、酸化前にＦａｂ’の一方を用いて他方を修飾することにより、ホモ二量体化の発生を低減する。しかしながら、このような改良を行っても、５０％以上の収率では、ヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２が滅多に生じない。しかしながら、好ましくない安全性の問題、低い反応速度、限られた有効性が、現在の抗体薬物の現状である。これらの不利な要因は、抗体のエピトープが自己抗原に由来することによる正常組織／細胞への非標的効果、免疫エフェクター細胞の抑制性微小環境、予想されなかったＦｃ媒介のエフェクター機能などに由来する可能性がある。したがって、この分野では、良好な治療的有効性を有する高純度の多重特異性（例えば、三重特異性）抗体が依然として必要である。
一側面では、本発明は以下を含む工学的抗体を提供する。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、システインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む第３ポリペプチド。
ここで、
ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成し、前記第１標的はＣＤ３である。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、システインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む第３ポリペプチド。
ここで、
ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成し、前記第１標的はＣＤ３である。
ＶＬ２とＶＨ２は結合して第２標的に結合できるドメインを形成し、前記第２標的はＣＤ１９である。
ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結され、かつＶＬ２とＶＨ２はそれぞれ独立に、電荷を有するアミノ酸を導入する１つ以上の置換を含み、前記電荷を有するアミノ酸の置換は、ホモ二量体の形成に静電学的に不利である。
前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。
上記の抗体では、ＶＬ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１であり、ＶＨ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２であり、ＶＬ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３であり、ＶＨ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４である。前記第１ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５であり、前記第２ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６であり、前記第３ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７である。
他の側面では、本発明は以下を含む工学的抗体をさらに提供する。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第３標的に結合する第３重鎖可変ドメインＶＨ３およびＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＨ３とＣＨ１はリンカーによって連結される第３ポリペプチド、および
（ｉｖ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、前記第３標的に結合する第３軽鎖可変ドメインＶＬ３、およびシステインを含む軽鎖固定ドメインＣＬを含み、ここで、ＶＬ３とＣＬはリンカーによって連結される第４ポリペプチド。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第３標的に結合する第３重鎖可変ドメインＶＨ３およびＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＨ３とＣＨ１はリンカーによって連結される第３ポリペプチド、および
（ｉｖ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、前記第３標的に結合する第３軽鎖可変ドメインＶＬ３、およびシステインを含む軽鎖固定ドメインＣＬを含み、ここで、ＶＬ３とＣＬはリンカーによって連結される第４ポリペプチド。
ここで、ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成する。
ここで、ＶＬ２とＶＨ２は結合して第２標的に結合できるドメインを形成する。
ここで、ＶＬ３とＶＨ３は結合して第３標的に結合できるドメインを形成する。
ここで、ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結され、かつ、ＶＬ２とＶＨ２はそれぞれ独立に、電荷を有するアミノ酸を導入する１つ以上の置換を含み、前記電荷を有するアミノ酸の置換は、ホモ二量体の形成に静電学的に不利である。
ここで、ＣＨ１とＣＬはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。
ここで、前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。
上記の抗体の一実施態様では、前記第１標的はＣＤ３であり、前記第２標的はＣＤ１９であり、前記第３標的はＣＤ２０である。ＶＬ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１であり、ＶＨ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２であり、ＶＬ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３であり、ＶＨ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４であり、ＶＬ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８であり、ＶＨ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９である。前記第１ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０であり、前記第２ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１であり、前記第３ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１２であり、前記第４ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３である。
上記の抗体の一実施態様では、前記第１標的はＣＤ２０であり、前記第２標的はＣＤ１９であり、前記第３標的はＣＤ３である。ＶＬ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８であり、ＶＨ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９であり、ＶＬ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３であり、ＶＨ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４であり、ＶＬ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１であり、ＶＨ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２である。前記第１ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４であり、前記第２ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５であり、前記第３ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６であり、前記第４ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７である。
本発明の新しい特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に挙げられる。本発明の特徴および利点は、下記の具体的な実施形態の部分および図面を参照することによりさらに詳細に明らかになるだろう。下記の具体的な実施形態には、本発明の原理が適用される例示的な実施形態が示される。本発明の図面は以下の通りである。
全般的に、本発明は、ＶＨとＶＬの間に位置するジスルフィド結合、それらの静電性質に基づいて選択するアミノ酸に出現する突然変異およびＦｃ断片に位置するノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）構造を有する、二重特異性工学的抗体および三重特異性工学的抗体を提供する。
一側面では、本発明は以下を含む二重特異性工学的抗体を提供する。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、システインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む第３ポリペプチド。
ここで、
ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成し、前記第１標的はＣＤ３である。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、システインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む第３ポリペプチド。
ここで、
ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成し、前記第１標的はＣＤ３である。
ＶＬ２とＶＨ２は結合して第２標的に結合できるドメインを形成し、前記第２標的はＣＤ１９である。
ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結され、かつＶＬ２とＶＨ２はそれぞれ独立に、電荷を有するアミノ酸を導入する１つ以上の置換を含み、前記電荷を有するアミノ酸の置換は、ホモ二量体の形成に静電学的に不利である。
前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。
一部の実施形態では、第１ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ＶＬ２－リンカー－ＶＨ１の構造を有する。
一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ＶＬ１－リンカー－ＶＨ２－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３の構造を有する。
一部の実施形態では、第３ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３の構造を有する。
前記第１ポリペプチドのリンカー、前記第２ポリペプチドのリンカー、および前記第３ポリペプチドのリンカーは、ＲＴＶＡＡ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ、またはＧＧＳＧＧＳＧＧＳの配列を有する。
前記第２ポリペプチド中のヒンジ領域および前記第３ポリペプチド中のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡからのヒンジを含む。
本発明の１つの例示的な実施形態において、ＶＬ２は、ＣｙｓがＧｌｎ１００を置換し、ＬｙｓがＧｌｎ３８を置換するアミノ酸置換を含み、ＶＨ２は、ＡｓｐがＧｌｎ３９を置換し、ＣｙｓがＧｌｙ４４を置換するアミノ酸置換を含む。前記第２ポリペプチドのＣＨ３ドメインおよび前記第３ポリペプチドのＣＨ３ドメインのうちの１つは、ＴｒｐがＴｈｒ３６６を置換するものを含み、他のＣＨ３ドメインは、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＶａｌがそれぞれＴｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、Ｔｙｒ４０７を置換するものを含む。
本発明の二重特異性抗体は同時に２つの抗原を識別でき、それはＶＨとＶＬの間に位置するジスルフィド結合およびそれらの静電性質に基づいて選択するアミノ酸に出現する突然変異を有し、一部の実施方式において、第２ポリペプチド鎖のＣＨ２ＣＨ３ドメインおよび第３ポリペプチド鎖のＣＨ２ＣＨ３ドメインはノブインホール構造を形成する。
他の側面では、本発明は以下を含む三重特異性工学的抗体を提供する。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第３標的に結合する第３重鎖可変ドメインＶＨ３およびＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＨ３とＣＨ１はリンカーによって連結される第３ポリペプチド、および
（ｉｖ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、前記第３標的に結合する第３軽鎖可変ドメインＶＬ３、およびシステインを含む軽鎖固定ドメインＣＬを含み、ここで、ＶＬ３とＣＬはリンカーによって連結される第４ポリペプチドである。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第３標的に結合する第３重鎖可変ドメインＶＨ３およびＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＨ３とＣＨ１はリンカーによって連結される第３ポリペプチド、および
（ｉｖ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、前記第３標的に結合する第３軽鎖可変ドメインＶＬ３、およびシステインを含む軽鎖固定ドメインＣＬを含み、ここで、ＶＬ３とＣＬはリンカーによって連結される第４ポリペプチドである。
ここで、ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成する。
ここで、ＶＬ２とＶＨ２は結合して第２標的に結合できるドメインを形成する。
ここで、ＶＬ３とＶＨ３は結合して第３標的に結合できるドメインを形成する。
ここで、ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結され、かつ、ＶＬ２とＶＨ２は独立に、電荷を有するアミノ酸を導入する１つ以上の置換を含み、前記電荷を有するアミノ酸の置換は、ホモ二量体の形成に静電学的に不利である。
ここで、ＣＨ１とＣＬはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。
ここで、前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。
一部の実施形態では、第１ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ＶＬ２－リンカー－ＶＨ１の構造を有する。
一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ＶＬ１－リンカー－ＶＨ２－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３の構造を有する。
一部の実施形態では、第３ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ＶＨ３－リンカー－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３の構造を有する。
一部の実施形態では、第４ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、ＶＬ３－リンカー－ＣＬの構造を有する。
前記第１ポリペプチドのリンカー、前記第２ポリペプチドのリンカー、前記第３ポリペプチドのリンカー、および前記第４ポリペプチドのリンカーは、ＲＴＶＡＡ、またはＧＧＧＧＳ、またはＧＧＳＧＧＳ、またはＧＧＳＧＧＳＧＧＳの配列を有する。
前記第２ポリペプチド中のヒンジ領域および前記第３ポリペプチド中のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡからのヒンジを含む。
本発明の１つの例示的な実施形態において、ＶＬ２は、ＣｙｓがＧｌｎ１００を置換し、ＬｙｓがＧｌｎ３８を置換するアミノ酸置換を含み、ＶＨ２は、ＡｓｐがＧｌｎ３９を置換し、ＣｙｓがＧｌｙ４４を置換するアミノ酸置換を含む。前記第２ポリペプチドのＣＨ３ドメインおよび前記第３ポリペプチドのＣＨ３ドメインのうちの１つは、ＴｒｐがＴｈｒ３６６を置換するものを含み、他のＣＨ３ドメインは、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＶａｌがそれぞれＴｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、Ｔｙｒ４０７を置換するものを含む。
本発明の三重特異性抗体は同時に３つの抗原を識別でき、それはＶＨとＶＬの間に位置するジスルフィド結合およびそれらの静電性質に基づいて選択するアミノ酸に出現する突然変異を有し、一部の実施方式において、第２ポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインおよび第３ポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインはノブインホール構造を形成する。
ジスルフィド結合
本発明の一部の実施形態では、ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結される。一部の実施形態では、ＶＬ２のＦＲとＶＨ２のＦＲはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。ＶＬ－ＶＨ界面にシステイン突然変異を導入して、ＶＬとＶＨの間にジスルフィド結合を形成し、これによりＶＬとＶＨを共有結合して連結させることで、抗体の安定性を改善する。
ＶＬ２の位置１００とＶＨ２の位置４４はシステインに置換された。置換されたシステインは、二重特異性抗体と三重特異抗体のＶＬ２とＶＨ２を連結するジスルフィド結合を形成する。
電荷を有するアミノ酸による置換
ＶＬ２とＶＨ２の間にジスルフィド結合を導入する以外に、本発明の二重特異性抗体と三重特異性抗体のＶＬ２とＶＨ２には、異なる電荷性質の１つ以上のアミノ酸の置換を有する。
初期の研究により、ジスルフィド結合の導入は抗体の安定性を大幅に向上させたが、一部の割合の軽重鎖の間は非共有結合の方式で結合され、生成物の純度に影響を与える。本発明の三重特異性抗体では、領域の静電作用力の影響を考慮して、ＶＨ２とＶＬ２にそれぞれ異なる電荷性質を有する１つ以上のアミノ酸の置換を導入して、これにより望ましくない非共有結合方式を最小限にし、さらに生成物の安定性および純度を改善する。
本発明の一部の実施形態では、ＶＬ２は負電荷を有するアミノ酸に置換され、ＶＨ２は正電荷を有するアミノ酸に置換される。本発明の一部の実施形態では、ＶＬ２は正電荷を有するアミノ酸に置換され、ＶＨ２は負電荷を有するアミノ酸に置換される。負荷電を有するアミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、正荷電を有するアミノ酸はリジンまたはアルギニンである。
本発明の例示的な実施形態では、ＶＬ２上のＧｌｎ３８はＬｙｓに置換され、ＶＨ２上のＧｌｎ３９はＡｓｐに置換され、それによって荷電を有するアミノ酸の置換が形成される。
ノブインホール構造（ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）
本発明の二重特異性抗体および三重特異性抗体において、前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される。一部の実施形態では、第２ポリペプチド鎖のＣＨ２ＣＨ３ドメインおよび第３ポリペプチド鎖のＣＨ２ＣＨ３ドメインはノブインホール構造を形成する。
ノブインホール構造は、異種オリゴマーの第２ポリペプチドと第３ポリペプチドの間の界面を設計するために使用される「空隙への突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ）」戦略とも呼ばれる。
全般的に、好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。「突起」は前記第２ポリペプチドの界面中の小さいアミノ酸側鎖を比較的大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することを採用することによって構築される。突起の大きさと同じまたは類似の相補性「空隙」は、比較的大きいアミノ酸側鎖を比較的小さいアミノ酸（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、第３のポリペプチドの界面に任意選択的に構築される。位置決めと寸法が適切な突起または空隙が、第２または第３ポリペプチドの界面に存在する場合、隣接する界面にそれぞれ対応する空隙または突起を設計するだけでよい。米国特許ＵＳ８，２１６，８０５号を参照すると、その開示の内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの例示的な実施形態では、第２ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ＴｒｐがＴｈｒ３６６を置換するものを含み、第３ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＶａｌがそれぞれＴｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、Ｔｙｒ４０７を置換するものを含み、これによりノブインホール構造を形成する。
他の例示的な実施形態では、第２ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＶａｌがそれぞれＴｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、Ｔｙｒ４０７を置換するものを含み、第３ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ＴｒｐがＴｈｒ３６６を置換するものを含み、これによりノブインホール構造を形成する。
抗体の調製
抗体のすべての形式はＩｇＧ抗体の重鎖と軽鎖に基づき、それは本分野の既知の方法を使用して調製することができ、前記方法は一般的に、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の表現カセットを構築し、２つの遺伝子を適切な細胞システムに共にトランスフェクションして組換え抗体を生成し、安定的かつ高収率の細胞クローンを調製し、細胞発酵でｃＧＭＰの最終抗体の生成物を生成することを含む。
実施例
実施例
本発明はさらに以下の実施例によって例示されるが、これに限られない。以下の実施例部分は、本発明の工学的抗体の作製を例示する。
実施例１．二重特異性抗体の構築
本実施例では、ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体の構築方式を例示する。本実施例の二重特異性抗体を構築する過程で、ＣＤ３およびＣＤ１９におけるＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に例示されている（ＣＤ３ ＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１、ＣＤ３ ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２、ＣＤ１９ ＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３、ＣＤ１９ ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４）。
構築方法：コドンの配列をＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅを用いて最適化する。まず、ｐＵＣ５７ベクターにターゲット遺伝子を構築し、その後、ｐＴＧＥ５ベクターにサブクローニングする。ＤＮＡはトランスフェクションのためにＭａｘｉｐｒｅｐにより調製される。ＣＨＯ３Ｅ７細胞を培養し、０．３×１０６個細胞／ｍｌの濃度で継代する。細胞密度が１．８～２．５×１０６個細胞／ｍｌに達したときにトランスフェクションを行う。まず、３００μｌのＤＮＡ重鎖および軽鎖をそれぞれ５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ＣＨＯ培地に添加して、軽く振り混ぜる。続いて、３ｍｇのＰＥＩトランスフェクション試薬を加え、３分間軽く振り混ぜる。混合物を３７℃で７分間静置し、続いて４５０ｍｌの細胞懸濁液に加え、総体積５００ｍｌを得た。２４時間後、混合物に２５ｍｌのＴＮ１（母液濃度２００ｇ／Ｌ）を加える。トランスフェクション後１日目、３日目および５日目にそれぞれ１ｍｌの懸濁液を取り、検出する。５０μｌのサンプルを取って細胞の計数を行い、残存サンプルを３０００ｒｐｍの条件で５分間遠心処理し、その後上澄み液を－２０℃に保持する。６日目に培養物を採取し、５５００ｒｐｍの条件下で３０分間遠心処理する。上澄み液を分離し、０．２２μｍフィルターでろ過し蛋白質をさらに精製する。クロマトグラフィーカラム：５ｍｌ Ｍｏｎｏｆｉｎｉｔｙ Ａ樹脂（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ロット番号Ｌ００４３３）クロマトグラフィーカラム；平衡バッファーＡ：２０ｍＭ ＰＢ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；洗浄バッファーＢ：５０ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．５；中和バッファーＣ：１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０；流速：２ｍｌ／ｍｉｎ；勾配：１００％勾配溶出。分離後、０．１５５ｍｌ中和バッファーＣを各１ｍｌの成分中に加える。収集した蛋白質溶液は、４℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）において１６時間継続して透析を行う。
上記の方法により、以下の３つのポリペプチド鎖を含むＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体（抗体Ａ、図１に構造模式図を示す）を構築して得る。
第１ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）：ＣＤ１９ ＶＬ－リンカー－ＣＤ３ ＶＨ
第２ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）：ＣＤ３ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
第３ポリペプチドＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）：ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
第１ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）：ＣＤ１９ ＶＬ－リンカー－ＣＤ３ ＶＨ
第２ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）：ＣＤ３ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
第３ポリペプチドＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）：ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
得られた抗体Ａはサイズ排除（ＳＥＣ）により精製され、その純度は９５％以上である。
実施例２．親和力試験
ＢＩＡｃｏｒｅ法を用いて、ヒトＣＤ３ε抗原およびヒトＣＤ１９抗原に対する抗体Ａの結合親和性を試験し、ｋａ、ｋｄおよびＫＤ値を算出する。本実施例では、捕獲法を用いて親和性を評価する。ヒトＣＤ１９をリガンドとすることにより、ヒスタミン抗体が結合されたチップ上に捕捉させる。続いて、５つの異なる濃度の候補薬物を分析物としてサンプリングし、親和性を分析する。ＣＤ３ε抗原およびＣＤ１９抗原をチップ上に固定し、ＢＩＡｃｏｒｅ法を採用して抗体Ａに対して親和性試験を行い、以下の結果を得た。
実施例３．Ｒａｊｉ細胞に対する細胞殺傷分析
リンパ球をエフェクター細胞として用い、標的細胞（Ｒａｊｉ細胞）に対する抗体が媒介する殺傷作用を分析する。操作手順は以下の通りである。
エフェクター細胞の準備：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心により血液から新鮮分離する。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ分離キットを用いてＰＢＭＣからさらにそれぞれ分離する。ＰＢＭＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をそれぞれ細胞培地に再懸濁し、細胞密度および細胞生存率を検出する。細胞培地を用いて細胞密度を６×１０６個生細胞／ｍＬに調整し、続いて５０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を平底９６ウェルプレートに加える。標的細胞に対するエフェクター細胞の比率（Ｅ／Ｔ）は２０：１であり、実験に使用される。細胞培地：１０％のＨＩ－ＦＢＳおよび１％のペニシリン－ストレプトマイシンで懸濁しているＲＰＭＩ １６４０。
標的細胞の準備：Ｒａｊｉ細胞の継代密度は２×１０５個細胞／ｍＬであり、継代成長４日後に実験に使用し始める。適切な量の細胞懸濁液を５０ｍｌ遠心管に移し、室温、２００ｇの条件下で５分間遠心処理する。細胞を細胞培地に再懸濁し、細胞密度と細胞生存率を検出する。細胞培地で細胞密度を３×１０５個生細胞／ｍＬに調整し、続いて５０μＬ／ウェルの細胞懸濁液をＲａｊｉ細胞が既に存在する平底９６ウェルプレートに加える。
抗体の準備：細胞培地中で抗体Ａおよび対照としてのボルナツズマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＭＧＤ０１１およびＲＧ６０２６を異なる濃度に希釈する。５０μＬの細胞培地または希釈された溶液を指示されたウェルに加え、最終濃度０ｐＭ、１ｐＭまたは１００ｐＭを得る。
抗体、標的細胞およびエフェクター細胞を有する平底９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に置き、４時間、２０時間および４０時間でサンプリングして検出する。サンプルを３５０ｇの条件で５分間継続して遠心処理し、細胞を再懸濁してＰＩで染色する。各ウェルに計数ビーズを１０μＬ添加し、続いてフローサイトメトリーによりサンプルを分析する。分析の結果、抗体ＡのＥＣ５０値が１．０８６ｐＭであり、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）のＥＣ５０値が５．４７６ｐＭであり、ＭＧＤ０１１ＥＣ５０値が１．７２１ｐＭであり、ＲＧ６０２６のＥＣ５０値が０．６７０１ｐＭであることが示される。抗体Ａの標的細胞に対する殺傷作用は図２に示す通りである。
実施例３．生体内薬効評価
抗体Ａの生体内抗腫瘍効果をＪｅｋｏ－１／ＮＣＧ Ｍｉｘｅｎｏモデルで試験する。最初（０日目）に、１００μＬの１：１ＰＢＳ／ゲルで懸濁した５×１０６個のＪｅｋｏ－１細胞を動物の右背部皮下に接種した。接種３日後（３日目）、動物の腹腔に１×１０７／０．１ｍｌのＰＢＭＣを注射する。腫瘍の平均体積が１００ｍｍ３に達したとき、抗体サンプルを投与する。４種類の抗体（ボルナツズマブ＠０．５ｍｇ／ｋｇ、抗体Ａ＠０．３ｍｇ／ｋｇ、ＭＧＤ０１１＠０．３ｍｇ／ｋｇ、ＲＧ６０２６＠０．７ｍｇ／ｋｇ）、および１つの対照群（ｐＨ６．０ ＰＢＳ）について、６個の動物／群として試験を行う。全てのサンプルは尾静脈を介して静脈注射により投与する。全ての抗体およびビヒクルを週２回、３週間連続投与する。相対的な腫瘍抑制（ＴＧＩＲＴＶ）に基づいて治療効果を評価し、動物の体重変化と死亡に基づいて安全性を評価する。
相対的な腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＲＴＶ（％）：ＴＧＩＲＴＶ＝１－ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ（％）。ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ（％）は、相対的な腫瘍増殖速度であり、すなわち、ある時点でのＰＢＳを受けた対照群の腫瘍体積に対する、治療を受けた群の腫瘍体積の比である。ＴＲＴＶおよびＣＲＴＶはそれぞれある時間点における治療群および対照群の腫瘍体積（ＴＶ）である。
接種後４０日目に実験を終了する。図３に示すように、すべての治療（抗体）群は腫瘍増殖が著しく抑制されたことを示している。また、図４に示すように、すべての治療（抗体）群においていずれも顕著な体重の減少を示さなかったことも治療用抗体に顕著な体内毒性作用がないことを示している。
実施例４．三重特異性抗体の構築
本実施例では、ＣＤ３×ＣＤ１９×ＣＤ２０三重特異性抗体の構築方式を例示する。本実施例の三重特異性抗体を構築する過程では、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２０におけるＶＨおよびＶＬ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９に例示されている（ＣＤ３ ＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１、ＣＤ３ ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２、ＣＤ１９ ＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３、ＣＤ１９ ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４、ＣＤ２０ ＶＬ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８、ＣＤ２０ ＶＨ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９）。
実施例１に記載の構築方法により、以下の４つのポリペプチド鎖を含むＣＤ３×ＣＤ１９×ＣＤ２０三重特異性抗体（抗体＃１）が構築される。
ポリペプチドＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）：ＣＤ１９ ＶＬ－リンカー－ＣＤ３ ＶＨ
ポリペプチドＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）：ＣＤ３ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）：ＣＤ２０ ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）：ＣＤ２０ ＶＬ－ＣＬ
ポリペプチドＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）：ＣＤ１９ ＶＬ－リンカー－ＣＤ３ ＶＨ
ポリペプチドＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）：ＣＤ３ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）：ＣＤ２０ ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）：ＣＤ２０ ＶＬ－ＣＬ
上記と同様の方法を採用して、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２０の位置のみを交換して、以下の４つのポリペプチド鎖を含むＣＤ３×ＣＤ１９×ＣＤ２０三重特異性抗体（抗体＃２）を構築して得る。
ポリペプチドＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）：ＣＤ１９ ＶＬ－リンカー－ＣＤ２０ ＶＨ
ポリペプチドＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）：ＣＤ２０ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）：ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）：ＣＤ３ ＶＬ－ＣＬ
ポリペプチドＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）：ＣＤ１９ ＶＬ－リンカー－ＣＤ２０ ＶＨ
ポリペプチドＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）：ＣＤ２０ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）：ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２ＣＨ３
ポリペプチドＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）：ＣＤ３ ＶＬ－ＣＬ
得られた抗体＃１および抗体＃２はサイズ排除（ＳＥＣ）により精製され、その純度はいずれも９０％以上である。
実施例５．親和力試験
ＢＩＡｃｏｒｅ法を用いて、ヒトＣＤ３ε抗原およびヒトＣＤ１９抗原に対する抗体＃１の結合親和性を試験して、ｋａ、ｋｄおよびＫＤ値を算出する。本実施例では、捕獲法を用いて親和性を評価する。ヒトＣＤ１９をリガンドとすることにより、ヒスタミン抗体が結合されたチップ上に捕捉させる。続いて、５つの異なる濃度の候補薬物を分析物としてサンプリングし、親和性を分析する。ＣＤ３ε抗原およびＣＤ１９抗原をチップ上に固定し、ＢＩＡｃｏｒｅ法を採用して抗体＃１に対して親和性試験を行った結果は以下の通りである。
実施例６．Ｒａｊｉ細胞に対する細胞殺傷分析
リンパ球をエフェクター細胞として用い、標的細胞（Ｒａｊｉ細胞）に対する抗体が媒介する殺傷作用を分析する。操作手順は以下の通りである。
エフェクター細胞の準備：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心により血液から新鮮分離する。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ分離キットを用いてＰＢＭＣからさらにそれぞれ分離する。ＰＢＭＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をそれぞれ細胞培地に再懸濁し、細胞密度および細胞生存率を検出する。細胞培地を用いて細胞密度を６×１０６個生細胞／ｍＬに調整し、続いて５０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を平底９６ウェルプレートに加える。標的細胞に対するエフェクター細胞の比率（Ｅ／Ｔ）は２０：１であり、実験に使用される。細胞培地：１０％のＨＩ－ＦＢＳおよび１％のペニシリン－ストレプトマイシンで懸濁したＲＰＭＩ １６４０。
標的細胞の準備：Ｒａｊｉ細胞の継代密度は２×１０５個細胞／ｍＬであり、継代成長４日後に実験に使用し始める。適切な量の細胞懸濁液を５０ｍｌ遠心管に移し、室温、２００ｇの条件下で５分間遠心処理する。細胞を細胞培地に再懸濁し、細胞密度と細胞生存率を検出する。細胞培地で細胞密度を３×１０５個生細胞／ｍＬに調整し、続いて５０μＬ／ウェルの細胞懸濁液をＲａｊｉ細胞が既に存在する平底９６ウェルプレートに加える。
抗体の準備：細胞培地中で抗体＃１、抗体＃２および対照としての二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１９を異なる濃度に希釈する。５０μＬの細胞培地または希釈した溶液を指示されたウェルに加え、最終濃度０ｐＭ、１ｐＭまたは１００ｐＭを得た。
抗体、標的細胞およびエフェクター細胞を有する平底９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に置き、４時間、２０時間および４０時間でサンプリングして検出する。サンプルを３５０ｇの条件で５分間継続して遠心処理し、細胞を再懸濁してＰＩで染色する。各ウェルに計数ビーズを１０μＬ添加し、続いてフローサイトメトリーによりサンプルを分析する。分析の結果、抗体＃２のＥＣ５０値が９７１．８ｐＭであり、抗体＃１のＥＣ５０値が１．４２３ｐＭであることが示され、また、抗体＃１および抗体＃２の標的細胞に対する殺傷作用は図６に示す通りである。
実施例７．Ｋ５６２細胞に対する細胞殺傷分析
ＣＤ３×ＣＤ１９×ＣＤ２０がＣＤ１９に依存しない細胞殺傷作用を観察するため、ＣＤ１９－ＣＤ２０－二重陰性細胞Ｋ５６２上に標的細胞としてＣＤ２０に安定に導入し、エフェクター細胞としてリンパ球を使用して、標的細胞（Ｋ５６２細胞）に対する抗体が媒介する殺傷作用を分析する。
Ｋ５６２－ＣＤ２０細胞を遠心した後、１６４０＋２％ＦＢＳ培地で再懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、カウントして、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００００ｃｅｌｌｓ／１００ｕｌで播種する。ＰＢＭＣを取り、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、１６４０＋２％ＦＢＳで再懸濁し、カウントして、上記セルプレートの各ウェルに１０００００ｃｅｌｌｓ／１００ｕｌをさらに加える。抗体をそれぞれＰＢＳで希釈し、８ポイントで１０倍勾配希釈し、細胞培養プレートの各ウェルに１０ｕｌを加え、各濃度は２つのウェルであり、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートする。検出キットから基質を取り出し、各ボトルに１２ｍｌのｂｕｆｆｅｒを加えて再懸濁する。培養プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心し、ウェルごとに上澄み５０ｕＬを新しい培養プレートに取り、各ウェルにそれぞれ５０ｕｌの新しく配置した基質を加え、室温で１０分間遮光してインキュベートし、酵素標識器でＯＤ４９０を検出する。分析の結果、抗体＃１のＥＣ５０値が１．２２２ｐＭであることが示され、また、抗体＃１および対称抗体の標的細胞に対する殺傷作用は図７に示す通りである。
実施例８．生体内薬効評価
抗体＃１および抗体＃２の体内抗腫瘍効果をＪｅｋｏ－１／ＮＣＧ Ｍｉｘｅｎｏモデルで試験する。最初（０日目）に、１００μＬの１：１ＰＢＳ／ゲルで懸濁した５×１０６個のＪｅｋｏ－１細胞を動物の右背部皮下に接種した。接種３日後（３日目）、動物の腹腔に１×１０７／０．１ｍｌのＰＢＭＣを注射する。腫瘍の平均体積が１００ｍｍ３に達したとき、抗体＃１および抗体＃２を投与する。４種類の抗体（ＣＤ３×ＣＤ１９＠０．５ｍｇ／ｋｇ、抗体＃１＠０．５ｍｇ／ｋｇ、抗体＃１＠３ｍｇ／ｋｇ、抗体＃２＠０．５ｍｇ／ｋｇ）および１つの対照群（ｐＨ６．０ＰＢＳ）について、６個の動物／群として試験を行う。全てのサンプルは尾静脈を介して静脈注射により投与する。全ての抗体およびビヒクルを週２回、３週間連続投与する。相対的な腫瘍抑制（ＴＧＩＲＴＶ）に基づいて治療効果を評価し、動物の体重変化と死亡に基づいて安全性を評価する。
相対的な腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＲＴＶ（％）：ＴＧＩＲＴＶ＝１－ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ（％）。ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ（％）は、相対的な腫瘍増殖速度であり、すなわち、ある時点でのＰＢＳを受けた対照群の腫瘍体積に対する、治療を受けた群の腫瘍体積の比である。ＴＲＴＶおよびＣＲＴＶはそれぞれある時間点における治療群および対照群の腫瘍体積（ＴＶ）である。
接種後２８日目に実験を終了する。図９に示すように、すべての治療（抗体）群は腫瘍増殖が著しく抑制されたことを示している。また、図８に示すように、すべての治療（抗体）群においていずれも顕著な体重減少を示さなかった、これはまた、治療用抗体に顕著な体内毒性作用がないことを示している。
本明細書では、本発明の例示的な実施形態を説明および示したが、当業者にとっては、これらの実施形態は単なる例示にすぎないことは明らかである。当業者は、本発明から逸脱することなく、これらの実施形態に対して様々な変更、修正、および置き換えを行うことができる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物も添付の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (10)
- 工学的抗体であって、
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、および
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、システインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む第３ポリペプチドを含み、
ここで、
ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成し、前記第１標的はＣＤ３であり、
ＶＬ２とＶＨ２は結合して第２標的に結合できるドメインを形成し、前記第２標的はＣＤ１９であり、
ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結され、かつＶＬ２とＶＨ２はそれぞれ独立に、電荷を有するアミノ酸を導入する１つ以上の置換を含み、前記電荷を有するアミノ酸の置換は、ホモ二量体の形成に静電学的に不利であり、
前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される、工学的抗体。 - ＶＬ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１であり、ＶＨ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２であり、ＶＬ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３であり、ＶＨ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４である、請求項１に記載の抗体。
- 前記第１ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５であり、前記第２ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６であり、前記第３ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７である、請求項１に記載の抗体。
- 工学的抗体であって、
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第２標的に結合する第２軽鎖可変ドメインＶＬ２と第１標的に結合する第１重鎖可変ドメインＶＨ１とを含み、ここで、ＶＬ２とＶＨ１はリンカーによって連結される第１ポリペプチド、
（ｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第１標的に結合する第１軽鎖可変ドメインＶＬ１と第２標的に結合する第２重鎖可変ドメインＶＨ２、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＬ１とＶＨ２はリンカーによって連結される第２ポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、第３標的に結合する第３重鎖可変ドメインＶＨ３およびＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ならびにシステインを含むヒンジドメインおよびＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＶＨ３とＣＨ１はリンカーによって連結される第３ポリペプチド、および
（ｉｖ）Ｎ－末端からＣ－末端までの方向に、前記第３標的に結合する第３軽鎖可変ドメインＶＬ３、およびシステインを含む軽鎖固定ドメインＣＬを含み、ここで、ＶＬ３とＣＬはリンカーによって連結される第４ポリペプチドを含み、
ここで、ＶＬ１とＶＨ１は結合して第１標的に結合できるドメインを形成し、
ここで、ＶＬ２とＶＨ２は結合して第２標的に結合できるドメインを形成し、
ここで、ＶＬ３とＶＨ３は結合して第３標的に結合できるドメインを形成し、
ここで、ＶＬ２とＶＨ２はジスルフィド結合によって共有結合して連結され、かつ、ＶＬ２とＶＨ２はそれぞれ独立に、電荷を有するアミノ酸を導入する１つ以上の置換を含み、前記電荷を有するアミノ酸の置換は、ホモ二量体の形成に静電学的に不利であり、
ここで、ＣＨ１とＣＬはジスルフィド結合によって共有結合して連結され、
ここで、前記第２ポリペプチド鎖のヒンジドメインと前記第３ポリペプチド鎖のヒンジドメインはジスルフィド結合によって共有結合して連結される、工学的抗体。 - 前記第１標的はＣＤ３であり、前記第２標的はＣＤ１９であり、前記第３標的はＣＤ２０である、請求項４に記載の抗体。
- 前記第１標的はＣＤ２０であり、前記第２標的はＣＤ１９であり、前記第３標的はＣＤ３である、請求項４に記載の抗体。
- ＶＬ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１であり、ＶＨ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２であり、ＶＬ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３であり、ＶＨ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４であり、ＶＬ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８であり、ＶＨ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９である、請求項５に記載の抗体。
- ＶＬ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８であり、ＶＨ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９であり、ＶＬ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３であり、ＶＨ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４であり、ＶＬ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１であり、ＶＨ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２である、請求項６に記載の抗体。
- 前記第１ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０であり、前記第２ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１であり、前記第３ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１２であり、前記第４ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３である、請求項５に記載の抗体。
- 前記第１ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４であり、前記第２ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５であり、前記第３ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６であり、前記第４ポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７である、請求項６に記載の抗体。
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