CN110563848A - 一种双特异性抗体及其用途 - Google Patents

一种双特异性抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110563848A
CN110563848A CN201910678208.1A CN201910678208A CN110563848A CN 110563848 A CN110563848 A CN 110563848A CN 201910678208 A CN201910678208 A CN 201910678208A CN 110563848 A CN110563848 A CN 110563848A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
amino acid
cancer
ser
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910678208.1A
Other languages
English (en)
Inventor
杨彪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201910678208.1A priority Critical patent/CN110563848A/zh
Publication of CN110563848A publication Critical patent/CN110563848A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含能与PD‑1特异性结合的第一抗原结合功能区和能与TIM‑3特异性结合的第二抗原结合功能区，本发明提供的抗体为IgG形式，所述双特异抗体能同时结合两种靶分子并且在治疗复杂疾病方面效果更好，不易产生脱靶效应。

Description

一种双特异性抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，特别地涉及一种双特异性抗体及其用途。
背景技术
目前已经有数十种单克隆抗体药物被相关机构认证并且运用到了临床抗肿瘤治疗中，虽然它们给肿瘤免疫治疗带来了突破性的成效，但是其疗效往往有限，如其中一些会产生耐药性，从而导致部分患者用药后不响应，或是在初始响应后出现复发再进展。普通的肿瘤治疗性抗体只能结合单一的抗原，其结合特异性相对较低，容易发生脱靶效应。
双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)能分别识别和结合两种不同的抗原，所以它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上，进而增强对靶细胞的杀伤作用，同时它也可以结合同一肿瘤细胞上的不同抗原以增强其结合特异性，从而减少脱靶毒性等副作用。这种具有双功能的重组抗体作为***的药物拥有比单抗药物更高的疗效。
1986年，Staerz和Bevan第一次利用双特异性抗体把细胞毒性T淋巴细胞运用于癌细胞溶解实验。2014年12月，安进公司研发的双特异性抗体免疫治疗药物Blinatumomab用于复发性或难治性的费城染色体阴性前B细胞急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblasticleukemia，ALL)的治疗。
随着全球环境的恶化和人们生活习惯的改变，肿瘤的发病率越来越高，肿瘤患者的死亡率也逐渐上升，故抗肿瘤药物的市场将不断扩大。随着科学研究技术的发展，可以通过改变双特异性抗体的结构、相对分子质量和化合价来改善其血浆清除率、组织渗透率和药物代谢动力学等，进而提高其成药稳定性和临床疗效。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种双特异性抗体及其用途。
本发明是以如下技术方案实现的：
一种双特异性抗体，所述抗体包含能与PD-1特异性结合的第一抗原结合功能区和能与TIM-3特异性结合的第二抗原结合功能区。
进一步地，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列是与SEQ IDNo.7、9、10所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。
进一步地，所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列是与SEQ IDNo.8、11、12所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。
进一步地，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7、9、10任一项所示和/或所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.8、11、12任一项所示。
优选地，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
更进一步地，所述双特异抗体的Fc链为IgG形式。
进一步地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)和双特异性抗体。
进一步地，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有上抗体相应核苷酸编码序列的宿主细胞，收集细胞，纯化双特异性抗体或其他等同生产方案。
进一步地，所述双特异性抗体可以与至少一种治疗剂偶联以形成免疫偶联物。
优选地，所述治疗剂选自细胞毒素剂、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。
本发明还提供双特异性抗体的用途，包括从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的上述抗体及其抗原结合片段并与药学上可接受的载体制成药物用于***的用途，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌。本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。
代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。
抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。
“可变区”是指在抗体间，可变区的某些区段的序列显著不同，所述高度可变区为各3-12个氨基酸，其主要采取β折叠构型，由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由FR紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))，恒定区不直接涉及抗体对抗原的结合。
“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。
“抗体的抗原结合片段”可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。
“IgG”是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
“单克隆抗体”是指获得自大体上均质的抗体的群体的抗体，即组成该群体的抗体除了个别抗体可少量存在的可能天然生成的突变外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，是指针对单一抗原位点。此外，相对于包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。除单克隆抗体的特异性外，单克隆抗体的有利的处在于其可经合成而不被其他抗体污染。
一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。
本发明的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、噬菌体展示***、酵母、植物细胞、动物细胞。
“治疗”包括但不限于以下中的一项或更多项试验表征：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；预防或延迟疾病的恶化；预防或延迟疾病的扩散；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。在本发明中“治疗”可以解释为癌症的病理结果(例如肿瘤体积的减小)。
药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。
附图说明
图1显示抗PD-1/TIM-3双特异性抗体的结构；
图2显示了抗PD-1/TIM-3双特异性抗体的PD-1、TIM-3同时结合活性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)作为实验动物进行小鼠免疫试验。初次免疫使用50μg人TIM-3蛋白(购自北京同立海源生物科技有限公司)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按0.5ml/只注射量注射小鼠腹腔，每隔2周用25μg人TIM-3蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液进行加强免疫，加强免疫三次，末次免疫1周后，收集小鼠静脉血并分离血清，通过ELISA方法测量抗体效价并选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。
收集对数生长的骨髓瘤细胞(SP2/0)制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤后离心8分钟弃上清，将细胞沉淀置于40℃水浴中预热，向细胞沉淀中加入预热至40℃的PEG-4000溶液1ml，出现颗粒后1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基以终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1.5×107/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养并观察，待细胞表面积达到孔板面积1/2以上时，吸出上清液样品供抗体检测。
实施例2：
筛选杂交瘤培养上清液的抗人TIM-3抗体。具体地，用缓冲液在96孔高吸附酶标板上包被人TIM-3(购自北京同立海源生物科技有限公司)，包被量100μL每孔，之后用缓冲液洗涤3次后；用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μL上清液样品(S1-S85)以及阳性血清(对照，CK1-5)，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL以比例1/10000稀释于含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人TIM-3结合抗体的阳性克隆。
实施例3：
将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。首先按照说明书使用RNA prep Pure试剂盒(Tiangen)提取细胞mRNA。之后使用Quant Script RT试剂盒(Tiangen)合成cDNA第一链。将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。
经过PCR扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体TL10-11中(载体骨架pEGFP-N1，购自上海吉满生物)。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系(购自上海纪宁生物科技)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为1.5×107细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为39.1μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为45μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。
实施例4：
检测实施例1获得的抗人TIM-3鼠源单抗(以下简称OM-anti-TIM-3)与其抗原结合的动力学常数。利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。简要地，将OM-anti-TIM-3溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭。结合阶段将不同浓度的OM-anti-TIM-3以27μL/min的速度注入2.5min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以27μL/min的速度注入8min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。OM-anti-TIM-3的结合动力学常数为4.77E+04(1/Ms)、解离动力学常数为1.64E-05(1/s)、解离平衡常数为0.01(nM)。
实施例5：检测鼠源单抗体内中和活性
测定OM-anti-TIM-3的体内中和活性。简要地，选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。随机分成五组，每组6只，静脉注射并单次给药，每组剂量水平分别为0.5nmol/kg,5nmol/kg，15nmol/kg，25nmol/kg，50nmol/kg OM-anti-TIM-3。给药一小时后，给每只小鼠皮下注射人TIM-3蛋白15μg，注射2小时后，对各小鼠进行眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样约40分钟左右至凝血，离心获取血清样品，采用CCK ELISA试剂盒按说明书测定血清中小鼠CCK的浓度，结果表明25nmol/kg OM-anti-TIM-3能够抑制人TIM-3刺激小鼠分泌的CCK的水平，基本能将小鼠CCK水平降低至未刺激状态。
实施例6：
测定OM-anti-TIM-3的在大鼠体内的药代动力。简要地，选用6-8周龄雌性SD大鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。取大鼠5只，分别给予25nmol/kg OM-anti-TIM-3。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。ELISA测定血清中OM-anti-TIM-3含量，测试结果表明，单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的OM-anti-TIM-3的药代参数如下：半衰期为498小时；药时曲线下面积为43721nM.hr；估算零浓度为391nM；表观分布容积为119mL/Kg；清除率为0.178mL/hr/kg；平均驻留时间为163小时。
实施例7：
人源化形式的抗人TIM-3抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与OM-anti-TIM-3非CDR区匹配最好的人源化模板，其中重链可变区的模板为人源IgVH4-28*03，轻链可变区的模板为人源IGKV1-16*02，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表1所示。
表1.回复突变获得的氨基酸序列
将人源化的抗人TIM-3单抗的重链可变区(SEQ ID NO：9)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:13)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人TIM-3单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：11)与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:14)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。
实施例8:
构建分别含抗人PD-1的抗体(Pembrolizuma)的重链和轻链的TL10-11表达载体，其中抗体可变区序列来源于http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi？pdbcode＝9798，通过PCR的方法分别扩增轻链可变区以及轻链恒定区，重链可变区以及重链恒定区，PCR引物根据碱基互补原则以及酶切位点的需要进行常规设计。获得抗人PD-1抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人PD-1抗体的重链和轻链。
分别构建抗人TIM-3的抗体的重链和轻链的TL10-11表达载体(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)，根据常规方法，获得抗人TIM-3抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人TIM-3抗体的重链和轻链。
实施例9：
本发明参考WO2013060867中描述的一种大规模生产异二聚体双特异抗体的方法，该方法先还原两种混合的同源二聚体形式抗体，然后通过在这两种同源二聚体抗体的Fc区引入不对称氨基酸突变从而促使不同抗体的Fab臂发生交换，最后通过氧化铰链区的链间二硫键形成稳定的双特异抗体。
分别将含抗人PD-1抗体的重链和轻链的表达载体转染293F细胞，另外分别将含抗人TIM-3抗体的重链和轻链的表达载体也转染293F细胞。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的293表达培养基中，细胞密度为1.5X107细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为31.12ug/mL，轻轻混匀；然后加入线性PEI至终浓度为45ug/mL，轻轻混匀。之后放入细胞培养箱，摇床37℃培养1小时。之后加入20倍转染体积的新鲜培养基，继续摇床37℃培养，通过ELISA的方法测定抗PD-1/TIM-3双特异性抗体的表达量，蛋白纯化由武汉普健生物完成，双特异性抗体结构如图1所示。
实施例10：
检测获得实施例9获得的双特异性抗体与抗原TIM-3，抗原PD-1的结合的动力学常数，方法同实施例4，双特异性抗体的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。
表2.双特异性抗体与其与其抗原结合的动力学常数
测定双特异性抗体在大鼠体内的药代动力，简要地，选6-8周龄雌性SD大鼠随机分成2组(编号测试组1，测试组2，每组5只)，测试组1给予25nmol/kg双特异性抗体；测试组2给予50nmol/kg双特异性抗体。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45min至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。
单次静脉注射的剂量为50nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t1/2为43小时，药时曲线下面积AUClast为32823nM.hr，估算零浓度C0为101nM，表观分布容积Vd为41mL/Kg，清除率CL为0.89mL/hr/kg，平均驻留时间MRTlast为83小时。
单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t1/2为36小时，药时曲线下面积AUClast为29123nM.hr，估算零浓度C0为97nM，表观分布容积Vd为32mL/Kg，清除率CL为0.81mL/hr/kg，平均驻留时间MRTlast为72小时。
实施例11：
用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗PD-1/TIM-3双特异性抗体的双靶点的结合活性，方法同实施例2。简要地，用碳酸盐缓冲溶液(pH9.3)在96孔高吸附酶标板上包被重组人TIM-3(浓度1μg/mL，100μL)，4℃过夜；PBST洗涤5次后用PBST(含1％BSA)封闭孔(280μL/孔)，25℃孵育1h；PBST洗涤5次后加入稀释在PBST(含1％BSA)的双特异性抗体样品以及对照(100μL)，25℃孵育1h，PBST洗涤5次，然后加入稀释的生物素标记的PD-1-Fc(0.5μg/mL，每孔100μL)，25℃孵育1h，加稀释在的PBST里的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(1:1000)，每孔100μL，25℃孵育1h，PBST洗涤5次，加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入H2SO4(1M,100μL/孔)终止显色，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，结果如图2所示，PD-1单抗和TIM-3单抗的组合不能同时结合PD-1、TIM-3，只有抗PD-1/TIM-3双特异性抗体具有同时结合两种抗原的活性。
实施例12：
检测抗人TIM-3人源化单抗(MeH-037)，抗人PD-1(Pembrolizuma)，双特异性抗体对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(C57BL/6背景，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)。取15只小鼠，接种MC38细胞，待小鼠明显荷瘤切片验证，构建成功后观察肿瘤生长并记录肿瘤体积，每周给药2次(腹腔注射)，连续给药5周，自给药之日起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(a x b2)/2。
待小鼠肿瘤体积增至所需体积，按体积分组每组5只：Y1,Y2,Y3,Y4,Y5(体积约150mm3)；Y6,Y7,Y8,Y9,Y10(体积约100mm3)；Y1,Y6设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，Y2,Y7给药25nmol/kg抗人TIM-3人源化单抗，Y3,Y8给药25nmol/kg抗人PD-1(Pembrolizuma)，Y4,Y9给药剂量为25nmol/kg双特异性抗体，Y5,Y10给药剂量为50nmol/kg双特异性抗体，试验结果如表3所示。
表3.试验小鼠肿瘤消融比
由表3可见，双特异性抗体相较于抗人TIM-3人源化单抗和PD-1在肿瘤消融比例上有显著提高，尤其是给药较高浓度双特异性抗体(50nmol/kg)时，5周时间的肿瘤消融比例高达19.3％，由此可见，本发明提供的双特异性抗体在小鼠实验中具有明显抗肿瘤活性，显著抑制了小鼠移植瘤的生长，双特异性抗体针对中等体积肿瘤(约100mm3)消融效果更佳，即在癌症前期的抑制效果更为显著。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 杨彪
<120> 一种双特异性抗体及其用途
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR1-L
<400> 1
Gly Asp Asp Asn Arg Met Phe
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR2-L
<400> 2
Asn Asn His Arg Ser Gln Asn Lys His Val
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR3-L
<400> 3
Ala Lys Ser His Gly Pro Met Glu Asp
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR1-H
<400> 4
Ala Val Thr Gln Asp Phe Trp Pro
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR2-H
<400> 5
Gln Pro Glu His Gly Val Thr Arg Met Gln
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR3-H
<400> 6
Val Glu Trp Val Asp Ala Cys Glu Ala Val
1 5 10
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> ORI VH
<400> 7
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Leu Ile Tyr Gln Ala Arg Glu
1 5 10 15
Thr Ala Val Thr Gln Asp Phe Trp Pro Trp Gln Cys Thr Ala Met Met
20 25 30
Trp Thr Gly Thr Trp Tyr Leu Trp Cys Phe Met Gly Ile Asn Cys Gln
35 40 45
Pro Glu His Gly Val Thr Arg Met Gln Tyr Pro Glu Pro His Ser Cys
50 55 60
Glu Arg Ala Pro Val Ser Ile Met Cys Cys His Gln His His Trp Thr
65 70 75 80
Asp Asn Cys Phe Asp Val Thr Trp Ile Ile Arg Asn Val Glu Trp Val
85 90 95
Asp Ala Cys Glu Ala Val Pro Lys Arg Trp Asn Thr Ala Lys Met Leu
100 105 110
Thr Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
115 120
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> ORI VL
<400> 8
Trp Leu Met Gly Phe Lys Gln Cys Trp Asp Trp Ile Thr Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Asp Asn Arg Met Phe Trp Glu Asn Glu Gln His Tyr Pro Met
20 25 30
Phe Gln Leu Met Glu Phe Glu Pro Ala Asp Asp Ala Trp Asn Asn His
35 40 45
Arg Ser Gln Asn Lys His Val Val Gln Phe Ser Ala Trp Pro Phe Trp
50 55 60
Leu Ala Gly Ser Thr Thr Trp Lys Asp Ile Arg Met Ile Ser Arg Lys
65 70 75 80
Cys Arg Cys Ser Ala Lys Ser His Gly Pro Met Glu Asp Arg Pro Cys
85 90 95
Asn Trp Phe Met Tyr Ala Thr Thr Gly Leu Ser Phe Arg Asp Gly Asn
100 105 110
Ile Tyr Asn Asn
115
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> MeH-037 VH
<400> 9
Ala Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Leu Ile Tyr Gln Ala Arg Glu
1 5 10 15
Thr Ala Val Thr Gln Asp Phe Trp Pro Trp Gln Cys Thr Ala Met Met
20 25 30
Trp Thr Gly Thr Trp Tyr Leu Gly Cys Phe Met Gly Ile Asn Cys Gln
35 40 45
Pro Glu His Gly Val Thr Arg Met Gln Tyr Pro Glu Pro His Ser Cys
50 55 60
Glu Arg Ala Pro Val Ser Ile Met Cys Cys His Gln His His Trp Thr
65 70 75 80
Asp Asn Cys Phe Asp Val Thr Trp Ile Ile Arg Asn Val Glu Trp Val
85 90 95
Asp Ala Cys Glu Ala Val Pro Lys Arg Trp Asn Thr Ala His Met His
100 105 110
Thr Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
115 120
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> MeH-012 VH
<400> 10
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Leu Ile Tyr Gln Ala Arg His
1 5 10 15
Thr Ala Val Thr Gln Asp Phe Trp Pro Trp Gln Cys Thr Ala Met Met
20 25 30
Trp Thr Gly Thr Trp Tyr Leu Trp Cys Phe Leu Ala Ile Asn Cys Gln
35 40 45
Pro Glu His Gly Val Thr Arg Met Gln Tyr Asp Glu Pro His Ser Cys
50 55 60
Glu Arg Ala Pro Val Ser Ile Met Cys Cys His Gln His His Trp Thr
65 70 75 80
Asp Asn Cys Phe Asp Val Thr His Ile Ile Arg Asn Val Glu Trp Val
85 90 95
Asp Ala Cys Glu Ala Val Pro Lys Arg Trp Asn Thr Ala Lys Met Leu
100 105 110
Thr Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
115 120
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> MeH-037 VL
<400> 11
Trp Leu Met Gly Phe Lys Gln Cys Asp Asp Trp Ile Thr Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Asp Asn Arg Met Phe Trp Glu Asn Glu Gln His Tyr Pro Met
20 25 30
Phe Gln Leu Met Glu Phe Glu Pro Ala Asp Asp Ala Lys Asn Asn His
35 40 45
Arg Ser Gln Asn Lys His Val Val Gln Phe Ser Ala Trp Pro Phe Trp
50 55 60
Leu Ala Gly Ser Thr Thr Trp Lys Asp Ile Arg Met Ile Ser Arg Lys
65 70 75 80
Cys Arg Cys Ser Ala Lys Ser His Gly Pro Met Glu Asp Arg Pro Cys
85 90 95
Asn Trp Phe Met Tyr Ala Thr Thr Gly Leu Ser Phe Arg Asp Gly Asn
100 105 110
Ile Tyr Ala Asn
115
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> MeH-012VL
<400> 12
Asn Leu Met Gly Phe Lys Gln Cys Trp Asp Glu Ile Thr Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Asp Asn Arg Met Phe Trp Glu Asn Glu Gln His Tyr Pro Met
20 25 30
Phe Gln Leu Met Glu Phe Glu Pro Ala Asp Asp Ala Trp Asn Asn His
35 40 45
Arg Ser Gln Asn Lys His Val Val Gln Phe Ser Ala Gln Pro Phe Trp
50 55 60
Leu Ala Gly Ser Cys Thr Trp Lys Asp Ile Arg Met Ile Ser Arg Lys
65 70 75 80
Cys Arg Cys Ser Ala Lys Ser His Gly Pro Met Glu Asp Arg Pro Cys
85 90 95
Asn Trp Phe Met Tyr Ala Thr Thr Gly Leu Ser Phe Arg Asp Gly Asn
100 105 110
Ile Tyr Phe Asn
115
<210> 13
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
20 25 30
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
35 40 45
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
50 55 60
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 110

Claims (10)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含能与PD-1特异性结合的第一抗原结合功能区和能与TIM-3特异性结合的第二抗原结合功能区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列是与SEQ ID No.7、9、10所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列是与SEQ ID No.8、11、12所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7、9、10任一项所示和/或所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8、11、12任一项所示。
5.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第二抗原结合功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述第二抗原结合功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
6.根据权利要求1-5任一所述的抗体，其特征在于，所述双特异抗体的Fc链为IgG形式。
7.根据权利要求1-6任一所述的抗体，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)和双特异性抗体。
8.根据权利要求1-7任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有权利要求1-7所述抗体相应核苷酸编码序列的宿主细胞，收集细胞，纯化双特异性抗体或其他等同生产方案。
9.根据权利要求1-8任一项所述的抗体，其特征在于，所述双特异性抗体可以与至少一种治疗剂偶联以形成免疫偶联物，所述治疗剂选自细胞毒素剂、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。
10.双特异性抗体的用途，其特征在于，包括从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的权利要求1-9所述抗体及其抗原结合片段并与药学上可接受的载体制成药物用于***的用途，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌。
CN201910678208.1A 2019-07-25 2019-07-25 一种双特异性抗体及其用途 Withdrawn CN110563848A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910678208.1A CN110563848A (zh) 2019-07-25 2019-07-25 一种双特异性抗体及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910678208.1A CN110563848A (zh) 2019-07-25 2019-07-25 一种双特异性抗体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110563848A true CN110563848A (zh) 2019-12-13

Family

ID=68773223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910678208.1A Withdrawn CN110563848A (zh) 2019-07-25 2019-07-25 一种双特异性抗体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110563848A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111748040A (zh) * 2020-07-31 2020-10-09 杭州皓阳生物技术有限公司 多价抗体及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111748040A (zh) * 2020-07-31 2020-10-09 杭州皓阳生物技术有限公司 多价抗体及其制备方法
CN111748040B (zh) * 2020-07-31 2021-09-28 杭州皓阳生物技术有限公司 多价抗体及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7393337B2 (ja) 抗ｂ７－ｈ４抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途
US20210324080A1 (en) Antibody targeting ctla-4 , preparation method therefor and use thereof
CA2798285C (en) Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof
MX2010011955A (es) Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
CN110563843A (zh) 一种靶向人vista蛋白的单克隆抗体
WO2021170082A1 (zh) 抗cd47/抗pd-l1抗体及其应用
AU2021390121A1 (en) Anti-human b7-h3 antibody and application thereof
CN110642950B (zh) 一种人源化t细胞活化的v域免疫抑制因子抗原结合片段
US11685778B2 (en) Anti-human LAG-3 monoclonal antibody and use thereof
WO2019238074A1 (zh) 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用
CN110563848A (zh) 一种双特异性抗体及其用途
JP2024514855A (ja) Ｄｌｌ３に対する結合分子及びその使用
CN110563847A (zh) 用于治疗性用途的免疫检查点抑制剂
CN111558038B (zh) 一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂
CN117999284A (zh) 靶向tigit的单克隆抗体
CN110713538A (zh) 一种抗人cd28单克隆抗体及其用途
CN110713541A (zh) 一种双特异性抗体及其抗肿瘤用途
CN111748040B (zh) 多价抗体及其制备方法
CN111875697B (zh) 一种包含肽标签的融合蛋白
CN111840571B (zh) 一种抗体药物偶联物及其用途
CN114761434B (zh) Pd-1抗体及其制备方法与应用
WO2021244587A1 (zh) 一种抗PD-L1/TGF-β融合蛋白
CN110724195A (zh) 一种抗人icos单克隆抗体
CN114163528A (zh) Cd47结合分子及其应用
CN116813771A (zh) Cd112抗体及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20191213