CN108303542B - 一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒采用磁性微粒包被的抗原、发光标记物标记的蛋白与待测样本中的抗体发生特异性反应而进行待测样品中抗体含量的测定。本发明的试剂盒实现猪繁殖与呼吸综合征抗体的定量检测，灵敏度高，检测范围宽，快速，重复性好，全自动操作及高通量检测的效果。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征抗体检测技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及采用该试剂盒进行检测的检测方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，主要引起怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状。本病的传染性极强，一旦感染，发病猪将持续高温41度以上并出现急性死亡；妊娠母猪流产率高达30％以上；仔猪则100％发病并伴随着50％以上的死亡率风险，给我国的养猪业造成严重的经济损失。
PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，分为2个型，即欧洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)。目前我国流行主要是Ⅱ型毒株。该病毒的病毒粒子中含有一个核衣壳，核衣壳由正链RNA基因组和核衣壳蛋白(N)组成，核衣壳外边包裹一层囊膜；病毒的囊膜有6种病毒结构蛋白：E、M、GP2、GP3、GP4和GP5。M、N和GP5三种蛋白是PRRS病毒的主要结构蛋白。
在我国，免疫接种是防治猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒抗原蛋白起着重要的作用，也是必须的结构蛋白，免疫后能产生保护性中和抗体。免疫后猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价与攻毒保护具有明显的相关性，所以通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证。
猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白是主要的中和性抗原蛋白，其抗体是疫苗免疫后抗体水平的监测和病毒感染后抗体水平检测的主要标的，抗体水平高低与其免疫或感染状况直接相关，所以有猪繁殖与呼吸综合征抗体定量检测的现实需求。现有的检测机构有兽医站、疫苗公司、养殖场等存在着大量的样本，也对大通量的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒和仪器有着需求。现有的ELISA、病毒中和试验、胶体金等的方法难以满足。
目前建立并应用的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测方法有ELISA方法、病毒中和试验、免疫荧光法、胶体金试纸条等方法，其中ELISA方法目前是猪繁殖与呼吸综合征抗体最常用的方法，ELISA所测OD值的范围在0.1-3.5，限定了所测量的抗体范围较窄，只能做到半定量，反应的时间通常在2小时左右，时间较长；病毒中和试验是通过猪繁殖与呼吸综合征病毒和抗体在细胞上中进行抗原抗体反应来判定抗体滴度，能较全面反映中和抗体的高低，全过程为病毒滴定、抗体中和、结果判定等过程需5-7天时间，全过程只能人工来操作、判定，重复性差；免疫荧光法通常也是在细胞上操作，存在灵敏度不高，重复性差等缺点；胶体金方法能快速得出结果，但是只能定性，难以定量，限制了应用范围。
专利CN104237513A(公布日为2014.12.24)公开了一种甲状腺过氧化物酶抗体磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括TPO-Ab校准品，TPO-Ab稀释液，偶联有链霉亲和素的磁性微粒悬浮液，生物素标记的TPO-Ab抗原，鼠抗人酶标结合物，TPO-Ab质控品，化学发光液A和B，20倍浓缩洗液和反应管，该试剂盒对甲状腺过氧化物酶抗体的含量进行定量测定，实现灵敏度高，特异性，精密性，稳定性良好的效果。该试剂盒在人抗体上应用广泛，但在动物抗体上还未有报道。
目前猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体检测主要采用的是半定量的ELISA方法并不能满足定量需求，这一点主要是由于缺乏猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体标准品和定量标准、没有准确可重复性的检测方法造成的。与兽医不同，在人医领域，各个疾病的标志物，例如上述的甲状腺过氧化物酶抗体，都已经得到充分研究，建立了通用的国家标准、国际标准或行业标准，定量简单易行，因此不同厂家生产的产品得到了规范，检测结果一致性较好。而在兽医领域，目前的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体检测市场大部分被进口的ELISA定性检测试剂占据，并且各厂家的产品检测结果相差很大，不利于畜牧养殖业发展，亟需建立定量标准以及准确可靠重复性佳的检测方法。
发明内容
为了解决现有兽医检测技术中存在的检测时间长、难以定量、重复性差、难以自动化等的问题，本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，它可以定量检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的含量。为此，本发明还提供一种利用该试剂盒进行检测的方法，本发明的检测方法灵敏度高、定量检测且检测范围宽、检测时间短、重复性好。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：
本发明的第一方面，提供一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。
其中，所述的偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。
其中，所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗FITC抗体-FITC偶联。
其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：
S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；
S2，加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白；
S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；
S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中。
其中，所述磁性微粒的溶液、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的比例为10mg:0.6-9.5nmol。
优选的是，所述磁性微粒的溶液、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的比例为10mg:2-8nmol。
其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白间接偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：
1)磁性微粒结合亲和素
S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；
S2，加入亲和素；
S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；
S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中，构成磁性微粒-亲和素复合物；
2)猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白结合生物素
S1，取猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白，透析纯化；
S2，依次加入生物素和封闭剂，反应；
S3，透析除去未结合的生物素，获得猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素。
3)磁性微粒-亲和素与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素复合物混合，通过亲和素与生物素的结合力连接磁性微粒与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白。
其中，所述发光标记物标记的蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：
S1，取与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白或与猪繁殖与呼吸综合征抗体特异性结合的蛋白，透析纯化；
S2，加入发光标记物，反应；
S3，加入封闭剂，反应；
S4，透析分离未结合的发光标记物。
其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白可以为猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP2a、GP3、GP4、GP5、5a、N、M、E蛋白中的一种或几种组合，并且是抗原蛋白全长、天然抗原蛋白片段、重组表达的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白全长、重组表达的抗原蛋白片段，抗原蛋白多肽、抗原蛋白化学合成物中的一种或几种的组合，所述的磁性微粒为以Fe3O4为核心，表面覆有聚合物涂层，并导入羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团的微粒。
其中，所述磁性微粒的直径为0.1-5μm。
优选的是，所述磁性微粒的直径为1-3μm，所述磁性微粒直径CV＜3％。
其中，所述发光标记物选自吖啶酯、碱性磷酸酶、过氧化物酶中的任意一种。
其中，所述发光标记物标记的蛋白选自猪繁殖与呼吸综合征抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、抗猪IgG抗体、抗猪IgM抗体中的任意一种或多种的组合。
其中，所述发光底物与发光标记物一一对应。
优选的是，所述发光标记物为吖啶酯时，发光底物由第一发光底物和第二发光底物组成，第一发光底物为含有0.1mol/L硝酸、0.1％过氧化氢的溶液，第二发光底物为含有2％Tween-20、0.25mol/L NaOH的溶液；所述发光标记物为碱性磷酸酶时，发光底物为以金刚烷为基础的底物液；所述发光标记物为过氧化物酶时，发光底物由第一发光底物和第二发光底物组成，第一发光底物为含有0.5g/L鲁米诺、0.1g/L对碘酚的溶液，第二发光底物为0.625g/L过氧化脲溶液。
其中，所述试剂盒中还包括稀释液，质控品，校准品和清洗液，稀释液为缓冲液、牛血清白蛋白、阻断剂、单克隆抗体，多克隆抗体中的一种或多种的组合。
为建立可靠的定量标准，本发明采用了校准品定标，确保试验的可重复性。校准品溯源至经典的病毒中和试验，根据病毒中和试验得到的血清抗体效价，确定了校准品的浓度。其中，校准品分为8个浓度梯度，依次为0，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200U/mL。
其中，所述质控品为猪繁殖与呼吸综合征抗体低值质控品和高值质控品，所述低值质控品的质控范围为20-30U/mL，高值质控品的质控范围为100-150U/mL；所述清洗液为0.05mol/LpH为8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液或0.01mol/L pH为7.0的磷酸盐(PBS)缓冲液，所述Tris缓冲液和PBS缓冲液中分别含有0.1％的Tween-20。
本发明的第二方面，提供一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法，采用上述的检测试剂盒，包括如下步骤：
S1，向反应容器中依次加入10-100μL待测样品或校准品、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液；
S2，于35-39℃下反应10-20分钟；
S3，用磁铁进行吸附，吸去上清液，加入200-500μL清洗液洗涤，弃去清洗液；
S4，向S3中加入100-200μL发光标记物标记的蛋白溶液；
S5，重复S2和S3的步骤；
S6，向S5中加入发光底物于35-39℃下反应0.5-10分钟；
S7，用化学发光仪检测发光值，绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
所述待测样品包括血液样品，体液样品和组织样品。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：
1.本发明的试剂盒采用直径0.1-5μm的磁性微粒为包被载体，磁性微粒是球体，有磁性，具有表面积大的特点，能包被更多猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白；磁性微粒可悬浮在液体中，所以可以充分地、全方位地和反应物接触并反应，而现有的猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测方法、病毒中和试验、免疫荧光等方法的包被载体是酶标板表面或细胞板表面，包被或容纳的蛋白有限。因此本发明的检测方法和ELISA、病毒中和试验、免疫荧光等方法相比：
1)包被的蛋白较多，检测范围宽；
2)本发明的检测方法是能充分接触的液相反应，反应时间短，通常5～10分钟。
2.本发明的检测方法以发光底物与发光标记物一一对应。本发明检测方法采用的发光标记物可以是以下一种：吖啶酯及其衍生物、碱性磷酸酶(AP)、过氧化物酶(HRP)。吖啶酯及其衍生物是化学发光剂直接标记在蛋白上，通过起动发光试剂(NaOH-H2O2)作用而发光；蛋白标记碱性磷酸酶、过氧化物酶是酶促发光，碱性磷酸酶的底物是金刚烷及其衍生物配置的溶液，过氧化物酶的底物是鲁米诺及其衍生物配置的溶液。而目前猪繁殖与呼吸综合征抗体检测方法的ELISA显色底物通常是TMB，显色灵敏度、强度远低于化学发光。
3.本发明检测方法因磁性微粒在磁铁作用下很方便的清洗和分离，容易实现加样、反应、清洗、分离、检测全自动操作，易于实现快速、高通量、全自动检测，整个过程由检测仪器精确控制，检测结果可重复性好；而现有的检测方法如ELISA、病毒中和试验、免疫荧光、胶体金等检测方法均难以实现全自动操作，重复性差。
4.本发明采用高度均一的液相反应，并配合校准品、质控品控制试验的准确性，使重复性得到了很大提升,提高了不同批次试验间检测结果的可比性，更适用于疫苗免疫之后的监测。而目前猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法受其原理、操作限制，不同批次试验检测结果难以重复。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1是本发明羧基磁性微粒最适的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原用量曲线；
图2是本发明甲苯磺酰基磁性微粒最适的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原用量曲线；
图3是本发明实施例一中的校准曲线；
图4是本发明实施例二中的校准曲线；
图5是本发明实施例三中的校准曲线；
图6是本发明实施例四中的校准曲线。
具体实施方式
可用于本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原蛋白或其片段没有特殊限制，可以包括所述天然或重组的gE蛋白的全长或其片段。优选地，可包括猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白全长序列如SEQ ID NO.:1所示，其含有200个氨基酸，分子量为25kD；猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白片段序列如SEQ ID NO.:2所示，其含有102个氨基酸，分子量12.5kD；猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白多肽序列如SEQ ID NO.:3所示，其含有42个氨基酸，分子量为5kD；或采用猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白序列如SEQ ID NO.:4所示，其含有123个氨基酸，分子量为15kD；猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白序列如SEQ ID NO.:5所示，其含有174个氨基酸，分子量为15kD。
本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。本发明的所述蛋白或其片段可以是重组的、天然的、合成的蛋白或其片段。本发明所述蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
磁性微粒指内部有磁性核心，外部包覆聚合物的微粒。包覆层含有活性基团，可与蛋白、多肽等偶联，并不影响蛋白、多肽的免疫活性；磁核使微粒在外部磁场作用下可定向移动聚集，离开磁场之后可在溶液中均匀分散，从而兼顾了抗原抗体的液相反应和抗原抗体复合物与未反应物质的分离。
可用于本发明的磁性微粒没有特殊限制，可以是任何具有磁性核心、表面附有聚合物的磁性颗粒。可用于本发明磁性微粒的核心为氧化铁(Fe3O4)；可用于本发明磁性颗粒表面的聚合物包括聚苯乙烯、丙烯酸树脂、聚甲基丙烯酸甲酯等。本发明磁性微粒的大小优选为0.1-5μm，更优选为1-3μm。可用于本发明的磁性微粒通常以微粒群溶液的形式存在，通常，所述微粒群溶液中，微粒大小形状高度均一，粒径CV<3％。
可用于本发明的磁性微粒还可以含有多个活性基团，从而通过化学交联的方式将蛋白、多肽结合于磁性微粒表面。优选地，所述的活性基团包括羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团。含有活性基团的磁性微粒可以通过本领域常规技术制备获得或直接市售可得。例如购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Caboxyl的含有羧基的磁性微粒；或购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Tosyl含有甲苯磺酰基的磁性微粒。
本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原与磁性微粒之间可通过直接或间接偶联。例如，所述的直接偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗FITC抗体-FITC偶联。优选的方式为：链霉亲和素包被在磁性微粒上，生物素偶联在猪繁殖与呼吸综合征病毒上，通过链霉亲和素-生物素作用结合猪繁殖与呼吸综合征病毒和磁性微粒；抗FITC抗体包被在磁性微粒上，FITC交联在猪繁殖与呼吸综合征病毒上，通过抗FITC抗体-FITC相互作用结合猪繁殖与呼吸综合征病毒和磁性微粒。
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法，采用上述的检测试剂盒，包括如下步骤：
S1，向反应容器中依次加入10-100μL待测样品或校准品、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液；
S2，于35-39℃下反应10-20分钟；
S3，用磁铁进行吸附，吸去上清液，加入200-500μL清洗液洗涤，弃去清洗液；
S4，向S3中加入100-200μL发光标记物标记的蛋白溶液；
S5，重复S2和S3的步骤；
S6，向S5中加入发光底物于35-39℃下反应0.5-10分钟；
S7，用化学发光仪检测发光值，绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
以羧基磁性微粒和甲苯磺酰基磁性微粒为例，进行磁性微粒、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白最适用量实验。
一、羧基磁性微粒、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白最适用量实验
采用5种猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白，其中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白全长的加入量为10、20、50、100、200、500μg，对应物质的量为0.4、0.8、2、4、8、20nmol；nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白片段的加入量为5、10、25、50、100、250μg，对应物质的量为0.4、0.8、2、4、8、20nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白多肽的加入量为2、4、10、20、40、100μg，对应物质的量为0.4、0.8、2、4、8、20nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白全长的加入量为5、10、25、50、100、250μg，对应物质的量为0.33、0.67、1.67、3.33、6.67、16.7nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白片段的加入量为5、10、25、50、100、250μg，对应物质的量为0.45、0.91、2.27、4.55、9.09、22.7nmol，羧基磁性微粒的加入量为10mg。
将上述猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白与羧基磁性微粒分别用于制备包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液，将包含该磁性悬浮液的试剂盒分别用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，结果如表1所示，图1为包被蛋白用量与其发光值对应的曲线。
结果表明，随蛋白用量增加，发光值上升速度逐渐变缓，说明磁性微粒结合蛋白接近饱和；而蛋白用量继续增加，发光值反而有所降低，说明蛋白过量，出现了较多的蛋白自身交联。
因此，对于羧基磁性微粒，猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白全长、片段、多肽的最适用量为0.8-8nmol/10mg磁性微粒；N蛋白全长的最适用量为0.67-6.67nmol/10mg磁性微粒；M蛋白片段的最适用量为0.91-9.09nmol/10mg磁性微粒。五种蛋白虽然氨基酸数量、分子量差别很大，但按物质的量计算，最佳包被蛋白用量相差不大，都在0.6-9.5nmol/10mg磁性微粒范围内。
表1
Figure BDA0001207205730000071
二、甲苯磺酰基磁性微粒、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白最适用量实验
采用5种猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白，其中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白全长的加入量为10、20、50、100、200、500μg，对应物质的量为0.4、0.8、2、4、8、20nmol；nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白片段的加入量为5、10、25、50、100、250μg，对应物质的量为0.4、0.8、2、4、8、20nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白多肽的加入量为2、4、10、20、40、100μg，对应物质的量为0.4、0.8、2、4、8、20nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白全长的加入量为5、10、25、50、100、250μg，对应物质的量为0.33、0.67、1.67、3.33、6.67、16.7nmol；猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白片段的加入量为5、10、25、50、100、250μg，对应物质的量为0.45、0.91、2.27、4.55、9.09、22.7nmol，甲苯磺酰基磁性微粒的加入量为10mg。
将上述猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白与甲苯磺酰基磁性微粒分别用于制备包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液，将包含该磁性悬浮液的试剂盒分别用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，结果如表2所示，图2为包被蛋白用量与其发光值对应的曲线。
结果表明，随蛋白用量增加，发光值上升速度逐渐变缓，说明磁性微粒结合蛋白接近饱和。因此，对于甲苯磺酰基磁性微粒，猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白全长、片段、多肽的最适用量为0.8nmol/10mg磁性微粒以上；N蛋白全长的最适用量为0.67nmol/10mg磁性微粒以上；M蛋白片段的最适用量为0.91nmol/10mg磁性微粒以上。五种蛋白虽然氨基酸数量、分子量差别很大，但按物质的量计算，最佳包被蛋白用量相差不大，考虑成本因素，蛋白用量不宜过多，结合羧基磁性微粒的结果，确定五种蛋白的最佳用量范围为0.65-9.5nmol/10mg磁性微粒。
表2
Figure BDA0001207205730000081
/>
实施例一
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测的试剂盒，包括包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液，碱性磷酸酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗体溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，发光底物。
包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒(购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Caboxyl)的溶液，浓度为10mg/mL，用0.1mol/L pH为5.0的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液中；
(2)加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白(购自于青岛易邦生物工程有限公司)30μg；
(3)称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液溶解，使EDC的浓度为10mg/mL；
(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振荡反应2小时；
(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含1％的BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300(购于Sigma公司，货号：48914-U)。
所述的磁性微粒为含有羧基基团的磁性微粒。
碱性磷酸酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗体溶液的制备：
(1)取1mg碱性磷酸酶，用0.05mol/L pH为9.5的碳酸盐缓冲液(CB缓冲液)稀释至10mg/mL；
(2)称取高碘酸钠(NaIO4)并用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液溶解，使NaIO4的浓度为12.5mg/mL；
(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振荡混匀，于2℃下避光反应1小时；
(4)取10μL乙二醇，加入1mL 0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液，获得乙二醇溶液；
(5)取(4)中乙二醇溶液100μL加入(3)中，于6℃避光反应1小时；
(6)取猪繁殖与呼吸综合征单克隆抗体0.5mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液于2℃下避光透析20小时；
(7)称取硼氢化钠(NaBH4)溶于纯水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；
(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2℃避光反应2小时；
(9)过分子筛纯化分离未结合的碱性磷酸酶和猪繁殖与呼吸综合征单克隆抗体；
(10)将(9)中纯化后的抗体溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05M的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液稀释备用。
稀释浓度为0.1-0.5μg/mL。
校准品是经标定的含有已知浓度的猪繁殖与呼吸综合征抗体的缓冲液。
校准品的制备：
(1)将经猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗强化免疫后获得的猪繁殖与呼吸综合征抗体强阳性血清于60℃热灭活1小时；
(2)将(1)中灭活后的强阳性血清经0.2μm的微滤膜过滤，加入0.1％的ProClinTM300；
(3)将(2)中的血清进行标定，按一定浓度稀释，得到0，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200U/mL系列校准品。
质控品是经标定的猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性猪血清。分为低值质控品和高值质控品，其中低值质控品的质控范围为20-30U/mL，高值质控品的质控范围为100-150U/mL。质控品用于控制试验的有效性，定期检测质控品，若超出质控范围，则须使用校准品重新定标。
质控品的制备：选择10份以上猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，60℃热灭活1小时，混合后经0.2μm的微滤膜过滤，加入0.1％的ProClinTM300，得到质控品。
稀释液是含有1％BSA，pH为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.05mol/L pH为8.0的Tris缓冲液；发光底物是以金刚烷及其衍生物为基础的溶液，此例中的发光底物为Lumi-Phos 530，购于Lumigen公司，货号：P-5000。
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法，包括如下步骤：
S1、取若干反应管，依次加入10μL待测血清或校准品、100μL稀释液和25μL包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液；
S2、37℃下反应10分钟；
S3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入300μL清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；
S4、向S3中加入100μL碱性磷酸酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗体溶液；
S5、37℃下反应10分钟；
S6、重复步骤S3中的清洗步骤；
S7、S6中加入100μL发光底物；
S8、37℃下反应5分钟；
S9、用化学发光仪检测发光值，绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
以浓度值取对数为X轴，以发光值取Logit为Y轴，进行线性拟合，绘制校准曲线。
Figure BDA0001207205730000101
Sn：校准品(除校准品零值外)或样本发光值；
S0：校准品零值的发光值。
表3为不同浓度的校准品所对应的发光值，图3为绘制的校准曲线。
表3
Figure BDA0001207205730000112
一、灵敏度实验
用本实施例中的试剂盒和国外知名厂家生产的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒(酶联免疫吸附试验，以下简称为ELISA试剂盒)同时检测不同稀释倍数的猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，其中，本实施例的试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数(CV％＝10个测试结果的标准偏差/算术平均值)。结果证明，本实施例中的试剂盒定量准确。以CV％<20％的最低浓度作为灵敏度，本实施例中灵敏度<2.69U/mL，优于ELISA试剂盒。
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
表4为实施例一的试剂盒与ELISA试剂盒的灵敏度比较
Figure BDA0001207205730000111
二、重复性实验
取3例猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，用本试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算其浓度的变异系数，结果如表5。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。
表5
Figure BDA0001207205730000121
三、符合率实验
本试剂盒与ELISA试剂盒同时检测多份猪血清，检测结果如表6。结果显示，本试剂盒与ELISA试剂盒阳性符合率93.5％，阴性符合率94.6％，总体符合率93.7％。
表6
Figure BDA0001207205730000122
四、将本实施例的试剂盒进行猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的免疫监测
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
在用猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫后，随机抽取4头，分别于免疫后1、7、14、21天抽取血样检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，并以未免疫猪作为对照，检测结果如表7。结果显示，在免疫后14天、21天，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体由阴转阳，且浓度逐渐上升；而未免疫猪的抗体含量无明显变化；两种试剂检测结果一致。
表7
Figure BDA0001207205730000123
/>
Figure BDA0001207205730000131
五、特异性实验
用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(CSFV)、***病毒O型(FMDV-O)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。检测结果均低于10U/mL，均为阴性，未发现交叉反应。
表8
相关病毒 CSFV FMD-O PRV PCV2 BVDV
浓度(U/mL) 4.34 3.37 3.71 2.67 2.81
实施例二
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测的试剂盒，包括包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液，吖啶酯标记的山羊抗猪IgG抗体(购自北京索莱宝科技有限公司)溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，第一发光底物和第二发光底物。
包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/mL，用0.1mol/L pH为9.5的硼酸缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.1mol/L pH为9.5的硼酸缓冲液中；
(2)加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白40μg，涡旋混匀；
(3)加入0.1mol/L pH为9.5的硼酸缓冲液(含有3mol/L硫酸铵)0.5mL，37℃下振荡反应20小时；
(4)加入0.5mL 10％的BSA水溶液，涡旋混匀，37℃振荡反应12小时；
(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。
所述的磁性微粒为含有甲苯磺酰基基团的磁性微粒。
吖啶酯标记山羊抗猪IgG抗体溶液的制备：
(1)取1mg山羊抗猪IgG抗体，用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液在8℃下透析过夜；
(2)取含有0.2mg吖啶酯的吖啶酯溶液加入到(1)中，常温避光反应2小时；
(3)加入100μL 0.1g/mL赖氨酸溶液，常温避光反应2小时；
(4)用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液在8℃下避光透析24小时；
(5)将(4)中的抗体溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
校准品的制备方法与实施例一相同。
质控品的制备方法与实施例一相同。
稀释液是含有1％BSA，pH为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/L pH为7.0的PBS缓冲液；第一发光底物为含有0.1mol/L硝酸、0.1％过氧化氢的溶液，第二发光底物为含有2％Tween-20、0.25mol/L NaOH的溶液。
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法，包括如下步骤：
S1、取若干反应管，依次加入20μL待测血清或校准品、100μL稀释液和20μL包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液；
S2、35℃下反应15分钟；
S3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入200μL清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；
S4、向S3中加入150μL吖啶酯标记山羊抗猪IgG抗体溶液；
S5、35℃下反应15分钟；
S6、重复步骤S3中的清洗步骤；
S7、S6中依次加入100μL第一发光底物和100μL第二发光底物；
S8、用化学发光仪检测发光值，绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
表9为不同校准品浓度所对应的发光值，图4为绘制的校准曲线。
Figure BDA0001207205730000141
Figure BDA0001207205730000151
一、灵敏度实验
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
用本实施例的试剂盒和ELISA试剂盒同时检测不同稀释倍数的猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，其中，本试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数，结果如表10。结果证明，本实施例的试剂盒定量准确，且灵敏度<1.51U/mL，优于ELISA试剂盒。
表10为本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒的灵敏度比较
Figure BDA0001207205730000152
二、重复性实验
取3例猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，用本实施例的试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算其浓度的变异系数，结果如表11。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。
表11
Figure BDA0001207205730000153
Figure BDA0001207205730000161
三、符合率实验
本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒同时检测多份猪血清，结果如表12。本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒阳性符合率94.6％，阴性符合率94.6％，总体符合率94.6％。
表12
Figure BDA0001207205730000162
四、将本实施例的试剂盒进行猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的免疫监测
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
在用猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后，随机抽取4头，分别于免疫后1、7、14、21天抽取血样检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，并以未免疫猪作为对照，结果如表13。结果显示，在免疫后14天、21天，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体由阴转阳，且浓度逐渐上升；而未免疫猪的抗体含量无明显变化；两种试剂检测结果一致。
表13
Figure BDA0001207205730000163
Figure BDA0001207205730000171
五、特异性实验
用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(CSFV)、***病毒O型(FMDV-O)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。检测结果均低于10U/mL，均为阴性，未发现交叉反应。
表14
相关病毒 CSFV FMD-O PRV PCV2 BVDV
浓度(U/mL) 5.6 5.62 5.47 4.98 4.55
实施例三
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测的试剂盒，包括包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液，辣根过氧化物酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗原溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，第一发光底物和第二发光底物。
包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/mL，用0.01mol/L pH为7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液中；
(2)加入0.1mL 25％(v/v)的戊二醛溶液，37℃振荡反应2小时；
(3)用1mL 0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液清洗3遍；
(4)加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原重组抗原30μg，37℃振荡反应20小时；
(5)加入0.5mL 10％牛血清白蛋白(BSA)水溶液，涡旋混匀，37℃振荡反应2小时；
(6)用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。
所述的磁性微粒为含有氨基基团的磁性微粒。
辣根过氧化物酶标记猪繁殖与呼吸综合征抗原的制备：
(1)取1mg辣根过氧化物酶，用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液稀释至10mg/mL；
(2)称取NaIO4并用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液溶解，使NaIO4的浓度为12.5mg/mL；
(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振荡混匀，于8℃下避光反应1小时；
(4)取10μL乙二醇，加入1mL 0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液，获得乙二醇溶液；
(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2℃避光反应1小时；
(6)取猪繁殖与呼吸综合征抗原1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液于8℃下避光透析22小时；
(7)称取NaIO4溶于纯水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；
(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于8℃避光反应2小时；
(9)过分子筛纯化；
(10)将(9)中纯化后的抗原溶液用含有1％BSA的pH7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
校准品的制备方法与实施例一相同。
质控品的制备方法与实施例一相同。
稀释液是含有1％BSA，pH为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/L pH7.0的PBS缓冲液；第一发光底物为0.5g/L鲁米诺、0.1g/L对碘酚的溶液，第二发光底物为0.625g/L过氧化脲溶液。
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法，包括如下步骤：
S1、取若干反应管，依次加入100μL待测血清或校准品、100μL稀释液和50μL包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液；
S2、39℃下反应20分钟；
S3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入500μL清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；
S4、向S3中加入200μL辣根过氧化物酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗原溶液；
S5、39℃下反应20分钟；
S6、重复步骤S3中的清洗步骤；
S7、S6中依次加入50μL第一发光底物和50μL第二发光底物；
S8、35℃下反应0.5分钟；
S9、用化学发光仪检测发光值，绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
表15为校准品不同浓度对应的发光值，图5为绘制的校准曲线。
Figure BDA0001207205730000181
Figure BDA0001207205730000191
一、灵敏度实验
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
用本实施例的试剂盒和ELISA试剂盒同时检测不同稀释倍数的猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，其中，本试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数，结果如表16。结果证明，本试剂盒定量准确，且灵敏度<0.80U/mL，优于ELISA试剂盒。
表16
Figure BDA0001207205730000192
二、重复性实验
取3例猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，用本实施例的试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算其浓度的变异系数，结果如表17。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。
表17
Figure BDA0001207205730000193
Figure BDA0001207205730000201
三、符合率实验
本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒同时检测多份猪血清，检测结果如表18。本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒阳性符合率94.2％，阴性符合率93.4％，总体符合率93.9％。
表18
Figure BDA0001207205730000202
四、本实施例的试剂盒用于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫监测
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
在用猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫后，随机抽取4头，分别于免疫后1、7、14、21天抽取血样检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体，并以未免疫猪作为对照。结果显示，在免疫后14天、21天，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体由阴转阳，且浓度逐渐上升；而未免疫猪的抗体含量无明显变化；两种试剂检测结果一致。
表19
Figure BDA0001207205730000203
Figure BDA0001207205730000211
五、特异性实验
用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(CSFV)、***病毒O型(FMDV-O)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。检测结果均低于10U/mL，均为阴性，未发现交叉反应。
表20
相关病毒 CSFV FMD-O PRV PCV2 BVDV
浓度(U/mL) 2.26 2.22 2.25 1.71 1.53
实施例四
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测的试剂盒，包括包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液，碱性磷酸酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗体，生物素化抗原，校准品，质控品，清洗液，发光底物。
包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/mL，用0.1mol/L pH为5.0的1-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液中；
(2)加入链霉亲和素50-500μg；
(3)称取EDC，用0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液溶解，使EDC的浓度为10mg/mL；
(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振荡反应2小时；
(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。
所述的磁性微粒为含有羧基基团的磁性微粒。
碱性磷酸酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗体溶液的制备：
(1)取1mg碱性磷酸酶，用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液稀释至10mg/mL；
(2)称取NaIO4并用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液溶解，使NaIO4的浓度为12.5mg/mL；
(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振荡混匀，于8℃下避光反应1小时；
(4)取10μL乙二醇，加入1mL 0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液，获得乙二醇溶液；
(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于6℃避光反应1小时；
(6)取O型***病毒单克隆抗体1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液于2℃下避光透析24小时；
(7)称取NaBH4溶于纯水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；
(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2℃避光反应2小时；
(9)过分子筛纯化；
(10)将(9)中纯化后的抗体溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
生物素抗原的制备：
(1)取1mg猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，用0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液在8℃下透析过夜；
(2)将预活化的生物素溶于纯水中，制备50mmol/L的生物素溶液；
(3)取(2)中生物素溶液20μL加入(1)中，常温反应1小时；
(4)将(3)中加入100μL 0.1g/mL赖氨酸溶液，常温反应1小时；
(5)将(4)中溶液用0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液在5℃下透析24小时。
(6)将(5)中溶液用含有1％BSA的pH为7.00.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
校准品的制备方法与实施例一相同。
质控品的制备方法与实施例一相同。
清洗液是含0.1％Tween-20的0.05mol/L pH8.0的Tris缓冲液；发光底物是以金刚烷及其衍生物为基础的溶液。此例中的发光底物为Lumi-Phos 530，购于Lumigen公司，货号：P-5000。
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法，包括如下步骤：
S1、取若干反应管，依次加入20μL待测血清或校准品、100μL生物素化抗原和25μL包被猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的磁性悬浮液；
S2、37℃下反应10分钟；
S3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入500μL清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；
S4、向S3中加入200μL碱性磷酸酶标记的猪繁殖与呼吸综合征抗体溶液；
S5、37℃下反应10分钟；
S6、重复步骤S3中的清洗步骤；
S7、S6中加入100μL发光底物；
S8、39℃下反应10分钟；
S9、用化学发光仪检测发光值，绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
表21为校准品不同浓度对应的发光值，图6为绘制的校准曲线。
表21
Figure BDA0001207205730000231
一、灵敏度实验
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
用本实施例的试剂盒和ELISA试剂盒同时检测不同稀释倍数的猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，其中，本实施例的试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数，结果如表22。结果证明，本试剂定量准确，且灵敏度<3.02U/mL，优于ELISA试剂盒。
表22
Figure BDA0001207205730000232
Figure BDA0001207205730000241
二、重复性实验
取3例猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性血清，用本实施例的试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算其浓度的变异系数，结果如表23。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。
表23
Figure BDA0001207205730000242
三、符合率实验
本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒同时检测多份猪血清，结果如表24。本实施例的试剂盒与ELISA试剂盒阳性符合率92.3％，阴性符合率92.7％，总体符合率92.4％。
表24
Figure BDA0001207205730000243
四、本实施例的试剂盒用于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫监测
本实施例浓度<10U/mL判定为阴性，浓度≥10U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/P<0.40判定为阴性，S/P≥0.40判定为阳性。
在用猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫后，随机抽取4头，分别于免疫后1、7、14、21天抽取血样检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体，并以未免疫猪作为对照。结果显示，在免疫后14天、21天，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体由阴转阳，且浓度逐渐上升；而未免疫猪的抗体含量无明显变化；两种试剂检测结果一致。
表25
Figure BDA0001207205730000244
Figure BDA0001207205730000251
五、特异性实验
用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(CSFV)、***病毒O型(FMDV-O)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV2)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。检测结果均低于10U/mL，均为阴性，未发现交叉反应。
表26
相关病毒 CSFV FMD-O PRV PCV2 BVDV
浓度(U/mL) 2.96 3.48 2.12 2.79 2.19
本发明采用特定粒径的磁性微粒作为包被载体，采用特定的猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白与磁性微粒之比进行混合并反应，获得了包被均质、结构稳定的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原偶联磁性微粒，也节省了包被蛋白原料，其包被的蛋白充分、检测范围较宽，灵敏度较高、反应时间非常短(仅需5-10分钟)，并具有高通量、自动化、可重复的优异特点。
上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。
序列表
<110> 上海鸣捷生物科技有限公司
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法
<160>5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>200
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 1
MLGRCLTAGCCSRLLSLWCIVPFCFAVLVNASSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTEWLGNKF 60
DWTVETFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLVTVSTAGFYHGRYVLSSIYAVCALAAL 120
TCFVIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIIEKGGKVEVEGHLIDLKRVV 180
LDGSVATPLTRVSAEQWGRL 200
<210>2
<211>102
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
LTLCELNGTE WLGNKFDWTV ETFVIFPVLT HIVSYGALTT SHFLDTVGLV TVSTAGFYHG 60
RYVLSSIYAV CALAALTCFV IRLAKNCMSW RYSCTRYTNF LL 102
<210>3
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
CELNGTEWLG NKFDWTVETF VIFPVLTHIV SYGALTTSHF LD 42
<210>4
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
MPNNNGKQQK KKRGNGQPVN QLCQMLGKII AQQNQSRGKG PGKKIKNKNP EKPHFPLATE 60
DDVRHHFTSS ERQLCLSSIQ TAFNQGAGAC TLSDSGRISY TVEFSLPTHH TVRLIRVTAP 120
SSA 123
<210>5
<211>174
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
MGSSLDDFCY DSTAPQKVLL AFSITYTPVM IYALKVSRGR LLGLLHLLIF LNCTFTFGYM 60
TFVHFESTNK VALTMGAVVA LLWGVYSAIE TWKFITSRCR LCLLGRKYIL APAHHVESAA 120
GFHPIAANDN HAFVVRRPGS TTVNGTLVPG LKSLVLGGRK AVKQGVVNLV KYAK 174

Claims (6)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，包括猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物；
所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白选自猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白全长、GP5蛋白片段、GP5蛋白多肽、N蛋白、M蛋白中的一种，所述的磁性微粒为以Fe3O4为核心，表面覆有聚合物涂层，并导入羧基、甲苯磺酰基基团的微粒；
所述磁性微粒的直径为1-3μm，所述磁性微粒直径CV＜3％；
所述试剂盒中还包括稀释液，质控品，校准品和清洗液，稀释液选自缓冲液、牛血清白蛋白、阻断剂、单克隆抗体，多克隆抗体中的一种或多种的组合；
所述质控品为猪繁殖与呼吸综合征抗体低值质控品和高值质控品，所述低值质控品的质控范围为20-30U/mL，高值质控品的质控范围为100-150U/mL；所述清洗液为0.05mol/LpH为8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液或0.01mol/LpH为7.0的磷酸盐(PBS)缓冲液，所述Tris缓冲液和PBS缓冲液中分别含有0.1％的Tween-20；
所述猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白全长、片段、多肽的最适用量为0.8nmol/10mg磁性微粒；N蛋白全长的最适用量为0.67nmol/10mg磁性微粒；M蛋白片段的最适用量为0.91nmol/10mg磁性微粒。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联磁性微粒的溶液制备方法包括如下步骤：
S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；
S2，加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白；
S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；
S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中。
3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白间接偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：
1)磁性微粒结合亲和素
S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；
S2，加入亲和素；
S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；
S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中，构成磁性微粒-亲和素复合物；
2)猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白结合生物素
S1，取猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白，透析；
S2，加入生物素，反应；
S3，加入封闭剂，反应；
S3，透析除去未结合的生物素，获得猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素；
3)磁性微粒-亲和素与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素复合物混合，通过亲和素与生物素的结合力连接磁性微粒、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白。
4.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述发光标记物标记的蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：
S1，取与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白或猪繁殖与呼吸综合征抗体特异性结合的蛋白，透析；
S2，加入发光标记物，反应；
S3，加入封闭剂，反应；
S4，透析分离未结合的发光标记物。
5.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述发光标记物选自吖啶酯、碱性磷酸酶、过氧化物酶中的任意一种，所述发光标记物标记的蛋白选自猪繁殖与呼吸综合征抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、抗猪IgG抗体、抗猪IgM抗体中的一种或多种的组合。
6.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物与发光标记物一一对应。
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