CN114164179A - 分泌抗sva抗体的杂交瘤细胞及其分泌的抗体与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，具体公开了分泌抗SVA抗体的杂交瘤细胞及其分泌的抗体与应用。本发明的杂交瘤细胞包括杂交瘤细胞株SVA‑VP2‑6D5和/或杂交瘤细胞株SVA‑VP3‑7A9；杂交瘤细胞株SVA‑VP2‑6D5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021277，杂交瘤细胞株SVA‑VP3‑7A9保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021276。以杂交瘤细胞株SVA‑VP2‑6D5和SVA‑VP3‑7A9分泌的单克隆抗体共同作为竞争抗体构建的竞争CLEIA，可用于A型塞内卡病毒抗体的定量检测。该检测方法敏感、快速、准确，为SVA抗体检测提供了一种可靠的血清学检测方法。

Description

分泌抗SVA抗体的杂交瘤细胞及其分泌的抗体与应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体地说，涉及分泌抗SVA抗体的杂交瘤细胞及其分泌的抗体与应用。
背景技术
猪塞尼卡病毒病是由塞尼卡病毒A(Senecavirus A，SVA)引起的一种猪水泡病。SVA最早被叫做塞内卡谷病毒A(Seneca Valley virus SVV)，2015年国际病毒分类委员会(ICTV)将其列入小RNA病毒科塞内卡病毒属，SVA与同科的心肌炎病毒属成员同源性最接近。SVA可引起仔猪腹泻，经产母猪和公猪鼻、上颚、口腔、唇部和蹄冠周围出现小泡和溃疡，偶发腹泻症状，1-3天的新生仔猪死亡率可达30％-70％。迄今为止，各国均报道发生过该病。但目前国内外对SVA的认识及研究较少，一旦大规模暴发必定会给养殖业带来严重的经济损失。
SVA是无囊膜的单股正链RNA病毒，结构呈二十面体，直径约为30nm，基因组全长约7.2～7.3kb，病毒基因具有1个开放阅读框(ORF)，编码有2181个氨基酸组成的多聚蛋白前体，之后被裂解为1个前导蛋白和3个主要多聚蛋白(P1、P2和P3)。P1基因区域主要编码4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)，形成病毒的核衣壳，而P2和P3基因区域编码7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。研究显示，VP2和VP3蛋白可诱导机体产生主要的中和抗体，用于清除体内的病毒，在抵御SVA感染和缓解临床症状中发挥着至关重要的作用。同时以其为检测抗原建立血清学方法，与血清中和试验有高度的一致性。
由于SVA感染猪以后引起的临床症状与***、猪水泡病等难以区分，仅凭借临床症状和病理剖检难以诊断SVA。因此病毒分离鉴定是最常用的病原学检测方法，但该方法操作繁杂，检测周期长；PCR及荧光定量PCR检测方法成本较高，仪器设备价格高昂，难以在基层推广应用；ELISA方法具有操作简便、敏感性高、适于大规模样品检测的优点，是实验室常用的检测方法。目前已有基于单抗检测SVA抗体的阻断ELISA试剂，但过程相对繁琐，操作时长；也有一些其他关于SVA抗体检测阻断及竞争ELISA方法的研究，但均是基于特异性、敏感性均较低的多抗来建立的。
化学发光酶联免疫方法(Chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)是将化学发光体系与酶联免疫分析技术相结合，以化学发光强度与反应物浓度的正比关系，检测微量抗原或抗体的一种新型免疫测定技术。该技术与普通间接ELISA检测方法相比，操作简单，反应时间短；可通过绘制标准曲线实现定量分析；敏感性与精确度明显优于其他方法，标准阳性样本检出率可高达100％；检测范围很广，可达6个数量级。目前，该方法已被广泛应用于人体外诊断试剂如肿瘤标记物检测，丙型肝炎、艾滋病抗体检测，食品安全检测等项目，但在动物疫病检测领域应用尚不广泛。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于建立一种敏感、快速、准确的SVA竞争CLEIA检测方法。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一株杂交瘤细胞株，其命名为SVA-VP2-6D5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021277；或者，命名为SVA-VP3-7A9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021276。
杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5于2021年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO:C2021277。
杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9于2021年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO:C2021276。
本发明研究获得了两株杂交瘤细胞SVA-VP2-6D5和SVA-VP3-7A9，它们分别能分泌抗SVA r-VP2和SVAr-VP3的单克隆抗体，在将上述抗体进行酶标后，可用于作为SVA竞争CLEIA检测中的竞争抗体，实现理想的SVA检测效果。
第二方面，本发明提供杂交瘤细胞，其包括杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5和杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9；所述杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021277，所述杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021276。
第三方面，本发明提供上述杂交瘤细胞株或杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
第四方面，本发明提供上述杂交瘤细胞株或杂交瘤细胞或单克隆抗体在制备检测A型塞内卡病毒的试剂或试剂盒中的应用。
第五方面，本发明提供一种检测A型塞内卡病毒的试剂或试剂盒，其含有上述的单克隆抗体。
优选，所述的试剂或试剂盒，含有酶标记的两种单克隆抗体，所述两种单克隆抗体分别为rVP2单克隆抗体和rVP3单克隆抗体，所述rVP2单克隆抗体由杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5产生，所述rVP3单克隆抗体有杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9产生；
更优选，所述rVP2单克隆抗体和所述rVP3单克隆抗体的质量比为1：(1.1-1.8)，进一步优选为1:1.2，以获得更好的检测灵敏性；
以本发明的试剂盒检测时，利用的是竞争化学发光酶联免疫检测方法，具体以纯化的SVA灭活浓缩病毒蛋白为抗原，两种酶标单抗作为竞争酶标记物。
本发明发现当将两株杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5和SVA-VP3-7A9分泌的单克隆抗体进行酶标后共同作为检测试剂盒中的竞争抗体，将使得检测效果更佳。
和/或，所述试剂盒中还含有酶标单抗稀释液；所述酶标单抗稀释液为含有1.4-1.6％，优选为1.5％酪蛋白的Tris-cl溶液，可利于提升检测的敏感性。
第六方面，本发明提供一种检测A型塞内卡病毒的抗体竞争化学发光酶联免疫方法，其使用上述单克隆抗体作为竞争抗体的组成部分。
本发明的方法中，所述竞争抗体为酶标记的rVP2单克隆抗体和酶标记的rVP3单克隆抗体，所述rVP2单克隆抗体和rVP3单克隆抗体如上所述，所述rVP2单克隆抗体和所述rVP3单克隆抗体的质量比为1：(1.1-1.8)，优选为1:1.2。
本发明的方法中，在结合包被抗原时，酶标记的rVP2单克隆抗体中rVP2单克隆抗体的浓度为0.75-1μg/mL，优选为0.86μg/mL；酶标记的rVP3单克隆抗体中rVP3单克隆抗体的浓度为1.7-2.65μg/mL，优选为2.1μg/mL，以在保证灵敏性的同时节省原料。
本发明的方法中，抗原包被时，所用的浓度为0.9-1.1μg/mL，优选为1μg/mL，以保证在使用最少原材料的同时获得更好的对阴阳性样品检出的敏感性和特异性；
和/或，待测样品、竞争抗体共同与包被抗原的作用时间为28-32min，优选为30min；
和/或，发光底物作用时间为4.5-5.5min，优选为5min。
具体地，本发明以灭活A型塞内卡病毒作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的抗A型塞内卡病毒VP2、VP3蛋白单克隆抗体作为酶标抗体，以阳性血清稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测。
本发明的有益效果至少在于：
本发明制备了抗SVA r-VP2、SVA r-VP3单克隆抗体酶标记物，以纯化的SVA灭活浓缩病毒蛋白为抗原，以两种酶标单抗作为竞争酶标记物，成功建立了一种敏感、快速、准确的SVA 竞争CLEIA 检测方法。可在45min内即可完成检测，可检测到最大稀释倍数为1∶2048稀释的校准品溯源血清，与***等其它5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应；批内分析内、分析间变异系数均不超过15％，重复性和稳定性较好；与中和试验分别检测480份临床血清，阳性符合率为95.33％，阴性符合率为97.58％，总符合率为96.88％，具有高度的一致性。本发明填补了SVA抗体定量检测试剂盒的空白，为临床上SVA抗体检测提供一种可靠的血清学检测方法。
附图说明
图1为实施例1中SDS-PAGE分析纯化后的单克隆抗体电泳图，其中，M：蛋白Marker；1：SVA-VP2-6D5单抗；2：SVA-VP3-7A9单抗。
图2为实施例2中SVA-VP2-6D5单抗作为一抗Western blot结果电泳图，其中，M：蛋白Marker；1：rVP2蛋白；2：rVP3蛋白；3：pET32a/BL21空载体。
图3为实施例2中SVA-VP3-7A9单抗作为一抗Western blot结果电泳图，其中，M：蛋白Marker；1：rVP2蛋白；2：rVP3蛋白；3：pET32a/BL21空载体。
图4为实施例3中校准品(抗体剂量值为0～100NCU/mL)绘制的曲线图，其中，横坐标为抗体剂量值，单位为NCU/mL，纵坐标为发光值。
图5为实施例3中ROC曲线绘制结果，其中，横坐标为1-特异性，纵坐标为敏感性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具体实施方式中所用的部分材料、仪器信息如下：
1、病毒、细菌、细胞、血清及实验动物：
SVV-HeNXX/swine/2017保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201767(已公开于中国专利CN109182278A中，SVV-HeNXX/swine/2017的保藏信息如下：微生物保藏编号：CCTCC NO:V201767；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间：2017年11月22日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心)，其病毒培养物、重组表达的pET32a(+)-rVP2、pET32a(+)-rVP3蛋白(构建方法如下：提取SVV-HeNXX/swine/2017病毒株RNA，经反转录后PCR分别扩增VP2、VP3基因，分别克隆至pGEM-T Easy载体，经BamHI和SalI双酶切后连接至原核表达载体pET32a(+)，转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，构建重组菌pET32a(+)-rVP2、pET32a(+)-rVP3。利用0.5mmol/L IPTG进行诱导表达。在非变性条件下，利用镍柱从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2、SVA VP3蛋白)、大肠杆菌BL21pLysS菌体蛋白由河南省动物疫病预防控制中心表达获得和供应。骨髓瘤细胞(SP2/0)由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存；***病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)O型、A型阳性血清由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供，效价均不低于1∶256；猪水泡病病毒(Swine Vesicular Disease virus，SVDV)阳性血清来源于瑞士Prionics公司PrioCHECKSVDV酶联免疫抗体检测试剂盒，猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)阳性血清为PRVgB抗体阳性血清国家参考品(Z89)，猪繁殖与呼吸***综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV)阳性血清由哈尔滨国生生物提供，效价不低于1∶27；大肠杆菌阳性血清，效价不低于1∶128，购自北京索莱宝科技有限公司。采自猪塞内卡病毒病灭活疫苗(SVV-HeNXX/swine/2017株，悬浮培养)临床试验的SVA临床免疫抗体阳性血清和SVA阴性血清均经过血清中和试验(SNT)检测；8～10周龄雌性BALB/c小鼠由河南省实验动物中心提供。
2、主要仪器和试剂：
Bam HI、Hind III、预染蛋白质Marker、BCA蛋白定量试剂盒等购自TaKaRa公司；His·Bind蛋白纯化试剂盒购自上海劢瑞生物科技有限公司；羊抗鼠IgG(HRP标记)二抗、抗His标签鼠单抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PEG2000、X-gal、IPTG、NaSCN、BSA、Casein等购自Solarbio公司；胎牛血清购自Seropro公司；DMEM、DMSO购自武汉博士德生物工程有限公司；HT、HAT、8-Azaguanine、单抗亚类鉴定试剂盒购自美国Sigma公司；高速液相蛋白层析***仪(NGCTM Chromatography Systems)、SUPrATM Cartridge亲和层析柱购自美国Bio-RAD公司；发光底物液由洛阳莱普生信息科技有限公司提供；LUMO化学发光仪购自郑州安图生物工程股份有限公司；FMDV O型抗体检测试剂盒、FMDV A型抗体检测试剂盒购自韩国金诺(MEDIAN)诊断试剂株式会社；PRV gB抗体检测试剂盒、PRRSV抗体检测试剂盒购自美国IDEXX爱德士生物科技公司；猪水泡病病毒SVDV抗体检测试剂盒购自瑞士Prionics公司。
实施例1抗SVA rVP2、SVA rVP3蛋白单克隆抗体的制备
根据已知的单克隆抗体制备方法，按照既定的免疫程序(参见中国专利申请号：201710671265.8)将经灭活浓缩的SVV-HeNXX/swine/2017株(SVA)培养液乳化后免疫Balb/c小鼠。以纯化的rVP2、rVP3蛋白为包被抗原、羊抗鼠IgG(HRP标记)为酶标二抗建立筛选抗体用的间接ELISA方法，检测三次免疫后小鼠的特异性抗体效价。选取效价最高的免疫小鼠加强免疫后，取其脾脏进行细胞融合，用建立的间接ELISA方法筛选特异性阳性孔，采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，经5次亚克隆后阳性率达到100％时，即可进行扩大培养。采用体内诱生腹水法对可稳定传代的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，采用辛酸—饱和硫酸铵沉淀方法对无菌采集的经单抗亚类鉴定为IgG亚型的腹水进行粗纯化，高速液相蛋白层析***结合SUPrATM Cartridge亲和层析柱进一步纯化，脱盐处理并用BCA法测定最终单抗浓度。间接ELISA方法对单抗效价进行测定，以SP2/0细胞诱生的小鼠腹水为阴性对照。
具体结果为：用间接ELISA方法分别测定完成三次免疫小鼠的血清抗体效价，SVArVP2、SVA rVP3蛋白抗体效价均高于1:16000。选择rVP2、rVP3抗体效价均最高的小鼠，取其脾脏进行融合，融合率达100％。经过5次亚克隆阳性筛选、非特异性反应测定及亚型测定筛选，分别获得1株能特异性分泌rVP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5，亚型为IgG1，其上清效价为1:16000；1株能特异性分泌rVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9，亚型为IgG2a，其上清效价为1:16000，SVA-VP2-6D5和SVA-VP3-7A9杂交瘤细胞株经反复冻融15次及连续传代15代以上均可稳定分泌抗体，效价仍高达1:16000；制备腹水获取的单克隆抗体经纯化后纯度高达90％以上，电泳图见图1。
经脱盐浓缩后SVA-VP2-6D5和SVA-VP3-7A9单抗浓度分别为6.2mg/mL和5.7mg/mL，效价分别为1：10万和1：4万。
实施例2抗SVA rVP2、rVP3蛋白单克隆抗体的鉴定
1、Western blot分析
以rVP2、rVP3蛋白、pET32a(+)/BL21空载体蛋白作为抗原，以实施例1制备的rVP2(SVA-VP2-6D5)、rVP3(SVA-VP3-7A9)单克隆抗体为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG为酶标二抗，Western blot鉴定单抗的反应性，具体步骤如下：
1.1样品准备：吸取一定量的样品加4×上样缓冲液混匀，煮沸10分钟，以10000r/min离心1分钟。
1.2 12％分离胶配制(15.08mL)：双蒸水5.1mL，30％丙烯酰胺贮存液6.0mL，Tris-HCl(1.5mol/L，pH值8.8)3.8mL，10％SDS 0.15mL，10％过硫酸铵0.1mL，TEMED0.005mL。
1.3 5％浓缩胶配制(6.09mL)：双蒸水4.2mL，30％丙烯酰胺贮存液1.0mL，Tris-HCl(1.0mol/L，pH值6.8)0.82mL，10％SDS 0.06mL，10％过硫酸铵0.06mL，TEMED0.01mL。
1.4装胶：将12％分离胶缓慢装入电泳板中，待凝固后缓慢加入5％的浓缩胶，快速***梳子；浓缩胶凝固后，将电泳板放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取出梳子，上样，10μl/孔。
1.5接通电源在15mA恒定电流状态下电泳至溴酚蓝移至电泳板底部时，终止电泳，卸下电泳槽，轻取出胶板。
1.6以下列顺序制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸。
用干净的玻棒轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以消除各层之间的气泡。海绵垫和滤纸、PVDF膜预先在转移缓冲液中平衡10分钟。将固定好的凝胶-膜“三明治”转移至电转仪中，凝胶侧朝向负极，PVDF膜侧朝向正极，并接好冷却装置，200mA恒流转移1小时。
1.7转移完毕后取下PVDF膜，进行封闭：将PVDF膜放入大小适当的玻璃平皿中，用5％脱脂奶粉-TBST 2～8℃封闭12小时；
1.8洗膜I：弃去封闭液，用TBST缓慢振摇洗膜三次，每次5分钟；加一抗：将实施例1中获得的rVP2和rVP3单克隆抗体(rVP2的初始浓度为6.2mg/mL，rVP3的初始浓度为5.7mg/mL，均1∶2000倍稀释)分别作为一抗，缓慢振摇2小时；洗膜Ⅱ：弃去一抗，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5分钟；加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(初始浓度1mg/ml，1∶2000倍稀释)加入TBST中，缓慢振摇0.5小时；洗膜Ⅲ：弃去二抗，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5分钟；
1.9底物：称取12mg DAB溶于20mL TBST中，过滤后加入60μl浓度为30％的H2O2，将PVDF膜置于显色液中，待出现特异性反应条带后，立即浸入双蒸水中洗膜终止反应。用吸水纸吸干膜上水分，避光干燥保存，观察并记录结果。
Western blot结果显示，SVA-VP2-6D5单抗可与rVP2蛋白特异性地反应，SVA-VP3-7A9单抗可与rVP3蛋白特异性地反应，而与pET32a/BL21空载体均无非特异***叉反应，见图2、图3。
2、特异性鉴定
用大肠杆菌BL21pLysS菌体蛋白包被板建立的检测方法及猪伪狂犬gB、***O/A型、猪繁殖与呼吸***综合征病毒、SVDV抗体检测试剂盒包被板鉴定单克隆抗体的特异性，以羊抗鼠IgG(HRP标记)为酶标二抗，同时设阴性对照进行分析。阴性对照为阴性小鼠血清。
结果显示SVA-VP2-6D5、SVA-VP3-7A9单抗分别可与rVP2、rVP3蛋白特异性地反应，而与大肠杆菌菌体蛋白、灭活SVDV、猪伪狂犬gB、***O/A型、猪繁殖与呼吸***综合征病毒病原均未发生非特异性反应，见表1。
表1单抗的特异性鉴定(OD450值)
Figure BDA0003382363750000081
Figure BDA0003382363750000091
注：S/N值(样品与阴性对照OD值的比值)＜2.1，样品应判定为抗体阴性；S/N值≥2.1，样品应判定为抗体阳性。
3、应用性鉴定
以灭活浓缩的SVA为包被抗原，分别先加入SPF猪血清、50份SVA阳性猪血清、50份VA阴性猪血清，再加入待检单抗，最后加入羊抗鼠IgG(HRP标记)为酶标二抗，显色终止读取OD450。当加入SVA阳性猪血清血清孔的OD450值低于加入SPF猪血清孔OD450值一半左右时，说明此SVA单抗可被猪血清中免疫抗体特异性地阻断，即为针对特异性SVA抗原位点的单抗，可用于后续建立方法的应用。
经检测，加入50份SVA免疫猪血清孔的OD450值均低于加入SPF猪血清孔和50份SVA阴性猪血清OD450值的一半，见表2。单抗SVA-VP2-6D5、SVA-VP3-7A9能够与SVA的抗原位点特异性结合，可用于后续方法建立的应用。
表2单抗的应用性鉴定(OD450值)
Figure BDA0003382363750000092
实施例3SVA抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法(CLEIA)的建立
1、最佳浓度的确定
以pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液将纯化的SVA灭活浓缩病毒蛋白分别按2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL浓度稀释并包被化学发光板，分别将5份SVA阳性猪血清、5份SVA阴性猪血清与含HRP标记单抗的酶标单抗1:1混合后加入100μL于发光板中置37℃反应30min，PBST洗涤后加鲁米诺化学发光底物，化学发光免疫分析仪测定结果，以最大N/P化学发光值比值所对应的浓度确定为最佳包被浓度。
经检验辣根过氧化物酶标记抗SVA rVP2蛋白单克隆抗体(SVA-VP2-6D5)后酶量为1.387mg/mL，IgG量为3.42mg/mL，克分子比值(E/P)为1.62；辣根过氧化物酶标记抗SVArVP3蛋白单克隆抗体(SVA-VP3-7A9)后酶量为0.913mg/mL，IgG量为2.087mg/mL，克分子比值(E/P)为1.75。将辣根过氧化物酶标记的抗SVA rVP2、SVA rVP3蛋白单克隆抗体按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000稀释(稀释液为含3％牛血清白蛋白(BSA)的Tris-cl溶液)，以最大N/P化学发光值比值确定最佳酶标单抗工作浓度。
rVP2和rVP3单抗经辣根过氧化物酶标记后经检测效价分别为1:12000和1:8000，故采用rVP2的浓度低于rVP3的浓度的配合方式进行后续研究。
结果：阴阳比值N/P值随着rVP2酶标单抗稀释度大于1：4000后降低而下降，随着rVP3酶标单抗稀释度大于1：2000后降低而下降，随着包被浓度降低先上升后下降，SVA全病毒蛋白包被浓度为1μg/mL，rVP2和rVP3酶标单抗稀释度分别为1∶4000和1:2000时，N/P值最大，为94.3，结果见表3。因此，确定最佳包被浓度为1μg/mL，rVP2酶标单抗稀释度为1∶4000，rVP3酶标单抗稀释度为1∶2000。
表3 SVA抗体竞争CLEIA最佳浓度的确定
Figure BDA0003382363750000101
2、最佳酶标单抗稀释液的确定
分别以含15％胎牛血清、1.5％酪蛋白、3％牛血清白蛋白(BSA)、1％胰酪胨的Tris-cl作为酶标单抗稀释液，通过上述最佳浓度确定时所采用的方法，以最大N/P化学发光值比值所对应的酶标单抗稀释液作为最佳酶标单抗稀释液。
检测结果显示，含1.5％酪蛋白的酶标单抗稀释液有效提高了敏感性，N/P值最大，见表4，故将含1.5％酪蛋白的Tris-cl溶液作为酶标单抗稀释液。
表4酶标单抗稀释液的确定
Figure BDA0003382363750000111
3、最佳反应时间的确定
将待检血清和酶标单抗1:1混合后加入SVA蛋白包被后的发光板中，分别于37℃反应15min、30min、60min，作2组重复试验，加入发光底物后15～25℃下避光分别作用3分钟、5分钟、10分钟，每个时间点作2组重复，以最大化学发光值N/P比值所对应时间为待检血清与酶标单抗最佳反应时间及最佳底物作用时间。
检测结果显示，待检血清、酶标单抗与抗原在37℃条件下作用30min时，最后加入发光底物后作用5min，N/P值最大，见表5、表6，因此确定最佳作用时间为30min+5min。
表5酶标单抗、待检血清与抗原的最佳反应时间
Figure BDA0003382363750000112
表6底物最佳作用时间
Figure BDA0003382363750000113
4、校准品的制备
采用经血清中和试验测定中和效价为1：29的塞内卡病毒抗体阳性血清作为校准品溯源血清，赋值为5000NCU/mL，用上述确定的酶标单抗稀释液对血清进行倍比稀释，测定稀释血清的发光值，以抗体剂量值为横坐标，发光值为纵坐标，运用ELISACalc软件进行分析，通过四参数曲线拟合方法拟合出校准曲线。从曲线中选择出5个特征点，用酶标单抗稀释液将标准阳性血清根据剂量值按比例分别稀释，作为校准品2～校准品6，用酶标单抗稀释液将SPF猪血清1∶20倍稀释制备校准品1。根据校准品溯源血清检测值和校准品绘制的校准曲线回算抗体剂量值关系，标定合格后将校准品定量分装，-20℃以下保存备用。
具体结果为：将校准品溯源血清进行2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048倍稀释，绘制出校准品的四参数拟合曲线。根据曲线看出抗体剂量值≤100NCU/mL时发光值区分最为明显，因此以100NCU/mL为起点(校准品溯源血清稀释50倍)，依次配制不同抗体剂量值的血清样品，重复多次绘制四参数拟合曲线，当抗体剂量值在5NCU/mL、12NCU/mL、25NCU/mL、50NCU/mL和100NCU/mL时，所对应的坐标点重复性最好，且曲线的r2均＞0.99，见图4。配制三批次校准品，制备校准品抗体剂量值与理论抗体剂量值的偏差在5.0％以内，结果见表7。
表7配制校准品理论抗体剂量值与实测剂量值比较
Figure BDA0003382363750000121
5、临界值的确定
以确定的最佳反应条件和试剂检测，背景清晰的SVA疫苗临床试验的猪血清243份，用血清中和试验鉴定均为SVA抗体阳性；检测采集未经SVA疫苗免疫的猪血清181份，用血清中和试验鉴定均为SVA抗体阴性；检测用血清中和试验检测为SVA抗体效价小于25的阳性血清30份，测定并根据上述获得的标准曲线计算出抗体剂量值，以NCU/ml表示。采用SPSS16.0软件对所有血清样本的抗体剂量值进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并以约登(Youden)指数(Youden指数＝敏感性-(1-特异性))最大的点作为阴阳性判断的临界点，对应的抗体剂量值即为临界值。
利用SPSS 16.0软件对上述所有样本的检测结果进行数据分析，以敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，绘制ROC曲线，见图5。计算每个临界值的Youden指数(Youden指数＝敏感性-(1-特异性))，Youden指数最大为0.974，所对应抗体剂量值为10.2NCU/mL，见表8(仅显示关键临界值附近数据)。因此，将本方法的临界值确定为10，最终将本方法的判定标准定为：样本抗体剂量值≥10NCU/mL时，为SVA抗体阳性；样本抗体剂量值＜10NCU/mL时，为SVA抗体阴性。在此判定标准下，此临界值对应的敏感性为98.0％，特异性为99.4％。
表8不同剂量值所对应的敏感性、特异性及Youden指数
Figure BDA0003382363750000131
6、最终确立的检测方法
根据上述步骤，本发明建立了完整的SVA抗体竞争CLEIA检测方法，具体如下：
6.1平衡
使用前，将包被板、酶标单抗混悬液(按本发明上述方法确定的由1.5％酪蛋白的Tris-cl溶液配置的特定浓度/稀释度的两个酶标rVP2和rVP3单抗混合液)、发光底物从冷藏柜中取出，平衡至室温，校准品1～校准品6用前轻轻旋转或震荡混匀。
6.2洗涤工作液配制
使用前将25倍PBST浓缩洗涤液用纯化水或蒸馏水进行25倍稀释。1份25倍浓缩洗涤液加24份蒸馏水(如：40ml 25倍浓缩洗涤液加入960ml蒸馏水)。
6.3操作步骤
6.3.1加样：取出抗原包被板。每次实验需要设置系列校准品6孔。首先在血清稀释板样品孔每孔加入60μl样品，校准品孔每孔加入60μl校准品，再向以上各孔均加入60μl酶标单抗混悬液，振荡混匀；每孔吸取100μl转移至包被板对应孔内。
6.3.2温育：置37℃恒温培养箱中温育30分钟(±1分钟)。
6.3.3洗板：取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。
6.3.4加入底物：每孔加入50μl的发光底物A和50μl的发光底物B，振荡混匀(也可发光底物A、B等比例混匀后加100μl)。发光底物A为鲁米诺溶液(称取24.23g三羟甲基氨基甲烷溶于800ml纯水中充分搅拌均匀，调节pH值至8.0。加入0.026g鲁米诺干粉，待其完全溶解后加纯化水定容至1000ml)，发光底物B为氨基酸氧化酶溶液(称取15.42g醋酸铵溶于800ml纯水中，调pH值至5.2，加入0.066g氨基酸氧化酶，而后加纯化水定容至1000ml)。
6.3.5静置：在室温(15～25℃)条件下避光放置5分钟。
6.3.6读值：用化学发光仪读取发光值。
6.4结果判定：以校准品1～校准品6的发光值为纵坐标，对应的抗体剂量值(0NCU/ml、5NCU/ml、12NCU/ml、25NCU/ml、50NCU/ml、100NCU/ml)为横坐标，通过ELISA Calc软件绘制校准品的四参数拟合曲线。
6.5成立条件：校准品1～校准6对应的抗体剂量值与发光值经校准曲线拟合，当校准曲线的相关系数r2≥0.99时，实验成立。否则，应重新检测。
6.6判定标准：当样品的抗体剂量值＜10NCU/ml，样品应判定为SVA抗体阴性；如果样品的抗体剂量值≥10NCU/ml，则该样品判定为SVA抗体阳性。
实施例4
1、特异性试验
用实施例3中建立的上述SVA抗体竞争CLEIA分别检测FMDV O型、FMDV A型、SVDV、PRV、PRRSV阳性血清各10份，大肠杆菌阳性血清2份，同时用SVA血清中和试验进行平行检测，验证建立方法的特异性。
结果显示，见表9，用建立的SVA抗体竞争CLEIA分别检测FMDV O型、FMDV A型、SVDV、PRV、PRRSV阳性血清、大肠杆菌阳性血清，均为阴性，无交叉反应，与血清中和试验结果一致。表9中校准品1-6具体参见实施例3中“4、校准品的制备”中的记载。
表9特异性试验结果
Figure BDA0003382363750000151
注：血清中和试验判定结果为血清抗体效价＜1:24时为阴性，血清抗体效价≥1:24时为阳性。
2、敏感性试验
将校准品溯源血清用酶标单抗稀释液按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048、1∶4096稀释，分别用建立的SVA抗体竞争CLEIA进行检测，同时以血清抗体中和试验进行鉴定，验证建立方法的敏感性。
建立的SVA竞争CLEIA与中和试验检测结果一致，均可检测到最大稀释倍数为1∶2048稀释的校准品溯源血清，结果见表10。
表10敏感性试验结果
Figure BDA0003382363750000152
Figure BDA0003382363750000161
注：血清中和试验判定结果为血清抗体效价＜1:24时为阴性，血清抗体效价≥1:24时为阳性。表10中校准品1-6具体参见实施例3“4、校准品的制备”中的记载。
3、重复性试验
用3个批次SVA抗体竞争CLEIA试剂分别检测经血清抗体中和试验测定为SVA抗体阴性、强阳性、弱阳性样本(用血清中和试验检测为SVA抗体效价小于25的阳性血清)共13份，每份血清样品作5次重复检测，对结果进行统计学分析，计算批间变异系数(Coefficient of Variation,CV)，CV(％)＝(标准差/平均值)×100％。
检测结果见表11～表14，建立的SVA竞争CLEIA分析内、分析间变异系数在2.11％～8.43％之间，小于10％；批间变异系数在3.69％～12.16％之间，小于15％。
表11 20200601批重复性试验结果
Figure BDA0003382363750000162
表12 20200602批重复性试验结果
Figure BDA0003382363750000171
表13 20200603批重复性试验结果
Figure BDA0003382363750000172
表14 3批试剂盒检测同样13份血清盘的变异系数
Figure BDA0003382363750000173
Figure BDA0003382363750000181
4、保存期研究
将样本稀释液、经包装的包被发光板、校准品、酶标单抗溶液、发光底物组装配套，从3个批次SVA抗体竞争CLEIA试剂中随机抽取3套试剂分别放置2～8℃保存，分别于1、2、3、6、9、12、15个月进行检验，根据敏感性和特异性试验结果确定该方法试剂的保存期。
3套不同批次SVA竞争CLEIA试剂于2～8℃放置保存15个月，仍可检测到最大稀释倍数为1∶2048稀释的阳性溯源血清，检测FMDV O型、FMDV A型、SVDV、PRV、PRRSV阳性血清、大肠杆菌阳性血清，剂量值均小于10NCU/ml，无交叉反应。因此，将该方法的保存期可确定为12个月。
实施例5比对试验
分别采用建立的SVA抗体竞争CLEIA与血清中和试验分别对从不同猪场采集的480份猪血清进行检测，确定所建方法与中和试验之间的符合率。
检测结果显示，见表15，建立的SVA竞争CLEIA检测结果与中和试验阳性符合率为95.33％，阴性符合率为97.58％，总符合率为96.88％。
表15 SVA竞争CLEIA检测方法与中和试验结果的比较
Figure BDA0003382363750000182
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一株杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为SVA-VP2-6D5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021277；或者，命名为SVA-VP3-7A9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021276。
2.杂交瘤细胞，其特征在于，包括杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5和杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9；所述杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2021277，所述杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021276。
3.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的杂交瘤细胞或权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测A型塞内卡病毒的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种检测A型塞内卡病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，含有酶标记的两种单克隆抗体，所述两种单克隆抗体分别为rVP2单克隆抗体和rVP3单克隆抗体，所述rVP2单克隆抗体由杂交瘤细胞株SVA-VP2-6D5产生，所述rVP3单克隆抗体有杂交瘤细胞株SVA-VP3-7A9产生；
优选，所述rVP2单克隆抗体和所述rVP3单克隆抗体的质量比为1：(1.1-1.8)，更优选为1:1.2；
和/或，所述试剂盒中还含有酶标单抗稀释液；所述酶标单抗稀释液为含有1.4-1.6％，优选为1.5％酪蛋白的Tris-cl溶液。
7.一种检测A型塞内卡病毒的抗体竞争化学发光酶联免疫方法，其特征在于，使用权利要求3所述的单克隆抗体作为竞争抗体的组成部分。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述竞争抗体为酶标记的rVP2单克隆抗体和酶标记的rVP3单克隆抗体，所述rVP2单克隆抗体和rVP3单克隆抗体如权利要求6中所述，所述rVP2单克隆抗体和所述rVP3单克隆抗体的质量比为1：(1.1-1.8)，优选为1:1.2。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在结合包被抗原时，酶标记的rVP2单克隆抗体中rVP2单克隆抗体的浓度为0.75-1μg/mL，优选为0.86μg/mL；酶标记的rVP3单克隆抗体中rVP3单克隆抗体的浓度为1.7-2.65μg/mL，优选为2.1μg/mL。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，抗原包被时，所用的浓度为0.9-1.1μg/mL，优选为1μg/mL；
和/或，待测样品、竞争抗体共同与包被抗原的作用时间为28-32min，优选为30min；
和/或，发光底物作用时间为4.5-5.5min，优选为5min。
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