CN102998442A - 醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：醛固酮校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的醛固酮抗体；醛固酮酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；醛固酮质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种醛固酮（ALD）磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
高血压是最常见的心血管病，是全球范围内的重大公共卫生问题。据***最新数据，我国现有高血压患者2亿多人，在前十种慢性疾病患病率中高血压位居第一，且在逐年增加。高血压是引发高血压心脏病、冠心病、心力衰竭、慢性肾功能衰竭、脑血管疾病等的主要危险因素。临床上醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、去甲肾上腺素对高血压的诊断与分型，以及评估冠心病、心力衰竭等疾病的严重程度和预后都有重要意义。
醛固酮是由肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌的一种盐皮质素。是人体内调节血容量的激素，通过调节肾脏对钠的重吸收，维持水平衡；醛固酮的分泌主要受肾素一血管紧张素***的调，当细胞外液容量下降时，刺激肾小球旁细胞分泌肾素，激活肾素-血管紧张素-醛固酮***、醛固酮分泌增加，使肾脏重吸收钠增加，进而引起水重吸收增加，细胞外液容量增多；相反细胞外液容量增多时，通过上述相反的机制，使醛固酮分泌减少，肾重吸收钠水减少，细胞外液容量下降。血钠降低，血钾升高同样刺激肾上腺皮质，使醛固酮分泌增加。
目前，测定醛固酮的方法有放射性免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫分析等，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；化学发光免疫分析（CLIA）是当今最为敏感的微量免疫测定法。
将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，与以微孔板为固相载体的ALD化学发光试剂盒相比，具有以下优势：（1）以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量，从而节约了成本；（2）以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积，及发光面积，提高了反应的灵敏度；（3）反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间；（4）在反应过程中引入了生物素-亲和素***（biotin-avidin system，BAS），它是70年代末发展起来的一种新型反应放大***，由于具有与标记试剂高亲和力的牢固结合、多级放大效应，使其具有灵敏度高、特异性好、稳定性高的特点，目前已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术；（5）本试剂盒与管式化学发光仪配套使用，在样本测定过程中灵活性更好。但目前将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合用于ALD检测还没有广泛用于临床。
发明内容
本发明要解决的问题是提供ALD的磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：醛固酮校准品，浓度为为0，60，150，450，1500，4000pg/mL，校准品稀释液为含有50%牛血清的磷酸缓冲液；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的ALD抗体；ALD酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；醛固酮质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。
进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。
进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1-2um。
进一步，所述的醛固酮质控品包括低值质控品和高值质控品。
进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）醛固酮校准品的配制：
将ALD纯品用含有50%牛血清的磷酸缓冲液稀释成系列梯度，浓度分别为0，60，150，450，1500，4000pg/mL。
（2）醛固酮质控品的配制：
将ALD纯品用50%牛血清的校准品稀释液配制低值质控品和高值质控品，浓度允许范围分别为196～294pg/mL和1880～2820pg/mL。
（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：
取100mL0.1mol/L2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。
（4）生物素标记的醛固酮抗体的制备
取0.5mg醛固酮抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；
（5）醛固酮酶结合物的制备
将O-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min；浓缩后，加入40mL水，用***抽提，抽提物用Na2SO4干燥，将其溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；将EDC溶解在pH8.0的PBS缓冲液中，得I液；将HRP溶于PH7.4的PBS缓冲液中，得III液；将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4℃搅拌16小时，用0.01MPBS使之充分透析；
（6）20倍浓缩洗液的配制
20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；
（7）化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；
（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
本发明的原理是，本试剂盒采用竞争法原理测定血清或血浆中的ALD，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-ALD抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-ALD抗体复合物，加入样本和酶结合物后，酶结合物与样本中的ALD竞争结合磁微粒表面的ALD抗体，形成磁微粒-亲和素-生物素-ALD抗体-ALD-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值（RLU）。样本的发光值与样本中ALD浓度呈负相关。样本中的ALD浓度依据由校准品ALD浓度和对应的RLU建立的LogX-LogY数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的ALD含量。
本专利发明的醛固酮（ALD）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点：（1）反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于2pg/mL。（3）特异性强，本产品与B型脑钠肽（BNP）、心钠素（ANP）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）交叉特异性均小于1%。（4）精密度良好，批内和批间精密度不高于10%。（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。
附图说明
图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定醛固酮与放免试剂盒测定醛固酮的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的醛固酮值，横坐标为放免试剂盒测定醛固酮值，两种方法相关系数（r2）=0.9754，直线方程y=1.0019x+1.7624。
具体实施方式
实施例1：制备醛固酮（ALD）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅰ
（1）醛固酮校准品的配制：
将ALD纯品用含有50%牛血清的磷酸缓冲液稀释成系列梯度，浓度分别为0，60，150，450，1500，4000pg/mL。
（2）醛固酮质控品的配制：
将ALD纯品用50%牛血清的校准品稀释液配制低值质控品和高值质控品，浓度分别为196pg/mL和2820pg/mL。
（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：
取100mL0.1mol/L2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。
（4）生物素标记的醛固酮抗体的制备
取0.5mg醛固酮抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液5次；
（5）醛固酮酶结合物的制备
将O-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min；浓缩后，加入40mL水，用***抽提，抽提物用Na2SO4干燥，将其溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；将EDC溶解在pH8.0的PBS缓冲液中，得I液；将HRP溶于PH7.4的PBS缓冲液中，得III液；将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4℃搅拌16小时，用0.01MPBS使之充分透析；
（6）20倍浓缩洗液的配制
20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；
（7）化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；
（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
实施例2：制备醛固酮（ALD）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅱ
（1）同实施例1醛固酮校准品的配制
（2）醛固酮质控品的配制：
将ALD纯品用50%牛血清的校准品稀释液配制低值质控品和高值质控品，浓度分别为294pg/mL和1880pg/mL。
（3）同实施例1磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备
（4）生物素标记的醛固酮抗体的制备
取0.5mg醛固酮抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析2h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3次；
（5）-（9）同实施例1步骤。
实施例3：制备醛固酮（ALD）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅲ
（1）同实施例1醛固酮校准品的配制
（2）醛固酮质控品的配制：
将ALD纯品用50%牛血清的校准品稀释液配制低值质控品和高值质控品，浓度分别为205pg/mL和2540pg/mL。
（3）同实施例1磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备
（4）生物素标记的醛固酮抗体的制备
取0.5mg醛固酮抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应50min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液4次；
（5）-（9）同实施例1步骤。
实施例4：本发明试剂盒的使用方法
1将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。
2配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
3配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。
4将反应管编号，向试管中依次加入10-50uL校准品或血清标本、100uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、100uL生物素-ALD抗体结合物、100uLALD酶结合物，37℃下振荡反应10-30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液200-400uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出ALD的浓度。
实施例3本试剂盒的方法学评价结果
实施例4本试剂盒的临床对比实验
本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数110例，先以ALD放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y=1.0019x+1.7624，相关系数为R2=0.9754。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对两种方法的ALD测值进行t检验（检验水准α=0.05），P=0.256＞0.05，两种方法测定的ALD测值无显著性差异。灵敏度（真阳性率）为97.25%、特异性（真阴性率）为97.31%，都较高；而假阳性率（误诊率）为2.13%、假阴性率（漏诊率）为3.42%，都较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，本试剂盒的粗一致性为98.12%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。
为了确定本试剂盒的临床参考值，对589份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为：
普食：卧位60~180pg/mL
立位70~300pg/mL
低钠：卧位120~360pg/mL
立位150~650pg/mL
Claims (6)
1.醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1）醛固酮校准品，浓度为0，60，150，450，1500，4000pg/mL，校准品稀释液为含有50%牛血清的磷酸缓冲液；
2）偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；
3）生物素标记的醛固酮抗体；
4）醛固酮抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；
5）醛固酮质控品；
6）化学发光液A液和B液；
7）20倍浓缩洗液；
8）反应管。
2.根据权利要求1所述的醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。
3.根据权利要求1所述的醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2um。
4.根据权利要求1所述的醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的醛固酮质控品包括低值质控品和高值质控品。
5.根据权利要求1所述的醛固酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
6.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）醛固酮校准品的配制：
将ALD纯品用含有50%牛血清的磷酸缓冲液稀释成系列梯度，浓度分别为0，60，150，450，1500，4000pg/mL；
（2）醛固酮质控品的配制：
将ALD纯品用50%牛血清的校准品稀释液配制低值质控品和高值质控品，浓度分别为196～294pg/mL和1880～2820pg/mL；
（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：
取100mL0.1mol/L2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL0.01mol/LPBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/LPBS定溶至1L即可；
（4）生物素标记的醛固酮抗体的制备
取0.5mg醛固酮抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/LPBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；
（5）醛固酮酶结合物的制备
将O-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min；浓缩后，加入40mL水，用***抽提，抽提物用Na2SO4干燥，将其溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；将EDC溶解在pH8.0的PBS缓冲液中，得I液；将HRP溶于PH7.4的PBS缓冲液中，得III液；将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4℃搅拌16小时，用0.01MPBS使之充分透析；
（6）20倍浓缩洗液的配制
20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；
（7）化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；
（9）对采用该方法制的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
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