CN106771245B - H9亚型禽流感病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用 - Google Patents

H9亚型禽流感病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联磁性微粒及其制备方法和应用。具体地，涉及一种H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供磁性微粒溶液、和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段；(b)将(a)中的磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段相偶联的混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为10mg：1.75‑16.0nmol。本发明方法获得了包被均质、结构稳定的H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联磁性微粒，其检测范围较宽，灵敏度较高、反应时间非常短(仅需5‑10分钟)，并具有高通量、自动化、可重复的优异特点。

Description

H9亚型禽流感病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地，涉及一种H9亚型禽流感病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用。
背景技术
禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的可感染各种家禽和野生鸟类的一种感染和疾病综合征。禽流感病毒的血清亚型多而复杂，同一血清亚型内有不同的变异株，不同变异株对不同禽类的致病性又有很大差异。根据AIV的致病性，将其分为低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI)和高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)。H9亚型禽流感病毒属于低致病性，引起的禽流感主要是由于细菌感染或环境等其它因素共同作用的结果。但近年来亚洲爆发的H9N2亚型禽流感，却表现了较为严重的症状，H9N2亚型禽流感病毒致病力在朝着强的方向发展。在国内H9亚型禽流感症状更为复杂，肉仔鸡感染后发病突然，传播迅速，往往有混和感染。发病前H9N2免疫反应低下，发病后HI抗体水平显著提高。20～34日龄鸡只多发生减食或厌食，精神沉郁，咳嗽、喷嚏、甩头，发出咯咯叫声或呼噜声，常见鼻眼有分泌物，拉黄白绿稀粪，死亡率较低，和大肠杆菌混和感染时死亡率为30％～50％。成年鸡表现形式呈多样性，主要发生在免疫过的鸡群，感染鸡的HI抗体迅速上升，高达13～16log2。
病理剖检变化可见，呼吸***：气管、肺、气囊、鼻窦充血、出血和水肿；多脏器泛发性密集点状出血：心、肝、脾、肾、胰腺、胸腺、法氏囊等点状出血；生殖***：卵巢萎缩、出血、破裂，输卵管水肿、出血，卵黄性腹膜炎。
H9亚型禽流感抗原HA蛋白是主要的中和性抗原蛋白，其抗体是疫苗免疫后抗体水平的监测和病毒感染后抗体水平检测的主要标的，抗体水平高低与其免疫或感染状况直接相关，通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证。现有的检测机构有兽医站、疫苗公司、养殖场等存在着大量的样本，也对大通量的H9亚型禽流感抗体检测试剂盒和仪器有着需求。目前建立并应用的H9亚型禽流感抗体检测方法有血凝抑制试验、ELISA方法、病毒中和试验、免疫荧光法、胶体金试纸条等方法，其中血凝抑制试验目前是H9亚型禽流感抗体检测最常用的方法，通过固定病毒抗原含量，倍比稀释抗体血清来中和HA血凝素来判断抗体滴度；ELISA试验较为灵敏，但难以定量；病毒中和试验是通过H9亚型禽流感病毒和抗体在细胞上中进行抗原抗体反应来判定抗体滴度，能较全面反映中和抗体的高低，全过程为病毒滴定、抗体中和、结果判定等过程需5-7天时间，全过程只能人工来操作、判定，重复性差；免疫荧光法通常也是在细胞上操作，存在灵敏度不高，重复性差等缺点；胶体金方法能快速得出结果，但是只能定性，难以定量，限制了应用范围。
现有的血凝抑制试验、ELISA、病毒中和试验、胶体金等的方法难以满足。因此，本领域迫切需要开发一种高灵敏度、高准确性、花费时间较短的检测方法。
发明内容
本发明第一方面，提供了一种H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，包括步骤：
(a)提供磁性微粒溶液、和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段；
(b)将(a)中的磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段相偶联的混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为1-20.0nmol，较佳地，10mg：1.5-10.0nmol，更佳地，10mg：1.75-4.0nmol。
在另一优选例中，所述步骤(b)中还包括步骤(b’)：向所述的混合液中加入交联剂和/或催化剂，从而获得经交联和/或经催化的混合液；和/或
所述步骤(b)中还包括步骤(b”):向所述的混合中加入标记物，从而获得经标记的混合液。
在另一优选例中，所述的H9亚型禽流感病毒抗原包括HA蛋白、NA蛋白、或M蛋白。
在另一优选例中，所述标记物包括发光标记物，例如，光激发发光标记物、电激发发光标记物。
在另一优选例中，所述的发光标记物包括吖啶酯、碱性磷酸酶、和/或过氧化物酶。
在另一优选例中，还包括步骤(c)：向(b)所获得的混合液中加入封闭剂。
在另一优选例中，所述的磁性微粒与所述的H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的结合方式包括直接偶联和间接偶联。
在另一优选例中，所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗FITC抗体-FITC偶联。
在另一优选例中，所述的直接偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、或甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。
在另一优选例中，所述的磁性微粒核心为氧化铁。
在另一优选例中，所述的磁性微粒还含有活性基团。
在另一优选例中，所述的活性基团包括羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团。
在另一优选例中，所述的磁性微粒的粒径为0.1-5μm，优选地为1-3μm。
在另一优选例中，所述的磁性微粒溶液中,磁性微粒粒径CV<3％。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒抗原或其片段包括：H9亚型禽流感病毒全长、天然H9亚型禽流感病毒片段、重组表达的H9亚型禽流感病毒全长、重组表达的H9亚型禽流感病毒片段，H9亚型禽流感病毒多肽、或H9亚型禽流感病毒化学合成物。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒HA蛋白的全长序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒HA蛋白片段的序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒HA蛋白多肽片段的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒NA蛋白的全长序列如SEQ ID NO.:4所示。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒M蛋白片段的序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)提供磁性微粒溶液、和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段；
(b)将(a)中的磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段进行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为10mg：0.6-9.5nmol；
(b’)向(b)中加入交联剂或催化剂，从而得到经交联或催化的混合液；
(b”)向(b’)经交联或催化的混合液中加入封闭剂。
本发明第二方面，提供了一种H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的比例为1-20.0nmol，较佳地，10mg：1.5-10.0nmol，更佳地，10mg：1.75-4.0nmol。
在另一优选例中，所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒由本发明第一方面所述的方法制成。
本发明第三方面，提供了本发明第二方面所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的用途，用于制备检测H9亚型禽流感抗体的检测试剂和/或试剂盒。
本发明第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有容器和说明书，所述的容器内含有本发明第二方面所述的H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒。
在另一优选例中，所述的容器内还含有独立包装的质控品或校准品、或清洗液。
在另一优选例中，所述校准品包括H9亚型禽流感病毒抗体阴性或阳性血清稀释液。
在另一优选例中，所述清洗液包括含有Tween 20的Tris缓冲液或含有Tween 20的PBS缓冲液。
在另一优选例中，所述Tween 20的Tris缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为8.0。
在另一优选例中，所述Tween 20的PBS缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7.0。
在另一优选例中，所述的说明书记载了含有本发明第二方面所述的H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的使用方法，包括步骤：
(i)提供待测样品、和所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒；
(ii)将所述待测样品与所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒混合并进行反应；
(iii)将(ii)中反应后的混合液进行洗涤并加入发光底物；
(iv)对(iii)中加入发光底物后的混合液进行发光值检测，从而定量或定性检测待测样品中的H9亚型禽流感病毒抗体。
在另一优选例中，所述的待测样品包括血液样品、体液样品和组织样品。
本发明第五方面，提供了一种检测H9亚型禽流感病毒抗体的检测方法，包括步骤：
(i)提供待测样品、和所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒；
(ii)将所述待测样品与所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒混合并进行反应；
(iii)将(ii)中反应后的混合液进行洗涤并加入发光底物；
(iv)对(iii)中加入发光底物后的混合液进行发光值检测，从而定量或定性检测待测样品中的H9亚型禽流感病毒抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本发明制备实施例1中的校准曲线；
图2是本发明制备实施例2中的校准曲线；
图3是本发明制备实施例3中的校准曲线；
图4是本发明制备实施例4中的校准曲线；
图5是本发明实验实施例1中羧基磁珠最适的蛋白用量曲线；
图6是本发明实验实施例1中甲苯磺酰基磁珠最适的蛋白用量曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，采用特定比例的H9亚型禽流感病毒抗原或其片段和磁性微粒进行混合，可以获得包被饱和均质、空间构象稳定的包被磁性微粒，所包被的磁性微粒上作为H9亚型禽流感病毒抗原的检测试剂，能够高灵敏、高准确率地检出样本中H9亚型禽流感病毒抗原，且在最大程度上节省了试剂制备成本。在此基础上，完成了本发明。
H9亚型禽流感病毒抗原或其片段
可用于本发明的H9亚型禽流感病毒抗原蛋白或其片段没有特殊限制，可以包括所述天然或重组的H9亚型禽流感病毒抗原蛋白的全长或其片段。优选地，可包括H9亚型禽流感病毒HA蛋白全长序列如SEQ ID NO.:1所示，其含有560个氨基酸，分子量69kD；H9亚型禽流感病毒HA蛋白片段序列如SEQ ID NO.:2所示，其含有112氨基酸，分子量13.6kD；H9亚型禽流感病毒HA蛋白多肽序列如SEQ ID NO.:3所示，其含有43氨基酸，分子量5kD；或采用H9亚型禽流感病毒NA蛋白序列如SEQ ID NO.:4所示，其含有466个氨基酸，分子量57kD；H9亚型禽流感病毒M蛋白序列如SEQ ID NO.:5所示，其含有252个氨基酸，分子量32kD。
本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。本发明的所述蛋白或其片段可以是重组的、天然的、合成的蛋白或其片段。本发明所述蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
磁性微粒
如本文所用，术语“磁性微粒”、“磁性颗粒”、“磁珠”可互换使用，指的是内部有磁性核心，外部包覆聚合物的微粒。包覆层含有活性基团，可与蛋白、多肽等偶联，并不影响蛋白、多肽的免疫活性；磁核使微粒在外部磁场作用下可定向移动聚集，离开磁场之后可在溶液中均匀分散，从而兼顾了抗原抗体的液相反应和抗原抗体复合物与未反应物质的分离。
可用于本发明的磁性微粒没有特殊限制，可以是任何具有磁性核心、表面附有聚合物的磁性颗粒。可用于本发明磁性微粒的核心为氧化铁(Fe3O4)；可用于本发明磁性颗粒表面的聚合物包括聚苯乙烯、丙烯酸树脂、聚甲基丙烯酸甲酯等。本发明磁性微粒的大小优选为0.1-5μm，优选为1-3μm。可用于本发明的磁性微粒通常以微粒群溶液的形式存在，通常，所述微粒群溶液中，微粒大小形状高度均一，粒径CV<3％。
可用于本发明的磁性微粒还可以含有多个活性基团，从而通过化学交联的方式将蛋白、多肽结合于磁性微粒表面。优选地，所述的活性基团包括羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团。含有活性基团的磁性微粒可以通过本领域常规技术制备获得或直接市售可得。例如购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Caboxyl的含有羧基的磁性微粒；或购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Tosyl含有甲苯磺酰基的磁性微粒。
H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联的磁性微粒及其制备方法
本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联的磁性微粒及其制备方法，所述方法包括步骤：
(a)提供磁性微粒溶液、和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段；
(b)将(a)中的磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段相偶联的混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为10mg：1.75-16.0nmol；
(c)：向(b)所获得的混合液中加入封闭剂。
通常，所述步骤(b)中还包括步骤(b’)：向所述的混合液中加入交联剂和/或催化剂，从而获得经交联和/或经催化的混合液；和/或
所述步骤(b)中还包括步骤(b”):向所述的混合中加入标记物，从而获得经标记的混合液。
所述方法包括步骤：
(a)提供磁性微粒溶液、和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段；
(b)将(a)中的磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段进行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为1-20.0nmol，较佳地，10mg：1.5-10.0nmol，更佳地，10mg：1.75-4.0nmol；
(b’)向(b)中加入交联剂或催化剂，从而得到经交联或催化的混合液；
(b”)向(b’)经交联或催化的混合液中加入封闭剂。
可用于本发明的交联剂和催化剂没有特别限制，可以是本领域中常用于磁珠表面包裹的交联剂或催化剂。优选地，所述的交联剂和催化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、戊二醛、硫酸铵。
可用于本发明的标记物没有特殊限制，可以是生物检测领域中用于显色、显影的常用标记物。优选地，所述标记物包括发光标记物，例如光激发发光标记物、电激发发光标记物。例如，所述发光标记物包括吖啶酯、碱性磷酸酶、和/或过氧化物酶。其可通过本领域的常规技术进行制备或配置。
优选的是，所述发光标记物为吖啶酯时，发光底物由第一发光底物和第二发光底物组成，第一发光底物为含有0.1mol/L硝酸、0.1％过氧化氢的溶液，第二发光底物为含有2％Tween-20、0.25mol/L NaOH的溶液；所述发光标记物为碱性磷酸酶时，发光底物为以金刚烷为基础的底物液；所述发光标记物为过氧化物酶时，发光底物由第一发光底物和第二发光底物组成，第一发光底物为含有0.5g/L鲁米诺、0.1g/L对碘酚的溶液，第二发光底物为0.625g/L过氧化脲溶液。
可用于本发明H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联的磁性微粒中磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为10mg：0.6-9.5nmol，优选为10mg：2.0-8.0nmol。在该范围以下时，发光值随蛋白用量增加迅速上升，说明蛋白未完全结合于磁珠；在该范围内时，发光值增幅变缓，说明磁珠结合蛋白接近饱和；而超过该范围时，发光值随蛋白用量增加反而有所降低，说明蛋白开始出现较多的自身交联，从而导致了偶联磁珠产生构型的改变。
本发明中H9亚型禽流感病毒抗原或其片段与磁性微粒之间可通过直接或间接偶联。例如，所述的直接偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗FITC抗体-FITC偶联。优选的方式为：链霉亲和素包被在磁性微粒上，生物素偶联在H9亚型禽流感病毒上，通过链霉亲和素-生物素作用结合H9亚型禽流感病毒和磁性微粒；抗FITC抗体包被在磁性微粒上，FITC交联在H9亚型禽流感病毒上，通过抗FITC抗体-FITC相互作用结合H9亚型禽流感病毒和磁性微粒。
本发明H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联的磁性微粒可用于制备检测H9亚型禽流感病毒抗体的检测试剂和/或试剂盒。
检测试剂或试剂盒
本发明提供了一种检测H9亚型禽流感病毒抗体的检测试剂或试剂盒，所述的试剂盒含有容器和说明书，所述的容器内含有本发明H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒。优选地，所述的容器内还含有独立包装的质控品或校准品、或清洗液；其中，所述校准品包括H9亚型禽流感病毒抗体阴性或阳性血清稀释液。优选地，所述的说明书记载了含有本发明第二方面所述的H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的使用方法，包括步骤：
(i)提供待测样品、和所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒；
(ii)将所述待测样品与所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒混合并进行反应；
(iii)将(ii)中反应后的混合液进行洗涤并加入发光底物；
(iv)对(iii)中加入发光底物后的混合液进行发光值检测，从而定量或定性检测待测样品中的H9亚型禽流感病毒抗体。
可用于本发明的清洗液没有特别限制，可以为本领域常用的磁珠清洗液，优选包括含有Tween 20的Tris缓冲液或含有Tween 20的PBS缓冲液。
在另一优选例中，所述Tween 20的Tris缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为8.0。
在另一优选例中，所述Tween 20的PBS缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7.0。
应用
本发明H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒及含有其的检测试剂、检测试剂盒可有效地用于高效、高灵敏度地检测待测样本中的H9亚型禽流感病毒抗体，且所述检测可以是定性或定量检测。
本发明有益效果
本发明采用特定粒径的磁性微粒作为包被载体，采用特定的H9亚型禽流感病毒与磁性微粒之比进行混合并反应，获得了包被均质、结构稳定的H9亚型禽流感病毒抗原或其片段偶联磁性微粒，也节省了包被蛋白原料，其包被的蛋白充分、检测范围较宽，灵敏度较高、反应时间非常短(仅需5-10分钟)，并具有高通量、自动化、可重复的优异特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
通用方法
1.H9亚型禽流感抗体的检测方法，包括如下步骤：
S1、取若干反应管，依次加入20μL待测血清或校准品、100μL稀释液和25μL包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液；
S2、37℃下反应10分钟；
S3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入300-500μL清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；
S4、向S3中加入100μL碱性磷酸酶标记的H9亚型禽流感抗体溶液；
S5、37℃下反应10分钟；
S6、重复步骤S3中的清洗步骤；
S7、S6中加入100μL发光底物；
S8、37℃下反应5分钟；
S9、用化学发光仪检测发光值。
2.绘制校准曲线，根据校准曲线计算待测血清中抗体的浓度。
以浓度值取对数为X轴，以发光值取Logit为Y轴，进行线性拟合，绘制校准曲线。
Sn：校准品(除校准品零值外)或样本发光值；
S0：校准品零值的发光值。
制备实施例1
本实施例制备了一种H9亚型禽流感抗体检测的试剂盒，包括包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液，碱性磷酸酶标记的H9亚型禽流感抗体溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，发光底物和反应管。
包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒(购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Caboxyl)的溶液，浓度为10mg/mL，用0.1mol/L pH为5.0的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液中；
(2)加入纯化的H9亚型禽流感抗原蛋白(购自于青岛易邦生物工程有限公司)50-500μg；
(3)称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液溶解，使EDC的浓度为10mg/mL；
(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振荡反应2小时；
(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含1％的BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300(购于Sigma公司，货号：48914-U)。
所述的磁性微粒为含有羧基基团的磁性微粒。
碱性磷酸酶标记的H9亚型禽流感抗体溶液的制备：
(1)取1mg碱性磷酸酶，用0.05mol/L pH为9.5的碳酸盐缓冲液(CB缓冲液)稀释至10mg/mL；
(2)称取高碘酸钠(NaIO4)并用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液溶解，使NaIO4的浓度为12.5mg/mL；
(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振荡混匀，于2-8℃下避光反应1小时；
(4)取10μL乙二醇，加入1mL 0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液，获得乙二醇溶液；
(5)取(4)中乙二醇溶液100μL加入(3)中，于2-8℃避光反应1小时；
(6)取H9亚型禽流感单克隆抗体0.5-1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液于2-8℃下避光透析20-24小时；
(7)称取硼氢化钠(NaBH4)溶于纯水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；
(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反应2小时；
(9)过分子筛纯化分离未结合的碱性磷酸酶和H9亚型禽流感单克隆抗体；
(10)将(9)中纯化后的抗体溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05M的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液稀释备用。
稀释浓度由预实验效果来确定，合适的稀释浓度为0.1-0.5μg/mL。
校准品是经标定的含有已知浓度的H9亚型禽流感抗体的缓冲液。
校准品的制备：
(1)将经H9亚型禽流感病毒疫苗强化免疫后获得的H9亚型禽流感抗体强阳性血清于60℃热灭活1小时；
(2)将(1)中灭活后的强阳性血清经0.2μm的微滤膜过滤，加入0.1％的ProClinTM300；
(3)将(2)中的血清进行标定，按一定浓度稀释，得到0，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200U/mL系列校准品。
质控品是经标定的H9亚型禽流感抗体阳性鸡血清。分为低值质控品和高值质控品，其中低值质控品的质控范围为20-30U/mL，高值质控品的质控范围为100-150U/mL。质控品用于控制试验的有效性，定期检测质控品，若超出质控范围，则须使用校准品重新定标。
质控品的制备：
(1)选择10份以上H9亚型禽流感抗体阳性血清，60℃热灭活1小时，混合后经0.2μm的微滤膜过滤，加入0.1％的ProClinTM300。
(2)调整混合阳性血清至合适的浓度。
稀释液是含有1％BSA，pH为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.05mol/L pH为8.0的Tris缓冲液；发光底物是以金刚烷及其衍生物为基础的溶液，此例中的发光底物为Lumi-Phos 530，购于Lumigen公司，货号：P-5000。
表1为不同浓度的校准品所对应的发光值，图1为绘制的校准曲线
表1
制备实施例2
本实施例制备了一种H9亚型禽流感抗体检测的试剂盒，包括包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液，吖啶酯标记的山羊抗鸡IgG抗体(购自北京索莱宝科技有限公司)溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，第一发光底物和第二发光底物，反应管。
包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/mL，用0.1mol/L pH为9.5的硼酸缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.1mol/L pH为9.5的硼酸缓冲液中；
(2)加入纯化的H9亚型禽流感抗原蛋白50-500μg，涡旋混匀；
(3)加入0.1mol/L pH为9.5的硼酸缓冲液(含有3mol/L硫酸铵)0.5-1mL，37℃下振荡反应20-24小时；
(4)加入0.5mL 10％的BSA水溶液，涡旋混匀，37℃振荡反应6-12小时；
(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。
所述的磁性微粒为含有甲苯磺酰基基团的磁性微粒。
吖啶酯标记山羊抗鸡IgG抗体溶液的制备：
(1)取1mg山羊抗鸡IgG抗体，用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液在2-8℃下透析过夜；
(2)取含有0.2mg吖啶酯的吖啶酯溶液加入到(1)中，常温避光反应2小时；
(3)加入100μL 0.1g/mL赖氨酸溶液，常温避光反应2小时；
(4)用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液在2-8℃下避光透析20-24小时；
(5)将(4)中的抗体溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
校准品的制备方法与制备实施例一相同。
质控品的制备方法与制备实施例一相同。
稀释液是含有1％BSA，pH为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/L pH为7.0的PBS缓冲液；第一发光底物为含有0.1mol/L硝酸、0.1％过氧化氢的溶液，第二发光底物为含有2％Tween-20、0.25mol/L NaOH的溶液。
表2为不同校准品浓度所对应的发光值，图2为绘制的校准曲线。
表2
制备实施例3
本实施例制备了一种H9亚型禽流感抗体检测的试剂盒，包括包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液，辣根过氧化物酶标记的H9亚型禽流感抗原溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，第一发光底物和第二发光底物，反应管。
包被H9亚型禽流感抗原蛋白的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/mL，用0.01mol/L pH为7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液中；
(2)加入0.1mL 25％(v/v)的戊二醛溶液，37℃振荡反应2小时；
(3)用1mL 0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液清洗3遍；
(4)加入纯化的H9亚型禽流感抗原重组抗原50-500μg，37℃振荡反应20-24小时；
(5)加入0.5mL 10％牛血清白蛋白(BSA)水溶液，涡旋混匀，37℃振荡反应2小时；
(6)用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。
所述的磁性微粒为含有氨基基团的磁性微粒。
辣根过氧化物酶标记H9亚型禽流感抗原的制备：
(1)取1mg辣根过氧化物酶，用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液稀释至10mg/mL；
(2)称取NaIO4并用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液溶解，使NaIO4的浓度为12.5mg/mL；
(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振荡混匀，于2-8℃下避光反应1小时；
(4)取10μL乙二醇，加入1mL 0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液，获得乙二醇溶液；
(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2-8℃避光反应1小时；
(6)取H9亚型禽流感抗原0.5-1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液于2-8℃下避光透析20-24小时；
(7)称取NaBH4溶于纯水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；
(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反应2小时；
(9)过分子筛纯化；
(10)将(9)中纯化后的抗原溶液用含有1％BSA的pH7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
校准品的制备方法与制备实施例一相同。
质控品的制备方法与制备实施例一相同。
稀释液是含有1％BSA，pH为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/L pH7.0的PBS缓冲液；第一发光底物为0.5g/L鲁米诺、0.1g/L对碘酚的溶液，第二发光底物为0.625g/L过氧化脲溶液。
表3为校准品不同浓度对应的发光值，图3为绘制的校准曲线。
表3
制备实施例4
本实施例制备了一种H9亚型禽流感抗体检测的试剂盒，包括包被链霉亲和素的磁性悬浮液，碱性磷酸酶标记的H9亚型禽流感病毒抗原，生物素化抗原，校准品，质控品，清洗液，发光底物和反应管。
包被链霉亲和素的磁性悬浮液的制备：
(1)取1mL含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/mL，用0.1mol/L pH为5.0的1-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1mL 0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液中；
(2)加入链霉亲和素50-500μg；
(3)称取EDC，用0.1mol/L pH为5.0的MES缓冲液溶解，使EDC的浓度为10mg/mL；
(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振荡反应2小时；
(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。
所述的磁性微粒为含有羧基基团的磁性微粒。
碱性磷酸酶标记的H9亚型禽流感病毒抗原溶液的制备：
(1)取1mg碱性磷酸酶，用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液稀释至10mg/mL；
(2)称取NaIO4并用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液溶解，使NaIO4的浓度为12.5mg/mL；
(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振荡混匀，于2-8℃下避光反应1小时；
(4)取10μL乙二醇，加入1mL 0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液，获得乙二醇溶液；
(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2-8℃避光反应1小时；
(6)取H9亚型禽流感病毒抗原0.5-1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/L pH为9.5的CB缓冲液于2-8℃下避光透析20-24小时；
(7)称取NaBH4溶于纯水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；
(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反应2小时；
(9)过分子筛纯化；
(10)将(9)中纯化后的抗体溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
生物素抗原的制备：
(1)取1mgH9亚型禽流感病毒抗原，用0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液在2-8℃下透析过夜；
(2)将预活化的生物素溶于纯水中，制备50mmol/L的生物素溶液；
(3)取(2)中生物素溶液20μL加入(1)中，常温反应1小时；
(4)将(3)中加入100μL 0.1g/mL赖氨酸溶液，常温反应1小时；
(5)将(4)中溶液用0.01mol/L pH为7.4的PBS缓冲液在2-8℃下透析20-24小时。
(6)将(5)中溶液用含有1％BSA的pH为7.0 0.05mol/L的MOPS缓冲液稀释备用。
校准品的制备方法与制备实施例一相同。
质控品的制备方法与制备实施例一相同。
清洗液是含0.1％Tween-20的0.05M pH8.0的Tris缓冲液；发光底物是以金刚烷及其衍生物为基础的溶液。此例中的发光底物为Lumi-Phos 530，购于Lumigen公司，货号：P-5000。
表4为校准品不同浓度对应的发光值，图4为绘制的校准曲线。
表4
实验实施例1H9亚型禽流感病毒抗原或其片段对磁性微粒的比例研究
本实施例采用了5种H9亚型禽流感病毒抗原或其片段(SEQ ID NO.:1-5)2种磁性微粒((购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Caboxyl)和含有甲苯磺酰基的磁性微粒(购于日本JSR公司，货号：MagnosphereTM MS300/Tosyl))包被，制备过程如下：
本实验实施例先采用了制备实施例1中所制备的H9亚型禽流感病毒HA蛋白偶联磁性微粒，其中H9亚型禽流感病毒HA蛋白全长的加入量为31.3、62.5、125、250、500、1000μg，对应物质的量为0.45、0.91、1.81、3.62、7.25、14.49nmol；H9亚型禽流感病毒HA蛋白片段的加入量为6.3、12.5、25、50、100、200μg，对应物质的量为0.46、0.92、1.84、3.68、7.35、14.71nmol；H9亚型禽流感病毒HA蛋白多肽的加入量为2.5、5、10、20、40、80μg，对应物质的量为0.5、1、2、4、8、16nmol；H9亚型禽流感病毒NA蛋白全长的加入量为25、50、100、200、400、800μg，对应物质的量为0.44、0.88、1.75、3.51、7.02、14.04nmol；H9亚型禽流感病毒M蛋白片段的加入量为15.7、31.3、62.5、125、250、500μg，对应物质的量为0.49、0.98、1.95、3.91、7.81、15.63nmol。
本实验实施例还采用了制备实施例2中所制备的H9亚型禽流感病毒HA蛋白偶联磁性微粒，其中H9亚型禽流感病毒HA蛋白全长的加入量为31.3、62.5、125、250、500、1000μg，对应物质的量为0.45、0.91、1.81、3.62、7.25、14.49nmol；H9亚型禽流感病毒HA蛋白片段的加入量为6.3、12.5、25、50、100、200μg，对应物质的量为0.46、0.92、1.84、3.68、7.35、14.71nmol；H9亚型禽流感病毒HA蛋白多肽的加入量为2.5、5、10、20、40、80μg，对应物质的量为0.5、1、2、4、8、16nmol；H9亚型禽流感病毒NA蛋白全长的加入量为25、50、100、200、400、800μg，对应物质的量为0.44、0.88、1.75、3.51、7.02、14.04nmol；H9亚型禽流感病毒M蛋白片段的加入量为15.7、31.3、62.5、125、250、500μg，对应物质的量为0.49、0.98、1.95、3.91、7.81、15.63nmol。
配以碱性磷酸酶标记的H9亚型禽流感病毒溶液、清洗液、发光底物和反应管进行试验。
1.1羧基磁珠的最适蛋白用量
用本实施例H9亚型禽流感抗体阳性血清，结果如表5所示，图5为包被蛋白用量与其发光值对应的曲线。
结果表明，随蛋白用量增加，发光值上升速度逐渐变缓，说明磁珠结合蛋白接近饱和；而蛋白用量继续增加，发光值反而有所降低，说明蛋白过量，出现了较多的蛋白自身交联。
因此，对于羧基磁珠，H9亚型禽流感HA蛋白全长、片段、多肽的最适用量为1.81-16.0nmol/10mg磁珠；NA蛋白全长的最适用量为1.75-14.4nmol/10mg磁珠；M蛋白片段的最适用量为1.95-15.63nmol/10mg磁珠。五种蛋白虽然氨基酸数量、分子量差别很大，但按物质的量计算，最佳包被蛋白用量相差不大，都在1.75-16.0nmol/10mg磁珠范围内。其中，1.75-4.00nmol/10mg磁珠效果最好。
表5羧基磁珠的最适蛋白用量
1.2甲苯磺酰基磁珠的最适蛋白用量
用本实施例检测H9亚型禽流感抗体阳性血清，结果如表6所示，图6为包被蛋白用量与其发光值对应的曲线。
随蛋白用量增加，发光值上升速度逐渐变缓，说明磁珠结合蛋白接近饱和。因此，对于甲苯磺酰基磁珠，H9亚型禽流感HA蛋白全长、片段、多肽的最适用量为1.81nmol/10mg磁珠以上；NA蛋白全长的最适用量为3.51nmol/10mg磁珠以上；M蛋白片段的最适用量为1.95nmol/10mg磁珠以上。五种蛋白虽然氨基酸数量、分子量差别很大，但按物质的量计算，最佳包被蛋白用量相差不大，考虑成本因素，蛋白用量不宜过多，结合羧基磁珠的结果，确定五种蛋白的最佳用量范围为1.75-16.0nmol/10mg磁珠。
表6甲苯磺酰基磁珠的最适蛋白用量
实验实施例2灵敏度实验
分别采用制备实施例1、2、3、4中的试剂盒分别进行灵敏度测试，国外知名厂家生产的H9亚型禽流感抗体检测试剂盒(酶联免疫吸附试验，以下简称为ELISA试剂盒)同时检测不同稀释倍数的H9亚型禽流感抗体血清，其中，本实施例的试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数(CV％＝10个测试结果的标准偏差/算术平均值)。以CV％<20％的最大稀释倍数作为灵敏度结果。结果分别见表7、8、9、10，可见本试剂灵敏度均优于ELISA试剂盒，其中表7可见本发明试剂盒灵敏度<1.93U/mL；表8可见本发明试剂盒灵敏度<0.89U/mL；表9可见本发明试剂盒灵敏度<0.95U/mL；表10可见本发明试剂盒灵敏度<0.96U/mL。
表7
表8
表9
表10
实验实施例3重复性实验
取3例H9亚型禽流感抗体阳性血清，分别采用制备实施例1、2、3、4中的试剂盒分别进行重复性测试，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算其浓度的变异系数，结果如表11、12、13、14。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。
表11
表12
表13
表14
实验实施例4符合率实验
分别采用制备实施例1、2、3、4中的试剂盒与ELISA试剂盒同时检测多份鸡血清，检测结果如表15-18。结果显示，四次实验中，本试剂与ELISA试剂盒阳性符合率分别为97.5％、97.5％、96.3％、96.3％，阴性符合率分别为95.2％、94.7％、94.4％、94.4％，总体符合率分别为95.6％、95.2％、94.7％、94.7％。
表15
表16
表17
表18
实验实施例5H9亚型禽流感病毒疫苗的免疫监测
浓度<8.0U/mL判定为阴性，浓度≥8.0U/mL判定为阳性；Elisa试剂盒S/N>0.50判定为阴性，S/N≤0.50判定为阳性。
在用H9亚型禽流感病毒疫苗免疫后，随机抽取3只，分别于免疫后0、7、10、14、21、35天抽取血样检测H9亚型禽流感抗体，采用制备实施例1、2、3、4中试剂盒进行检测，检测结果如表19-22。结果显示，在免疫后10至35天，H9亚型禽流感病毒抗体由阴转阳，且浓度逐渐上升；除第10天本发明试剂盒检测结果为阳性，而ELISA试剂盒检测结果为阴性外，两种试剂检测结果一致。
表19
表20
表21
表22
实验实施例6特异性实验
分别采用制备实施例1、2、3、4中的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括鸡传染性法氏囊病毒抗体(IBDV-Ab)、新城疫病毒抗体(NDV-Ab)、传染性支气管炎抗体(IBV-Ab)、禽白血病病毒J亚型抗体(ALV-J-Ab)、鸡网状内皮组织增生病毒抗体(REV-Ab)。检测结果检测结果均低于8.0U/mL，均为阴性，未发现交叉反应，见表23、24、25、26。
表23
相关病毒抗体 IBDV-Ab NDV-Ab IBV-Ab ALV-J-Ab REV-Ab
浓度(U/mL) 2.31 2.92 3.09 2.37 2.91
表24
相关病毒抗体 IBDV--Ab NDV-Ab IBV-Ab ALV-J-Ab REV-Ab
浓度(U/mL) 1.15 1.40 1.81 1.59 1.64
表25
相关病毒抗体 IBDV--Ab NDV-Ab IBV-Ab ALV-J-Ab REV-Ab
浓度(U/mL) 1.33 1.18 1.47 1.60 1.40
表26
相关病毒抗体 IBDV--Ab NDV-Ab IBV-Ab ALV-J-Ab REV-Ab
浓度(U/mL) 2.05 1.73 1.61 1.46 1.72
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海鸣捷生物科技有限公司
<120> H9亚型禽流感病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用
<130> P2016-1202
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 560
<212> PRT
<213> 禽流感病毒（Avian influenza virus）
<220>
<221> misc_feature
<223> HA蛋白全长
<400> 1
Met Lys Ala Leu Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu
50 55 60
Gly Arg Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Ser Ser
115 120 125
Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr
130 135 140
Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gln Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Arg Gly Arg Ser Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His
180 185 190
Pro Pro Thr Asp Thr Thr Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Leu
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Ile Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Val Arg Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Lys Gly Asn Cys Val Val
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Arg Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe His
290 295 300
Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Pro Lys Tyr Ile Gly Val
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Arg Ala
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Ala Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Met Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Val Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Ser Ile
545 550 555 560
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 禽流感病毒（Avian influenza virus）
<220>
<221> misc_feature
<223> HA蛋白片段
<400> 2
Thr Gln Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr Thr Asn
1 5 10 15
Asn Arg Gly Arg Ser Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His Pro Pro
20 25 30
Thr Asp Thr Thr Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr Thr Thr
35 40 45
Ser Val Ala Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Leu Ile Gly
50 55 60
Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr Tyr Trp
65 70 75 80
Ser Ile Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Val Arg Ser Asn Gly Asn
85 90 95
Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser His Gly
100 105 110
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 禽流感病毒（Avian influenza virus）
<220>
<221> misc_feature
<223> HA蛋白片段
<400> 3
Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe
1 5 10 15
Ser Glu Val Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp
20 25 30
Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala Glu
35 40
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> 禽流感病毒（Avian influenza virus）
<220>
<221> misc_feature
<223> N蛋白全长
<400> 4
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Arg Gly Asn Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ile Lys Asn Lys
35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
His His Phe Thr Ser Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Ser Ser Ala
115 120
<210> 5
<211> 252
<212> PRT
<213> 禽流感病毒（Avian influenza virus）
<220>
<221> misc_feature
<223> M蛋白全长
<400> 5
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Met Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Leu
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser His His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln
195 200 205
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr Gln Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Ile Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250

Claims (16)

1.一种H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供磁性微粒溶液、和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段，其中，所述的磁性微粒的粒径为0.1-5μm，所述H9亚型禽流感病毒抗原或其片段为H9亚型禽流感病毒HA蛋白全长、H9亚型禽流感病毒HA蛋白片段、H9亚型禽流感病毒HA蛋白多肽片段或H9亚型禽流感病毒M蛋白片段，且所述H9亚型禽流感病毒HA蛋白的全长序列如SEQ ID NO.:1所示，所述H9亚型禽流感病毒HA蛋白片段的序列如SEQ ID NO.:2所示，所述H9亚型禽流感病毒HA蛋白多肽片段的序列如SEQ ID NO.:3所示，所述H9亚型禽流感病毒M蛋白片段的序列如SEQ ID NO.:5所示；
(b)将(a)中的磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段进行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例为10mg：1.5-16.0nmol；
(b’)向(b)中加入交联剂，从而得到经交联的混合液；
(c)向(b’)经交联的混合液中加入封闭剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微粒与所述的H9亚型禽流感病毒抗原或其片段的结合方式包括直接偶联和间接偶联。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、或抗FITC抗体-FITC偶联。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的直接偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、或甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微粒核心为氧化铁。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微粒还含有活性基团。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的活性基团包括羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微粒溶液中,磁性微粒粒径CV<3％。
9.一种H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒，其特征在于，所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒由权利要求1-8中任一项所述的方法制成。
10.权利要求9所述H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒的用途，其特征在于，用于制备检测H9亚型禽流感病毒抗体的检测试剂或试剂盒。
11.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有容器和说明书，所述的容器内含有权利要求9所述的H9亚型禽流感病毒抗原偶联的磁性微粒。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的容器内还含有独立包装的质控品、或校准品、或清洗液。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品包括H9亚型禽流感病毒抗体阴性或阳性血清稀释液。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括含有Tween 20的Tris缓冲液或含有Tween 20的PBS缓冲液。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述含有Tween 20的Tris缓冲液中，Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为8.0。
16.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述含有Tween 20的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.0。
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