CN114480470A

CN114480470A - 高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒

Info

Publication number: CN114480470A
Application number: CN202011271024.2A
Authority: CN
Inventors: 付宪; 丁卫超; 林涛; 沈玥
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-05-13

Abstract

本发明提供了一种高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒。其中，该方法包括：以能够表达Cas蛋白和逆转录酶的模式生物的细胞作为试验起始细胞；向试验起始细胞导入靶向目标基因的敲入片段，敲入片段包括带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列，得到可基因编辑的细胞；使可基因编辑的细胞启动基因编辑并对筛选标记基因对应表型进行筛选得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体。该方法既充分利用了基因编辑高效率和高通量产生突变体的优势，又利用筛选标记基因将目标突变体快速、高效地筛选分离出来，克服了现有方法流程繁琐和耗时的问题，为大规模或高通量制备基因敲除突变体奠定了基础。

Description

高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒

技术领域

本发明涉及模式生物突变体构建领域，具体而言，涉及一种高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒。

背景技术

模式生物的突变体是研究高等生物学的一系列生物学问题的基本工具和手段，在科学研究和生产应用中非常广泛，而目前仍难以快速、高效地、大规模、高通量地获得模式生物突变体。

以酵母这一模式生物中的酿酒酵母为例，酿酒酵母是最经典的真核单细胞模式生物，酿酒酵母基因敲除突变体在科学研究和生产应用具有一定的指导意义和使用价值。酵母基因敲除突变体能够指示被敲除基因对酵母生命活动的必须性；研究酵母基因突变体能够启示被敲出基因的功能；特定的酵母基因突变体能作为底盘菌用作后续的生产应用；大规模的酵母基因敲除突变体研究能够为研究酵母最小基因组提供指导，并可用于开发具有重要价值的工业底盘菌。

目前，构建酿酒酵母基因敲除突变体的技术主要有：酵母转化介导同源重组技术、eMAGE(eukaryotic multiplex automated genome engineering，eMAGE)基因编辑技术以及以CRISPR/Cas为基础的一系列基因编辑技术。

(1)酵母转化介导同源重组技术通过向酵母转化一个基因敲除片段来实现基因敲除。通常该方法首先根据目标基因编码序列的上下游序列设计PCR引物，通过PCR将同源臂加到抗生素抗性基因两侧构建成基因敲除同源重组片段。然后，将基因敲除同源重组片段通过酵母转化方法转化至目标细胞株内。转化之后，将会自动诱导酵母发生同源重组，由于抗性基因两侧带有与目标基因编码序列上下游同源的序列，使得抗性基因有可能会通过同源重组将目标基因替换。再通过在抗生素条件下筛选，即可获得目标基因被抗性基因替换的突变体。

虽然该技术能筛选出敲除突变体，但是该技术效率较低，1μg DNA转化效率小于0.1％，且该技术不具备大规模或高通量构建基因敲除突变体的潜力。

(2)eMAGE基因编辑技术通过向酵母转化一段100nt长度左右的单链寡核苷酸来实现基因敲除。该技术需要通过电刺激转化，将单链寡核苷酸转化至酵母细胞株内，诱使酵母在DNA复制过程中，错误使用该单链寡核苷酸作为目标基因复制时后随链上的“冈崎片段”，使得寡核苷酸上的突变被引入到子细胞的目标基因中，实现基因敲除。

该技术效率受到目标基因与ARS序列距离的影响(效率随着距离的变长而降低)，故不具备基因组全局高效编辑的能力。此外，该技术在基因编辑的应用中缺乏快速有效的筛选方法。

(3)以CRISPR/Cas为基础的一系列基因编辑技术通过设计靶向目标基因的sgRNA，然后通过转化，在酵母体内表达Cas蛋白和靶向RNA。在靶向RNA的引导下，Cas蛋白对目标基因进行切割，引起双链断裂，诱发细胞进行DNA双链断裂修复。在修复过程中目标基因可能发生碱基的***或删除，从而引起目标基因失活，从而实现基因敲除。

但是，基因编辑后的突变体需要通过测序等一系列下游分析手段才能判断突变体是否成功获得，无法实现对突变体细胞株简单、快速和有效地筛选。

综上所述，一种能与高效基因敲除技术偶联使用、且能高效的、大规模或高通量筛选基因敲除突变体的方法亟待开发，该技术的建立将为基于酵母基因敲除突变体研究的科学发现和下游应用带来重大的益处。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒，以解决现有技术中相关模式生物突变体制备效率低下的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法，该方法包括：以能够表达Cas蛋白和逆转录酶的模式生物的细胞作为试验起始细胞；向试验起始细胞导入靶向目标基因的敲入片段，敲入片段包括带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列，得到可基因编辑的细胞；使可基因编辑的细胞启动基因编辑，并通过对筛选标记基因对应表型进行筛选得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体。

进一步地，向试验起始细胞导入质粒，质粒包括靶向目标基因的敲入片段，且带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列共价连接于质粒上；优选地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列的长度为800～2000bp；优选地，在质粒上，筛选标记基因的转录方向与向导RNA的DNA序列的转录方向相反；优选地，筛选标记基因选自如下任意一种或多种：抗生素抗性基因及荧光标记基因；更优选地，抗生素抗性基因选自如下任意一种：Ble基因、Neo基因及KanMX基因；进一步优选地，抗生素抗性基因为Ble基因；优选地，荧光标记基因选自如下任意一种：GFP基因、YFP基因、BFP基因、CFP基因、Luc基因、eGFP基因及RFP基因。

进一步地，按筛选标记基因的转录方向，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列依次包括：目标基因的上游同源臂、筛选标记基因的表达框及目标基因的下游同源臂；优选地，筛选标记基因的表达框包括依次连接的组成型启动子、筛选标记基因的编码区及终止子；更优选地，组成型启动子选自如下任意一种：P_TEF1、P_TPI1、P_PGK1、P_TDH3及P_ADH1；更优选地，终止子选自如下任意一种：T_TEF1和T _CYC1；优选地，靶向目标基因的敲入片段依次包括：驱动向导RNA的DNA序列表达的启动子、带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列、向导RNA的DNA序列以及向导RNA的DNA序列表达的终止子。

进一步地，使可基因编辑的细胞启动基因编辑，得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体包括：将可基因编辑的细胞置于含有诱导剂的培养基中，诱导可基因编辑的细胞启动基因编辑，基因编辑包括对目标基因进行双链断裂，以及利用带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列进行同源重组修复，得到修复细胞；利用筛选标记基因对修复细胞进行筛选，得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体；优选地，筛选标记基因为Ble基因，更优选地，利用筛选标记基因对修复细胞进行筛选时，培养基中添加的抗生素zeocin的浓度为125～200μg/mL，更优选为150μg/mL。

进一步地，修复细胞中含有质粒，质粒包括带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列，在利用筛选标记基因对修复细胞进行筛选之前，方法还包括去除修复细胞中的质粒，进一步优选地，采用自然***丢失法或药物反筛的方法去除修复细胞中的质粒。

进一步地，试验起始细胞，采用第一诱导型启动子驱动Cas蛋白和逆转录酶的表达；优选地，可基因编辑的细胞中，采用第二诱导型启动子驱动敲入片段的表达；优选地，第一诱导型启动子与第二诱导型启动子相同或不同；优选地，第一诱导型启动子与第二诱导型启动子各自独立地选自：P_GAL启动子或P_CUP1启动子，更优选地，P_GAL启动子选自P_GAL7、P_GAL7及P_GAL70中的一种或多种。

进一步地，模式生物为酵母，优选为酿酒酵母。

进一步地，能够表达Cas蛋白和逆转录酶的试验起始细胞通过以下方法获得：对含有Cas蛋白与逆转录酶的质粒进行酶切，得到表达Cas蛋白与逆转录酶的线性DNA片段；将线性DNA片段经同源重组导入营养缺陷型细胞内恢复营养缺陷型细胞的功能，得到试验起始细胞；优选地，缺陷型细胞为Δhis3酵母菌株；优选地，Cas蛋白为Cas9，更优选为S.pyogenes来源的Cas 9；更优选地，Cas蛋白的启动子为P_GAL7；优选地，逆转录酶为E.coli来源的EC86RT；更优选地，逆转录酶的启动子为P_GAL70。

进一步地，筛选标记基因为Ble基因，敲入片段包括依次连接的：诱导型启动子P_GAL7、目标基因的下游同源臂、T_TEF1终止子、Ble基因的编码区及P_TEF1启动子、目标基因的上游同源臂、向导RNA的DNA序列及T_GAL7终止子。

进一步地，依次以棉子糖和半乳糖为碳源，诱导可基因编辑的细胞启动基因编辑；优选地，以棉子糖为碳源，诱导可基因编辑的细胞表达第一时长，进一步以半乳糖为碳源，诱导可基因编辑的细胞表达第二时长；更优选地，第一时长和第二时长各自独立地为16～48h，进一步优选为20～30h。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种用于制备模式生物基因突变体的质粒，质粒包括靶向目标基因的敲入片段，敲入片段包括共价连接的带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列。

进一步地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列中，筛选标记基因的转录方向与向导RNA的转录方向相反；优选地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列的长度为800～2000bp；优选地，筛选标记基因为上述的方法中的筛选标记基因；优选地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列为上述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列。

应用本发明的技术方案，该方法通过利用基因编辑和同源重组方法的优势，将靶向目的基因的敲入片段设计为同源重组修复模板序列，而同源重组修复模板序列中含有筛选标记基因，这样在细胞中启动基因编辑即可导致目标基因被切割，进而诱发细胞自身基于同源重组修复模板序列对切割目标基因进行修复，从而实现了目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体。该方法不仅能够充分利用基因编辑产生突变体的高效率和高通量的优势，而且能够利用筛选标记基因将基因编辑之后的目标突变体快速、高效地筛选分离出来，克服了现有方法依赖于下游PCR和/或测序等鉴定流程繁琐和耗时的问题，为大规模或高通量制备基因敲除突变体奠定了基础，为进一步基于基因敲除突变体进行各种研究的科学发现和下游应用带来重大的益处。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明的设计的流程，主要包括：出发菌株的构建、抗性基因表达簇的设计和质粒构建、诱导基因编辑、突变体的筛选。

图2示出了根据本发明实施例1中出发酵母菌株的构建原理图，通过酶切获得基因编辑功能元件的Cas9/EC86RT片段，通过酵母转化方法将稳转片段同源重组至his3基因位点。重组后得到的出发菌株，在半乳糖的诱导下，P_GAL70/P_GAL7启动子驱动分别驱动逆转录酶EC86RT和Cas9蛋白表达，无半乳糖时，则不表达，从而调控基因编辑过程。

图3A示出的是本发明实施例2中抗生素抗性基因表达框的设计；图3B示出的是本发明实施例2中含抗性基因表达簇的阳性菌和不含抗性基因表达框的阴性菌在含150μg/ml抗生素zeocin的平板上的生长情况。

图4A至图4C示出了目标基因编辑效率的测试结果，其中图4A示出的是针对ade1和ade2基因位点进行编辑的敲入菌株在无选择压力培养基(SC^-His-Μra)上培养48小时后，计算红色菌落(发生目标基因编辑)个数与全体菌落个数的比例，获得基因编辑效率。其中，箭头所示记为红色克隆，三角形所示为白色克隆，白色克隆则为基因座无编辑的克隆。图4B示出的是对阴性菌株和阳性菌株进行PCR鉴定的特异性引物的设计，其中F1，R均靶标ade2的编辑位点附近，F2则靶标在Ble表达簇的启动子区域；图4C示出的是随机选取的22个克隆及阴性菌株(BY4741)的PCR鉴定结果。

图5示出了抗性基因***位置的准确性验证结果。

图6A至图6C示出了质粒丢失验证结果图，其中图6A显示的是F1/R引物对可以扩增出基因敲入的特异性片段，图6B显示的是所得到的8个克隆在SC培养基上培养3天能够正常生长；图6C显示的是，同样的八个菌株，在SC^-URA培养基上不能生长。

图7示出了目标酵母基因编辑突变体的抗生素浓度测试结果，菌株在150μg/mL的zeocin的筛选平板上培养7天，野生型菌株与只发生ade2基因敲入的菌株在筛选平板上无法生长，而通过抗性基因***获得的目标酵母基因敲入突变体可以正常生长。

图8A至图8C示出了利用抗生素筛选的有效性验证结果，其中，图8A显示的是筛选的流程示意图，图8B显示的是在抗生素zeocin平板上筛选得到阳性克隆；图8C显示的是将图8B的阳性克隆转印到SC^-URA的平板上后克隆不能生长。

图9示出了Ble抗性基因敲入的验证结果，采用图4B所示的Ble基因特异的引物对F2/R进行PCR鉴定，随机选取的克隆均能扩增出阳性条带。

图10A示出了含抗性基因Neo的菌株生长抑制所需的抗生素G418的有效浓度；图10B示出了含抗性基因Ble的菌株生长抑制时所需的抗生素zeocin的有效浓度。

图11抗性基因表达框中无启动子和终止序列的实验组(P₀/T₀)与抗性基因表达框中有启动子和终止序列的对照组(P_TEF1/T_TEF1)相比，以ade1基因作为靶点时的编辑效率测试。

图12在同样的筛选流程以及同样的涂板数情况下，抗性基因表达框中无启动子和终止序列的实验组(P₀/T₀)与抗性基因表达框中有启动子和终止序列的实验组(P_TEF1/T_TEF1)相比，筛选获得克隆数量的比较。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术中提到的，现有技术仍难以快速、高效地获得高通量的(酵母等)模式生物的基因编辑体，为改善这一现状，本发明以酵母为例进行了技术改进和试验，开发了一种适用于多种模式生物制备基因编辑突变体的方法，尤其适合发生同源重组频率比较高的模式生物，比如酵母。

基于本发明的研究结果，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法，该方法包括：以能够表达Cas蛋白和逆转录酶的模式生物的细胞作为试验起始细胞；向试验起始细胞中导入靶向目标基因的敲入片段，敲入片段包括带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列，得到可基因编辑的细胞；使可基因编辑的细胞启动基因编辑，通过筛选得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体。

该方法通过利用基因编辑和同源重组方法的优势，将靶向目的基因的敲入片段设计为同源重组修复模板序列，而同源重组修复模板序列中含有筛选标记基因，这样在细胞中启动基因编辑即可导致目标基因被切割，进而诱发细胞自身基于同源重组修复模板序列对切割目标基因进行修复，从而实现了目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体。该方法不仅能够充分利用基因编辑产生突变体的高效率和高通量的优势，而且能够利用筛选标记基因将基因编辑之后的目标突变体快速、高效地筛选分离出来，克服了现有方法依赖于下游PCR或测序等鉴定流程繁琐和耗时的问题，为大规模或高通量制备基因敲入突变体奠定了基础，为进一步基于基因敲入突变体进行各种研究的科学发现和下游应用带来重大的益处。

上述方法中，向试验起始细胞中导入上述敲入片段的方式有多种，比如可以将带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列以线性DNA的方式导入，也可以将两者构建于同一或不同质粒上导入。从转化效率及对后续的基因编辑的效率角度考虑，优选以构建于同一质粒上的方式导入。

因此，在本发明一种优选的实施例中，向试验起始细胞导入质粒，质粒包括靶向目标基因的敲入片段，且带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列共价连接于质粒上，将用于进行基因编辑的元件与用于进行同源重组修复的元件整合到一个质粒中，便于细胞启动逆转录蛋白表达后，逆转录蛋白在转录形成向导RNA的同时即可将同源重组修复模板序列携带至目标基因附近，便于提高同源重组修复的效率，从而提高基因编辑突变体的制备效率。

本发明的上述敲入片段中，筛选标记基因是能够表达具有功能的完整蛋白，且能够用于对产生的敲除突变体进行筛选的标记基因，而不是会导致目标基因表达提前终止的目标基因的截短序列。这在敲入片段的长度上也可以体现出来，目标基因的截短序列通常150bp以内，而用于筛选的标记基因的长度明显要长于150bp，根据常见筛选标记基因的长度估计，优选采用带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列的长度为800～2000bp。

需要说明的是，构建于同一质粒上的设计方式可以与向导RNA共用启动子，也可以单独带有启动子。单独带有启动子时，可以与向导RNA同方向表达，也可以反方向表达，最优选的为反方向表达。

当转录方向一致时，筛选标记基因的具体序列可以设置为仅有编码区序列，发生同源重组修复后，筛选标记基因受目标基因启动子的驱动进行表达；也可以设置为含有独立的启动子和终止子的完整表达框，这样后续筛选标记基因的表达不受目标基因启动子的影响而能够独立表达。但从进一步提高基因编辑和突变体制备效率的角度考虑，在本发明优选的实施例中，在上述质粒上，筛选标记基因的转录方向与向导RNA的DNA序列的转录方向相反。

将两者的转录方向设置为相反，是基于发明人在实验中发现，当两者的转录方向相同时，如果将筛选标记基因设计为具有独立启动子和终止子的完整表达框时，由于筛选标记基因位于向导RNA上游，筛选标记基因的终止子往往会导致其下游的向导RNA转录的提前终止，进而极大地降低基因编辑及相应突变体的发生概率。而将筛选标记基因与向导RNA的DNA序列设置在双链DNA的两条链上，转录方向相反，既便于选择稳定表达筛选标记基因的启动子(比如组成型启动子)，提高筛选标记基因在同源重组时置换不同位置的目的基因时均能稳定地高表达，而不受具体目标基因表达量的影响，从而大大提高突变体的筛选效率的同时，也能够稳定地表达向导RNA，使得基因编辑的优势与同源重组修复的优势能够相互结合，促进突变体产生和筛选鉴定的效率和通量。

上述试验起始细胞通过Cas蛋白和逆转录酶的表达后，逆转录酶以敲入片段为模板进行逆转录，得到向导RNA及与其共价连接的同源重组修复模板序列的片段，其中包含了筛选标记基因的完整表达框。基因编辑与同源重组修复两个过程中涉及的元件的表达采用诱导可控的方式进行，各元件具体采用的诱导型启动子可以相同，也可以不同。

在优选实施例中，能够表达Cas蛋白和逆转录酶的试验起始细胞，采用第一诱导型启动子驱动Cas蛋白和逆转录酶的表达。优选地，可基因编辑的细胞中，采用第二诱导型启动子驱动敲入片段的表达。优选地，第一诱导型启动子与第二诱导型启动子相同或不同。优选地，第一诱导型启动子与第二诱导型启动子各自独立地选自：P_GAL启动子或P_CUP1启动子；更优选地，P_GAL启动子选自P_GAL7、P_GAL7、P_GAL70中的一种或多种。

上述方法中，用于筛选阳性基因编辑突变体的筛选标记基因包括但不仅限于如下任意一种或多种：抗生素抗性基因和荧光标记基因(指自身能发荧光的基因)；优选地，抗生素抗性基因选自如下任意一种：Ble基因、Neo基因及kanMX基因；更优选为Ble基因；优选地，荧光标记基因选自如下任意一种：GFP基因、YFP基因、BFP基因、CFP基因、Luc基因、eGFP基因、及RFP基因。

需要说明的是，上述方法所适用的模式生物是同源重组发生频率较高的任意一种模式生物，既可以是原核生物，又可以是真核生物；真核生物为酿酒酵母。

模式生物为酵母，尤其是酿酒酵母时，抗生素抗性基因优选为Ble基因，本发明的实验发现，与传统的Neo抗性基因相比，Ble抗性基因具有基因长度短(更易于后续定点重组)以及抑制效果更好的优势。

上述敲入片段中，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列与向导RNA的DNA序列是顺次连接在驱动向导RNA表达的启动子和终止子之间的。其中，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列的设计与现有的靶向目标基因的同源重组修复模板序列的设计原则一致：在外源引入的筛选标记基因的两侧分别带上目标基因上、下游两侧的同源臂。具体地，按筛选标记基因的转录方向，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列依次包括：目标基因的上游同源臂、筛选标记基因的表达框及目标基因的下游同源臂。优选地，筛选标记基因的表达框包括依次连接的组成型启动子、筛选标记基因的编码区及终止子，如前述，带有独立的组成型启动子，能够使得筛选标记基因无论替换基因组任何位置的目标基因，都能够相对独立稳定地表达，从而减弱目标基因表达强弱对筛选标记基因表达影响，从而更有利于高效稳定地获得目标基因编辑突变体。更优选地，组成型启动子可以根据具体需要从已知的组成型启动子中进行合理选择。在本发明中，优选选自如下任意一种：P_TEF1、P_TPI1、P_PGK1、P_TDH3及P_ADH1。更优选地，终止子选自如下任意一种：TTEF1和T _CYC1。

在一种优选的实施例中，在上述质粒中，靶向目标基因的敲入片段按照从5’到3’的方向依次包括：驱动向导RNA的DNA序列表达的启动子、带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列、向导RNA的DNA序列以及向导RNA的DNA序列表达的终止子。

上述制备方法中，使可基因编辑的细胞启动基因编辑，得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体的步骤，就是诱导细胞自身启动基因编辑及同源重组修复的过程。因此该步骤优选包括：将可基因编辑的细胞置于含有诱导剂的培养基中，诱导可基因编辑的细胞启动基因编辑，基因编辑包括对目标基因进行双链断裂，以及利用带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列进行同源重组修复，得到修复细胞；利用筛选标记基因对修复细胞进行筛选，得到目标基因被筛选标记基因替换的基因编辑突变体。

需要说明的是，本发明中的筛选标记基因，与“引入密码子使目标基因提前终止的”目标基因不同，其特指与转化细胞的基因组不具有同源性，且能够筛选阳性转化子的外源基因。通过该外源的筛选标记基因的筛选特性，即可将阳性基因编辑突变体快速高效筛选出来。

优选地，采用Ble抗性基因在对阳性目标基因编辑突变体进行筛选时，对应的抗生素zeocin的浓度为125～200μg/mL，更优选为150μg/mL。

由于筛选标记基因是通过质粒导入试验起始细胞中的，因而在启动基因编辑之后，筛选标记基因通过同源重组修复置换目标基因后，细胞内若仍含有该质粒，则基于该筛选标记进行筛选有可能会筛选到质粒表达筛选标记基因，而目标基因未被筛选标记基因替换掉的假阳性突变体的情形，因此，在利用该筛选标记基因进行筛选之前，需要先从细胞中将该质粒去除。

因此，在本发明一种优选实施例中，进行同源重组修复的细胞中均含有质粒，该质粒包括带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列，在利用筛选标记基因对修复细胞进行筛选之前，该方法还包括去除修复细胞中的质粒；优选地，采用自然***丢失法或药物反筛的方法去除修复细胞中的质粒。以筛选标记基因为抗生素抗性基因为例，自然***丢失法将基因敲入阳性细胞进行质粒逐步去除的具体操作如下：将修复细胞接种于非选择培养基中进行培养，随着细胞的***，携带抗生素基因表达簇的质粒将逐步丢失，被整合到目标基因位点的抗生素抗性基因表达框将成为唯一的抗性蛋白表达来源，此时该细胞即为目标的基因编辑突变体。

上述方法中，试验起始细胞要能够表达Cas蛋白和逆转录酶，可以采用已有的能够表达Cas蛋白和逆转录酶的细胞，也可以构建具有该功能的细胞。在一种优选的实施例中，上述试验起始细胞通过以下方法获得：对含有Cas蛋白与逆转录酶的质粒进行酶切，得到表达Cas蛋白与逆转录酶的线性DNA片段；将线性DNA片段经同源重组导入营养缺陷型细胞内恢复缺陷型细胞的功能，得到试验起始细胞。优选地，缺陷型细胞为Δhis3酵母菌株；优选地，Cas蛋白为Cas9，更优选为S.pyogenes来源的Cas9；更优选地，Cas蛋白的启动子为P_GAL7；优选地，逆转录酶为E.coli来源的EC86RT；更优选地，逆转录酶的启动子为P_GAL70。

上述优选实施例中，含有Cas蛋白与逆转录酶的质粒可以从现有的基因编辑工具质粒中进行选择，比如pRS415、pRS416、pRS413、pRS425、pRS426质粒。上述缺陷型细胞根据模式生物物种的不同而有所不同。当模式生物为酵母，尤其是酿酒酵母时，缺陷型细胞选择Δhis3酵母菌株，此时线性DNA片段除了含有编码Cas蛋白和逆转录酶的基因外，还包括了编码HIS3蛋白的基因，因而通过同源重组将其转入Δhis3酵母菌株后，能够恢复该缺陷型酵母菌株的功能，使其能够在缺乏HIS3蛋白的培养基上生长。具体的Cas蛋白可以根据需要进行选择，本发明中优选能够切割双链DNA产生双链断裂(Double-strand break，DSB)的Cas9。而逆转录酶的具体基因也不限，只要能够启动向导RNA的逆转录酶即可。至于驱动Cas9和逆转录酶表达的启动子，只要是诱导型启动子(能够在特定的物理或化学信号的刺激下，大幅提高基因的转录水平。诱导型启动子能够同时控制基因的表达量和基因的表达时间)即可，可以相同也可以不同。本发明优选采用已有的基因编辑质粒中的成熟的诱导型启动子。以酿酒酵母为例，最严谨的诱导型启动子来自半乳糖诱导的启动子P_GAL1、P_GAL7和P_GAL10，该类启动子可以被半乳糖诱导，但在培养中需要先进行棉子糖饥饿处理后再进行半乳糖诱导。

在一优选的实施例中，模式生物为酵母，筛选标记基因为Ble基因，敲入片段(从5’端至3’端的方向)包括依次连接的：诱导型启动子P_GAL7、目标基因的下游同源臂、T_TEF1终止子、Ble基因的编码区及P_TEF1启动子、目标基因的上游同源臂、向导RNA的DNA序列及T_GAL7终止子。

上述优选实施例中，诱导型启动子均采用酵母半乳糖诱导型启动子，在Cas蛋白和逆转录酶表达后，即可在逆转录酶的作用下启动向导RNA的转录表达。上述连接顺序可以看出，抗生素抗性基因的转录方向与向导RNA的转录方向相反。诱导型启动子P_GAL7驱动关键元件(包括抗性基因Ble和sgRNA)的表达，抗性基因的表达框包括Ble的编码区、组成型启动子P_TEF1和对应的终止子T_TEF1，保证抗性基因在整合到基因组编辑位点后能稳定表达。而通过把抗性基因Ble的表达框的转录方向与P_GAL7驱动的sgRNA转录方向设计为相反的方向，可避免Ble表达框中的终止子T_TEF1引起的P_GAL7驱动的转录提前终止而让sgRNA无法表达的问题。

如上述，采用半乳糖诱导的诱导型启动子时，需要依次以棉子糖和半乳糖为碳源，诱导可基因编辑的细胞启动基因编辑；先在棉子糖为碳源的培养基上进行饥饿处理后，再更换为半乳糖为碳源的培养基，从而诱导相关蛋白表达，启动基因编辑及细胞自身的同源重组修复过程。在一种优选的实施例中，以棉子糖为碳源，诱导可基因编辑的细胞表达第一时长，进一步以半乳糖为碳源，诱导可基因编辑的细胞表达第二时长；更优选地，第一时长和第二时长各自独立地为16～48h，进一步优选为20～30h。

诱导型启动子P_GAL启动子在以棉子糖和半乳糖为碳源的培养基上会被激活，从而驱动下游基因的转录。先以棉子糖预激活P_GAL启动子，逐步完成碳源的替换。随后，替换成半乳糖为碳源的培养基，完全激活该启动子，使cas9蛋白、逆转录酶EC86RT表达元件被转录表达，同时，抗性基因转录元件和靶标目标基因的向导RNA(gRNA)被转录，从而激活整个***。在逆转录酶EC86RT的作用下，抗性基因簇被大量逆转录为单链DNA(ssDNA)并和gRNA偶联，形成引导-同源重组修复模板复合体。

在本发明第二种典型的实施例中，还提供了一种用于制备模式生物基因突变体的质粒，该质粒包括靶向目标基因的敲入片段，敲入片段包括共价连接的带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列。

优选地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列中，筛选标记基因的转录方向与向导RNA的转录方向相反；优选地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列的长度为800～2000bp；优选地，筛选标记基因为前述方法中的筛选标记基因；优选地，带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列为前述方法中的带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。

以下实施例描述了一种快速筛选酵母基因敲入突变体的方法，如图1所示，主要包括以下4个关键步骤：

1)将Cas9/EC86RT敲入酵母的基因组，构建出发菌株；

2)设计并构建抗性基因表达簇质粒，使其在酵母细胞中稳定表达；

3)使用特定的诱导物诱导基因编辑的发生；

4)利用抗生素对突变体进行快速和大量的筛选。

实施例1出发菌株的构建

通过酶切Cas9/EC86RT质粒(pXF259)获得cas9/EC86RT稳定转化的片段，通过酵母转化方法转化至Δhis3酵母菌株(BY4741)内，将cas9/EC86RT稳定转化的片段同源重组至his3基因位点使其恢复功能；再通过营养缺陷型培养基SC^-His培养基筛选出cas9/EC86RT被成功整合到基因组的转化子，通过菌落PCR手段鉴定转化是否成功。

具体如图2所示，通过酶切获得基因编辑功能元件的Cas9/EC86RT片段，通过酵母转化方法将Cas9/EC86RT片段同源重组至Δhis3酵母菌株的his3基因位点。重组后得到的出发菌株，在半乳糖(厂家：sigma，货号：59-23-4)的诱导下，P_GAL70/P_GAL7启动子分别驱动逆转录酶EC86RT和Cas9蛋白表达；无半乳糖时，则不表达，从而调控基因编辑过程。

其中，Cas9/EC86RT质粒酶切方法如下：

(a)将质粒稀释至200μg/μL；

(b)按照如下体系配置酶切反应：

质粒：5μL；

Buffer(厂家：thermo货号：00113437)：1μL；

Kpn I(厂家：thermo货号：FD0524)：1μL；

H₂O：3μL。

37℃反应4H。

(c)配置1％琼脂糖(厂家：bioswes，货号：142060)凝胶：

琼脂糖：1g；

TAE buffer：100mL。

(d)将酶切后的质粒进行恒压电泳：200V，20min；

(e)在蓝光下进行切胶；

(f)将胶块进行回收，回收得到的Cas9/EC86RT稳定转化的片段用于表1转化中的目标片段。回收方法如下(回收试剂厂家：AXYGen，货号：31216KE1)：

I，称重胶块；

II，以1mg＝1μL进行换算，加入三倍体积的溶胶缓冲液，37℃溶胶10min；

III，将溶液转移入收集柱内，8000rpm，离心30s；

IV，弃去收集液，向离心柱内加入200μL洗涤液，8000rpm，离心30s；

V，弃去收集液，将离心柱置于离心机内，8000rpm，离心2min；

VI，向离心柱中间位置，加入10μL去离子水，静置2min；

VII，将离心柱置于新的EP管内，12000rpm，离心2min；

VIII，取1μL收集液，测浓度；

酵母转化方法如下：

(a)挑取野生型酵母单克隆(Δhis3酵母菌株)，接种于2mL酵母富集培养基YPD(厂家：Coolaber，货号：PM2010)中，30℃转鼓培养24小时。

(b)测量菌液吸光度，取适量菌液接种于含有20mL YPD的三角瓶中，使每毫升菌液吸光值为0.1，30℃摇床200rpm培养至每毫升菌液吸光值为0.6。

(d)加入10mL重悬细胞，2000rpm，离心10min，去上清收集菌液。

(e)加入10mL 0.1M LioAc(厂家：sigma，货号：546-89-4)重悬细胞，2000rpm，离心10min，去上清收集菌液。

(f)加入10mL 0.1M LioAc重悬细胞，获得感受态细胞，需全程置于冰上。

(g)准备转化反应管，每管都包含如下表1的组分。

表1

(h)振荡混匀，小心添加100μL感受态细胞于最上层。

(i)颠倒混匀，30℃培养30min。

(j)加50μL DMSO(厂家：sigma，货号：67-68-5)，迅速颠倒混匀。

(k)42℃热激15min，置于冰上1min。

(l)8000rpm离心30s，去上清。

(m)用400μL5 mM CaCl₂(厂家：sigma，货号：10043-52-4)重悬细胞，室温培养10min。

(n)取50μL菌液涂于缺陷培养基(-His，厂家：Sunrise Science.，货号：1705-300)上，培养48小时。

(o)获得长有单克隆的培养基需及时进行后续实验，否则于4℃保存。

(p)筛选含有目标片段菌株的方法：挑取待测单克隆，溶于50μL ddH₂O中，取25μL菌液溶于25μL 40mM NaOH中，于99℃裂解15min，4℃静置1小时。取2.5μL上清液(注意不要吸到沉淀)，用于菌落PCR。

(q)菌落PCR，配置反应体系如下表2所示，循环温度设置如下表3所示。

表2

表2中的引物序列如下：

前引物：TGTGGGACAAGGGTAGGGAT(SEQ ID NO：1)；

后引物：GGCGTGAATGTAAGCGTGAC(SEQ ID NO：2)。

表3

实施例2抗性基因表达簇的设计和转化

组成型启动子TEF1启动子能够稳定地驱动抗性基因的表达，避免各基因座启动子不同驱动强度造成的抗性基因表达的差异。TEF1启动子对应的TEF1终止序列可以有效终止抗性基因的转录。

本实施例中将抗性基因表达簇进行反向互补设定，从而避免TEF1终止序列对后续sgRNA元件的转录终止。

如图3A所示，抗生素抗性基因表达框设计：诱导型启动子P_GAL7驱动关键元件(包括抗性基因Ble和sgRNA)的表达。抗性基因的表达框包括：Ble的编码区、组成型启动子P_TEF1和对应的终止子T_TEF1，保证抗性基因在整合到基因组编辑位点后能稳定表达；通过把抗性基因Ble的表达框的转录方向与P_GAL7驱动的sgRNA转录方向设计为相反的方向，可避免Ble表达框中的终止子T_TEF1引起的P_GAL7驱动的转录提前终止而让sgRNA无法表达的问题。

本实施例利用醋酸锂法将抗性基因质粒导入酵母中，利用质粒上的Ura表达簇和SC-Ura培养基筛选出阳性菌株，具体过程如下：

(a)按照图3A设计方案，分别合成靶向ade1和ade2基因的两个质粒(具体序列分别见序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)；

(b)利用醋酸锂法将质粒分别导入实施例1获得的出发菌株(阴性株)中，以便构建阳性株；

(c)将菌株接种于SC^-His-Ura培养基中培养24H；

(d)从0.1OD起始，以H₂O十倍梯度稀释菌株，稀释五个梯度；

(e)取各浓度梯度菌液，点板于SC^-His-Ura+抗生素平板上，平板配方见表4；

(f)将平板置于30°培养3天后观察。

表4

试剂名称	每500mL中加入
		两倍浓度酵母缺陷培养基(2xSC<sup>-His-Ura</sup>)	250mL
20％葡萄糖溶液	50mL
		1M Tris-HCl pH7.5(厂家：sigma，货号：1185-53-1)	50mL
4.2％琼脂(厂家：Diamond，货号:9002-18-0)	150mL
		Zeocin(100mg/mL)(厂家：Invitrogen，货号：R250-01)	750μL

结果如图3B所示，出发菌株(阴性菌)在各浓度梯度上均不能生长，而转化有抗性基因表达簇的菌株(阳性菌)在各菌液浓度梯度下均生长良好，说明基因表达簇成功、有效表达了。

实施例3诱导基因编辑

诱导型启动子P_GAL启动子在以半乳糖和棉子糖(厂家：Alfa Aesar，货号：A18313)为碳源的培养基上会被激活，从而驱动下游基因的转录。本发明中，先以棉子糖预激活P_GAL启动子，逐步完成碳源的替换。随后，替换成半乳糖为碳源的培养基，完全激活该启动子，使Cas9、EC86RT表达元件被转录表达，同时，抗性基因转录元件和靶标目标基因的gRNA被转录，从而激活整个***。在逆转录酶EC86RT的作用下，抗性基因簇被大量逆转录为单链DNA(ssDNA)并和gRNA偶联，形成引导-修复模板复合体。

基因编辑诱导方法如下：

(a)菌株的活化：

将实施例2平板中获得的两种阳性菌株单克隆转接入SC^-His-Ura液体培养基中，培养基配方示例见表5，30℃活化24H。

(b)菌株的诱导：

将活化后的菌株接种入以2％(工作浓度或终浓度)棉子糖作为碳源的SC^-His-Ura液体培养基中，菌液起始浓度为0.1OD，30℃诱导24H。

(c)基因编辑诱导：

将棉子糖诱导后的菌液以0.1OD的浓度接入以2％半乳糖为碳源的SC^-His-Ura液体培养基中，30℃诱导24H，诱导结束后，重复该诱导一次。

酵母培养所用培养基配方如表5所示。

表5

试剂名称	每500mL中加入
		两倍浓度酵母缺陷培养基(2x SC<sup>-His-Ura</sup>)	250mL
20％碳源(葡萄糖、棉子糖、半乳糖)溶液	50mL
		ddH<sub>2</sub>O	200mL

实施例4基因编辑效率的测试

本实施例以ade1和ade2基因的编码区域为靶标位点为例，测试目标抗生素基因***的效率。ade1和ade2基因表达的破坏均会导致酵母细胞呈现暗红色，从而可以实现对于基因编辑的效果的可视化评价。本实施例可将图3A设计所示的抗生素基因Ble片段特异性地***到基因的编码区，从而达到目标基因被敲入和突变菌株获得抗生素抗性的双重目的。

基因编辑效率测试操作步骤如下：

(a)将实施例3中诱导后的菌液稀释至10⁴个/mL浓度，取30μL菌液溶涂布在SC^{-His-Ura-1/2Ade2}：配方见表6，即接种3000个菌。

(b)30℃培养两天后观察克隆颜色，统计红色克隆和非红色克隆的数目，计算基因编辑效率，基因编辑效率＝红色克隆数目/(红色克隆数目+非红色克隆数目)。结果如图4A所示，ade2基因敲入组菌群中有15％的基因编辑克隆(即ade2基因的编辑效率为15％)，而ade1基因的编辑效率则接近100％。

(c)取红色克隆，采用图4B所示的靶标ade2基因座的特异性引物鉴定基因敲入的比例，计算红色克隆基因敲入效率，红色克隆基因敲入效率＝PCR验证证明存在基因敲入的克隆数目/PCR验证的总克隆数目。

结果如图4C所示，ade2基因编辑菌群中有97.7％的基因敲入菌株。综合计算，总的基因敲入效率(基因编辑效率×红色克隆基因敲入效率)接近15％，远高于一般的同源重组(0.1％)，提高了2个数量级。

靶标ade2基因座的特异性引物如下：

F1:CAATCAAATCTTTTCCCGGTTGTGG(SEQ ID NO：5)；

F2:GGATGTGATGTGAGAACTGTATCC(SEQ ID NO：6)；

R:GGCGTTCGTTGTAATGGTGGAG(SEQ ID NO：7)。

表6

试剂名称	每500mL中加入
		两倍浓度酵母缺陷培养基(2x SC<sup>-His-Ura-1/2Ade2</sup>)	250mL
20％碳源(葡萄糖)(厂家：BBI，货号：50-99-7)溶液	50mL
		4％琼脂	200mL

此外，效率的差异可能和对于基因未知的染色体结构、gRNA的序列设计有关，通过优化，可以达到接近100％的高效率编辑。为例验证本发明中基因编辑事件的准确性，选取ade2基因座作为靶标位点，基于特异性引物的PCR验证，证明了Ble基因被特异性地***到了基因组的指定位点，即编辑的准确率为97.7％。并且对于ade2基因座中***位点的测序分析测序显示接口处均无突变(如图5所示)。

实施例5抗生素筛选浓度的选定

在组成型启动子驱动下的抗性基因的表达基本稳定，通过特定浓度的抗生素可以将表达抗生素基因的酵母突变株筛选出来。本实施例中使用的抗生素为zeocin。由于质粒上的抗性基因表达簇也可以正常表达，会影响Ble基因敲入后目标突变体菌株的筛选，因此需要在筛选前将细胞内的质粒去除。本实施例主要采用自然***丢失法将基因敲入阳性菌株进行质粒逐步去除：将菌株接种于非选择培养基SC培养基中进行培养，随着细胞的***，携带抗生素基因表达簇的质粒将逐步丢失，被整合到ade2位点的Ble基因表达框将成为唯一的抗性蛋白表达来源，该菌株即为目标的酵母基因编辑突变体。本实施例进一步测试了抗生素zeocin对于目标的酵母基因编辑突变体、野生型菌株和只发生ade2基因敲入菌株的作用效果。

1.敲入目标基因的酵母基因编辑突变体获得方法如下：

(a)将实施例4中得到的阳性编辑菌群接入SC^-His培养基进行活化，配方如前，30℃培养24H；

(b)测菌的OD值，以SC^-His培养基稀释至0.1OD，如前培养24H；

(c)重复上述步骤两次；

(d)如前述方式，将菌稀释至SC^-His+FOA(厂家：US Biological life science.，货号：L19092703)培养基中，如前培养24H；

(e)测菌液OD，以1OD＝10⁷个/mL的计算方式，将菌液10倍梯度稀释至10⁴个/mL，取30μL，即300个菌涂布SC^-His+FOA的平板，30℃培养48H；

(f)挑取8个克隆，接种于SC^-His培养基，活化后在SC^-His-Ura平板上划线，培养基配方如前，30℃培养48H。

(g)如前述方法，将挑取的克隆以ade2基因座特异的引物F1/R(同实施例4所示引物)进行扩增，如图6A显示的是F1/R引物对可以扩增出基因敲入的特异性片段，如图6B所示，8个克隆均可以扩增出阳性条带，说明所有克隆均是基因敲入的菌株。

(h)如图6C所示，8株菌株均不能在SC^-URA培养基上生长，说明携带URA表达簇的质粒已被去除，所得到的8个菌株均为Ble基因***单拷贝的菌株。

2.针对目标突变体的抗生素浓度选择的操作方法如下：

(a)将出发菌株(实施例1获得的菌株)、基因敲除菌株(实施例4步骤c获得的发生了基因敲除但是未发生基因敲入的菌株)，单拷贝基因敲入株(本实施例上述步骤h获得的Ble基因***单拷贝的菌株)接种于SC^-HIS培养基进行活化，培养基配方如前。

(b)用H₂O梯度稀释每个菌株。

(c)取10μL各菌各梯度的稀释液，分别依次点在SC^-His+zeocin的平板上，配方如表7所示，将平板置于30°培养5天。

(d)如图7，150μg/mL的zeocin浓度已经有效抑制出发菌株，基因敲除菌株的生长，同时对单拷贝基因敲入株的生长没有影响，说明该浓度的抗生素是有效的、安全的。

表7SC^-His+zeocin平板配方

试剂名称	每500mL中加入
		两倍浓度酵母缺陷培养基(2xSC<sup>-His</sup>)	250mL
20％葡萄糖溶液	50mL
		1M Tris-HCl pH 7.5	50mL
4.2％琼脂	150mL
		Zeocin(100mg/mL)	750μL

实施例6筛选有效性的验证

本发明有效性的关键是通过zeocin抗性筛选后获得目标的酵母基因编辑突变体。在诱导基因编辑发生的步骤后，培养基内的菌群为混合菌群，包含：(1)ble基因被成功***基因组特定位的目标突变体菌株；(2)只发生基因编辑而ble基因未被成功***的非目标菌株；(3)未发生任何基因编辑的非目标菌株。因为上述菌株(2)和(3)不具有抗生素抗性，本实施例可利用抗生素筛选实现对目标酵母突变体菌株(1)的筛选。具体步骤如下：

(a)质粒丢失步骤：为了保证筛选的效果，必须将包含抗性基因的质粒去除，本实施例采用自然***丢失和施加选择压(5-FOA对于携带Ura基因质粒具有反筛作用)相结合的方式使实施例4中得到的阳性细胞丢失质粒(如图8A所示)。

(b)抗生素筛选步骤：将菌群涂布在含有150μg/μL zeocin的平板(配方见表8)上，进行筛选，如图8B所示，抗性平板上长出了许多具有抗性的克隆，证明基于zeocin筛选的有效性。

(c)质粒丢失验证步骤：所有在抗性平板上生长出的克隆均为阳性编辑的红色克隆，对所有克隆进行印板，转印至SC^-URA的平板上，如图8C所示，发现克隆在缺少尿嘧啶的培养基上不能生长，证明质粒已经完全丢失，抗性基因Ble的表达仅来自于敲入基因组的Ble表达簇。因此，ade2基因被成功编辑，且该方法能够有效地筛选出目标酵母基因编辑突变体，达到目标基因被敲入和突变菌株获得抗生素抗性的双重目的。

(d)基因编辑突变体的确认步骤：随机挑取18个克隆，以ade2基因座特异的引物F1/R(同实施例4所示引物)进行PCR扩增对克隆进行鉴定。结果如图9所示，所有克隆均能扩增出阳性条带，表明这些随机挑选的克隆均为基因敲入阳性的菌株，证明本实施例可以达到预期目的和效果。

表8

试剂名称	每500mL中加入
		两倍浓度酵母缺陷培养基(2×SC<sup>-3</sup>)	250mL
20％葡萄糖溶液	50mL
		1M Tris-HCl pH7.5	50mL
4.4％琼脂	145mL
		Zeocin(100mg/mL)	150μL

实施例7抗生素基因的选择

抗生素对于筛选的效果起着决定性的作用，本实施例比较了酵母中的两种抗生素基因Ble和Neo基因，分别测试对应抗生素对酵母的筛选效果。

(a)按照图3A设计方案，合成Ble和Neo基因表达质粒，其中含Ble基因表达质粒的序列同实施例2，含Neo基因表达质粒的序列见序列表中SEQ ID NO：8；

(b)利用醋酸锂法将两种质粒分别导入实施例1中获得的出发菌株(阴性株)中，构建阳性株；

(c)将菌株接种于SC^-His-Ura培养基中培养24H；

(d)从OD＝0.1起始，以H₂O十倍梯度稀释菌株，稀释五个梯度；

(e)取各浓度梯度菌液，分别点板于SC^-His-Ura+zeocin平板和SC^-His-Ura+G418上，平板配方见表9；

(f)将平板置于30℃培养3天后观察。

表9

试剂名称	每500mL中加入
		两倍浓度酵母缺陷培养基(2xSC<sup>-His-Ura</sup>)	250mL
20％葡萄糖溶液	50mL
		1M Tris-HCl pH7.5	50mL
4.2％琼脂	150mL
		抗性素(100mg/mL)	750μL

结果如图10A和图10B所示，Neo基因对应的抗生素G418的筛选效果不如Ble基因对应的抗生素zeocin。未达到完全的抑制效果，G418所需的药物浓度较高(约400μg/ml)，且容易有突变体的产生。而抗生素zeocin的抑制效果明显且所需浓度更低(约100-150μg/ml)，携带Ble抗性基因的酵母菌在筛选浓度下生长良好。

实施例8抗性基因表达簇中启动子和终止子的选择

本实施例测试了抗性基因表达簇中引入启动子和终止子的重要性。本实施例设计和比较了以ade1基因作为靶标，测试抗性基因表达框中无启动子和终止序列的实验组(P₀/T₀)与抗性基因表达框中携带启动子和终止序列的对照组(P_TEF1/T_TEF1)的编辑效率。与图3A中拥有启动子和终止序列的对照组相比，实验组(P₀/T₀)区别在于缺失了组成型启动子P_TEF1和终止子T_TEF1，抗性基因Ble的表达框的转录方向与向导RNA的DNA序列转录方向相同，其余条件和诱导过程与对照组完全相同。

(a)参照实施例2构建质粒、菌株；

(b)参照实施例3进行基因编辑的诱导；

(c)依照实施例4进行基因编辑效率的检测，结果如图11所示，P₀/T₀组靶标ade1的基因编辑的效率有大幅的下降，有无启动子对编辑效率存在显著影响。

(d)依照实施例6对阳性编辑菌株进行筛选，结果如图12所示，同样涂布30000个菌，实验组P₀/T₀未能筛选到任何阳性克隆，这说明启动子和终止序列对突变株的筛选具有重要的意义，在本实施例涉及的方法中具有不可或缺的作用。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

通过结合基因编辑和酵母同源重组方法的优势，提供了一种简单、可靠、高效的酿酒酵母基因编辑突变体筛选方法，可将抗生素基因Ble的表达框高效、定点地整合到基因组中的指定位点，获得基因编辑的目标突变体(最高的编辑效率和准确率接近100％)。

进一步地，本发明确定了Ble基因作为本发明中用于筛选用途的抗性基因，与传统的Neo抗性基因相比，Ble基因具有基因长度短(易于后续定点重组)和抑制效果更好的优势。值得指出的是，本发明巧妙地设计了表达框(抗性基因Ble的表达框的转录方向与P_GAL7驱动的sgRNA转录方向相反)，即能保证Ble基因在***基因组后能稳定表达，也能避免Ble基因表达框中的终止子T_TEF1引起的P_GAL7驱动的转录提前终止而使得sgRNA无法表达的问题。

而且，与单纯的酵母同源重组方法相比，本发明的方法显著提升了编辑效率(在无筛选压力的情况下，ade1基因的编辑效率约为98％，比传统的同源重组方法效率约高100倍以上)，极大的提高得到阳性株的概率以及缩短了其周期。较eMAGE基因编辑技术，本发明的方法所能编辑位点的可选择性很广，几乎能编辑酵母基因组中的任意位置。相较于CRISPR/Cas基因编辑技术，本发明利用细胞内供体片段单链化以及细胞内扩增技术，极大的提高了细胞内的基因编辑供体的浓度，极大促进了基因编辑的发生。同时，由于抗性基因的存在，本发明利用对应的抗生素，可以快速、有效的筛选出目标菌株，不依赖于测序等一系列下游分析手段分析。

综上可知，本发明的方法实现了基因编辑技术与酵母突变体筛选技术的高效偶联，能简单、快速、有效地筛选酿酒酵母基因敲除突变体，与传统方法相比，不依赖于PCR、测序等一系列下游分析手段来判断突变体是否成功获得，只需通过简单地抗性筛选就能获得目标突变体。因而，该方法的开发和建立能为基于酵母基因敲除突变体研究的科学发现和下游应用带来重大的益处。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒

<130> PN137658HDSM

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 前引物

<400> 1

tgtgggacaa gggtagggat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 后引物

<400> 2

ggcgtgaatg taagcgtgac 20

<210> 3

<211> 6239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(111)

<223> 靶向ade1基因的质粒中gRNA的DNA序列

<400> 3

caagtgcaaa gattatgcta gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat 60

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tgatggccgg 120

catggtccca gcctcctcgc tggcgccggc tgggcaacac cttcgggtgg cgaatgggac 180

ttaaagaaag tggaatattc attcatatca tattttttct attaactgcc tggtttcttt 240

taaatttttt attggttgtc gacttgaacg gagtgacaat atatatatat atatatttaa 300

taatgacatc attatctgta aatctgattc ttaatgctat tctagttatg taagagtggt 360

cctttccata aaaaaaaaaa aaaagaaaaa agaattttag gaatacaatg cagcttgtaa 420

gtaaaatctg gaatattcat atcgccacaa cttcttatgc ttataaaagc actaatgcct 480

gaatttatgt tgaaaatatg tgtcacaaat aaagaaactg tgacatctga cacatttcca 540

cgtacccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca 600

acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 660

tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 720

cagcctgaat ggcgaatggc gcgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 780

ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 840

tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 900

gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta 960

gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 1020

ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 1080

ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 1140

tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc 1200

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat agggtaataa 1260

ctgatataat taaattgaag ctctaatttg tgagtttagt atacatgcat ttacttataa 1320

tacagttttt tagttttgct ggccgcatct tctcaaatat gcttcccagc ctgcttttct 1380

gtaacgttca ccctctacct tagcatccct tccctttgca aatagtcctc ttccaacaat 1440

aataatgtca gatcctgtag agaccacatc atccacggtt ctatactgtt gacccaatgc 1500

gtctcccttg tcatctaaac ccacaccggg tgtcataatc aaccaatcgt aaccttcatc 1560

tcttccaccc atgtctcttt gagcaataaa gccgataaca aaatctttgt cgctcttcgc 1620

aatgtcaaca gtacccttag tatattctcc agtagatagg gagcccttgc atgacaattc 1680

tgctaacatc aaaaggcctc taggttcctt tgttacttct tctgccgcct gcttcaaacc 1740

gctaacaata cctgggccca ccacaccgtg tgcattcgta atgtctgccc attctgctat 1800

tctgtataca cccgcagagt actgcaattt gactgtatta ccaatgtcag caaattttct 1860

gtcttcgaag agtaaaaaat tgtacttggc ggataatgcc tttagcggct taactgtgcc 1920

ctccatggaa aaatcagtca agatatccac atgtgttttt agtaaacaaa ttttgggacc 1980

taatgcttca actaactcca gtaattcctt ggtggtacga acatccaatg aagcacacaa 2040

gtttgtttgc ttttcgtgca tgatattaaa tagcttggca gcaacaggac taggatgagt 2100

agcagcacgt tccttatatg tagctttcga catgatttat cttcgtttcc tgcaggtttt 2160

tgttctgtgc agttgggtta agaatactgg gcaatttcat gtttcttcaa cactacatat 2220

gcgtatatat accaatctaa gtctgtgctc cttccttcgt tcttccttct gttcggagat 2280

taccgaatca aaaaaatttc aaagaaaccg aaatcaaaaa aaagaataaa aaaaaaatga 2340

tgaattgaat tgaaaagctg tggtatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 2400

atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt 2580

ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttaggacgga tcgcttgcct gtaacttaca 2640

cgcgcctcgt atcttttaat gatggaataa tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt 2700

ttatgttttg tatttggatt ttagaaagta aataaagaag gtagaagagt tacggaatga 2760

agaaaaaaaa ataaacaaag gtttaaaaaa tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata 2820

tttattagac aagaaaagca gattaaatag atatacattc gattaacgat aagtaaaatg 2880

taaaatcaca ggattttcgt gtgtggtctt ctacacagac aagatgaaac aattcggcat 2940

taatacctga gagcaggaag agcaagataa aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga 3000

gtcttttaca tcttcggaaa acaaaaacta ttttttcttt aatttctttt tttactttct 3060

atttttaatt tatatattta tattaaaaaa tttaaattat aattattttt atagcacgtg 3120

atgaaaagga cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 3180

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 3240

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 3300

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 3360

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 3420

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 3480

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 3540

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 3600

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 3660

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 3720

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 3780

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 3840

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 3900

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 3960

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 4020

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 4080

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 4140

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 4200

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 4260

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 4320

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 4380

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 4440

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 4500

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 4560

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 4620

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 4680

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 4740

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 4800

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 4860

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 4920

tttgctggcc ttttgctcaa gtagaggggg taatttttcc cctttatttt gttcatacat 4980

tcttaaattg ctttgcctct ccttttggaa agctatactt cggagcactg ttgagcgaag 5040

gctcattaga tatattttct gtcattttcc ttaacccaaa aataagggaa agggtccaaa 5100

aagcgctcgg acaactgttg accgtgatcc gaaggactgg ctatacagtg ttcacaaaat 5160

agccaagctg aaaataatgt gtagctatgt tcagttagtt tggctagcaa agatataaaa 5220

gcaggtcgga aatatttatg ggcattatta tgcagagcat caacatgata aaaaaaaaca 5280

gttgaatatt ccctcaaaag atggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg 5340

ggcaacacct tcgggtggcg aatgggactt atgcgcaccc ttagcgagag gtttatcatt 5400

aaggtcaacc tctggatgtt gtttcggcat cctgcattga atctgagtta ctgtctgttt 5460

tcctgctaga gtggcagaac tggctgtaaa actgtactcc aagtgcaaag attatgcagt 5520

atagcgacca gcattcacat acgattgacg catgatatta ctttctgcgc acttaacttc 5580

gcatctgggc agatgatgtc gaggcgaaaa aaaatataaa tcacgctaac atttgattaa 5640

aatagaacaa ctacaatata aaaaaactat acaaatgaca agttcttgaa aacaagaatc 5700

tttttattgt cagtactgat cagtcctgct cctcggccac gaagtgcacg cagttgccgg 5760

ccgggtcgcg cagggcgaac tcccgccccc acggctgctc gccgatctcg gtcatggccg 5820

gcccggaggc gtcccggaag ttcgtggaca cgacctccga ccactcggcg tacagctcgt 5880

ccaggccgcg cacccacacc caggccaggg tgttgtccgg caccacctgg tcctggaccg 5940

cgctgatgaa cagggtcacg tcgtcccgga ccacaccggc gaagtcgtcc tccacgaagt 6000

cccgggagaa cccgagccgg tcggtccaga actcgaccgc tccggcgacg tcgcgcgcgg 6060

tgagcaccgg aacggcactg gtcaacttgg ccatcgaccc tccgcctccg ctaccgcctc 6120

caccagagcc tcctccaccc tctagtgagt gtgaactaag gagaagggca tcatcatcgc 6180

agacactaaa ttcgaattcg gtattaggaa acccgtttct tctgacgtaa gggtgcgca 6239

<210> 4

<211> 6517

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(109)

<223> 靶向ade2基因的质粒中gRNA的DNA序列

<400> 4

attaacgaaa ttgccccagt ttcagagcta tgctggaaac agcatagcaa gttgaaataa 60

ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttg atggccggca 120

tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacacct tcgggtggcg aatgggactt 180

aaagaaagtg gaatattcat tcatatcata ttttttctat taactgcctg gtttctttta 240

aattttttat tggttgtcga cttgaacgga gtgacaatat atatatatat atatttaata 300

atgacatcat tatctgtaaa tctgattctt aatgctattc tagttatgta agagtggtcc 360

tttccataaa aaaaaaaaaa aagaaaaaag aattttagga atacaatgca gcttgtaagt 420

aaaatctgga atattcatat cgccacaact tcttatgctt ataaaagcac taatgcctga 480

atttatgttg aaaatatgtg tcacaaataa agaaactgtg acatctgaca catttccacg 540

tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac 600

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 660

tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 720

gcctgaatgg cgaatggcgc gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 780

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 840

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 900

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 960

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1020

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1080

cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1140

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcct 1200

gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatag ggtaataact 1260

gatataatta aattgaagct ctaatttgtg agtttagtat acatgcattt acttataata 1320

cagtttttta gttttgctgg ccgcatcttc tcaaatatgc ttcccagcct gcttttctgt 1380

aacgttcacc ctctacctta gcatcccttc cctttgcaaa tagtcctctt ccaacaataa 1440

taatgtcaga tcctgtagag accacatcat ccacggttct atactgttga cccaatgcgt 1500

ctcccttgtc atctaaaccc acaccgggtg tcataatcaa ccaatcgtaa ccttcatctc 1560

ttccacccat gtctctttga gcaataaagc cgataacaaa atctttgtcg ctcttcgcaa 1620

tgtcaacagt acccttagta tattctccag tagataggga gcccttgcat gacaattctg 1680

ctaacatcaa aaggcctcta ggttcctttg ttacttcttc tgccgcctgc ttcaaaccgc 1740

taacaatacc tgggcccacc acaccgtgtg cattcgtaat gtctgcccat tctgctattc 1800

tgtatacacc cgcagagtac tgcaatttga ctgtattacc aatgtcagca aattttctgt 1860

cttcgaagag taaaaaattg tacttggcgg ataatgcctt tagcggctta actgtgccct 1920

ccatggaaaa atcagtcaag atatccacat gtgtttttag taaacaaatt ttgggaccta 1980

atgcttcaac taactccagt aattccttgg tggtacgaac atccaatgaa gcacacaagt 2040

ttgtttgctt ttcgtgcatg atattaaata gcttggcagc aacaggacta ggatgagtag 2100

cagcacgttc cttatatgta gctttcgaca tgatttatct tcgtttcctg caggtttttg 2160

ttctgtgcag ttgggttaag aatactgggc aatttcatgt ttcttcaaca ctacatatgc 2220

gtatatatac caatctaagt ctgtgctcct tccttcgttc ttccttctgt tcggagatta 2280

ccgaatcaaa aaaatttcaa agaaaccgaa atcaaaaaaa agaataaaaa aaaaatgatg 2340

aattgaattg aaaagctgtg gtatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 2400

agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 2460

tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 2520

tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 2580

aggttaatgt catgataata atggtttctt aggacggatc gcttgcctgt aacttacacg 2640

cgcctcgtat cttttaatga tggaataatt tgggaattta ctctgtgttt atttattttt 2700

atgttttgta tttggatttt agaaagtaaa taaagaaggt agaagagtta cggaatgaag 2760

aaaaaaaaat aaacaaaggt ttaaaaaatt tcaacaaaaa gcgtacttta catatatatt 2820

tattagacaa gaaaagcaga ttaaatagat atacattcga ttaacgataa gtaaaatgta 2880

aaatcacagg attttcgtgt gtggtcttct acacagacaa gatgaaacaa ttcggcatta 2940

atacctgaga gcaggaagag caagataaaa ggtagtattt gttggcgatc cccctagagt 3000

cttttacatc ttcggaaaac aaaaactatt ttttctttaa tttctttttt tactttctat 3060

ttttaattta tatatttata ttaaaaaatt taaattataa ttatttttat agcacgtgat 3120

gaaaaggacc caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 3180

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 3240

taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 3300

tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 3360

gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 3420

atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 3480

ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 3540

cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 3600

ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 3660

aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 3720

ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 3780

gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 3840

ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 3900

gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 3960

ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 4020

tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 4080

cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 4140

tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 4200

atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 4260

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 4320

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 4380

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 4440

cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 4500

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 4560

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 4620

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 4680

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 4740

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 4800

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 4860

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 4920

tgctggcctt ttgctcaagt agagggggta atttttcccc tttattttgt tcatacattc 4980

ttaaattgct ttgcctctcc ttttggaaag ctatacttcg gagcactgtt gagcgaaggc 5040

tcattagata tattttctgt cattttcctt aacccaaaaa taagggaaag ggtccaaaaa 5100

gcgctcggac aactgttgac cgtgatccga aggactggct atacagtgtt cacaaaatag 5160

ccaagctgaa aataatgtgt agctatgttc agttagtttg gctagcaaag atataaaagc 5220

aggtcggaaa tatttatggg cattattatg cagagcatca acatgataaa aaaaaacagt 5280

tgaatattcc ctcaaaagat ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg 5340

caacaccttc gggtggcgaa tgggacttat gcgcaccctt agcgagaggt ttatcattaa 5400

ggtcaacctc tggatgttgt ttcggcatcc tgcattgaat ctgagttact gtctgttttc 5460

ctgctggaaa tgttctattt agaaacaggg gaattgctta ttaacgaaat tgcccagtat 5520

agcgaccagc attcacatac gattgacgca tgatattact ttctgcgcac ttaacttcgc 5580

atctgggcag atgatgtcga ggcgaaaaaa aatataaatc acgctaacat ttgattaaaa 5640

tagaacaact acaatataaa aaaactatac aaatgacaag ttcttgaaaa caagaatctt 5700

tttattgtca gtactgatca gtcctgctcc tcggccacga agtgcacgca gttgccggcc 5760

gggtcgcgca gggcgaactc ccgcccccac ggctgctcgc cgatctcggt catggccggc 5820

ccggaggcgt cccggaagtt cgtggacacg acctccgacc actcggcgta cagctcgtcc 5880

aggccgcgca cccacaccca ggccagggtg ttgtccggca ccacctggtc ctggaccgcg 5940

ctgatgaaca gggtcacgtc gtcccggacc acaccggcga agtcgtcctc cacgaagtcc 6000

cgggagaacc cgagccggtc ggtccagaac tcgaccgctc cggcgacgtc gcgcgcggtg 6060

agcaccggaa cggcactggt caacttggcc atggttgttt atgttcggat gtgatgtgag 6120

aactgtatcc tagcaagatt ttaaaaggaa gtatatgaaa gaagaacctc agtggcaaat 6180

cctaaccttt tatatttctc tacaggggcg cggcgtgggg acaattcaac gcgtctgtga 6240

ggggagcgtt tccctgctcg caggtctgca gcgaggagcc gtaatttttg cttcgcgccg 6300

tgcggccatc aaaatgtatg gatgcaaatg attatacatg gggatgtatg ggctaaatgt 6360

acgggcgaca gtcacatcat gcccctgagc tgcgcacgtc aagactgtca aggagggtat 6420

tctgggcctc catgtcaggc ctcacaactc tggacattat accattgatg cttgcgtcac 6480

ttcaggaaac ccgtttcttc tgacgtaagg gtgcgca 6517

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> 靶标ade2基因座的特异性引物F1

<400> 5

caatcaaatc ttttcccggt tgtgg 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> 靶标ade2基因座的特异性引物F2

<400> 6

ggatgtgatg tgagaactgt atcc 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 靶标ade2基因座的特异性引物R

<400> 7

ggcgttcgtt gtaatggtgg ag 22

<210> 8

<211> 6954

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(815)

<223> 含Neo基因表达质粒中的Neo抗性基因序列

<400> 8

actgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat atcaggatta 60

tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag 120

ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata 180

caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg 240

acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca 300

ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt 360

gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga 420

atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc acctgaatca 480

ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttgccgggga tcgcagtggt gagtaaccat 540

gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc 600

cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc 660

agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc 720

ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt ggaatttaat 780

cgcggcctcg aaacgtgagt cttttcctta cccatatggt tgtttatgtt cggatgtgat 840

gtgagaactg tatcctagca agattttaaa aggaagtata tgaaagaaga acctcagtgg 900

caaatcctaa ccttttatat ttctctacag gggcgcggcg tggggacaat tcaacgcgtc 960

tgtgagggga gcgtttccct gctcgcaggt ctgcagcgag gagccgtaat ttttgcttcg 1020

cgccgtgcgg ccatcaaaat gtatggatgc aaatgattat acatggggat gtatgggcta 1080

aatgtacggg cgacagtcac atcatgcccc tgagctgcgc acgtcaagac tgtcaaggag 1140

ggtattctgg gcctccatgt caggcctcac aactctggac attataccat tgatgcttgc 1200

gtcacttcag gaaacccgtt tcttctgacg taagggtgcg caattaacga aattgcccca 1260

gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac 1320

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tgatggccgg catggtccca gcctcctcgc 1380

tggcgccggc tgggcaacac cttcgggtgg cgaatgggac ttaaagaaag tggaatattc 1440

attcatatca tattttttct attaactgcc tggtttcttt taaatttttt attggttgtc 1500

gacttgaacg gagtgacaat atatatatat atatatttaa taatgacatc attatctgta 1560

aatctgattc ttaatgctat tctagttatg taagagtggt cctttccata aaaaaaaaaa 1620

aaaagaaaaa agaattttag gaatacaatg cagcttgtaa gtaaaatctg gaatattcat 1680

atcgccacaa cttcttatgc ttataaaagc actaatgcct gaatttatgt tgaaaatatg 1740

tgtcacaaat aaagaaactg tgacatctga cacatttcca cgtacccaat tcgccctata 1800

gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1860

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1920

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 1980

gcgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 2040

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 2100

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 2160

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 2220

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 2280

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 2340

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 2400

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct 2460

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat agggtaataa ctgatataat taaattgaag 2520

ctctaatttg tgagtttagt atacatgcat ttacttataa tacagttttt tagttttgct 2580

ggccgcatct tctcaaatat gcttcccagc ctgcttttct gtaacgttca ccctctacct 2640

tagcatccct tccctttgca aatagtcctc ttccaacaat aataatgtca gatcctgtag 2700

agaccacatc atccacggtt ctatactgtt gacccaatgc gtctcccttg tcatctaaac 2760

ccacaccggg tgtcataatc aaccaatcgt aaccttcatc tcttccaccc atgtctcttt 2820

gagcaataaa gccgataaca aaatctttgt cgctcttcgc aatgtcaaca gtacccttag 2880

tatattctcc agtagatagg gagcccttgc atgacaattc tgctaacatc aaaaggcctc 2940

taggttcctt tgttacttct tctgccgcct gcttcaaacc gctaacaata cctgggccca 3000

ccacaccgtg tgcattcgta atgtctgccc attctgctat tctgtataca cccgcagagt 3060

actgcaattt gactgtatta ccaatgtcag caaattttct gtcttcgaag agtaaaaaat 3120

tgtacttggc ggataatgcc tttagcggct taactgtgcc ctccatggaa aaatcagtca 3180

agatatccac atgtgttttt agtaaacaaa ttttgggacc taatgcttca actaactcca 3240

gtaattcctt ggtggtacga acatccaatg aagcacacaa gtttgtttgc ttttcgtgca 3300

tgatattaaa tagcttggca gcaacaggac taggatgagt agcagcacgt tccttatatg 3360

tagctttcga catgatttat cttcgtttcc tgcaggtttt tgttctgtgc agttgggtta 3420

agaatactgg gcaatttcat gtttcttcaa cactacatat gcgtatatat accaatctaa 3480

gtctgtgctc cttccttcgt tcttccttct gttcggagat taccgaatca aaaaaatttc 3540

aaagaaaccg aaatcaaaaa aaagaataaa aaaaaaatga tgaattgaat tgaaaagctg 3600

tggtatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 3660

acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 3720

gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 3780

aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 3840

taatggtttc ttaggacgga tcgcttgcct gtaacttaca cgcgcctcgt atcttttaat 3900

gatggaataa tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt ttatgttttg tatttggatt 3960

ttagaaagta aataaagaag gtagaagagt tacggaatga agaaaaaaaa ataaacaaag 4020

gtttaaaaaa tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata tttattagac aagaaaagca 4080

gattaaatag atatacattc gattaacgat aagtaaaatg taaaatcaca ggattttcgt 4140

gtgtggtctt ctacacagac aagatgaaac aattcggcat taatacctga gagcaggaag 4200

agcaagataa aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga gtcttttaca tcttcggaaa 4260

acaaaaacta ttttttcttt aatttctttt tttactttct atttttaatt tatatattta 4320

tattaaaaaa tttaaattat aattattttt atagcacgtg atgaaaagga cccaggtggc 4380

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 4440

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 4500

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 4560

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 4620

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 4680

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 4740

tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 4800

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 4860

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 4920

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 4980

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 5040

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 5100

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 5160

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 5220

tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 5280

tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 5340

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 5400

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 5460

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 5520

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 5580

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 5640

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 5700

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 5760

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 5820

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 5880

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 5940

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 6000

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 6060

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 6120

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcaa 6180

gtagaggggg taatttttcc cctttatttt gttcatacat tcttaaattg ctttgcctct 6240

ccttttggaa agctatactt cggagcactg ttgagcgaag gctcattaga tatattttct 6300

gtcattttcc ttaacccaaa aataagggaa agggtccaaa aagcgctcgg acaactgttg 6360

accgtgatcc gaaggactgg ctatacagtg ttcacaaaat agccaagctg aaaataatgt 6420

gtagctatgt tcagttagtt tggctagcaa agatataaaa gcaggtcgga aatatttatg 6480

ggcattatta tgcagagcat caacatgata aaaaaaaaca gttgaatatt ccctcaaaag 6540

atggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacacct tcgggtggcg 6600

aatgggactt atgcgcaccc ttagcgagag gtttatcatt aaggtcaacc tctggatgtt 6660

gtttcggcat cctgcattga atctgagtta ctgtctgttt tcctgctgga aatgttctat 6720

ttagaaacag gggaattgct tattaacgaa attgcccagt atagcgacca gcattcacat 6780

acgattgacg catgatatta ctttctgcgc acttaacttc gcatctgggc agatgatgtc 6840

gaggcgaaaa aaaatataaa tcacgctaac atttgattaa aatagaacaa ctacaatata 6900

aaaaaactat acaaatgaca agttcttgaa aacaagaatc tttttattgt cagt 6954

Claims

1.一种高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法，其特征在于，所述方法包括：

以能够表达Cas蛋白和逆转录酶的模式生物细胞作为试验起始细胞；

向所述试验起始细胞导入靶向目标基因的敲入片段，所述敲入片段包括带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列，得到可基因编辑的细胞；

使所述可基因编辑的细胞启动基因编辑，并通过对所述筛选标记基因对应表型进行筛选，得到所述目标基因被所述筛选标记基因替换的基因编辑突变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述试验起始细胞导入质粒，所述质粒包括靶向所述目标基因的敲入片段，且所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和所述向导RNA的DNA序列共价连接于所述质粒上；

优选地，所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列的长度为800～2000bp；

优选地，在所述质粒上，所述筛选标记基因的转录方向与所述向导RNA的DNA序列的转录方向相反；

优选地，所述筛选标记基因选自如下任意一种或多种：抗生素抗性基因及荧光标记基因；更优选地，所述抗生素抗性基因选自如下任意一种：Ble基因、Neo基因及KanMX基因；进一步优选地，所述抗生素抗性基因为Ble基因；

优选地，所述荧光标记基因选自如下任意一种：GFP基因、YFP基因、BFP基因、CFP基因、Luc基因、eGFP基因及RFP基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，按所述筛选标记基因的转录方向，所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列依次包括：所述目标基因的上游同源臂、所述筛选标记基因的表达框及所述目标基因的下游同源臂；

优选地，所述筛选标记基因的表达框包括依次连接的组成型启动子、所述筛选标记基因的编码区及终止子；更优选地，所述组成型启动子选自如下任意一种：P_TEF1、P_TPI1、P_PGK1、P_TDH3及P_ADH1；更优选地，所述终止子选自如下任意一种：T_TEF1和T_CYC1；

优选地，所述靶向目标基因的敲入片段依次包括：驱动所述向导RNA的DNA序列表达的启动子、所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列、所述向导RNA的DNA序列以及所述向导RNA的DNA序列表达的终止子。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，使所述可基因编辑的细胞启动基因编辑，得到所述目标基因被所述筛选标记基因替换的基因编辑突变体包括：

将所述可基因编辑的细胞置于含有诱导剂的培养基中，诱导所述可基因编辑的细胞启动基因编辑，所述基因编辑包括对所述目标基因进行双链断裂，以及利用所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列进行同源重组修复，得到修复细胞；

利用所述筛选标记基因对所述修复细胞进行筛选，得到所述目标基因被所述筛选标记基因替换的基因编辑突变体；

优选地，所述筛选标记基因为Ble基因，更优选地，利用所述筛选标记基因对所述修复细胞进行筛选时，培养基中添加的抗生素zeocin的浓度为125～200μg/mL，更优选为150μg/mL；

优选地，所述修复细胞中含有质粒，所述质粒包括所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列，在利用所述筛选标记基因对所述修复细胞进行筛选之前，所述方法还包括去除所述修复细胞中的所述质粒，进一步优选地，采用自然***丢失法和药物反筛相结合的方法去除所述修复细胞中的所述质粒。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述试验起始细胞，采用第一诱导型启动子驱动所述Cas蛋白和所述逆转录酶的表达；

优选地，所述可基因编辑的细胞中，采用第二诱导型启动子驱动所述敲入片段的表达；

优选地，所述第一诱导型启动子与所述第二诱导型启动子相同或不同；

优选地，所述第一诱导型启动子与所述第二诱导型启动子各自独立地选自：P_GAL启动子或P_CUP1启动子，更优选地，所述P_GAL启动子选自P_GAL7、P_GAL7及P_GAL70中的一种或多种。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述模式生物为酵母，优选为酿酒酵母；

优选地，能够表达所述Cas蛋白和所述逆转录酶的所述试验起始细胞通过以下方法获得：

对含有所述Cas蛋白与所述逆转录酶的质粒进行酶切，得到表达所述Cas蛋白与逆转录酶的线性DNA片段；

将所述线性DNA片段经同源重组导入营养缺陷型细胞内恢复所述营养缺陷型细胞的功能，得到所述试验起始细胞；

优选地，所述缺陷型细胞为Δhis3酵母菌株；

优选地，所述Cas蛋白为Cas9，更优选为S.pyogenes来源的Cas 9；更优选地，所述Cas蛋白的启动子为P_GAL7；

优选地，所述逆转录酶为E.coli来源的EC86RT；更优选地，所述逆转录酶的启动子为P_GAL70。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述筛选标记基因为Ble基因，所述敲入片段包括依次连接的：诱导型启动子P_GAL7、所述目标基因的下游同源臂、T_TEF1终止子、所述Ble基因的编码区及P_TEF1启动子、所述目标基因的上游同源臂、所述向导RNA的DNA序列及T_GAL7终止子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，依次以棉子糖和半乳糖为碳源，诱导所述可基因编辑的细胞启动基因编辑；

优选地，以所述棉子糖为碳源，诱导所述可基因编辑的细胞表达第一时长，进一步以所述半乳糖为碳源，诱导所述可基因编辑的细胞表达第二时长；

更优选地，所述第一时长和所述第二时长各自独立地为16～48h，进一步优选为20～30h。

9.一种用于制备模式生物基因突变体的质粒，其特征在于，所述质粒包括靶向目标基因的敲入片段，所述敲入片段包括共价连接的带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列和向导RNA的DNA序列。

10.根据权利要求9所述的质粒，其特征在于，

所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列中，所述筛选标记基因的转录方向与所述向导RNA的转录方向相反；

优选地，所述筛选标记基因为权利要求2所述的方法中的所述筛选标记基因；

优选地，所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列为权利要求7所述的方法中的所述带有筛选标记基因的同源重组修复模板序列。