CN111471656A - 用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测NMO‑IgG的稳转细胞株及其构建方法，该构建方法包括：构建包含AQP4 M1基因的过表达载体，过表达载体转染细胞包装慢病毒，慢病毒浓缩纯化后转导细胞，利用载体所含抗性对应的抗生素作用转导后的细胞，筛选得到稳转细胞株。本发明通过将外源基因整合到细胞染色体上，使得构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定的表达AQP4 M1蛋白，不具备瞬时感染所具有的外源基因表达持续时间短的缺陷。

Description

用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法。
背景技术
视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是视神经与脊髓同时相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变，是主要累及视神经和脊髓的自身免疫性疾病，大脑不受累，或即使大脑受累，其损害也未能达到多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的诊断标准。多发性硬化，是以中枢神经***白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的、获得性慢性复发或进展的自身免疫性疾病，病理特征性改变为中枢神经***脱髓鞘白质斑块形成，病变多位于侧脑室周围，病变常累及白质的病干，脊髓和视神经也会受累。目前对NMO和MS的鉴别诊断，可依据现在专家共识的NMO、MS的诊断标准，但从临床实际应用来看，两者的鉴别诊断仍比较困难。
NMO-IgG(或称AQP4-IgG)的发现距今已有十多年的历史，其为NMOSD(视神经脊髓炎谱系障碍)的诊断、治疗和预后提供了一个新的方向。近年国外报道，在NMO患者血清中可检测到高度特异的NMO-IgG，有助于早期诊断。
目前的功能研究中，可以通过瞬时转染的方式将外源基因导入细胞，再使用表达人AQP4蛋白的细胞作为底物，来检测人血清中NMO-IgG的存在与否。但是，这一实现方式具有外源基因表达持续时间短的缺陷。
发明内容
本发明提供了用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法，外源基因能够长时间稳定表达。
第一方面，本发明提供了用于检测NMO-IgG的稳转细胞株的构建方法，包括：
(1)构建过表达载体：
利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增AQP4 M1基因，得到AQP4M1 PCR产物；
利用与两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切AQP4 M1 PCR产物和慢病毒载体；
连接AQP4 M1 PCR产物的酶切产物和慢病毒载体的酶切产物，得到过表达载体；
利用连接得到的过表达载体，转化感受态细胞；
利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素筛选转化后的感受态细胞，对筛选出的单菌落作扩增培养并从中提取过表达载体，电泳初筛提取的过表达载体并在初筛通过后送测序鉴定；
(2)包装慢病毒：
利用通过测序鉴定的过表达载体和慢病毒包装载体共转染细胞，细胞内包装慢病毒，浓缩纯化慢病毒，并以带荧光标记的空载体作对照；
(3)慢病毒转导细胞：
利用慢病毒转导细胞，并通过观察空载体的细胞荧光发光情况，来评估转导后细胞的病毒滴度；
(4)筛选稳转细胞株：
评估通过后，利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素持续作用转导后的细胞，以筛选出稳转细胞株并保存。
详细地，在中枢神经***中AQP4主要有两种亚型：AQP4 M1、AQP4M23。AQP4 M1作为AQP4的其中一个亚型，有较高的敏感性及特异性。
详细地，过表达载体中需***的目的片段为AQP4 M1，其序列为：ATGAGTGACAGACCCACAGCAAGGCGGTGGGGTAAGTGTGGACCTTTGTGTACCAGAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAAAGGGGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAAGCAGTCACAGCGGAATTTCTGGCCATGCTTATTTTTGTTCTCCTCAGCCTGGGATCCACCATCAACTGGGGTGGAACAGAAAAGCCTTTACCGGTCGACATGGTTCTCATCTCCCTTTGCTTTGGACTCAGCATTGCAACCATGGTGCAGTGCTTTGGCCATATCAGCGGTGGCCACATCAACCCTGCAGTGACTGTGGCCATGGTGTGCACCAGGAAGATCAGCATCGCCAAGTCTGTCTTCTACATCGCAGCCCAGTGCCTGGGGGCCATCATTGGAGCAGGAATCCTCTATCTGGTCACACCTCCCAGTGTGGTGGGAGGCCTGGGAGTCACCATGGTTCATGGAAATCTTACCGCTGGTCATGGTCTCCTGGTTGAGTTGATAATCACATTTCAATTGGTGTTTACTATCTTTGCCAGCTGTGATTCCAAACGGACTGATGTCACTGGCTCAATAGCTTTAGCAATTGGATTTTCTGTTGCAATTGGACATTTATTTGCAATCAATTATACTGGTGCCAGCATGAATCCCGCCCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATCATGGGAAATTGGGAAAACCATTGGATATATTGGGTTGGGCCCATCATAGGAGCTGTCCTCGCTGGTGGCCTTTATGAGTATGTCTTCTGTCCAGATGTTGAATTCAAACGTCGTTTTAAAGAAGCCTTCAGCAAAGCTGCCCAGCAAACAAAAGGAAGCTACATGGAGGTGGAGGACAACAGGAGTCAGGTAGAGACGGATGACCTGATTCTAAAACCTGGAGTGGTGCATGTGATTGACGTTGACCGGGGAGAGGAGAAGAAGGGGAAAGACCAATCTGGAGAGGTATTGTCTTCAGTATGA。
在本发明的一个实施方式中，引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，该引物包括XhoI的酶切位点；
引物对的下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示，该引物包括XbaI的酶切位点。
详细地，可以根据primer软件设计PCR扩增所用的引物对。设计出的这一引物对能够扩增出AQP4 M1的完整序列，同时还引入了XhoI、XbaI两个酶切位点，引物序列为：
AQP4 M1F ACACCTCGAGATGAGTGACAGACCCACAG
AQP4 M1R ACACTCTAGATCATACTGAAGACAATA
其中，在AQP4 M1F这一引物中，CTCGAG对应于XhoI的酶切位点，在AQP4 M1R这一引物中，TCTAGA对应于XbaI的酶切位点。该引物对特异性强，能得到目的序列，以便于后续进行实验。
在本发明的一个实施方式中，PCR扩增的反应体系中，引物浓度为50-300nM，DNA聚合酶用量为0.5-2.0U，PCR反应缓冲液为10*，dNTP浓度为100-400μM，Mg2+浓度为300-800μM，模板DNA用量为10-100ng；
扩增反应体系体积为20-50μl。
在本发明的一个实施方式中，PCR扩增的反应程序包括：94-98℃预变性2-10min；94-98℃变性10-90s，58-63℃退火10-90s，68-72℃延伸30-300s，共25-40个循环；68-72℃终延伸5-20min。
在本发明的一个实施方式中，酶切反应的反应体系中，XhoI用量为5-20U，XbaI用量为8-20U，酶切反应缓冲液为10*，AQP4 M1 PCR产物用量为0.5-3μg，慢病毒载体用量为0.5-3μg；
酶切反应体系体积为20-50μl；
酶切反应的反应程序包括在37℃下持续1-5h。
本实施方式中，使用XhoI和XbaI这两种限制性内切酶，来实现特异性酶切。
在本发明的一个实施方式中，连接反应的反应体系中，DNA连接酶的用量为200-700U，连接反应缓冲液为10*，AQP4 M1 PCR产物的酶切产物用量为100-500ng，慢病毒载体的酶切产物用量为10-100ng；
连接反应体系体积为20-50μl；
连接反应的反应程序包括在4-16℃过夜。
在本发明的一个实施方式中，转化反应的反应体系中，过表达载体、感受态细胞和LB培养基的体积比为1：20：100-1：50：800。
本实施方式中，转化反应体系可以包括过表达载体、感受态细胞及LB培养基。基于此，转化反应的实现步骤可以包括：将感受态细胞在冰上溶解，按比例将一定量的过表达载体、感受态细胞加入到离心管中，轻轻混匀，静置冰上20-30min；在42℃水浴锅中热休克感受态细胞0.5-2min，迅速移入冰中静置2-5min，按比例加入相应量的无抗生素LB培养基，37℃、160-225rpm条件下恒温摇床培养45-60min。
对于转化后细胞的鉴定操作，具体实现步骤可以包括：将转化后的感受态细胞涂于有抗性的LB琼脂平板上，倒置培养于37℃培养箱中，过夜。对AQP4 M1菌落分别平板挑菌，37℃、160-225rpm条件下摇菌12-18h，分别提取过表达载体的质粒。琼脂糖凝胶电泳初筛后将质粒送测序进行鉴定。
考虑到若过表达载体转化细胞成功，则转化后的细胞可具有载体固有的特定抗性，故该步骤中，可基于载体固有的特定抗性，筛除掉那些未成功转化的部分。
考虑到上述连接得到的过表达载体不一定均为预期所需的过表达载体，故该步骤中，对于筛选出的细胞，还可做测序鉴定。具体地，首先对筛选出的单菌落作扩增培养以从中提取过表达载体的质粒，然后电泳检测提取的质粒，根据质粒的条带大小是否在预期的目标区域内，对质粒作初步筛选，最后将通过电泳筛选质粒送测序鉴定，以鉴定相应过表达载体是否为预期所需的过表达载体。
在本发明的一个实施方式中，对于包装慢病毒，可以包括以下步骤：
①细胞常规培养于含10％FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)的培养基中。
其中，该细胞可以为293T细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞中的任意一种，该培养基可以为DMEM、RPMI1640等常规培养基的任意一种。
②将对数期状态良好的细胞接种至细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱过夜培养，当细胞汇合度达到50-90％时进行转染，转染体系包括培养基、脂质体、慢病毒包装载体及过表达载体，同时以带荧光标记的空载体作为对照。
其中，该脂质体可以为Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000中的任意一种。该转染体系中，慢病毒包装载体总质量(微克)和脂质体的体积(微升)的比值可以为1:2-1:3。
③转染后将细胞培养板在37℃、5％CO2条件下孵育4-6h，之后更换成完全培养基(培养基+10％FBS)，转染约24-72h后，收集细胞上清液，经0.45μm微孔滤膜纯化后加入到超滤离心管中，4000x g离心15-60min进行浓缩。
该步骤中，过表达载体转染细胞后，细胞内包装慢病毒，且包装好的慢病毒会分泌到细胞外的培养基中，通过收集细胞上清液并浓缩，从而实现慢病毒的收集和浓缩纯化。与此同时，以空载体作对照，空载体带荧光标记但不含AQP4 M1。
在本发明的一个实施方式中，对于慢病毒转导细胞，可以包括以下步骤：
①转导前1天取对数生长期状态良好的细胞接种于细胞培养板中。
②以慢病毒：完全培养基的体积比(V/V)为1:1-1:50的比例，混匀转染细胞。
③24h后更换为不含慢病毒液且含抗生素的完全培养基，并观察空载体的细胞荧光发光情况，评估病毒滴度。
步骤③中，可定期观察细胞生长情况，以确定细胞生长状态是否良好。
该转导步骤中，若对照组中慢病毒转导细胞成功，则对照组细胞有荧光发光，且可根据荧光发光情况来评估病毒滴度。通常情况下，荧光发光越强，病毒滴度越高，说明转导效率越高。
考虑到实验组和对照组的实验条件保持一致，故可根据对照组的细胞荧光发光情况，来评估实验组中转导后细胞的病毒滴度。
在本发明的一个实施方式中，对于筛选单克隆稳转细胞株，可以包括以下步骤：
①细胞荧光发光后，将转导后的细胞消化计数并调整浓度为10-100个细胞/ml。
②将含抗生素的细胞悬液加入至细胞培养板中，继续常规培养，定期观察细胞状态，5天后更换为含高浓度抗生素的完全培养基。
③当细胞增殖到肉眼可见的白点，在移液器尖端吸取少量胰酶，缓慢滴至细胞处，待细胞消化后，迅速吹打，将消化下的细胞转移至96孔板中，传代扩增，即为单克隆细胞株。
同上所述，可基于慢病毒载体固有的特定抗性，从转导后的细胞中，筛选出稳转细胞株。
第二方面，本发明提供了利用上述第一方面中任一所述构建方法所构建得到的稳转细胞株。
第三方面，本发明提供了上述第二方面中所述的稳转细胞株在检测人血清中NMO-IgG中的应用。
详细地，需要检测血清样本时，可以取冻存的稳转细胞株作传代继续培养，接种48孔细胞培养板并进行荧光检测，从而可根据荧光检测结果来判定血清样本为阳性还是阴性，即判定血清样本中是否含有NMO-IgG。
本发明使用稳定表达人AQP4 M1蛋白的细胞作为底物，经间接免疫荧光，可特异性检测NMO-IgG，有较高的特异性和敏感性。
详细地，稳转细胞株可用于NMO-IgG的定性检测，还可对抗体浓度作半定量的评估。
第四方面，本发明提供了上述第二方面中所述的稳转细胞株在筛选或制备抗NMOSD药物中的应用。
本发明将目的基因整合到细胞染色体上，使得构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定的表达AQP4 M1蛋白。稳定表达细胞株可以弥补瞬时转染所具有的外源基因表达时间短的缺陷，故便于长期观察基因对于细胞功能的影响以及蛋白间相互作用。此外，还节约了时间、人力及物力。本发明具有敏感度高、特异度高、转染效率高、省时等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的空载体对照组的慢病毒转导后细胞的细胞荧光照片；
图2是本发明一个实施例提供的稳转细胞株的照片；
图3是本发明一个实施例提供的稳转细胞株的免疫荧光检测照片。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
本发明实施例提供了一种用于检测NMO-IgG的稳转细胞株的构建方法，可以包括以下步骤：
步骤1.1：设计用于扩增AQP4 M1基因的引物对。
通过NCBI查找AQP4 M1的DNA序列及mRNA序列，根据AQP4基因序列设计用于PCR扩增的上下游引物及酶切位点。设计出的引物对如下述表1所示。
表1
引物名称 引物序列5’-3’
AQP4 M1F ACACCTCGAGATGAGTGACAGACCCACAG
AQP4 M1R ACACTCTAGATCATACTGAAGACAATA
步骤1.2：配制PCR扩增反应体系。具体组成如下述表2所示。
表2
PCR扩增反应体系 体积/μl
10*PCR反应缓冲液 5
2.0mM dNTP 5
Mg<sup>2+</sup> 1
引物Mix(10μM) 1
DNA聚合酶 1
ddH<sub>2</sub>O 36
模板DNA 1
Total 50
其中，扩增试剂，如PCR Buffer、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等，均为购买的商品化扩增试剂；采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD Plus酶系(货号：KOD-401)；模板DNA用量50ng。
步骤1.3：设置PCR扩增反应程序。
根据选取的扩增酶系，对退火及延伸的温度及时间进行优化，保证AQP4M1基因扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的结果中有明亮的条带，并且扩增时间相应最短。确定出的最优PCR扩增程序见下述表3。
表3
Figure BDA0002476705610000091
步骤1.4：执行PCR扩增反应以扩增AQP4 M1基因，得到AQP4 M1 PCR产物。得到扩增产物后可执行酶切处理。
步骤1.5：配制酶切反应体系。具体组成如下述表4所示。
表4
酶切体系 体积/μl
AQP4 M1 PCR扩增产物或慢病毒载体 2
XhoI 1
XbaI 1
10*酶切反应缓冲液 2
H2O 14
Total 20
其中，酶切试剂，如XhoI、XbaI、10*酶切反应缓冲液等，均为商品化酶切试剂，AQP4M1 PCR产物用量为1μg，慢病毒载体用量为1μg。
步骤1.6：执行酶切反应以分别酶切AQP4 M1 PCR产物和载体，反应条件为37℃、3h。
步骤1.7：配制连接反应体系。具体组成如下述表5所示。
表5
连接体系 体积/μl
AQP4 M1酶切产物 6
载体酶切产物 1
10*buffer 2
DNA连接酶 1
H<sub>2</sub>O 10
Total 20
其中，连接试剂，如DNA连接酶、10*酶切反应缓冲液等，均为商品化DNA连接试剂，采用TaKaRa公司T4 DNA Ligase酶系(货号：2011A)AQP4M1酶切产物用量为300ng，酶切慢病毒载体用量为50ng。
步骤1.8：执行连接反应以连接AQP4 M1酶切产物和慢病毒载体酶切产物，反应条件为4℃过夜。连接产物为过表达载体。
步骤1.9：过表达载体转化感受态细胞，并作筛选及鉴定。具体实现过程为：
将含有Amp(氨苄)抗性的感受态细胞(大肠杆菌DH5α)在冰上溶解，吸取50μl移入1.5ml的离心管，加入1μl过表达载体，轻轻混匀，在冰上静置30min。在42℃水浴锅中热休克细菌60s，迅速移入冰中静置2min，加入500μl无抗生素LB培养基，37℃恒温摇床220rpm培养1h。将转化后的菌液涂于有Amp抗性的LB琼脂平板上，倒置培养于37℃培养箱中，过夜。对AQP4 M1单菌落分别平板挑菌，37℃、220rmp摇菌14h，分别提取过表达载体的质粒，琼脂糖凝胶电泳初筛后将质粒送测序进行鉴定。
步骤1.10：利用通过测序鉴定的过表达载体和慢病毒包装载体转染细胞，细胞内包装慢病毒，浓缩纯化慢病毒，并以带荧光标记的空载体作对照。具体实现过程为：
步骤1.10.1：293T细胞常规培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
步骤1.10.2：转染前1天，取对数期状态良好的细胞，以6×105个/ml接种至六孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱过夜培养。当细胞汇合度达到80-90％时进行转染，Lipofectamine 2000、psPAX2、pMD2G及过表达载体pHBLV-CMVIE-IRES-puro-AQP4M1(同时以空载体作为对照)三质粒共转染细胞。
利用Lipofectamine 2000进行转染的体系见表6：
表6
Figure BDA0002476705610000111
制备脂质体-DNA复合物，将B管内容物转移至A管并充分混匀，室温孵育复合物10min。向每孔加入250μl的脂质体-DNA复合物。
步骤1.10.3：将细胞培养板置于37℃、5％CO2条件下孵育6h后，更换成完全培养基，在37℃、5％CO2下过夜孵育。转染约48h后，收集上清液，4℃、3000rpm离心15min。用0.45μm孔径过滤器过滤慢病毒上清液后加入到超滤离心管中，4000x g离心30min进行浓缩。
步骤1.11：利用慢病毒转导细胞，并观察细胞生长状态和空载体的细胞荧光发光情况，评估转导后细胞的病毒滴度。具体实现过程为：
步骤1.11.1：转导前1天取对数生长期状态良好的细胞，以每孔5×104个细胞接种于24孔板中。
步骤1.11.2：慢病毒转导细胞。转导体系见下述表7，培养基为含polybrene(2-30μg/ml)的完全培养基。
表7
Figure BDA0002476705610000121
步骤1.11.3：24h后更换为500μl不含病毒液且含抗生素的完全培养基，并观察细胞生长状态，以及观察NC对照组细胞荧光发光情况，以评估病毒滴度。其中，观察到的荧光发光情况可以如图1所示。
请参考图1，图1示出了经NC组空载体形成的慢病毒转导的细胞，在24h后出现较高表达的荧光。基于此，可以认为转导后细胞的病毒滴度较高、转导效果好，以及可以认为经AQP4 M1慢病毒转导后细胞的病毒滴度较高、转导效果好。
步骤1.12：评估通过后，利用慢病毒载体相应的抗生素作用细胞，筛选单克隆细胞株。具体实现过程为：
步骤1.12.1：细胞荧光发光后，将转导后的细胞消化计数并调整浓度为10个细胞/ml。
步骤1.12.2：向6孔板中每孔加1ml细胞悬液，并含终浓度为5μg/ml的puromycin，5天后更换为终浓度为30μg/ml的puromycin完全培养基。
步骤1.12.3：当细胞增殖到肉眼可见的白点，在移液器尖端吸取少量胰酶，缓慢滴至细胞处，待细胞消化后，迅速吹打，将消化下的细胞转移至96孔板中，传代扩增，即为单克隆细胞株。该细胞即为筛选出的稳转单克隆细胞株。其中，稳转细胞株在光镜下的细胞照片可以如图2所示。
由图2可以看出，筛选出的稳转细胞株的生长状态良好。
此外，筛选出的稳转单克隆细胞株可传代继续培养，接种48孔细胞培养板并进行荧光检测。检测结果可以如图3所示。
请参考图3，图3中的左图为稳转细胞株检测一阴性血清样本时的细胞荧光照片，未发现荧光，与预期荧光结果保持一致；图3中的右图为稳转细胞株检测一阳性血清样本时的细胞荧光照片，出现较高比例的荧光，与预期荧光结果保持一致。基于此检测结果，可说明转染效率较高，对血清中NMO-IgG的检测准确率高。
实施例2
本发明实施例提供了稳转细胞株在检测人血清中NMO-IgG中的应用。
具体可以包括以下步骤：
步骤2.1：将稳转细胞株常规培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
步骤2.2：取对数期状态良好的细胞，以5×105个/ml接种至48孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱过夜培养。
步骤2.3：第二天弃去48孔板中的培养基，用PBS清洗3次，弃去PBS。
步骤2.4：每孔加入150μl稀释后的山羊血清封闭1h。
步骤2.5：弃去山羊血清，每孔加入150μl血清样本，室温孵育1h。
步骤2.6：弃去血清样本，用PBS清洗3次，弃去PBS。
步骤2.7：每孔加入150μl稀释后的CY3标记的山羊抗人IgG，室温孵育1h。
步骤2.8：弃去CY3标记的山羊抗人IgG，用PBS清洗3次。最终每孔留少量PBS，荧光显微镜下观察荧光结果。上述步骤2.5中，加入的血清样本可以为分别取自不同检测对象的多个血清样本，以实现定性检测。
对于定性检测，可以得到上述图3所示的荧光结果，故可准确的定性检测血清样本中NMO-IgG的存在与否。
上述步骤2.5中，加入的血清样本也可以为取自同一检测对象的不同稀释度的血清样本，以实现半定量检测。
对于半定量检测，可以根据不同稀释度血清的荧光结果，半定量血清样本中NMO-IgG的含量。对于同一阳性血清样本，能够检测到荧光的稀释度越高，相应样本NMO-IgG含量越高，反之越低。
实施例3
本发明实施例提供了稳转细胞株在筛选或制备抗NMOSD药物中的应用。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法
<130> 2020.2.13
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增AQP4 M1基因的上游引物
<400> 1
acacctcgag atgagtgaca gacccacag 29
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增AQP4 M1基因的下游引物
<400> 2
acactctaga tcatactgaa gacaata 27

Claims (10)

1.用于检测NMO-IgG的稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括：
(1)构建过表达载体：
利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增AQP4 M1基因，得到AQP4 M1 PCR产物；
利用与两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切AQP4 M1 PCR产物和慢病毒载体；
连接AQP4 M1 PCR产物的酶切产物和慢病毒载体的酶切产物，得到过表达载体；
利用连接得到的过表达载体，转化感受态细胞；
利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素筛选转化后的感受态细胞，对筛选出的单菌落作扩增培养并从中提取过表达载体，电泳初筛提取的过表达载体并在初筛通过后送测序鉴定；
(2)包装慢病毒：
利用通过测序鉴定的过表达载体和慢病毒包装载体转染细胞，细胞内包装慢病毒，浓缩纯化慢病毒，并以带荧光标记的空载体作对照；
(3)慢病毒转导细胞：
利用慢病毒转导细胞，并通过观察空载体对照组的细胞荧光发光情况，来评估转导后细胞的病毒滴度；
(4)筛选稳转细胞株：
评估通过后，利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素持续作用转导后的细胞，以筛选出稳转细胞株并保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，该引物包括XhoI的酶切位点；
引物对的下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示，该引物包括XbaI的酶切位点。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
PCR扩增的反应体系中，引物浓度为50-300nM，DNA聚合酶用量为0.5-2.0U，PCR反应缓冲液为10*，dNTP浓度为100-400μM，Mg2+浓度为300-800μM，模板DNA用量为10-100ng；
扩增反应体系体积为20-50μl。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
PCR扩增的反应程序包括：94-98℃预变性2-10min；94-98℃变性10-90s，58-63℃退火10-90s，68-72℃延伸30-300s，共25-40个循环；68-72℃终延伸5-20min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
酶切反应的反应体系中，XhoI用量为5-20U，XbaI用量为8-20U，酶切反应缓冲液为10*，AQP4 M1 PCR产物用量为0.5-3μg，慢病毒载体用量为0.5-3μg；
酶切反应体系体积为20-50μl；
酶切反应的反应程序包括在37℃下持续1-5h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
连接反应的反应体系中，DNA连接酶的用量为200-700U，连接反应缓冲液为10*，AQP4M1 PCR产物的酶切产物用量为100-500ng，慢病毒载体的酶切产物用量为10-100ng；
连接反应体系体积为20-50μl；
连接反应的反应程序包括在4-16℃过夜。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，转化反应的反应体系中，过表达载体、感受态细胞和LB培养基的体积比为1：20：100-1：50：800。
8.利用权利要求1至7中任一所述构建方法所构建得到的稳转细胞株。
9.权利要求8所述的稳转细胞株在检测人血清中NMO-IgG中的应用。
10.权利要求8所述的稳转细胞株在筛选或制备抗NMOSD药物中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232795A (zh) * 2021-07-22 2022-10-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 稳定表达aqp4-m23蛋白的细胞株及其构建方法、应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937836A (zh) * 2014-04-04 2014-07-23 天津医科大学总医院 水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用
CN107022548A (zh) * 2017-03-22 2017-08-08 陕西脉元生物科技有限公司 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN108203719A (zh) * 2017-12-26 2018-06-26 吉林医药学院 用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物及其高通量筛选方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937836A (zh) * 2014-04-04 2014-07-23 天津医科大学总医院 水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用
CN107022548A (zh) * 2017-03-22 2017-08-08 陕西脉元生物科技有限公司 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN108203719A (zh) * 2017-12-26 2018-06-26 吉林医药学院 用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物及其高通量筛选方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232795A (zh) * 2021-07-22 2022-10-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 稳定表达aqp4-m23蛋白的细胞株及其构建方法、应用
CN115232795B (zh) * 2021-07-22 2023-09-19 北京和合医学诊断技术股份有限公司 稳定表达aqp4-m23蛋白的细胞株及其构建方法、应用

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