CN108265040B

CN108265040B - 一种嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体

Info

Publication number: CN108265040B
Application number: CN201710871026.7A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 杨雪宁; 王亮; 郑春阳
Original assignee: Robustnique Corp ltd
Current assignee: Robustnique Corp ltd
Priority date: 2017-09-24
Filing date: 2017-09-24
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2037-09-24
Also published as: CN108265040A

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供一种来源于不可培养微生物嗜盐古细菌SCGC‑AAA259I14的转座酶高活性突变体，并通过将该转座酶高活性突变体导入到大肠杆菌中，构建了重组表达该转座酶高活性突变体的大肠杆菌工程菌。所述大肠杆菌工程菌能够高效的表达转座酶高活性突变体。同大肠杆菌Tn5转座酶高活性突变体相比，重组转座酶高活性突变体具有更好的稳定性，能够显著降低纯化成本，可以作为分子生物试剂，应用于体外转座和二代测序建库技术等方面。

Description

一种嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供一种来源于不可培养微生物嗜盐古细菌SCGC-AAA259I14的转座酶高活性突变体及其应用。

背景技术

Tn5转座酶是IS4家族的复合转座子Tn5内部由IS50序列编码的转座酶，包含476个氨基酸残基，分子量53kDa。转座酶能够识别成对的末端序列（End sequence），经过“剪切和粘贴”的方式，完成转座反应。

转座酶的转座反应包括以下几个步骤：首先，Tn5转座酶识别供体DNA片段中的末端序列，两个Tn5转座酶分子结合，形成活性二聚体；活性二聚体在末端序列的外侧切割双链DNA，将末端序列和其间的DNA从供体DNA上切割下来；之后，活性二聚体同受体DNA结合，二聚体切割受体DNA，形成9bp的粘性末端；活性二聚体随后催化末端序列同受体DNA片段的粘性末端连接，完成转座反应。在体外的反应条件下，完成反应的Tn5转座酶依然同受体DNA片段紧密结合，需要使用变性剂等失活Tn5转座酶才能将其同受体DNA片段分离。目前在体内介导这一分离过程的机理还不太清楚。

目前，Tn5转座酶已被广泛的应用于分子生物学领域的体外转座、二代测序建库等领域。当使用两端包含ME接头序列的目的基因作为底物时，可以使用Tn5转座进行体外转座反应，将目的基因序列***到目标微生物的基因组中，达到对目标微生物基因组改造的效果。当使用分立式的两段ME接头序列时，可以使用Tn5转座酶完成建库反应，将目标DNA打断成一定大小的片段，当ME接头同时连接有二代测序用接头序列时，将目标DNA片段化的过程即包含了目标DNA打断和测序接头连接两个步骤，能够快速的完成二代测序建库。

现有的Tn5转座酶，在纯化的过程中，其N末端序列容易被大肠杆菌內源的蛋白酶降解，形成无活性的Tn5转座酶片段，这些片段还能在一定程度上抑制全长Tn5转座酶的活性。鉴于上述现象，在纯化Tn5转座酶的过程中，往往需要全程添加昂贵的蛋白酶抑制剂，这使得转座酶的纯化成本增加，也是目前市售转座酶价格高昂的因素之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有更高稳定性的转座酶高活性突变体及其应用。本发明通过构建大肠杆菌工程菌，能够高效的重组表达转座酶高活性突变体，该转座酶高活性突变体在纯化过程中能够更好耐受大肠杆菌內源蛋白酶的降解，省去了添加昂贵蛋白酶抑制剂的工序，同现与Tn5转座酶高活性突变体相比，显著降低了纯化成本。

本发明提供了一种来源于不可培养微生物嗜盐古细菌SCGC-AAA259I14的转座酶高活性突变体，包括：

氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶，以及与SEQ ID NO:1序列相似性高于90%，且具有转座酶活性的酶。编码所述转座酶高活性突变体的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明将上述转座酶高活性突变体导入大肠杆菌中，构建了重组表达该转座酶高活性突变体的大肠杆菌工程菌。所述大肠杆菌工程菌能够高效的表达转座酶高活性突变体。

重组表达的转座酶高活性突变体，在纯化的过程中，同Tn5转座酶相比，对大肠杆菌的內源蛋白酶降解具有更好的耐受性，能够在不使用多功能蛋白酶抑制剂的情况下，纯化获得全长序列，显著降低了纯化成本。

本发明还涉及上述转座酶高活性突变体在分子生物领域的应用。

附图说明

图1，Tn5转座酶纯品，泳道1为蛋白质Marker，泳道2为Tn5转座酶纯品，其中主条带下方的两条条带为纯化过程中的降解条带。

图2，嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体纯品，泳道1为蛋白质Marker，泳道2为嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体纯品，其中主条带下方的一条带为纯化过程中的降解条带。

具体实施方式

实施例1 转座酶高活性突变体大肠杆菌工程菌的构建

在不可培养微生物嗜盐古细菌SCGC-AAA259I14的转座酶（GenBank: KXA97509.1）基因中引入高活性突变W64K，并参照大肠杆菌的密码子偏好对突变后的基因序列进行密码子优化，所得的序列经金唯智公司合成，并构建至pTYB4表达载体中，得到pTYB4W64K质粒。

将pTYB4W64K质粒转化到大肠杆菌ER2566表达菌株中，使用LB培养基，37度培养至OD₆₀₀=0.6，加入0.1mM IPTG，降低培养温度至23度，继续培养6h，离心收集菌体。

实施例2 转座酶高活性突变体的纯化

取25-30g表达转座酶高活性突变体的大肠杆菌菌体，按1:17-20的比例加入缓冲液A（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，10% Glycerol）500 mL，混匀后进行均质破菌（1000 bar/2次），破菌后将样品进行离心处理（14000 rpm、20 min、4℃），离心后保留上清弃掉沉淀。

向离心上清缓慢加入到5 mL Chitin柱中；待全部破菌上清通过Chitin柱之后，使用缓冲液A进行冲洗柱子5-7倍柱体积，确保柱子中一些非特异结合蛋白被冲洗出去，此时转座酶高活性突变体结合于Chitin填料上。

称取DTT固体使用20 mL缓冲液A溶解（DTT终浓度为50 mM），缓慢将上述缓冲液添加到Chitin柱中；待3倍柱体积流穿之后，堵上下端出水口；4度放置过夜（约16 h），隔日准备好收集管，调整好位置，上端进水口连接好之后，打开下端出水口，开始收集，每管约1.8mL，收集7管，之后电泳检测每管含量；根据电泳结果合并样品。

将合并后的转座酶高活性突变体样品透析，样品透析操作在超净台中进行。使用超净台之前，需按照超净台使用规范对超净台进行擦拭和紫外照射处理。在紫外灭菌结束后，将置于4℃预冷的冰盒上的转座酶高活性突变体样品，1L大烧杯，转子，储液buffer，透析袋等物品放入超净台中。分别将缓冲液B（20 mM Tris-HCl pH 7.5，50% Glycerol，0.5mM EDTA, 1mM DTT）和转子放入1L大烧杯中。使用灭菌枪头吸取样品，加入到一段封闭的透析袋中。此过程尽量在短时间结束。加完所有样品后，封闭透析袋另一端，置入前述大烧杯中。盖上盖子。将磁力搅拌器置于4℃药品保存柜中。将前述大烧杯置于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌程序。600 rpm，过夜透析。透析后的样品即为转座酶高活性突变体纯品。

实施例3 转座酶高活性突变体在分子生物学领域的应用

转座酶高活性突变体在二代测序建库中的应用：

3.1构建转座体（Transposome）

3.1.1 准备如下反应体系：

3.1.2. 将反应物混匀，25°C反应30分钟。

3.1.3. 反应后的转座体可立即进行后续反应，也可-20°C保存。

3.2 片段化反应（Tagmentation）

3.2.1. 准备如下的反应体系

3.2.2. 37°C反应2h或56°C反应10~15分钟。

3.3 上一步骤所的产物经纯化、nick translation、PCR富集、纯化等步骤后可上机进行测序。

序列表

<110> 天津强微特生物科技有限公司

<120> 一种嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 471

<212> PRT

<213> 转座酶高活性突变体蛋白序列(人工序列)

<400> 1

Met Val Leu Asp Phe Ser Gly Asp Val Gly Leu Val Gly Gly Phe Cys

1 5 10 15

Tyr Ala Asp Val Ser Gln Tyr Met Lys Asp Glu Phe Gln Phe Thr Asp

20 25 30

Phe Gly Asp Lys Arg Leu Asp Asp Arg Leu Gln Arg Ile Gly Val Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Ala Pro Ser Glu Ser Ile Pro Arg Ala Cys Gly Asp Lys

50 55 60

Ala Ser Thr Lys Ala Thr Tyr Arg Phe Phe Asp Asn Glu Asn Val Thr

65 70 75 80

Pro Glu Glu Ile Leu Ser Ser His Lys Glu Glu Met Lys Ser Arg Leu

85 90 95

Lys Trp Val Lys Lys Val Leu Val Val Ser Asp Thr Thr Tyr Leu Thr

100 105 110

Phe Pro Ser His Pro Ser Lys Glu Gly Leu Gly Asp Ile Gly Asn Ser

115 120 125

Lys Thr Asp Val Glu Gly Val Leu Val His Ser Thr Ile Gly Val His

130 135 140

Pro Glu Thr Arg Arg Met Ile Gly Val Met Asp Gln Gln Val Leu Val

145 150 155 160

Gln Asp Gln Glu Gln Asp Pro Thr Glu Thr Cys Asp Thr Asn Gly Lys

165 170 175

Asp Glu Ser Ile Gln Leu Glu Ser Glu Gln Asp Lys Trp Ile Arg Gly

180 185 190

Asp Lys Glu Ala Ile Lys Met Leu Pro Glu Glu Thr Arg Pro Ile Phe

195 200 205

Val His Asp Arg Gly Ala Asp Asp Phe Ser Leu Phe Lys Lys Leu Lys

210 215 220

Glu Glu Gly Ser Gly Phe Val Ile Arg Ala Ser Gln Asn Arg Cys Ile

225 230 235 240

Lys Thr Pro Ser Gly Gln Gly Asn Tyr Leu Leu Asp Trp Ser Lys Asn

245 250 255

Leu Pro Glu Ile Gly Gln Thr Glu Ile His Ile Gln Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Arg Lys Gly Arg Asp Ala Thr Leu Ser Ile Gln Thr Gly Thr Cys Glu

275 280 285

Leu Leu Pro Pro Glu Lys Val Pro Gln Asp Thr Ser Pro Cys Gln Val

290 295 300

Asn Val Val Arg Ala Glu Glu Ile Glu Lys Glu Glu Asp Pro Leu Leu

305 310 315 320

Trp Val Leu Leu Thr Thr Glu Pro Val Glu Asp Phe Glu Asp Val Leu

325 330 335

Glu Val Ile Glu His Tyr Arg Lys Arg Trp Val Ile Glu Asp Trp His

340 345 350

Arg Ala Leu Lys Thr Gly Cys Arg Ile Glu Glu Arg Gln Leu Glu Lys

355 360 365

Trp Glu Arg Met Glu Val Leu Leu Ser Ile Tyr Ser Val Ile Ala Trp

370 375 380

Lys Val Leu Glu Ile Arg Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Glu Ile Ala

385 390 395 400

Pro Glu Glu Phe Leu Thr Glu Thr Gln Ile Ala Val Leu Glu Gly Lys

405 410 415

Phe Pro Asp Leu Lys Gly Lys Gly Gly Lys Glu Tyr Ala Val Ala Ile

420 425 430

Ala Lys Val Gly Gly Tyr Leu Asp Arg Ser Ser Asp Pro Pro Pro Gly

435 440 445

Trp Ile Val Thr Trp Arg Gly Phe Lys Lys Val Leu Thr Trp Val Glu

450 455 460

Gly Tyr Glu Ile Leu Ser Thr

465 470

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> 转座酶高活性突变体基因序列(人工序列)

<400> 2

atggttctgg acttctctgg tgacgttggt ctggttggtg gtttctgcta cgcggacgtt 60

tctcagtaca tgaaagacga attccagttc accgacttcg gtgacaaacg tctggacgac 120

cgtctgcagc gtatcggtgt tgcgctgggt ggtgcgccgt ctgaatctat cccgcgtgcg 180

tgcggtgaca aagcgtctac caaagcgacc taccgtttct tcgacaacga aaacgttacc 240

ccggaagaaa tcctgtcttc tcacaaagaa gaaatgaaat ctcgtctgaa atgggttaaa 300

aaagttctgg ttgtttctga caccacctac ctgaccttcc cgtctcaccc gtctaaagaa 360

ggtctgggtg acatcggtaa ctctaaaacc gacgttgaag gtgttctggt tcactctacc 420

atcggtgttc acccggaaac ccgtcgtatg atcggtgtta tggaccagca ggttctggtt 480

caggaccagg aacaggaccc gaccgaaacc tgcgacacca acggtaaaga cgaatctatc 540

cagctggaat ctgaacagga caaatggatc cgtggtgaca aagaagcgat caaaatgctg 600

ccggaagaaa cccgtccgat cttcgttcac gaccgtggtg cggacgactt ctctctgttc 660

aaaaaactga aagaagaagg ttctggtttc gttatccgtg cgtctcagaa ccgttgcatc 720

aaaaccccgt ctggtcaggg taactacctg ctggactggt ctaaaaacct gccggaaatc 780

ggtcagaccg aaatccacat ccagcagcag ggtaaccgta aaggtcgtga cgcgaccctg 840

tctatccaga ccggtacctg cgaactgctg ccgccggaaa aagttccgca ggacacctct 900

ccgtgccagg ttaacgttgt tcgtgcggaa gaaatcgaaa aagaagaaga cccgctgctg 960

tgggttctgc tgaccaccga accggttgaa gacttcgaag acgttctgga agttatcgaa 1020

cactaccgta aacgttgggt tatcgaagac tggcaccgtg cgctgaaaac cggttgccgt 1080

atcgaagaac gtcagctgga aaaatgggaa cgtatggaag ttctgctgtc tatctactct 1140

gttatcgcgt ggaaagttct ggaaatccgt gaaatcgcgc gtaccgaagg tgaaatcgcg 1200

ccggaagaat tcctgaccga aacccagatc gcggttctgg aaggtaaatt cccggacctg 1260

aaaggtaaag gtggtaaaga atacgcggtt gcgatcgcga aagttggtgg ttacctggac 1320

cgttcttctg acccgccgcc gggttggatc gttacctggc gtggtttcaa aaaagttctg 1380

acctgggttg aaggttacga aatcctgtct acc 1413

Claims

1. 一种转座酶高活性突变体，其特征在于所述转座酶高活性突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2. 编码权利要求1所述转座酶高活性突变体的基因，其核酸序列为SEQ ID NO:2。

3.权利要求1所述转座酶高活性突变体在分子生物学领域中的应用。