CN114958808B

CN114958808B - 一种小型编辑基因组的CRISPR/Cas***及其专用的CasX蛋白

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Publication number: CN114958808B
Application number: CN202210620492.9A
Authority: CN
Inventors: 刘俊杰; 张寿悦; 李丹苑
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2042-06-02
Also published as: CN114958808A

Abstract

本发明公开了一种小型编辑基因组的CRISPR/Cas***及其专用的CasX蛋白。CasX蛋白为LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白或CkbCasX蛋白。LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7所示。实验证明，本发明提供的CasX蛋白具有分子量小、非致病菌来源等特点，在低盐浓度下更接近生理条件，有较好的DNA切割活性，可以作为一个新型小分子量的、更适合AAV包裹的CRISPR‑Cas基因编辑***。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种小型编辑基因组的CRISPR/Cas***及其专用的CasX蛋白

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小型编辑基因组的CRISPR/Cas***及其专用的CasX蛋白。

背景技术

基于CRISPR-Cas的基因编辑技术具有巨大的临床治疗潜力，其能实现DNA和RNA编辑到基因表达调制等多种操作，为基因致病突变提供了一种永久纠正的方法。因此，将基于CRISPR-Cas疗法直接应用于人体将为治疗多种疾病带来巨大希望。目前，CRISPR-Cas疗法在多种疾病治疗中的应用已经进入到了临床前和临床测试阶段；但是，真正应用到临床中的还很少，最大的瓶颈就是编辑工具分子的准确性和安全性等还存在一些阻碍，常见的阻碍如下：

1、CRISPR-Cas***的活性窗口限制

除了crRNA通过碱基互补特异性识别序列引导CRISPR-Cas***，不同Cas蛋白还需要识别编辑位点附近特定的PAM序列。比如，SpyCas9识别NGG序列，AsCas12a识别TTTN序列。然而，大约一半的已知致病基因变异是由单核苷酸变异(SNV)引起的，为了编辑不同的SNV需要匹配周围不同的潜在PAM序列。因此，为了满足不同临床疾病的基因编辑需求，需要发现和鉴定更多识别不同PAM序列的新Cas蛋白，以拓展CRISPR-Cas***在基因组中适用的编辑活性窗口。

2、CRISPR-Cas***的脱靶效应

开发CRISPR-Cas***进行基因编辑时希望尽可能降低脱靶效应。降低脱靶效应，从而提高安全性一直是促进CRISPR-Cas***临床应用的重要研究目标。CRISPR-Cas***的脱靶效应的产生主要有两种原因：sgRNA与非靶点DNA序列错配导致的脱靶效应和不依赖sgRNA发生的脱靶效应。不同的Cas蛋白家族由错配导致的脱靶效应有所不同，应进一步筛选临床表现更好的Cas蛋白来构建基因编辑***。

3、CRISPR-Cas***的大小限制

CRISPR-Cas基因治疗在临床应用中的递送过程中，腺相关病毒(AAV)载体已经被广泛使用。尽管已经在临床有比较成熟的应用，AAV载体对CRISPR-Cas***的大小限制仍是其最大的局限性。AAV载体能够单次携带最多约4700个碱基对的DNA序列，但是，最常用的SpyCas9有4200个碱基对，因此其余组件序列的长度都受到了限制。因此，只能选用紧凑型启动子，无法使用组织特异性的启动子或引入更多条件诱导表达的控制因子，也无法完整包裹序列更长的、基于dCas9开发的单碱基编辑***。

4、CRISPR-Cas***的免疫原性

已有研究报道基因编辑***存在的免疫原性。CRISPR-Cas***是衍生自细菌和古细菌的蛋白质复合物，其中有些诸如金黄色葡萄球菌(SaCas9)或化脓性链球菌(SpyCas9)是人体中常见的致病菌，在临床试验中存在引起人体免疫反应的风险。

综上所述，如何在现有基因编辑工具基础上，发现新型、体积更小的、低免疫原性的Cas同源蛋白并深入研究其分子机制，从而探索优化CRISPR-Cas***的活性窗口范围、脱靶效应、体内递送安全性和免疫原性的可能性，是解决CRISPR-Cas***的临床治疗局限性的关键，具有重要的研究意义和价值。

发明内容

本发明的目的是提供体积更小的、低免疫原性的Cas蛋白。

本发明首先保护CasX蛋白，可为LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白或CkbCasX蛋白；

所述LesCasX蛋白可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

所述VemCasX蛋白可为如下b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的蛋白质；

b2)在SEQ ID NO:3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

b4)与SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

所述HrbCasX蛋白可为如下c1)或c2)或c3)或c4)：

c1)氨基酸序列是SEQ ID NO:5所示的蛋白质；

c2)在SEQ ID NO:5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

c3)将c1)或c2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

c4)与SEQ ID NO:5限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

所述CkbCasX蛋白可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)氨基酸序列是SEQ ID NO:7所示的蛋白质；

d2)在SEQ ID NO:7所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有双链DNA切割活性的蛋白质；

d4)与SEQ ID NO:7限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，且具有双链DNA切割活性的蛋白质。

所述LesCasX蛋白识别的PAM序列可为TTA、TTG或TTT。

所述VemCasX蛋白识别的PAM序列可为TTG、TTA或CTG。

所述HrbCasX蛋白识别的PAM序列可为TTA、TTC或TTG。

所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列可为TTA、TTG或TTT。

为了使CasX蛋白便于纯化，可在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQID NO:7所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tagII	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述CasX蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述CasX蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码上述任一所述CasX蛋白的核酸分子。

上述任一所述编码所述LesCasX蛋白的核酸分子可为A1)或A2)或A3)或A4)所示的DNA分子：

A1)编码区为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

A2)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码权利要求1所述LesCasX蛋白的DNA分子；

A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述LesCasX蛋白的DNA分子。

上述任一所述编码所述VemCasX蛋白的核酸分子可为B1)或B2)或B3)或B4)所示的DNA分子：

B1)编码区为SEQ ID NO:4所示的DNA分子；

B2)核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的DNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码权利要求1所述VemCasX蛋白的DNA分子；

B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述VemCasX蛋白的DNA分子。

上述任一所述编码所述HrbCasX蛋白的核酸分子可为C1)或C2)或C3)或C4)所示的DNA分子：

C1)编码区为SEQ ID NO:6所示的DNA分子；

C2)核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的DNA分子；

C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码权利要求1所述HrbCasX蛋白的DNA分子；

C4)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述HrbCasX蛋白的DNA分子。

上述任一所述编码所述CkbCasX蛋白的核酸分子可为D1)或D2)或D3)或D4)所示的DNA分子：

D1)编码区为SEQ ID NO:8所示的DNA分子；

D2)核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的DNA分子；

D3)与D1)或D2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码权利要求1所述CkbCasX蛋的DNA分子；

D4)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述CkbCasX蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述CasX蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述CasX蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述CasX蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成的CasX蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

上述任一所述CasX蛋白或上述任一所述核酸分子在切割双链DNA中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，切割双链DNA时，所述LesCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。所述VemCasX蛋白识别的PAM序列为TTG、TTA或CTG。所述HrbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTC或TTG。所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。

上述任一所述CasX蛋白或上述任一所述核酸分子在定向编辑基因组中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，定向编辑基因组时，所述Cas蛋白切割双链DNA识别的PAM序列如下：所述LesCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT；所述VemCasX蛋白识别的PAM序列为TTG、TTA或CTG；所述HrbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTC或TTG；所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。

本发明还保护一种定向编辑基因组的CRISPR/Cas***，该***中的Cas蛋白为上述任一所述CasX蛋白。

上述CRISPR/Cas***中，定向编辑基因组时，所述Cas蛋白切割双链DNA识别的PAM序列如下：所述LesCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT；所述VemCasX蛋白识别的PAM序列为TTG、TTA或CTG；所述HrbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTC或TTG；所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。

实验证明，在1×150mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为150mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)条件下，LesCasX蛋白对带有TTG、TTA和TTT-PAM的底物都有很强的切割活性；CkbCasX蛋白对带有TTA、TTG和TTT-PAM的底物有一定的切割活性，其中对TTA-PAM的切割相对最强；VemCasX蛋白对带有TTG、CTG和TTA-PAM的底物有很强的切割活性，其中对TTA-PAM的切割相对较弱。在1×300mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为300mM NaCl、10mM MgCl₂和1mMDTT)条件下，HrbCasX蛋白对带有TTA-PAM的dsDNA具有双链切割活性，且随着温度增加，反应活性增强，反应最适合在65℃的相对高温的环境中进行。综上所述，LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白具有分子量小、非致病菌来源等特点，在低盐浓度下，更接近生理条件，有较好的DNA切割活性，可以作为一个新型小分子量的更适合AAV包裹的CRISPR-Cas基因编辑***，有望克服现有CRISPR-Cas***在临床治疗应用中的部分局限性。本发明提供的CasX蛋白可以开发为基因编辑平台，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例2中LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的表达纯化的实验结果。

图2为实施例3中LesCasX蛋白双链DNA切割活性的鉴定结果。

图3为实施例5中LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的底物切割实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

裂解缓冲液：溶剂为pH7.5、20mM HEPES缓冲液，溶质及其浓度为600mM NaCl、30mMimidazole、10％甘油和1mM TECP。

洗脱缓冲液：溶剂为pH7.5、20mM HEPES缓冲液，溶质及其浓度为400mM NaCl、300mM imidazole、1mM TECP和10％甘油。

稀释缓冲液：溶剂为pH7.5、20mM HEPES缓冲液，溶质及其浓度为200mM NaCl和10％甘油。

SEC缓冲液：溶质及其浓度为pH7.5、20mM HEPES缓冲液，溶质及其浓度为150mMNaCl、10％甘油和1mM TECP。

实施例1、LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的发现

本发明的发明人采用生物信息学的方法构建已知Cas12序列特征模型，在细菌基因组中鉴定获得3441个新型未报道的Cas12蛋白，将其中来源于非致病菌的4个蛋白命名为LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白。

LesCasX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码LesCasX蛋白的基因(命名为LesCasX基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

VemCasX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。编码VemCasX蛋白的基因(命名为VemCasX基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

HrbCasX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。编码HrbCasX蛋白的基因(命名为HrbCasX基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

CkbCasX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。编码CkbCasX蛋白的基因(命名为CkbCasX基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2、LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的表达纯化

1、LesCasX蛋白的表达纯化

(1)向2CT-10表达载体(记载于如下文献中：Jun-Jie Liu，Natalia Orlova，etal.CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genomeeditors.Nature.2019.https://doi.org/10.1038/s41586-019-0908-x)的限制性内切酶SspI的识别位点***LesCasX基因，其它序列均不变，得到重组质粒10XHis_MBP_tev_LesCasX。

(2)将步骤(1)构建的重组质粒10XHis_MBP_tev_LesCasX导入大肠杆菌Rosetta，得到重组大肠杆菌，命名为Rosetta/LesCasX。

(3)完成步骤(2)后，将Rosetta/LesCasX单菌落接种于100mL LB培养基，37℃、220rpm振荡培养8h，得到培养菌液1。将培养菌液1接种于2L TB培养基，37℃、220rpm振荡培养直至OD_600nm的值为1.0左右，得到培养菌液2。之后将培养菌液2降温至16℃，再加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.4mM，过夜培养18h，得到培养菌液3。

(4)完成步骤(3)后，取培养菌液3，4000rpm离心15min，收集沉淀。

(5)取步骤(4)收集的沉淀，加入80mL裂解缓冲液重悬，之后超声裂解30min(220W，3s工作，7s间隔)，得到细胞裂解液。取细胞裂解液，15000rpm离心60min，收集上清液。

(6)将步骤(5)收集的上清液上样至重力柱(GE Healthcare公司的产品)，用5-10ml的裂解缓冲液清洗柱材，最后加入10倍柱体积的含300mM咪唑的洗脱缓冲液，得到带有MBP标签的蛋白的洗脱产物。

(7)将步骤(6)获得的带有MBP标签的蛋白的洗脱产物和TEV蛋白酶混合，4℃孵育过夜(目的为切除MBP标签)，得到样品。

(8)完成步骤(7)后，样品经SDS-page胶鉴定切除的效率，之后加入等体积稀释缓冲液，用蠕动泵载样到5ml heparin预装柱中，随后在AKTA仪器上，利用从200mM到1M的氯化钠的盐浓度梯度逐渐增加来竞争性洗脱目标蛋白。洗脱后的成分经SDS-PAGE鉴定，将蛋白条带大小正确的样品装入30kD的浓缩管，3800rpm多次短时离心，只到浓缩到500μL，得到浓缩后的样品。

(9)将步骤(8)得到的浓缩后的样品经1ml上样环上样到Superdex 200 10/300色谱柱，用SEC缓冲液进行洗脱。色谱柱通过颗粒粒径的大小对蛋白进行分离纯化。目标蛋白在11.5mL的洗脱体积后开始出峰，A280和A260的比值接近于2。洗脱后的样品经SDS-PAGE鉴定后用30kD的浓缩管进行浓缩，最后每管10μL进行液氮冻存。第一次纯化的蛋白经质谱分析，进一步确认产物是目标蛋白。通过上述步骤，获得纯化的LesCasX蛋白。

实验结果见图1中A(左图为出峰位置，右图为SDS-PAGE结果)。结果表明，LesCasX在大肠杆菌Rosetta中表达条件简单，产量大，纯度高，质量稳定，每升菌的表达量大约2.6mg。

2、VemCasX蛋白的表达纯化

(1)将pSUMOH10载体(记载于如下文献中：Xiangle Ren，Yang Zhou.，etal.Histone benzoylation serves as an epigenetic mark for DPF and YEATS familyproteins.Nucleic Acids Research，Volume 49，Issue 1，11 January 2021，Pages 114–126.https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1130)的限制性内切酶BamHI和KpnI的识别位点之间的DNA小片段替换为VemCasX基因，其它序列均不变，得到重组质粒pET28b-10XHis-SUMO-VemCasX。

(2)将步骤(1)构建的重组质粒pET28b-10XHis-SUMO-VemCasX导入大肠杆菌Rosetta，得到重组大肠杆菌，命名为Rosetta/VemCasX。

(3)完成步骤(2)后，将Rosetta/VemCasX单菌落接种于100mL TB培养基，37℃、220rpm振荡培养6-8h，得到培养菌液1。将培养菌液1接种于2L TB培养基，37℃、220rpm振荡培养直至OD_600nm值为1.0-1.2，得到培养菌液2。之后将培养菌液2降温至16℃，再加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.4mM，过夜培养18h，得到培养菌液3。

(4)完成步骤(3)后，取培养菌液3，4000rpm离心15min，收集沉淀。

(6)将步骤(5)收集的上清液上样至重力柱，用5-10ml的裂解缓冲液清洗柱材，最后加入10倍柱体积的含300mM咪唑的洗脱缓冲液，得到带有SUMO标签的蛋白的洗脱产物。

(7)将步骤(6)获得的带有SUMO标签的蛋白的洗脱产物和100μL UlpI蛋白酶混合，冰上反应30min，得到样品。

(8)完成步骤(7)后，样品经SDS-page胶鉴定切除SUMO标签的效率，之后加入等体积稀释缓冲液，用蠕动泵载样到5ml heparin预装柱中，随后在AKTA仪器上，利用从200mM到1M的氯化钠的盐浓度梯度逐渐增加来竞争性洗脱目标蛋白。洗脱后的成分经SDS-PAGE鉴定，将蛋白条带大小正确的样品装入30kD的浓缩管，3800rpm多次短时离心，只到浓缩到1mL，得到浓缩后的样品。

(9)将步骤(8)得到的浓缩后的样品经1ml上样环上样至Superdex 200 10/300色谱柱，用SEC缓冲液进行洗脱。色谱柱通过颗粒粒径的大小对蛋白进行分离纯化。目标蛋白在12ml左右的洗脱体积后开始出峰，A280和A260的比值接近于2。洗脱后的样品经SDS-PAGE鉴定后用30kD的浓缩管进行浓缩，最后每管10μL进行液氮冻存。

实验结果见图1中B(左图为出峰位置，右图为SDS-PAGE结果)。结果表明VemCasX蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达产量高，纯度高，且质量稳定。

3、HrbCasX蛋白的表达纯化

将步骤2中(1)的VemCasX基因替换为HrbCasX基因，其它步骤均不变，进行HrbCasX蛋白的表达纯化。

实验结果见图1中C(左图为出峰位置，右图为SDS-PAGE结果)。结果表明HrbCasX蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达产量高，纯度高，且质量稳定。

4、CkbCasX蛋白的表达纯

将步骤2中(1)的VemCasX基因替换为CkbCasX基因，其它步骤均不变，进行CkbCasX蛋白的表达纯化。

实验结果见图1中D(左图为出峰位置，右图为SDS-PAGE结果)。结果表明CkbCasX蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达产量高，纯度高，且质量稳定。

实施例3、LesCasX蛋白的双链DNA切割活性的鉴定

1、人工合成单链DNA分子甲：5’-CCGCGGGATTTCAAGGGCGACACCCTGGTGAACGACAATGAATATTTCGGCGCAGCGGC-3’和单链DNA分子乙：5’-GCCGCTGCGCCGAAATATTCATTGTCGTTCACCAGGGTGTCGCCCTTGAAATCCCGCGG-3’，用去离子水分别将单链DNA分子甲和单链DNA分子乙稀释至100μM，得到单链DNA分子甲稀释液和单链DNA分子乙稀释液；然后进行退火反应，得到双链底物DNA(即底物)。

双链底物DNA中含有PAM序列(TTCA)和gRNA靶向的protospacer序列，non-targeting strand带有5’-NH²标记。

双链底物DNA中PAM序列为TTCA，gRNA靶向的protospacer序列为5’-AGGGCGACACCCTGGTGAAC-3’，在含有PAM序列的非靶向链的5’端带有-NH₂的化学标记。

2、取步骤1得到的双链底物DNA，加入Cyanine5 NHS ester染料(双链底物DNA和Cyanine5 NHS ester染料的浓度比为1mM:10mM)，反应，得到Cyanine5标记的双链底物DNA。此反应利用Cyanine5 NHS ester染料和氨基的相互作用在双链底物DNA的非靶向链的5‘端上加Cyanine5的荧光标记，得到Cyanine5标记的双链底物DNA。

3、完成步骤2后，将Cyanine5标记的双链底物DNA、gRNA-1(SEQ ID NO:9所示)、实施例2纯化的LesCasX蛋白在切割缓冲液中混合，室温放置30min。随后加入带标记的底物，37℃进行孵育。孵育期间，分别在第0、2、5、10、15、30、60、120min取样，获得产物。

切割缓冲液由KCl、MgCl₂、DTT和pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液组成。切割缓冲液中，KCl的浓度为10mM、25mM、50mM、100mM、150mM或200mM，MgCl₂的浓度为10mM，DTT的浓度为1mM。

4、完成步骤3后，向产物中分别加入等体积的stop-loading(含95％Formamide、30mM EDTA和50μg/ml heparin的水溶液)终止反应，之后使用尿素-PAGE凝胶结合荧光成像仪扫描相应的信号，并对底物和产物进行定量分析，统计切割比例，并用Prism软件利用非线性回归分析模拟曲线。

切割比例＝产物条带的灰度值/(产物条带灰度值+底物条带灰度值)

尿素-PAGE凝胶荧光扫描实验结果见图2中A(S为底物，P为产物)。结果表明，随着时间的递增，产物的信号越来越强，说明被切割的底物越来越多；同时，盐浓度越低，LesCasX蛋白的DNA切割活性越强。

底物和产物的定量分析结果见图2中B(横坐标为取样的时间点；纵坐标为相应时间点内，被切割的产物的条带的灰度值和整个未切割底物和切割产物总灰度值的比值)。结果表明，KCl浓度越低，LesCasX蛋白对底物的切割速率越高，高于100mM的KCl浓度时，切割速率显著下降。

综上所述，LesCasX蛋白具有分子量小、非致病菌来源(低免疫原性)等特点，在低盐浓度下(更接近生理条件)有较好的双链DNA切割活性，可以作为一个新型的、更适合AAV包裹的CRISPR-Cas基因编辑***，有望克服现有CRISPR-Cas***在临床治疗应用中的部分局限性。

实施例4、LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的PAM序列的分析

一、随机PAM的质粒库的建立

1、人工合成两个带有互补序列的单链DNA分子，分别为5’-gcctgcaggtcgactctagaggatcNNNNNAGGGCGACACCCTGGTGAACg-3’(N为A、T、G或C)和5’-ggccagtgaattcgagctcggtacGTTCACCAGGGTGTCGCC-3’；之后将两个单链DNA分子在1×Annealingbuffer(含25mM KCl的pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液)中进行退火(退火程序为95℃5min)，缓慢降温至室温，得到退火产物。

2、取pUC19载体(TIANGEN公司，Addgene编号为#50005)，用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切，回收载体骨架。

3、将步骤1得到的退火产物和步骤2回收的载体骨架进行同源重组，之后转化大肠杆菌DH5α，得到重组菌。用无内毒素质粒大提试剂盒(天根，DP117)对重组菌进行质粒提取，获得携带随机PAM的质粒库。

二、PAM序列的分析

1、将Cas蛋白、gRNA和携带随机PAM的质粒库按照10:15:1的比例混合，之后在cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液；溶质为300mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)中37℃反应60min，加入EDTA终止反应。使用1.2％的agarose gel将线性化的质粒回收。

当Cas蛋白为LesCasX蛋白时，gRNA为gRNA-28(SEQ ID No：10所示)。

当Cas蛋白为VemCasX蛋白时，gRNA为gRNA-29(SEQ ID No：13所示)。

当Cas蛋白为HrbCasX蛋白时，gRNA为gRNA-22(SEQ ID No：11所示)。

当Cas蛋白为CkbCasX蛋白时，gRNA为gRNA-23(SEQ ID No：12所示)。

2、组装末端修复体系；之后11℃反应20min，75℃反应10min。

末端修复体系为40μL，由20μL线性化的质粒、8μL 5×T4 polymerase buffer、1.6μL(to the final 0.1mM each)10mM dNTP、10μL Nuclease free water和0.4μL T4 DNApolymerase组成。

3、向完成步骤2的体系中加入1μL dATP、1μL Dreamtaq聚合酶(Thermo，EP0702)，72℃反应30min(用于dA添加)，回收产物。

4、将步骤3回收的产物和adapter序列(32bp)用T4 DNA ligase(碧云天，D7003)进行连接(室温反应30min)，之后使用beads(诺唯赞，N411-03)回收产物。

Adapter序列为：5’-CGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGG-3’和5’-CCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGT-3’。

5、以步骤4回收的产物为模板，采用F：5’-ATGTTGTGTGGAATTGTGAGCG-3’和R：5’-CCTTGAAGTCGATGCCCTTCAG-3’进行PCR扩增，使用beads回收PCR扩增产物。

6、使用TIANSeq快速DNA文库构建试剂盒(目录号：NG102)对步骤5回收的PCR扩增产物进行文库构建，样品送诺禾致源公司测序，获得二代测序文库。

经数据分析，LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的PAM序列见表1。

表1

	PAM序列
		LesCasX蛋白	TTA；TTG；TTT
VemCasX蛋白	TTG；TTA；CTG
		HrbCasX蛋白	TTA；TTC；TTG
CkbCasX蛋白	TTA；TTG；TTT

实施例5、LesCasX蛋白、VemCasX蛋白、HrbCasX蛋白和CkbCasX蛋白的底物切割实验

一、gRNA的合成

根据LesCasX基因的核苷酸序列设计并合成gRNA-28，gRNA-28的核苷酸序列如SEQID No：10所示。根据HrbCasX基因的核苷酸序列设计并合成gRNA-22，gRNA-22的核苷酸序列如SEQ ID No：11所示。根据CkbCasX基因的核苷酸序列设计并合成gRNA-23，gRNA-23的核苷酸序列如SEQ ID No：12所示。根据VemCasX基因的核苷酸序列设计并合成gRNA-29，gRNA-29的核苷酸序列如SEQ ID No：13所示。

二、切割底物的制备

根据实施例4中步骤一建立的随机PAM的质粒库，构建含有单独PAM序列的pUC9-PAM质粒(环形)，作为切割底物。

每个pUC9-PAM质粒由DNA片段1、PAM序列、gRNA靶向的Protospacer序列和DNA片段2组成。DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID No：14自5’末端起第1至567位所示，DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID No：14自5’末端起第591至989位所示。

针对LesCasX蛋白的Protospacer序列为5’-AGGGCGACACCCTGGTGAAC-3’，PAM序列分别为TTA、TTG、TTT、TTCA和CCA。当PAM序列为TTA时，pUC9-PAM质粒的核苷酸序列如SEQ IDNo：14所示。

针对CkbCasX蛋白的Protospacer序列为5’-AGGGCGACACCCTGGTGAAC-3’，PAM序列分别为TTA、TTG、TTT和CCA。

针对VemCasX蛋白的Protospacer序列为5’-AGGGCGACACCCTGGTGAAC-3’，PAM序列分别为TTG、TTA和CTG。

针对HrbCasX蛋白的Protospacer序列为5’-AGGGCGACACCCTGGTGAAC-3’，PAM序列分别为TTA。

三、切割反应

1、LesCasX蛋白的底物切割实验

在1×150mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为150mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)或1×300mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为300mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)的体系中，将LesCasX蛋白、gRNA-28和针对LesCasX蛋白的切割底物dsDNA按照1500nM：2250nM：50nM的比例混合，37℃反应30min；加入EDTA终止反应；之后加入proteinase K(Solarbio，P1121)并使其在体系中的浓度为100μg/mL，继续消化60min；采用2％agarose gel进行分析。

按照上述步骤，将“LesCasX蛋白、gRNA-28和针对LesCasX蛋白的切割底物dsDNA按照1500nM：2250nM：50nM的比例混合”替换为“LesCasX蛋白和针对LesCasX蛋白的切割底物dsDNA按照1500nM：50nM的比例混合”，其它步骤均不变。

分析结果见图3中A(150mM代表反应体系为1×150mM-cleavage buffer，300mM代表反应体系为1×300mM-cleavage buffer)。结果表明，在1×150mM-cleavage buffer条件下，LesCasX蛋白对带有TTG、TTA和TTT-PAM的底物都有很强的切割活性；在1×300mM-cleavage buffer条件下，LesCasX蛋白的切割活性变弱，同时对TTG-PAM的切割活性最强。总之，LesCasX蛋白对含有TTG-PAM序列的双链DNA底物的切割活性最强。

2、CkbCasX蛋白的底物切割实验

按照步骤1的方法，将LesCasX蛋白替换为CkbCasX蛋白，gRNA-28替换为gRNA-23，针对LesCasX蛋白的切割底物dsDNA替换为针对CkbCasX蛋白的切割底物dsDNA，其它步骤均不变。

分析结果见图3中B。结果表明。在1×150mM-cleavage buffer条件下，CkbCasX蛋白对带有TTA、TTG和TTT-PAM的底物有一定的切割活性，其中对TTA-PAM的切割相对最强；在1×300mM-cleavage buffer条件下，CkbCasX蛋白对TTG-PAM仍有明显的切割。总之，CkbCasX蛋白对含有TTG-PAM序列的双链DNA底物的切割活性最强。

3、VemCasX蛋白的底物切割实验

按照步骤1的方法，将LesCasX蛋白替换为VemCasX蛋白，gRNA-28替换为gRNA-29，针对LesCasX蛋白的切割底物dsDNA替换为针对VemCasX蛋白的切割底物dsDNA，其它步骤均不变。

分析结果见图3中C。结果表明，在1×150mM-cleavage buffer条件下，VemCasX蛋白对带有TTG、CTG和TTA-PAM的底物有很强的切割活性，其中对TTA-PAM的切割相对较弱；在1×300mM-cleavage buffer条件下，VemCasX蛋白只对TTG显示出切割活性。总之，VemCasX蛋白对含有TTG-PAM序列的双链DNA底物的切割活性最强。

4、HrbCasX蛋白的底物切割实验

(1)实验组

在1×300mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为300mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)的体系中，将HrbCasX蛋白、gRNA-22和针对HrbCasX蛋白的切割底物dsDNA按照2500nM：3750nM：50nM的比例混合，得到混合物。由于HrbCasX的宿主属于嗜热菌，所以将混合物在不同的温度梯度(分别为25℃、37℃、45℃、55℃和65℃)中反应60min，加入EDTA终止反应；之后加入proteinase K并使其在体系中的浓度为100μg/mL，继续消化60min；采用2％agarose gel进行分析。

(2)对照组

按照实验组的步骤，将“HrbCasX蛋白、gRNA-22和针对HrbCasX蛋白的切割底物dsDNA按照2500nM：3750nM：50nM的比例混合”替换为“HrbCasX蛋白和gRNA-22按照2500nM：3750nM的比例混合”，其它步骤均不变。

按照实验组的步骤，将“在1×300mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为300mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)的体系中，将HrbCasX蛋白、gRNA-22和针对HrbCasX蛋白的切割底物dsDNA按照2500nM：3750nM：50nM的比例混合，得到混合物”替换为“在1×300mM-cleavage buffer(溶剂为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为300mM NaCl、10mM MgCl₂和1mM DTT)的体系中加入针对HrbCasX蛋白的切割底物dsDNA，得到混合物；混合物中，切割底物dsDNA的浓度为50nM”；其它步骤均不变。

分析结果见图3中D。结果表明，HrbCasX蛋白对带有TTA-PAM的dsDNA具有双链切割活性，且随着温度增加，反应活性增强；反应最适合在65℃的相对高温的环境中进行。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

<110> 清华大学

<120> 一种小型编辑基因组的CRISPR/Cas***及其专用的CasX蛋白

<160>14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>899

<212>PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Pro Thr Lys Asn Arg Lys Thr Asp Ser Thr Ser Ile His Ala Ser

1 5 10 15

Leu Arg His Leu Leu Gln Leu Gly Leu Lys Arg Ser Glu Ala Ala Ile

20 25 30

Pro Gln Thr Ile Thr Arg Thr Ala Lys Phe Lys Ile Asn Thr Ala Ile

35 40 45

Lys Pro Gly Leu Ile Pro Leu Leu Asn Ala Gln Phe Asp Ala Val Glu

50 55 60

Gly Phe Arg Arg Lys Val Leu Gly Glu Leu Glu Ala Trp Trp Asn Glu

65 70 75 80

Asp Pro Glu Ala Phe Gln Lys Met Val Lys Cys Ser Met Lys Met Lys

85 90 95

Phe Gln Gly Lys Ser Ser Cys Tyr Ala Trp Leu Tyr Thr His Phe Leu

100 105 110

Lys Gly Ala Thr Leu Ala Gln Gly Leu Ser Arg Asp Ala Ala Asn Ser

115 120 125

Leu Leu Asp Asn Met Gly Gly Gly Leu Lys Ser Phe Leu Thr Arg Arg

130 135 140

Ala His Val Ala Glu Glu Ile Arg Lys Arg Tyr Asp Gln Asn Leu Gly

145 150 155 160

Asp Trp Asp Asp Gly Leu Lys Asp Leu Ala Ala Glu His Gly Leu Glu

165 170 175

Leu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Val Asn Phe Glu Lys Leu Thr Ala Gln

180 185 190

Glu Ile Glu Lys Tyr Asn Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg Ala Trp Gly

195 200 205

Asn Leu Leu Leu Ile Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Arg Asp Ala Cys

210 215 220

Leu Pro Arg Tyr Leu Lys Gly Tyr Pro Gly Phe Pro Gly Ser Gln Arg

225 230 235 240

Tyr Ala Thr Ala Ser Ala Met Ala Ala Ala Leu Ala Glu Leu Glu Gln

245 250 255

Ala Ala Arg Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Arg Ala Arg Phe Ala Lys Val

260 265 270

Ser Ala Glu Ser Trp Ala Gln Thr Val Glu Arg Phe Ala Pro Ala Pro

275 280 285

Val Arg Ala Glu His Gly Arg Pro Glu Pro Arg Thr Ala His Gln Thr

290 295 300

Val Ser Ala Arg Leu Ala Ala Leu Ile Ala Ala Gln Pro Gly Trp Gln

305 310 315 320

Pro Ala Gln Leu Ala Glu Glu Ile Leu Ala Gly Val Leu Arg Gly Ala

325 330 335

Glu Lys Leu Lys Thr His Leu Ser Lys Cys Gly Ser His Asp Arg Gln

340 345 350

Ala Val Ile Lys Leu Ala Asn Leu Tyr Asn Val Ala Val Ala Phe Ala

355 360 365

Leu Glu Pro Val Arg Val Ala Gly Asp Tyr Leu Ser Phe Tyr Ala Glu

370 375 380

Glu Thr Pro Lys Arg Lys Ala Phe Gly Asn Val Arg Gly Ala Leu His

385 390 395 400

Gln Pro Ser Asp Asp Thr Ala Ala Ile Gln Ile Thr Gly Phe Ser Ile

405 410 415

Asn Asp Glu Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Gly Leu Leu Val Cys Lys Gln

420 425 430

Ser Gly Asp Arg Leu His Asp Glu Trp Ala Phe Leu Phe Cys His Gln

435 440 445

Pro Gly Gln Val Phe Gln Leu Ala Ala Glu Asp Ala Lys Leu Arg Gly

450 455 460

Lys Ile Leu Thr Glu Trp Leu Gly Phe Gly Ser Gln Gly Gly Ser Arg

465 470 475 480

Lys Lys Ala Glu Ala Ser Ala Lys Lys Met Ile Arg Arg Pro Val Trp

485 490 495

Met Asn Glu Lys Thr Pro Pro Thr Ile Leu Pro Leu Ala Phe Gly Val

500 505 510

Arg Gln Gly Arg Glu Tyr Leu Trp His Phe Asp Arg Asn Leu Arg Thr

515 520 525

Lys Glu Gly Trp Val Leu Gly Asn Gly Arg Leu Leu Arg Val Met Pro

530 535 540

Pro Gly Arg Pro His Ala Ala Asp Phe Tyr Leu Thr Leu Thr Leu Glu

545 550 555 560

Arg Glu Ala Pro Pro Leu Ala Glu Val Ala Ala Glu Lys Tyr Ile Gly

565 570 575

Ile Asp Arg Gly Glu Ala Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ile Ile Asp Arg

580 585 590

Glu Gly Arg Leu Leu Ala Gly Gly Lys Ile Ala Glu Ala Phe Arg Asp

595 600 605

Gln Gln Arg Lys Thr Asn Asp Glu Lys Arg Glu Leu Gln Arg Thr Ala

610 615 620

Gly Gly Tyr Thr Lys Ala Phe Arg Ser Lys Glu Arg Asn Arg Ala Arg

625 630 635 640

Ala Leu Gly Gly Glu Val Thr Arg Ala Ile Phe Ala Leu Ser Ala Ala

645 650 655

His Arg Ala Pro Val Ile Leu Glu Asn Leu Asn Ser Ser Leu Ala Thr

660 665 670

Arg Gly Gly Lys Gly Thr Met Met Ser Gln Met Gln Tyr Glu Arg Met

675 680 685

Leu Val Ala Leu Glu Gln Lys Phe Ala Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Leu

690 695 700

Pro Ser Ala Pro Lys Tyr Arg Lys Gly Asp Asn Gly Phe Ile Lys Leu

705 710 715 720

Val Gly Pro Ala Tyr Thr Ser Ala Thr Cys Ser Ala Cys Gly His Val

725 730 735

His Ser Ser Asp Phe Tyr Glu Lys Leu Ala Asp Thr Leu Glu Gly Lys

740 745 750

Cys Gly Ser Ser Trp Cys Val Thr Leu Pro Asn Gly Glu Gln Gln Gln

755 760 765

Leu Pro Asp Ala Tyr Thr Phe Trp Leu Lys Gly Lys Gly Glu Gln Thr

770 775 780

Lys Ser Thr His Glu Arg Leu Glu Glu Leu Leu Lys Gly Lys Ser Val

785 790 795 800

Ala Lys Leu Ala Lys Thr Asn Arg Arg Lys Leu Val Gly Leu Leu Lys

805 810 815

Ser Arg Trp Leu Pro Tyr Arg Ala Thr Gln Ala Asp Phe Ser Cys Val

820 825 830

Leu Cys Gly His Thr Met Asn Ala Asp Glu Gln Gly Ala Leu Asn Ile

835 840 845

Ala Arg Lys Phe Leu Phe Arg Thr Glu Arg Gly Lys Gln Ala Gly Glu

850 855 860

Leu Thr Glu Ala Glu Arg Arg Lys Met Arg Ala Asp Trp Gln Asn Trp

865 870 875 880

Tyr Lys Glu Lys Leu Arg Thr Val Trp Arg Ala Pro Glu Arg Gly Asp

885 890 895

Gly Asn Gly

<210>2

<211> 2697

<212>DNA

<213> Artificial sequence

<400>2

atgccaacta aaaaccgcaa aactgacagc acctctattc acgcatctct gcgccacctg 60

ctgcaactgg gcctgaaacg ctctgaagct gctatcccac agaccatcac tcgcaccgct 120

aaattcaaaa ttaacaccgc tattaaaccc ggcctgattc cactgctgaa cgcccagttc 180

gacgccgtgg aaggcttccg ccgcaaggtg ctgggcgaac tagaagcatg gtggaacgaa 240

gatcctgaag cattccagaa aatggtcaaa tgctccatga aaatgaaatt ccagggtaaa 300

agctcttgtt acgcttggct gtacacccac ttcctgaaag gcgcaaccct ggctcagggc 360

ctgtctcgcg acgcagctaa ctccctgctg gataacatgg gcggcggcct gaaaagcttc 420

ctgacccggc gcgcccacgt ggccgaagaa atccgcaaac gctatgacca aaacctgggc 480

gactgggatg atggcctgaa agacctggct gctgaacacg gcctggaact gcccccacca 540

ccaccccgcg tgaacttcga gaaactgacc gcccaggaga ttgaaaaata caacgactgg 600

gtgggccgca cccgcgcttg gggcaacctg cttctgatcc agaagaaaaa ggtggaacgc 660

cgcgacgcct gtctgccacg ctatctgaaa ggctacccag gctttcctgg ctctcagcgc 720

tacgctactg catccgcaat ggctgctgct ctcgctgaac tcgaacaggc tgcccgcgag 780

cagtacggca aagcacgcgc acgcttcgct aaagtgagcg ctgaatcctg ggctcaaacc 840

gtcgaacgct ttgcaccagc tcccgtgcgc gctgaacacg gccgcccaga acctcgcact 900

gcgcaccaga ccgtgagcgc acgcctggca gctctgatcg cagcccagcc gggctggcag 960

cctgctcagt tggctgaaga gatcctggct ggcgtgctgc gcggcgctga aaaactgaaa 1020

acccacctgt ccaaatgcgg ctcgcacgat cggcaggctg tcattaaact ggccaacctg 1080

tataacgtgg cagtcgcttt tgcactggaa ccagtgcgcg tggcaggcga ctacttgtcc 1140

ttctacgcag aagaaacccc aaaacgcaaa gctttcggca acgtgcgcgg cgccctgcac 1200

caaccatcgg atgataccgc cgctatccag atcaccggct tttccatcaa cgacgaaggc 1260

agcccaaact ataacgggct gctggtgtgc aaacagtctg gcgatcgcct tcatgatgaa 1320

tgggcattcc tgttctgcca ccaaccaggc caggtgttcc agctggccgc cgaagatgct 1380

aaactgcgcg gcaaaatcct gaccgaatgg ctcggcttcg gctctcaggg cggctctcgg 1440

aaaaaagcag aagcatctgc aaagaaaatg atccggcgcc ctgtctggat gaacgaaaaa 1500

accccaccaa ctatcctgcc tctggctttc ggggtccgcc agggccgcga atacctctgg 1560

cactttgacc gcaacctgcg caccaaagaa ggctgggtgc tgggcaacgg ccgcctgctg 1620

cgcgtgatgc ctccaggccg ccctcacgct gcggatttct acctgactct gaccctggaa 1680

cgcgaagccc ctccactggc agaagtcgca gctgaaaaat atatcggcat cgaccgcggc 1740

gaagcagtgc cagcagctta cgccatcatc gatcgcgaag gccgcctgct cgctggcggc 1800

aaaattgctg aagcattccg cgatcagcag cgcaaaacca acgatgagaa acgcgaactc 1860

cagcgcaccg ctggcggcta tactaaagca ttccgctcta aagaacgcaa ccgcgctcgc 1920

gcactgggcg gcgaagtgac cagagctatt ttcgccctga gcgctgcaca ccgcgcacca 1980

gtcatcctgg aaaacctgaa ctcctccctg gccacccgcg gaggaaaagg cactatgatg 2040

agccagatgc agtacgaacg catgctcgtc gctcttgaac agaaattcgc tgaagccggc 2100

ctgtacgcac tgccaagtgc tcctaaatac cgtaagggcg acaacggctt catcaaactg 2160

gtcggccctg cttacacttc tgccacctgc tctgcctgcg gccacgtgca ttcttctgac 2220

ttttatgaaa aactggcaga caccctggaa ggcaaatgtg gctcttcctg gtgtgtgacc 2280

ctgcctaacg gcgaacagca gcagctgcct gacgcataca ccttctggct gaaaggcaaa 2340

ggcgaacaga ctaagtctac ccatgaacgc ctggaagaac tgctgaaggg caaatctgtg 2400

gctaaactgg cgaaaaccaa ccgccgcaaa ctggtcggcc tgctgaaatc ccgctggctg 2460

ccataccgcg ccacccaggc agatttctct tgcgtcctgt gcggccatac catgaacgct 2520

gacgaacagg gcgccctgaa catcgcccgc aaattcctgt tccgcactga acgcggcaaa 2580

caggctggcg aactgactga ggctgaacgc cgcaaaatgc gcgctgattg gcagaactgg 2640

tataaagaaa aactgcgcac tgtgtggcgc gcacctgaac gcggcgacgg caacggc 2697

<210>3

<211>880

<212>PRT

<213> Artificial sequence

<400>3

Met Lys Thr Lys Asn Arg Ser Asn Ser Ile His Ala Ser Leu Arg Gln

1 5 10 15

Leu Leu Ala Leu Gly Leu Ser Lys Ser Ser Ser Ala Glu Pro Gln Arg

20 25 30

Ile Thr Arg Thr Val Lys Phe Lys Ile Asn Thr Asp Ile Arg Pro Asp

35 40 45

Leu Ile Pro Val Leu Asn Arg His Phe Asp Phe Phe Glu Lys Phe Arg

50 55 60

Arg Lys Val Leu Ala Glu Leu Glu Ala Leu Trp Asn Lys Asp Gln Lys

65 70 75 80

Ser Phe Gln Ala Met Val Gln Cys Ser Ala Lys Lys Pro Tyr Gln Lys

85 90 95

Lys Thr Ser Cys Tyr Ala Trp Leu Asp Thr His Phe Ile Thr Glu Ala

100 105 110

Lys Glu Ser Leu Asp Leu Pro Arg Lys Pro Ala Thr Ser Leu Leu Tyr

115 120 125

Asn Leu Ser Gly Gly Leu Lys Ser Phe Leu Thr Arg Arg Glu Thr Val

130 135 140

Ala Glu Asp Ile Gln Lys Arg Phe Asn Asp Asn Leu Arg Glu Trp Asn

145 150 155 160

Gly Asp Leu Ser Gln Leu Ala Ser Asp Leu Lys Ala Pro Leu Pro Pro

165 170 175

Ala Pro Pro Asn Leu Asp Phe Glu Asn Leu Ile Glu Lys Ala Ile Glu

180 185 190

Lys Tyr Asn Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg Ala Trp Cys Asn Leu Ile

195 200 205

Leu Val Gln Gln Lys Lys Val Glu Arg Arg Asp Ala Cys Leu Pro Arg

210 215 220

Tyr Leu Lys Gly Tyr Pro Gly Phe Phe Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Thr

225 230 235 240

Thr Ala Gly Leu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Leu Glu Gln Val Ala Arg

245 250 255

Glu Gln Ser Lys Lys Met Pro Thr Arg Phe Ala Lys Leu Thr Pro Glu

260 265 270

Ile Trp Thr Ala Ile Gln Glu Arg Phe Ser Pro Pro Glu Val Cys Glu

275 280 285

Ala Gly Glu Lys Arg Arg Pro Arg Thr Ala His Gln Thr Val Cys Leu

290 295 300

Arg Phe Ala Ala Leu Arg Ala Ala His Pro Glu Trp Thr Pro Val Gln

305 310 315 320

Leu Ala Glu Glu Ile Leu Ala Gly Ile Phe Arg Gly Ala Glu Lys Leu

325 330 335

Lys Lys His Leu Ala Ala Asn Gly Phe Thr Asp Arg Pro Ala Val Ile

340 345 350

Lys Leu Ala Asn Leu Tyr Asn Val Ala Ala Ala Phe Ser Leu Asp Pro

355 360 365

Ile Arg Ala Ala Gly Asp Tyr Ile Leu Phe Tyr Glu Glu Glu Thr Pro

370 375 380

Lys Arg Asn Ala Phe Gly Asp Val Arg Gly Gly Leu His Gln Pro Ser

385 390 395 400

Asp Glu Ser Ala Ala Ile Glu Ile Met Gly Phe Gly Leu Gln Lys Glu

405 410 415

Ser Gly Lys Pro Leu Tyr Asn Gly Leu Leu Val Cys Lys Lys Ser Glu

420 425 430

Lys Glu His Asp Asp Ser Trp Ala Phe Leu Tyr Cys His Thr Glu Gly

435 440 445

Gln Thr Phe Glu Leu Ala Asn Glu Lys Ala Lys Leu Arg Gly Lys Leu

450 455 460

Leu Thr Asp Trp Thr Gly Phe Ala Ser Arg Gly Gly Ser Arg Lys Lys

465 470 475 480

Ala Glu Ala Ser Ala Lys Gln Leu Ala Arg Gly Arg Val Trp Ile Ser

485 490 495

Glu Lys Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Leu Ala Phe Gly Ser Arg Gln

500 505 510

Gly Arg Glu Tyr Leu Trp His Phe Asp Arg Asp Leu Arg Glu Lys Asn

515 520 525

Glu Trp Val Leu Gly Asn Gly Arg Leu Leu Arg Ile Met Pro Pro Gly

530 535 540

Gln Pro Asn Ala Ala Asp Phe Tyr Leu Ala Ile Thr Leu Glu Arg Gln

545 550 555 560

Val Pro Pro Leu Ala Asp Ile Lys Ala Glu Arg Phe Ile Gly Ile Asp

565 570 575

Arg Gly Glu Ala Ile Pro Ala Ala Tyr Ala Val Ile Asp Glu Leu Gly

580 585 590

Lys Leu Leu Ala Ser Gly Lys Ile Ala Glu Ser Tyr Arg Lys Gln Gln

595 600 605

Arg Glu Phe Asn Asp Ala Lys Arg Glu Leu Gln Arg Thr Gln Gly Gly

610 615 620

Tyr Thr Arg Trp Leu Arg Ser Lys Glu Arg Asn Arg Ala Arg Ala Leu

625 630 635 640

Ser Gly Glu Val Thr Arg Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Glu His Arg

645 650 655

Ala Pro Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Ser Ser Leu Ala Met Arg Gly

660 665 670

Gly Lys Lys Thr Met Met Ser Leu Met Gln Tyr Gln Pro Val Gln Arg

675 680 685

Ala Leu Glu Gln Lys Phe Leu Glu Ala Gly Leu Trp Glu Ala Pro Lys

690 695 700

Arg Lys Gln Lys Phe Pro Lys Lys Asp Asn Gly Phe Ile Lys Leu Ile

705 710 715 720

Asp Ala Trp Trp Thr Ser Arg Thr Cys Ser Gln Cys Gly Asn Thr His

725 730 735

Ser Ser Glu Phe Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Thr Leu Thr His Ala Pro

740 745 750

Asp Glu Lys Trp Cys Val Thr Val Cys Glu Arg Pro Phe Val Leu Pro

755 760 765

Asp Thr Tyr Gln Tyr Arg Phe Arg Gly Glu Asp Lys Val Gly Asn Thr

770 775 780

Asn Glu Arg Leu Gln Ser Leu Leu Lys Gly Lys Gln Ile Lys Glu Leu

785 790 795 800

Thr Gly Lys Gln Arg Glu His Leu Ile Glu Phe Leu Glu Arg Leu Leu

805 810 815

Ser Phe Arg Pro Gln Gln Ala Asn Phe Arg Cys Leu Lys Cys Gly Tyr

820 825 830

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Leu Phe Glu Leu Glu His Pro Pro Lys Lys Gly Glu Lys Asp Arg Arg

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cgcgaacgcc agacctcccg ctccctgacc gtgggcaacg tgaccggcaa gctgggccgc 1920

tacggcctga ttctgcctct gtccttcggc actagccagg cccggcgcta cctgtggctg 1980

tcccacaagc atcgcggcga cgagctgctg tctgccatcg aggccgccag cgtcaacatc 2040

aagaacgccc gcatcatccg cgagcagacc aagggcggga gccgcctgta cgtcgccctg 2100

gctgtggagc gcccatacgt gcctatcgac gccaccacca agcaggtgga gggctacatt 2160

ggcgtggacc gcggcgagtc cgccctggcc gtctttgctc gcgtcgatac caacggccgc 2220

ctgcaggaga ccccacagag ctttggcgag ctgcctaaga agatccgccg cgcctacaac 2280

cgggtccgcc agcagcagag ccaggccaag cgcctggtgg gcggcacctg gttcgcccac 2340

aagattgata actacgtccg ccagattgcc attagagccg tggatgccat gctgacccac 2400

tgctgcggca tcgccctgga gcacctgagc cggggcttcg cccgcggcgg caccgccagc 2460

tgggagcacc agtacactaa ggtcgccgat aagctgattg acgtgctgag ctttgccggc 2520

ttcactgtgc caactaacgg cgagctcttc cctctgggcg tgaagagcaa gcaccactgg 2580

ttcggcgcca tcccacctgg caacaccagc cggacctgcc ctaagtgcgc cgccgtgtgg 2640

tccaacccaa ttgagctgaa gctggccaac ggcagcttca ccctgaccta ccgcgatgag 2700

ctgcgcgaga acattaaggc cctgaagctg gagcgcgatg tgagcggcgt gtggcatggc 2760

agctggctgg ccgacggcaa gaagatccag agcttcactc ctaagtccct gaaggagctg 2820

aacagcctga ccaacaagct ggccaccgcc aagggcgatg agcgccgcaa gctggagcgc 2880

gatatgctcg agctgttcaa gcaccgccac cgcaacacct acgaccgctt ttactgtctg 2940

ctgtgcaaca ttgagctgaa cgccgataag gtgggcgccc tgaacatcgc ccgcaaggcc 3000

atctaccagc tggagggcaa gccaccacag ggcatcagcc tggagaagga gaagcgccgc 3060

cagcactggc aggagtggta cagccgccag ctgaacgaca accactggtg ggatagcaag 3120

gtggagaaga tgctgaag 3138

<210>9

<211>138

<212>RNA

<213> Artificial sequence

<400>9

gcgcccguua guauuuucuu ugauucugua cgccugccgg ccccaccgga ugugacguac 60

uucgcgaaca ucaacgguuc agaaagaacc gcugacgcuc gcgaagaugg auucaaagag 120

ggcgacaccc uggugaac 138

<210>10

<211>133

<212>RNA

<213> Artificial sequence

<400>10

gcguuaguau uuucuuugau ucuguacgcc ugccggcccc accggaugug acguacuucg 60

cgaacaucaa cgguucuucg gaaccgcuga cgcucgcgaa gauggauuca aagagggcga 120

cacccuggug aac 133

<210>11

<211>175

<212>RNA

<213> Artificial sequence

<400>11

ggauugacug agguuggguu aguuugguuu uagcaaccuc agucagucac cggcaaaaaa 60

ccggucaccg gcaaaaaccg guugcaaaaa gaguauagau uguaaaagga agguuggaga 120

acaaccuucc uuuuacaacc uaugcucacu aaaacagggc gacacccugg ugaac 175

<210>12

<211>161

<212>RNA

<213> Artificial sequence

<400>12

ggucggccua ucuaacguuu gucugcgccg acacccgcaa ggguuauugg ggaaucagcg 60

aaucggcaga agcccguugc ccccagcacu auacaguuca aagggacgag aagucccuuu 120

gaacugaaaa gugcagcaga cagggcgaca cccuggugaa c 161

<210>13

<211>149

<212>RNA

<213> Artificial sequence

<400>13

gcguuagcug ucucuucgga ggcagauuua cuuugauucu uugcgccuuu acgucccacg 60

uauuugacgc aacucgcgaa cuucagcggu ucuucggaau cgcugacgcu cgcggggcug 120

guuucaaaga gggcgacacc cuggugaac 149

<210>14

<211>989

<212>DNA

<213> Artificial sequence

<400>14

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 60

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 120

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 180

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 240

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 300

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 360

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 420

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 480

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct 540

tgcatgcctg caggtcgact ctagatttta agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 600

tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 660

acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 720

tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 780

acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 840

ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 900

ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaacgagct cgaattcact 960

ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggg 989

Claims

1.CasX蛋白，为LesCasX蛋白、VemCasX蛋白或CkbCasX蛋白；

所述LesCasX蛋白为如下a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

所述VemCasX蛋白为如下b1)或b2)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的蛋白质；

所述CkbCasX蛋白为如下d1)或d2)：

d1)氨基酸序列是SEQ ID NO:7所示的蛋白质；

d2)在SEQ ID NO:7所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的CasX蛋白，其特征在于：

所述LesCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT；

所述VemCasX蛋白识别的PAM序列为TTG、TTA或CTG；

所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。

3.编码权利要求1或2所述CasX蛋白的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：

编码所述LesCasX蛋白的核酸分子为A1)或A2)所示的DNA分子：

A1)编码区为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

A2)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

编码所述VemCasX蛋白的核酸分子为B1)或B2)所示的DNA分子：

B1)编码区为SEQ ID NO:4所示的DNA分子；

B2)核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的DNA分子；

编码所述CkbCasX蛋白的核酸分子为D1)或D2)所示的DNA分子：

D1)编码区为SEQ ID NO:8所示的DNA分子；

D2)核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

6.权利要求1或2所述CasX蛋白或权利要求3或4所述核酸分子在切割双链DNA中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：切割双链DNA时，

所述LesCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT；

所述VemCasX蛋白识别的PAM序列为TTG、TTA或CTG；

所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。

8.权利要求1或2所述CasX蛋白或权利要求3或4所述核酸分子在定向编辑基因组中的应用。

9.一种定向编辑基因组的CRISPR/Cas***，其特征在于：所述Cas蛋白为权利要求1或2所述CasX蛋白。

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的CRISPR/Cas***，其特征在于：定向编辑基因组时，所述Cas蛋白切割双链DNA识别的PAM序列如下：

所述LesCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT；

所述VemCasX蛋白识别的PAM序列为TTG、TTA或CTG；

所述CkbCasX蛋白识别的PAM序列为TTA、TTG或TTT。