JP5586164B2 - 潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法に関する。

潰瘍性大腸炎は、発症要因が未だ解明されておらず、直腸に限局して起こる比較的良性型の大腸炎で、幅広い年齢に発症する発症頻度の高い疾患である。予後は、炎症と潰瘍が直腸だけに限局している潰瘍性直腸炎では良好で、重篤な合併症はほとんどみられない。一方で約１０−３０％では、潰瘍性直腸炎が大腸全体に広がる。結腸癌は、末期の潰瘍性大腸炎患者に毎年１００人に１人の割合で発症するとされており、潰瘍性大腸炎が腸内の広範囲にわたる場合は、１００人に１０人が結腸癌になるとされている。また、罹患期間が８年以上の場合も結腸癌に進行する率が高いとされている（非特許文献１）。

このようなことから、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクの予測は臨床上重要であり、診断治療においては、癌化リスクを予測する評価方法が求められている。

ＲＵＮＸ３は、転写因子の一種類である。その上流部位のメチル化、若しくはそのヘテロ接合体の欠失（Ｌｏｓｓ−ｏｆ−Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，ＬＯＨ）が、胃癌の発症リスク要因となることが示唆され（非特許文献２）、大腸癌（非特許文献３）、膵臓癌（非特許文献４）においても同様であるとの報告がある。一方、長期罹患潰瘍性大腸炎患者の炎症部位は、正常部位と比較してＲＵＮＸ３のｍＲＮＡ発現量が増加していることが示されているが、癌化リスクとの関連は示されていない（非特許文献５）。

一方、その他の疾患の指標としてＤＮＡコピー数があるが、これは、ｍＲＮＡ発現量とは独立した指標として用いられている。実際、ＤＮＡコピー数と遺伝子発現量との間で相関があるのは、３．８％の遺伝子のみであり、ほとんどの遺伝子において相関がないことが知られている（非特許文献６）。ここ数年間でＤＮＡコピー数の解析にアレイＣＧＨ法などを用いて網羅的に検索する方法が開発された。更にＤＮＡコピー数変異（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、以下、単にＣＮＶと示すこともある）と疾患との関連が示唆され（非特許文献７，非特許文献８）、具体的な遺伝子のＣＮＶを指標として癌患者の予後を予測する方法も開示されている（特許文献１）。

しかし、長期罹患潰瘍性大腸炎患者の発癌リスクと、ＤＮＡコピー数との間での関連性は全く報告されていない。

国際公開ＷＯ２００７０８６３５１パンフレット メルクマニュアル医学百科最新家庭版２００４／０６／１４発行 Ｃｅｌｌ １０９: １１３，２００２ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １４: ２２６，２００８ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９８: １６９０，２００８ Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ Ｅ−Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００８／Ｊｕｌ／３０ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２: １１３４，２００２ Ｎａｔｕｒｅ ４４４: ４４４−５４，２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５: ５２５−８，２００４

本発明は、潰瘍性大腸炎患者の診断において、潰瘍性大腸炎患者の臨床サンプルを対象とし、癌化リスクを予測するための客観的な方法を提供することを課題とする。

本発明者らは長期間臨床サーベイランスを行い集積した潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜組織を解析（遺伝子発現プロファイリング、ＤＮＡコピー数の変異プロファイリング）することで、本疾患に伴うＤＮＡコピー数変異と癌化リスクとの間に関連があることを解明し、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法を発明した。従って、本発明は、以下の項に示す潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを判定する方法、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを判定するためのキット及びプライマーセットを提供する。

項１．潰瘍性大腸炎患者から採取したゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を指標として、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法。

項２．項１に記載の方法であって、被験者由来の大腸粘膜組織におけるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が２の場合には被験者の癌化発症リスクが高いと決定し、コピー数が２よりも大きい場合には癌化リスクが低いと決定する方法。

項３．潰瘍性大腸炎患者から採取したゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定する工程を含む、項１又は２に記載の方法。

項４．ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数をＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、アレイＣＧＨ法、ＤＮＡマイクロアレイ法又はサザンハイブリダイゼーション法で測定する項３に記載の方法。

項５．ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数のＰＣＲ法での測定値が、２．４〜２．６の数値範囲内で予め設定された境界値Ａ以下の場合にはコピー数が２であるとして被験者の癌化発症リスクが高いと決定し、当該測定値が境界値Ａよりも大きい場合にはコピー数が２より大きいとして癌化リスクが低いと決定する、項４に記載の方法。

項６．ＲＵＮＸ３の塩基配列が配列番号１又は２で示される、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

項７．ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬を含む潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定するためのキット。

項８．ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬が、ＲＵＮＸ３の全部又は一部を増幅するＲＵＮＸ３特異的プライマー、又はＲＵＮＸ３特異的プローブである項７記載のキット。

項９．ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬として、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＮＴ＿００４６１０で表される配列の８０７０２１１〜８０７０１４１番目の領域を含む核酸断片を増幅する一対のＲＵＮＸ３特異的プライマーを含む、項７に記載のキット。

項１０．配列番号５で示されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６で示されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合せからなるプライマーセット。

本発明によれば、高い検査感度で、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数から、潰瘍性大腸炎患者の発癌リスクを客観的に予測することに利用できる。

大腸癌周辺大腸粘膜上皮組織（ＬＩ）、一般大腸癌（ＳＣ）、癌非合併潰瘍性大腸炎大腸粘膜上皮組織（ＵＣ）、潰瘍性大腸炎合併癌組織（ＵＣ−Ｃａ）及び癌合併潰瘍性大腸炎大腸粘膜上皮組織（ＵＣＣ）でのＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の箱ひげ図を示している。

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。

潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法
本発明は、潰瘍性大腸炎患者から採取したゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を指標として、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法を提供する。

本発明の方法と対象となる潰瘍性大腸炎患者とは、潰瘍性大腸炎と診断された患者をいい、活動期及び緩解期のいずれの患者も含まれる。

ここで、通常、潰瘍性大腸炎は、症状の経過と病歴、内視鏡による大腸検査をし、感染症等を除外することで診断する。好ましくは、厚生省特定疾患 難治性炎症性腸管障害調査研究班潰瘍性大腸炎診断基準改定案（平成９年度研究報告）又は厚生科学研究費補助金特定疾患対策研究事業難治性炎症性腸管障害に関する調査研究班潰瘍性大腸炎の難治例の定義に関する研究（平成１４年度研究報告書）に従い診断する。

また、本発明において、癌化リスクの高い患者とは、将来癌に罹患する可能性が高い患者を示す。

本明細書において、「ＲＵＮＸ３」とは、前述するように転写因子の一種であって、分子量約４４Ｋダルトンの蛋白質をコードする遺伝子を指す。その遺伝子配列情報はＮＣＢＩｗｅｂ ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）データーベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）において、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１０３１６８（ヒト，ｉｓｏｆｏｒｍ １）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ:ＮＭ＿００４３５０（ヒト，ｉｓｏｆｏｒｍ ２）等として登録されている。また、当該ＲＵＮＸ３遺伝子は、１番染色体（アクセス番号ＮＣ＿０００００１）の２５１６４０８８〜２５０９８５８９番目の領域にコードされている。即ち、上記データベースにアクセス番号ＮＴ＿００４６１０として登録されている配列の８０２４５７９〜８０９００７８番目の領域にコードされている。また、アミノ酸配列については、同データベースにおいてＮＰ＿００１０２６８５０（ヒト，ｉｓｏｆｏｒｍ １）、ＮＰ＿００４３１１（ヒト，ｉｓｏｆｏｒｍ ２）等として登録されている（ヒトの核酸及びアミノ酸配列については、文献：Ｂａｅ，Ｓ．Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． ８: ８０９−８１４，１９９３を参照）。

ここで、本発明の方法には、潰瘍性大腸炎患者である被験者（以下、本発明において被験者とは潰瘍性大腸炎患者を示す）から採取したゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定する工程及び測定したＤＮＡコピー数から癌化リスクを決定する工程を含む方法だけでなく、ゲノムＤＮＡの配列が既知である被験者のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の情報から癌化リスクを決定する方法も包含される。

また、本発明は、ゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のコピー数を指標にするため、潰瘍性大腸炎患者のゲノムＤＮＡを採取する組織としては、特に限定されないが、例えば、大腸粘膜組織、便検、腸液等が挙げられ、大腸粘膜組織が好ましい。被験者由来の大腸粘膜組織におけるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するためには、生検体試料、摘出臓器、パラフィン包埋組織標本、腸液、便、あるいはそこから得られる培養細胞、培養組織などを用いるとよい。

ゲノム中におけるＲＵＮＸ３の正常の遺伝子コピー数は、ヒト体細胞、すなわちディプロイドゲノムでは２である。しかし、本発明者らは、潰瘍性大腸炎患者を母集団とした場合、さらに大腸癌を発症した患者の多くについてＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が正常値の２であり、大腸癌を発症していない患者の多くについてＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が正常値より有意に大きい（例えば、コピー数３）ことを見出した。

従って、本発明の１つの実施態様において、本発明の方法によれば、被験者由来の大腸粘膜組織におけるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を指標とし、コピー数が２の場合には被験者の癌化発症リスクが高いと予測し、コピー数が２よりも大きい場合には癌化リスクが低いと決定することができる。

ここで、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数は、例えばＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、アレイＣＧＨ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、サザンハイブリダイゼーション法で測定することができるが、これらの方法に限るものではない。

Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法
ＰＣＲ法を利用したＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の測定方法は、例えば以下のような手順で行うことができるが、これに特に限定されず、ＰＣＲ条件等は公知のＣＮＶ測定方法に従い適宜設定できる。

フェノール・クロロホルム法、遠心カラム法、磁気ビーズ法などを用いて調製された癌細胞のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを実施する。

ＰＣＲについては、下記実施例にて記載したＡＢＩ Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （株式会社アプライドバイオシステムズ）を用いた方法を例示することができる。すなわち、９５℃２０秒（１サイクル）及び９５℃１秒、６０℃２０秒、４０サイクルである。但し、これらの条件は、再現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発明の範囲に含まれるものとする。ターゲットＤＮＡの定量値は、任意の閾値にＰＣＲ産物が到達した時のＰＣＲサイクル数（Ｃｔ値）を基に求めることができる。さらに、遺伝子のコピー数は癌と正常細胞でのコピー数変化のほとんどないリファレンス配列を用いた定量値により補正することによって、算出することができる。

従って、ＰＣＲ法を用いて得られるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の測定値は、通常、自然数ではなく、２．３２３・・・等の小数点以下の数字が生じるかたちで得られる。このため、本発明の方法において、ＰＣＲ法を用いる場合、好ましくは、所定の値を境界値とし、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の測定値が当該境界値以下の場合には当該コピー数が２であると判定、すなわち、被験者の癌化発症リスクが高いと決定し、測定値が境界値よりも大きい場合には当該コピー数が２よりも大きいと判定、すなわち、癌化リスクが低いと決定する。ここで、当該境界値は、コピー数が２であると予想され得るＰＣＲ測定値の上限値として、予備実験等により適宜設定できる。例えば、コピー数が２であることが判明している、またはその可能性が高い１人または複数の被験者由来の検体からＰＣＲ法により複数のコピー数の測定値を取得し、その標準誤差に基づき境界値を設定することができる。本発明において、境界値は、好ましくは、２．４〜２．６である。

ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数をＰＣＲ法で測定する場合には、ＲＵＮＸ３の全部又は一部を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマー等のＲＵＮＸ３特異的プライマーを用いるとよい。このＲＵＮＸ３特異的プライマーは、ＲＵＮＸ３の全領域中、他のゲノムＤＮＡには見られない塩基配列を有する領域にハイブリダイズし得るものであるとよい。

プライマーのサイズは、好ましくは１７〜２５塩基程度である。プライマーのＴｍ値は上流プライマーと下流プライマーで揃え、５５〜６５℃くらいに設定すると良好な結果を得られる傾向がある。プライマー間の相補性が少ないペアを選択し、２つのプライマー同士がアニールしないようにする。特にプライマーダイマーの形成による増幅効率の低下を防ぐため、各プライマーの３'末端同士が３塩基以上連続して相補的にならないように設計する。また、通常、プライマー内の二次構造形成を避けるために、４塩基以上の自己相補配列を含まないようにする。通常、ＧＣ含量は４０〜６０%前後とし、部分的にＧＣあるいはＡＴ−ｒｉｃｈにならないようにする。また、通常、プライマーの３’末端と鋳型ＤＮＡが安定して結合するように、特にプライマーの３’側がＡＴ−ｒｉｃｈ又はＧＣ−ｒｉｃｈにならないように設定される。

プライマーは、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を特異的に測定することができる配列が好ましく、ゲノム上のＲＵＮＸ３遺伝子をコードしている領域を含む近傍領域の配列がより好ましく、ゲノム上のＲＵＮＸ３の配列と相同性を有する配列が更に好ましく、ゲノム上のＲＵＮＸ３のイントロン部分を検出できる配列が更に好ましく、ゲノム上のＲＵＮＸ３のイントロン部分とエクソン部分を跨ぐような配列が更に好ましく、データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）のアクセス番号ＮＴ＿００４６１０．１８で表される配列の８０７０２１１〜８０７０１４１の領域を含む核酸断片を増幅する一対のＲＵＮＸ３特異的プライマーが更に好ましく、配列番号５及び配列番号６の配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが特に好ましい。

ＰＣＲ法に用いるプライマーの塩基配列の一例を以下に記載する。

Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: ５’−ＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: ５’−ＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡ−３’（配列番号６）
参照ゲノムとしては、例えば、ＬＩＮＥ−１（癌でも正常でもほとんどＤＮＡコピー数が変わらないと考えられているゲノム上に多数存在する配列）等を用いることができ、そのプライマーの塩基配列の一例を以下に記載する。

Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５’− ＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧ −３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５’− ＴＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧ −３’（配列番号８）
螢光 ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＦＩＳＨ）法
ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数をＦＩＳＨ法で測定する場合は、以下のような手順で行うとよいが、これらの方法に限るものではない。プローブとしては、ＲＵＮＸ３と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴ又はポリヌクレオチドプローブが好ましい（以下、ＲＵＮＸ３と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴ又はポリヌクレオチドプローブをＲＵＮＸ３特異的プローブと示すこともある）。このＲＵＮＸ３特異的プローブは、ＲＵＮＸ３の全領域中、癌細胞に存在しうる他のゲノムＤＮＡには見られない塩基配列を有する領域にハイブリダイズしうるものであるとよい。

ＦＩＳＨ法に用いるプローブとしては、目的の配列を有するＤＮＡ断片、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ、ＰＡＣクローン、ＢＡＣクローン等を用いることができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のＤＮＡあるいはＲＮＡ（核酸）の有無及び分布を確認する方法として発展してきた。その原理としては、細胞内の特定核酸に相補的な塩基配列をもつプローブ核酸が特異的に複合体を形成（ハイブリダイゼーション）する性質を利用したもので、プローブに予め放射線同位元素（ＲＩ）や抗原物質（ハプテン）などを標識しておくとハイブリダーゼーションした個所が識別可能となることによる。従来プローブの標識としては、ＲＩだけでなく、非放射線物質のビオチン、ジゴキシゲニン等のハプテンを利用した蛍光標識方法を用いてもよい（参考文献：実験医学別冊、蛋白質・核酸分子のｉｎ ｓｉｔｕ同定法、遠山編）。

ＦＩＳＨ法は、公知の方法に従い実施することができるが、その手順を以下に例示する。染色体標本は、単離癌培養細胞のスライドガラス塗末標本でも良いし、ホルマリン固定しパラフィン包埋した癌を含む組織ブロックから薄切されたスライド標本でも良い。染色体標本スライドはハードニング（固着）させハイブリダイゼーション過程でのスライドガラスからの脱落を防いでからホルムアミド処理により変性させておく。ビオチンを標識とするＦＩＳＨ法においてはビオチン−ｄＵＴＰ（又はｄＡＴＰ）を用いてプローブＤＮＡを標識し、ＤＮＡを熱変性させた後、１本鎖ＤＮＡとハイブリダーゼーションを行なう。形成されたビオチン標識ＤＮＡとゲノムＤＮＡの２本鎖ＤＮＡをＳＳＣバッファーを主とする洗浄液を用いて洗浄し、ビオチンと親和性の高いアビジン−ＦＩＴＣ溶液で処理する。さらにＳＳＣバッファー系列により洗浄し、抗退色剤を滴下しカバーグラスをかけ、蛍光顕微鏡により観察し写真撮影する。細胞内の螢光箇所はＲＵＮＸ３を示しているので、その数を測定し、ＤＮＡコピー数を測定する。

アレイＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（アレイＣＧＨ）法
ＣＧＨ法は、蛍光色素を用い、どこの染色体で異常が生じているのかを特定する解析方法でＦＩＳＨ法の一種であるであるが、従来法では分解能が低く、得られたゲノム異常のデータから標的の遺伝子への同定には結びつきにくかった。今回ＤＮＡコピー数異常を検出する対象とするゲノム領域は明確になっていることから、以下のＣＧＨ法でのＤＮＡコピー数の異常の検出が可能である。

アレイＣＧＨ法は、以下のような手順で行うとよいが、これらの方法に限るものではない。被験者由来細胞と、対照として用いる正常細胞からＤＮＡを抽出し、被験者由来細胞のＤＮＡを緑色蛍光色素（ＦＩＴＣ）で標識し、正常細胞由来のＤＮＡを赤色蛍光色素（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）で標識する。双方の標識ＤＮＡの等量からなる混合溶液を調製しハイブリダイゼーションを行なう。従来法ではハイブリダイズさせる標本として正常のヒトから採取した血液を培養後、細胞***を***中期で停止させ、細胞膜を露出した状態でスライドガラスに塗末した染色体標本スライドとして用いていたが、多数のクローン化したＤＮＡ断片をアレイ化したスライドグラスを用いてＣＧＨを行なうことで（アレイＣＧＨ）、ラベルした癌及び正常細胞由来ＤＮＡ由来の蛍光シグナル強度比をもとにアレイ化されたＤＮＡ断片に相当する領域の癌のＤＮＡコピー数を定量化できる。アレイ化するＤＮＡとして、１００ｋｂのヒトゲノム断片をクローン化したＢＡＣクローン、ＢＡＣを鋳型にＤＯＰ−ＰＣＲ法などでクローン化ゲノム断片を増やした産物を使うことができる。（参考文献：アレイＣＧＨ診断活用ガイドブック ２００８年２月発行）。

ＤＮＡマイクロアレイ法
アレイＣＧＨ法と同様に、市販のＳＮＰ検出用ＤＮＡマイクロアレイ（オリゴヌクレオチドアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイ）を用いてゲノム特定領域のＤＮＡコピー数の変化を検出することができる。ＤＮＡの調製方法、標識方法についてはそれぞれの市販アレイの標準プロトコールを用いることができる。ＤＮＡコピー数は、その標準プロトコールに従い定量化できる。

サザンハイブリダイゼーション法
サザンハイブリダイゼーション法は核酸の相補性を利用して目的のＤＮＡを検出する古典的な方法である。すなわち癌及び正常細胞から調製したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動してＤＮＡのサイズに応じて分画する。次にアルカリ変性により１本鎖ＤＮＡへの変性を行なった後、ニトロセルロースなどのフィルターに転写し固定化する。このフィルターに対し標的配列を含むＤＮＡ断片を放射性同位元素等で標識したプローブを反応させ、目的の遺伝子領域のＤＮＡコピー数の変化を検出することができる。

潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定するためのキット
また、本発明は、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬を含む潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定するためのキットを提供する。

ＲＵＮＸ３のコピー数を測定するための試薬としては、前述したＲＵＮＸ３の全部又は一部を増幅するＲＵＮＸ３特異的プライマー、ＲＵＮＸ３特異的プローブ等を挙げることができる。これらのＲＵＮＸ３特異的プライマー及びＲＵＮＸ３特異的プローブについては上述した通りである。

当該キットには、さらに、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法などによるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の測定に必要なその他の試薬一式、緩衝液、取扱説明書等が含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、癌化リスクを予測するための判定基準なども記載しておくとよい。

プライマーセット
さらに、本発明は、配列番号５のＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６のＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合せからなる一セットのプライマーを提供するが、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するためであれば、この配列に限定するものではなく、前述したＲＵＮＸ３特異的プライマーを適宜使用することができる。本発明のプライマーを用いることにより、被験者由来の大腸粘膜上皮におけるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数をＰＣＲ法により測定することができ、この測定結果に基づいて、被験者の癌化リスクの有無を予測することができる。

本発明は、潰瘍性大腸炎と診断された患者、又はそれと疑われる患者の検体に対して実施できる。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

潰瘍性大腸炎患者粘膜上皮組織を用いた検証
癌早期発見のためのサーベイランス内視鏡検査時の生検組織検体、あるいは手術切除標本の一部よりＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数及びその発現レベルを測定した。解析対象は、文書にて研究協力の同意が得られた患者である。手術時に採取する検体は切除標本の一部であり、内視鏡検査時に組織を採取する場合には、右側結腸（上行結腸、横行結腸）、左側結腸（下行結腸、Ｓ状結腸）及び直腸の腫瘍部あるいは非腫瘍部の大腸粘膜から生検鉗子にて採取された組織である。なお本試験はヘルシンキ宣言に基づく倫理的原則及び臨床研究に関する倫理指針に従い実施された。

実施例１．ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の測定
ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を求めるために、以下の配列のプライマーを設計した。

Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: ５’−ＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: ５’−ＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡ−３’（配列番号６）
参照ゲノムとしてＬＩＮＥ−１（癌でも正常でもほとんどＤＮＡコピー数が変わらないと思われるゲノム上に多数存在する配列）を用い、以下の配列のプライマーを設計した。

Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５’− ＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧ −３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５’− ＴＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧ −３’（配列番号８）
潰瘍性大腸炎大腸上皮組織のゲノムＤＮＡはＱＩＡＡＭＰ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （株式会社キアゲン） を用い使用説明書に従い２ μｇ／ｍＬに調製し，ＤＮＡコピー数の定量に使用した。

ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用い、ＡＢＩ７９００シークエンスディテクターにより下記のＰＣＲ条件で行った。ＰＣＲ反応条件は９５℃２０秒（１サイクル）及び９５℃１秒、６０℃２０秒、４０サイクルである。

ターゲットＤＮＡの定量値は、任意の閾値にＰＣＲ産物が到達した時のＰＣＲサイクル数（Ｃｔ値）を基に検量線を作成して求めた回帰式より計算された。さらに、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数は下式により算出された。

（Ｔ （ＲＵＮＸ３） ／ Ｔ （ＬＩＮＥ−１）） ／ （Ｃ （ＲＵＮＸ３） ／ Ｃ （ＬＩＮＥ−１）） ｘ ２
（ここで、Ｔは求めたい腫瘍のＤＮＡでのＲＵＮＸ３又はＬＩＮＥ−１の定量値、Ｃは対照として用いたヒト（男）正常組織由来のゲノムＤＮＡでのＲＵＮＸ３又はＬＩＮＥ−１の定量値である。）
結果
潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜組織［３５症例、内訳は、癌非合併症例（図１中、ＵＣと示す）が１８症例、癌合併症例（図１中、ＵＣＣと示す）が１７症例］、潰瘍性大腸炎を伴わない大腸癌患者より切除した癌組織（図１中、ＳＣと示す：１６症例）及びその周辺粘膜上皮組織（図１中、ＬＩと示す：２１症例）、さらに潰瘍性大腸炎と合併した大腸癌（図１中、ＵＣ−Ｃａと示す：１３症例）でのＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数の分布を図１に示す。

潰瘍性大腸炎の粘膜組織において大腸癌を発症していない患者（ＵＣ：１８症例）においては、平均値及び標準偏差が２．９６±０．１３と、２よりも優位に高い値を示したのに対し、大腸癌を発症した潰瘍性大腸炎患者（ＵＣＣ：１７症例）の粘膜組織では、平均値が１．９３±０．１８と、２付近のコピー数を示した。潰瘍性大腸炎患者が合併した大腸癌組織（ＵＣ−Ｃａ）でのＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数は１．８９±０．１７と２付近のコピー数を示した。潰瘍性大腸炎を伴わない患者での大腸癌（ＳＣ）及び大腸癌周辺大腸粘膜上皮組織（ＬＩ）では、それぞれ１．８８±０．１６及び２．００±０．１４とＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数は約２の値を示した。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ ｔｅｓｔ（Ｔｒａｎｓ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １６：８８，１９５３）により多重性を考慮した総当たりの検定を行った結果、ＵＣのＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数は他のいずれとも優位に高値であった。これらの結果から、潰瘍性大腸炎患者のうちＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が２より大きい患者は大腸癌発症リスクが低く、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が２である患者は大腸癌発症リスクが高いことが分かる。

上記のように、潰瘍性大腸炎を伴わない大腸癌患者（ＳＣ、ＬＩ）及び大腸癌の合併した潰瘍性大腸炎患者（ＵＣＣ、ＵＣ−Ｃａ）のいずれも、サンプルを採取した部位に関わらずコピー数は、２付近の値を示していた。従って、本発明の方法によれば、サンプルの採取部位に関わらず、高感度で癌化リスクを決定できることが分かる。

実施例２．潰瘍性大腸炎患者における癌化リスクの決定
次に潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜組織について、癌化リスクの決定を行った。

具体的には、まずＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が正常であると予想されるＰＣＲでの測定値の範囲を設定するために、カットオフ値（境界値）として癌周辺組織粘膜組織での測定値の標準誤差を元にＡ_１＝２．４２（２＋３ＳＤ）及びＡ_２＝２．５６（２＋４ＳＤ）を設定した。そして、潰瘍性大腸炎患者について、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数がカットオフ値以下である場合、癌合併リスク大と判定した（表１）。

上記表１から明らかなように、カットオフ値をＡ_１＝２．４２とした場合、癌合併症例（１７症例）のうち、１５症例は正しく癌合併リスク大と判定され、誤って癌合併リスク小と判定されるのは２症例に止まることとなる。一方、癌非合併症例（１８症例）のうち、１２症例は正しく癌合併リスク小と判定され、誤って癌合併リスク大と判定されるのは６症例に止まることとなる。

一般に、リスク判定方法において生じる誤判定には、癌化リスクが実際には高い患者を誤って癌化リスク小と判定してしまう誤判定及び癌化リスクが実際には低い患者を誤って癌化リスク大と判定してしまう誤判定がある。ここで、癌の早期発見のためのサーベイランスにおいては、癌化リスクのある患者をもれなく検出することが重要であるため、上記誤判定のうち、癌化リスクが実際には高い患者を誤って癌化リスク小と判定しまう誤判定がなるべく少なくする方法が好ましい。

本方法の場合、潰瘍性大腸炎の合併症例の検査感度は８８％であり、非常に高い感度で癌合併リスクを決定することができる。

さらに、カットオフ値をＡ_２＝２．５６とした場合、癌合併症例（１７症例）のうち、１７症例全てが正しく癌合併リスク大と判定される。従って、この場合、潰瘍性大腸炎の合併症例を１００％の検査感度検査感度で判定できた。

ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクと関連することを見出した。これにより、被験者の癌化リスクを検出することが可能となり、この予測結果は癌早期発見のためのサーベイランス治療に利用できる。

配列番号１は、ヒト由来ＲＵＮＸ３（ｉｓｏｆｏｒｍ １）の遺伝子ＤＮＡ配列を示す。

配列番号２は、ヒト由来ＲＵＮＸ３（ｉｓｏｆｏｒｍ ２）の遺伝子ＤＮＡ配列を示す。

配列番号３は、ヒト由来ＲＵＮＸ３（ｉｓｏｆｏｒｍ １）のアミノ酸配列を示す。

配列番号４は、ヒト由来ＲＵＮＸ３（ｉｓｏｆｏｒｍ ２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号５は、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を求めるために用いたフォワードプライマーのＤＮＡ配列を示す。

配列番号６は、ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を求めるために用いたリバースプライマーのＤＮＡ配列を示す。

配列番号７は、参照ゲノム配列ＬＩＮＥ−１のＤＮＡコピー数を求めるために用いたフォワードプライマーのＤＮＡ配列を示す。

配列番号８は、参照ゲノム配列ＬＩＮＥ−１のＤＮＡコピー数を求めるために用いたリバースプライマーのＤＮＡ配列を示す。

Claims (10)

1. 潰瘍性大腸炎患者から採取したゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を指標として、潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法であって、被験者由来の大腸粘膜組織におけるＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数が２の場合には被験者の癌化発症リスクが高いと決定し、コピー数が２よりも大きい場合には癌化リスクが低いと決定する方法。
2. 潰瘍性大腸炎患者から採取したゲノムＤＮＡが、非腫瘍部の大腸粘膜から採取されたものである、請求項１に記載の方法。
3. 潰瘍性大腸炎患者から採取したゲノムＤＮＡ中のＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数をＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、アレイＣＧＨ法、ＤＮＡマイクロアレイ法又はサザンハイブリダイゼーション法で測定する請求項３に記載の方法。
5. ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数のＰＣＲ法での測定値が、２．４〜２．６の数値範囲内で予め設定された境界値Ａ以下の場合にはコピー数が２であるとして被験者の癌化発症リスクが高いと決定し、当該測定値が境界値Ａよりも大きい場合にはコピー数が２より大きいとして癌化リスクが低いと決定する、請求項４に記載の方法。
6. ＲＵＮＸ３の塩基配列が配列番号１又は２で示される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法に使用するための潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定するためのキット。
8. ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬が、ＲＵＮＸ３の全部又は一部を増幅するＲＵＮＸ３特異的プライマー、又はＲＵＮＸ３特異的プローブである請求項７記載のキット。
9. ＲＵＮＸ３のＤＮＡコピー数を測定するための試薬として、配列番号９に示す塩基配列の領域を含む核酸断片を増幅する一対のＲＵＮＸ３特異的プライマーを含む、請求項７に記載のキット。
10. 配列番号５で示されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６で示されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合せからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法に使用するためのプライマーセット。

Images