CN109439743A - 一种重症哮喘的生物标志物及其应用 - Google Patents
一种重症哮喘的生物标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重症哮喘的生物标志物及其应用,所述生物标志物为ENSG00000241587。本发明通过检测lncRNA在正常人、普通哮喘患者以及重症哮喘患者血液样本中的表达水平,首次发现了ENSG00000241587在重症哮喘中呈现显著性差异,说明ENSG00000241587可作为检测靶标应用于重症哮喘的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种一种重症哮喘的生物标志物及其应用,具体地所述生物标志物为ENSG00000241587。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等参与的气道慢性炎症性疾病,以气道高反应为主要表现形式,存在可逆性气流受限,反复发作喘息、气短、胸闷、咳嗽等症状,绝大部分哮喘患者在给予抗炎药物及支气管扩张剂后能有效缓解哮喘症状,约5%~10%哮喘患者纵使给予多种药物联合治疗症状仍难以控制,称之为重症哮喘(Severe asthma),却消耗了大量医疗卫生资源,使哮喘治疗费用逐年上涨。
重症支气管哮喘虽然在哮喘患者中所占比例不大,但其病因及发病机制复杂,对糖皮质激素联合β2受体激动剂的反应性较差,治疗较为困难,且易出现严重并发症危及生命。对重症哮喘进行正确的诊断、寻找哮喘诱发、加重的危险因素,并针对各个因素采取适当的处理措施、提高患者治疗依从性是提高哮喘控制水平的关键措施,临床上应当引起医生及患者的足够重视。目前重症哮喘的流行病学情况、遗传学研究、病理特征和发病机制等尚未完全明确,有待进一步研究。
随着人类基因组学与分子生物学技术的发展,哮喘的遗传学研究已成为国际热点。通常认为,哮喘是由免疫、遗传、环境以及其他因素共同作用而引起的多基因遗传病,具有明显的遗传倾向,遗传度大约70%-80%,其发生涉及多个基因的紊乱。
长链非编码(long non-coding RNA,简称lncRNA)是一类位于细胞核或细胞质内结构类似、长度大于200个核苷酸的不编码蛋白质的转录本。它们含有邻近的启动子相关序列,不具有开放阅读框(ORF)。最近有大量研究证实lncRNA发挥重要功能,且发挥功能的形式多样,包括染色质修饰,转录因子调控和转录后调控等。研究与重症哮喘相关的lncRNA,有可能在将来为哮喘的风险提前预估提供一个新的生物指标,从而实现哮喘的早期诊断和检测以及筛选出易感个体。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供与重症哮喘发生发展相关的基因标志物,使用基因标志物来诊断疾病具有及时性、特异性和灵敏性,患者在重症哮喘早期就能知晓风险,针对风险高低,采取相应的预防和治疗措施,从而提高生活质量。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了检测样本中ENSG00000241587的试剂在制备诊断重症哮喘的产品中的应用。
进一步,所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测ENSG00000241587水平的试剂。
进一步,所述试剂包括:
特异性识别ENSG00000241587基因的探针;或
特异性扩增ENSG00000241587基因的引物。
进一步,所述特异性扩增ENSG00000241587的引物序列如SEQ ID NO.2~3所示。
进一步,所述样本选自人的血液。
本发明提供了一种体外检测ENSG00000241587表达水平的产品,所述产品包括制剂、核酸膜条、芯片或试剂盒。
进一步,所述芯片包括针对ENSG00000241587的特异性引物或寡核苷酸探针。
进一步,所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法检测基因标志物表达水平的试剂。
进一步,所述通过qRT-PCR法检测基因标志物表达水平的试剂包括如序列SEQ IDNO.2~3所示的特异性扩增ENSG00000241587基因的引物。
本发明提供了ENSG00000241587在构建预测重症哮喘的计算模型中的应用。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了ENSG00000241587基因表达与重症哮喘相关,通过检测受试者中ENSG00000241587的表达水平,可以判断受试者是否患有重症哮喘、或者判断受试者是否存在患有重症哮喘的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种重症哮喘的新的生物标志物-ENSG00000241587,相比传统的检测手段,使用基因诊断更及时、更特异、更灵敏,能够实现重症哮喘的早期诊断,从而降低重症哮喘的死亡率。
附图说明
图1是利用QPCR检测ENSG00000241587在哮喘患者中的表达情况图,其中***:P<0.001,ns:P>0.05。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,通过高通量测序的方法,检测重症哮喘患者、普通哮喘患者和正常人中的差异表达基因,探讨其与重症哮喘的发生之间的关系,从而为重症哮喘的早期检测提供标志物。通过筛选,本发明首次发现了重症哮喘患者中ENSG00000241587显著性上调,提示ENSG00000241587可作为检测指标应用于重症哮喘的临床诊断。
ENSG00000241587基因
ENSG00000241587基因位于3号染色体上,在本发明的上下文中,“ENSG00000241587基因”包括人ENSG00000241587基因以及人ENSG00000241587基因的任何功能等同物的多核苷酸。在本发明的具体实施方式中,一种代表性的ENSG00000241587基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本领域技术人员将认识到,本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸***或缺失),在至少大约60%的核苷酸碱基、通常至少大约70%、更通常至少大约80%、优选至少大约90%、及更优选至少大约95-98%核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性,则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
本发明的ENSG00000241587基因可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达ENSG00000241587的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
检测技术
本发明的ENSG00000241587使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测,这些技术包括但不限于:核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到,由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击,因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序),高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术,基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面,这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在玻璃表面形成数以亿计的簇,每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇,然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于:聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到,某些扩增技术(例如,PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如,RT-PCR),而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如,TMA和NASBA)。
通常,PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环,以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数;RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA),然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝;TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝,其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝,TMA任选地包括使用阻断,部分、终止部分和其他修饰部分,以改善TMA过程的灵敏度和准确度;LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接,以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物;SDA使用以下步骤的多个循环:引物序列对与靶序列的相反链进行退火,在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物,半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻,以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链,从而引起产物的几何扩增。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如,ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本,并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交,然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学,对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针,以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂,在基质凝胶上通过电泳分离,然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹,其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合,而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。
核酸膜条、芯片、试剂盒
在本发明中,核酸膜条包括基底和固定于所述基底上特异性识别ENSG00000241587的寡核苷酸探针;所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底,例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
在本发明中芯片包括有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ENSG00000241587所示的部分或全部序列。所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记,其范围包括引物。杂交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中针对ENSG00000241587基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
本发明的ENSG00000241587芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如,如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的lncRNA芯片。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针,例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
本本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒可用于检测ENSG00000241587基因的表达水平,包含用于ENSG00000241587检测和/或定量的本发明的引物,和/或芯片。任选的与试剂盒的说明书在一起。
试剂盒包括一种或多种无菌容器,这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。
本发明中试剂盒或芯片可用于检测包括ENSG00000241587基因在内的多个基因(例如,与重症哮喘相关的多个基因)的表达水平,将重症哮喘的多个标志物同时进行检测,可大大提高重症哮喘诊断的准确率。
本发明提供了一种预测重症哮喘的计算模型,所述模型可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的,在数学上组合ENSG00000241587和一种或多种其他标志物的测定水平,并将组合值与实际的诊断问题关联起来,可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与ENSG00000241587的测定组合。
优选的,在标志物组合中应用的方法是一种对数函数。优选的,应用此方法的结果是单一值。根据实际的诊断问题,能容易地将此类值与例如个体关于重症哮喘的风险或有助于评估哮喘患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式,此类对数函数是如下获得的:a)将个体分类入组,例如正常人、有哮喘风险的个体、哮喘患者等等,b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物,c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值,并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中,标志物不再是独立的,而是代表一个标志物组合。
本发明中,在进行差异表达基因的筛选分析时,原始基因表达水平和可选择剪接数据可通过应用设计用于归一化和/或提高数据的可信度的算法来改进。在本发明的某些实施方案中,由于处理的单个数据点的巨大数量,数据分析要求计算机或其他装置、机器或设备来应用本文所述的各种不同算法。“机器学***的信号(其通过例如基于微阵列杂交分析获得)通常经过算法处理以分类表达谱。监管的学习通常包括“训练”分类器以识别类之间的区别,然后“测试”分类器在独立测试集上的准确性。对于新的未知样品,可使用分类器来预测该样品所属的类。
在本发明中,表达水平上调或增加是指同参照样本相比,疾病样本中的基因的表达水平高于参照样本中的表达水平。参照样本是自表观健康个体的参照群提供的、用于体外评估目的的生物样本。如本发明所使用的,“参照水平”指在表观健康个体的参照群中建立的值。
本领域技术人员知道,在进行测量结果与参照浓度比较时,参照浓度可以使用阴性参照样本、阳性参照样本、或包括一种或超过一种这些类型对照的混合参照样本来测定。
表述“将测定得到的浓度与参照浓度比较”仅仅用于进一步例示对熟练技术人员显而易见的内容。在对照样本中建立参照浓度。对照样本可以是内部或外部对照样本。在一个实施方案中,使用内部对照样本,即在测试样本中以及在自同一受试者采集的一份或多份其它样本中评估标志物水平以确定所述标志物的水平是否存在任何变化。在另一个实施方案中,使用外部对照样本。对于外部对照样本,将自个体衍生的样本中标志物的存在或量与其在已知患有给定状况或已知有给定状况风险的个体或已知没有给定状况的个体(即“正常个体”)中的存在或量比较。
统计学方法
在本发明中,实验至少采用3次重复实验,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
实施例
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与哮喘相关的基因标志物
1、样品收集
收集3例正常人、3例普通成人哮喘患者、3例重症成人哮喘患者的血液外周静脉血3ml,患者均知情同意,上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
患者纳入标准:
普通哮喘患者符合2016年支气管哮喘防治指南中支气管哮喘诊断标准;重症哮喘符合《重症哮喘诊断与处理中国专家共识》;三组样本采集时短期内均为服用任何药物;(4)年龄>18岁。
患者排除标准:
合并感染、肺栓塞、慢性支气管炎、肺结核及血液***疾病的患者;肝脏功能异常的患者。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA,具体步骤详见说明书。利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl,OD260/280介于1.8~2.2之间。
3、构建cDNA文库
利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建。
使用试剂盒去除核糖体rRNA,向反应体系中加入fragmentation buffer将RNA打断成短片段,以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加碱基A,连接测序接头,然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,加UNG酶消化cDNA二链,最后进行PCR扩增,最后用琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段,使用建好的文库上机测序。
4、上机测序
使用Illumina Hiseq X-ten/Miseq测序平台,进行2*100bp/300bp测序,具体操作按说明书进行。
5、高通量转录组测序数据分析
使用TopHat将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对,参考基因组来自于Ensembl V84,将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度,使用R包limma package分析基因的差异表达,筛选标准是p<0.01。
6、结果
RNA-seq结果显示,ENSG00000241587基因在重症哮喘患者血液中的表达水平显著高于正常人和普通哮喘患者血液中的表达量,提示ENSG00000241587作为可能的个性化指标应用于重症哮喘的诊断。
实施例2 QPCR测序验证ENSG00000241587基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择ENSG00000241587基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的方法收集选择普通哮喘患者45例,重症哮喘患者38例,正常人40例的血液样本。
2、RNA提取
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA,具体步骤详见说明书。
3、逆转录
采用TIANGEN的FastQμant cDNA第一链合成试剂盒进行反转录,具体操作详见说明书。
4、QPCR检测
4.1引物设计
根据编码ENSG00000241587的基因和GAPDH基因的序列设计QPCR扩增引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下:
ENSG00000241587:
正向引物为5’-CTAAGTTCAGTATCAGTGT-3’(SEQ ID NO.2);
反向引物为5’-TTTGACCTACTCTGTTTC-3’(SEQ ID NO.3)。
GAPDH:
正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.4);
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)。
4.2QPCR扩增检验
采用TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)进行扩增,在60-95℃进行溶解曲线分析,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,2-ΔΔCT法进行相对定量;实验操作按详见说明书。
5、结果
结果如图1所示,与正常人和普通哮喘相比,ENSG00000241587在重症哮喘患者中的表达显著上调,差异具有统计学意义P<0.001,而与正常人相比,ENSG00000241587在普通哮喘中的表达水平则无明显变化,P>0.05。说明ENSG00000241587可作为个性化指标应用于重症哮喘的辅助诊断。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 常州市第二人民医院
<120> 一种重症哮喘的生物标志物及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 298
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
actgggtgtg gtggtgtgcg ccagttgtcc cagctacttg ggaggctgag acaggaggat 60
ctgttgagcc caggaggtct gggctgtaga gcagtatgcc aattgggtgt ccacactaag 120
ttcagtatca gtgtgatgac ctcctggaag caaggaccac catgttgcct aaggaggggt 180
gaactggccc aggttggaaa cagagtaggt caaaactccc atgctgatca gtagtgggat 240
agtgcctgtg aatagccgtt acactccagc ctgggcaatg aaaaaaaagt gtgtcttt 298
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaagttcag tatcagtgt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgacctac tctgtttc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctctggtaaa gtggatattg t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggaatca tattggaaca 20
Claims (10)
1.检测样本中ENSG00000241587的试剂在制备诊断重症哮喘的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测ENSG00000241587水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂包括:
特异性识别ENSG00000241587基因的探针;或
特异性扩增ENSG00000241587基因的引物。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述特异性扩增ENSG00000241587的引物序列如SEQ ID NO.2~3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用,其特征在于,所述样本选自人的血液。
6.一种体外检测ENSG00000241587表达水平的产品,其特征在于,所述产品包括制剂、核酸膜条、芯片或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的产品,其特征在于,所述芯片包括针对ENSG00000241587的特异性引物或寡核苷酸探针。
8.根据权利要求6所述的产品,其特征在于,所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法检测基因标志物表达水平的试剂。
9.根据权利要求8所述的产品,其特征在于,所述通过qRT-PCR法检测基因标志物表达水平的试剂包括如序列SEQ ID NO.2~3所示的特异性扩增ENSG00000241587基因的引物。
10.ENSG00000241587在构建预测重症哮喘的计算模型中的应用。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
CN113817818A (zh) * | 2021-10-22 | 2021-12-21 | 常州市第二人民医院 | 用于诊断过敏性气道炎症的工具 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106636413A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-10 | 常州市第二人民医院 | 一种用于诊断哮喘的分子标志物 |
CN107164529A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-09-15 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 一种与哮喘发生发展相关的基因的应用 |
CN107267649A (zh) * | 2017-08-08 | 2017-10-20 | 常州市第二人民医院 | Stradb在哮喘早期诊断中的应用 |
-
2018
- 2018-12-24 CN CN201811585326.XA patent/CN109439743A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106636413A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-10 | 常州市第二人民医院 | 一种用于诊断哮喘的分子标志物 |
CN107164529A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-09-15 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 一种与哮喘发生发展相关的基因的应用 |
CN107267649A (zh) * | 2017-08-08 | 2017-10-20 | 常州市第二人民医院 | Stradb在哮喘早期诊断中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BRADLEY E. CHIPPS等: "Severe Asthma in Children", 《CURR ALLERGY ASTHMA REP》 * |
O.ALEJANDRO BALBIN等: "The landscape of antisense gene expression in human cancers", 《GENOME RESEARCH》 * |
程诗亮等: "miR-21与IL-12在儿童支气管哮喘血清中的含量及意义", 《浙江临床医学》 * |
韩国敬等: "重症哮喘表型及内型的研究进展", 《中华老年多器官疾病杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113817818A (zh) * | 2021-10-22 | 2021-12-21 | 常州市第二人民医院 | 用于诊断过敏性气道炎症的工具 |
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