CN108226308A - 测定样品中脱氢乙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种测定样品中脱氢乙酸的方法。所述方法包括：(1)将所述样品、正己烷、水及甲醇进行混合，并将所得到的混合液进行离心，得到具有上、下两层第一分离液的混合液，收集下层第一分离液；(2)将甲醇、水和所述上层第一分离液进行混合，并将所得到的混合液进行离心，得到具有上、下两层第二分离液的混合液，收集下层第二分离液；(3)合并所述下层第一分离液和下层第二分离液，用氢氧化钠溶液调节所述合并后溶液的pH值，并进行定容，得到待测液；以及(4)利用液相色谱法对所述待测液1进行检测，并基于检测结果确定所述样品中脱氢乙酸含量。本发明能够准确地测定黄油或奶油中脱氢乙酸含量，且操作快速、简便。

Description

测定样品中脱氢乙酸的方法

技术领域

本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及测定样品中脱氢乙酸的方法。

背景技术

脱氢乙酸是一种低毒、高效、广谱抗菌剂，广泛应用于涂料、油料、皮革制品、食品、饲料、包装材料和化妆品，具有防霉防腐的作用。

由于脱氢乙酸有抗菌的作用，加入乳及乳制品中起到的抗菌作用比较明显，从而增加保存时间；虽然抗菌作用比较明显，但是在食品中都有最大允许用量，在酸性食品中最大允许添加量为0.6％，一般添加量为为0.02％～0.2％。

然而，目前测定样品中脱氢乙酸的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了一种测定样品中脱氢乙酸的方法。本发明能够准确地测定黄油或奶油中脱氢乙酸含量，且操作快速、简便。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前，主要采用GB/T23377-2009《食品中脱氢乙酸的测定-高效液相色谱法》(简称国标法)检测脱氢乙酸含量的方法，但是该方法检测过程复杂，且回收率低。

有鉴于此，发明人过大量实验发现，采用正己烷、热水和甲醇联用的方式，与待测样品混合，得到混有油脂的正己烷层和混有脱氢乙酸的甲醇-水层，起到提取脱氢乙酸的同时避免油脂干扰的效果。接着，用甲醇和水提取正己烷层中混有的少量脱氢乙酸。合并两次提取的脱氢乙酸，用氢氧化钠溶液调节pH值，使其与后续液相色谱所需流动相的pH值相近。最后，进行定容、过滤及液相色谱检测。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够准确地测定黄油或奶油中脱氢乙酸含量，且操作快速、简便。

为此，本发明提出了一种测定样品中脱氢乙酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将所述样品、正己烷、水及甲醇进行混合，并将所得到的混合液进行离心，得到具有上、下两层第一分离液的混合液，收集下层第一分离液；(2)将甲醇、水和所述上层第一分离液进行混合，并将所得到的混合液进行离心，得到具有上、下两层第二分离液的混合液，收集下层第二分离液；(3)合并所述下层第一分离液和下层第二分离液，用氢氧化钠溶液调节所述合并后溶液的pH值，并进行定容，得到待测液；以及(4)利用液相色谱法对所述待测液进行检测，并基于检测结果确定所述样品中脱氢乙酸含量，其中，所述样品为黄油或奶油，所述用氢氧化钠溶液调节合并后溶液的pH值和所述液相色谱法所采用的流动相的pH值分别独立地为7.0～8.5。

发明人经过大量实验得到上述最优检测方法。具体地，由于黄油或奶油中存在大量油脂，而待检测的脱氢乙酸被包覆在油脂中，影响检测。由此，先用正己烷、水及甲醇与样品进行混合，从而有效地使脱氢乙酸与油脂分离，得到主要溶有脱氢乙酸的甲醇-水层(下层)以及主要溶有油脂的正己烷层(上层)。由此，能够有效地防止油脂对检测结果的干扰。接着，用甲醇和水与正己烷层进行混合，以进一步提取混有的少量脱氢乙酸。

采用国标法检测脱氢乙酸时，多次转移提取容器(如容量瓶→分液漏斗→离心管)，转移过程中会容易造成溶液损失，使得检测的回收率较低。本发明的方法可以直接在离心管中进行，无需多次转移，从而避免溶液损失，回收率较高，且缩短了检测时间。此外，发明人意外地发现，采用甲醇提取脱氢乙酸的得率明显高于氢氧化钠溶液，且由于黄油和无水奶油蛋白质含量较低的特性，所以采用甲醇提取时无需另行添加蛋白沉淀剂。然而，采用其他试剂的提取效果不如甲醇好。

发明人意外地发现，用氢氧化钠溶液调节合并后溶液的pH值和液相色谱法所采用的流动相的pH值显著影响目标峰的出峰时间。若两者的pH值差距较大，将导致待测液的出峰时间与标准品(pH值接近流动相的pH值)的出峰时间不一致，从而无法准确判断目标峰，容易造成目标峰的误判。进而，通过采用氢氧化钠溶液调节合并后的溶液的pH值，使其与流动相pH值相同或相近，且均在7.0～8.5范围内，能够有效地保证标准品和待测液的出峰时间一致，从而保证检测结果的准确性。

由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够准确地测定黄油或奶油中脱氢乙酸含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，上述测定样品中脱氢乙酸的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述液相色谱法所采用的流动相为甲醇-乙酸铵溶液，其中所述流动相中乙酸铵溶液含量为85～99质量％、pH值为7.5～8.5。发明人发现，通过控制乙酸铵溶液的pH值及其与甲醇的比例，能够使得目标峰分离，且待测液的出峰时间与标准品(pH值接近流动相的pH值)的出峰时间一致。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够准确地测定黄油或奶油中脱氢乙酸含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，步骤(1)中，所述水的温度为50～80℃。发明人经过大量实验发现，将样品与50～80℃水进行混合后，能够加速黄油或奶油溶解，提高检测效率。若温度过低，无法充分溶解黄油或奶油，延长检测时间；若温度过高，脱氢乙酸不稳定，容易分解。根据本发明的优选实施例，所述水的温度为60℃。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，所述甲醇与水的体积比为1:1。发明人经过大量实验得到上述比例关系，在此条件下能够准确地测定脱氢乙酸的含量，而当甲醇与水的体积比在其它比例条件下，回收率普遍偏低。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，步骤(1)中，所述正己烷、甲醇与水的体积比为2:1:1。发明人经过大量实验得到上述比例关系，在此条件下能够充分溶解奶油或黄油，且使油脂和脱氢乙酸充分分离，即油脂存在于正己烷中，脱氢乙酸存在于甲醇中，从而有效地提取出脱氢乙酸，防止油脂干扰。若正己烷用量较少，将导致无法充分提取油脂，使得甲醇-水层混有部分油脂，造成干扰；若甲醇与水的用量过多，相当于稀释脱氢乙酸，将导致后续液相色谱检测的峰面积过小，容易造成误差。根据本发明的另一个实施例，基于2～7g所述样品，步骤(1)中，所述正己烷、甲醇与水的用量分别为10mL、5mL及5mL。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，采用甲醇-水溶液进行所述定容，其中，所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，所述离心是在5000rpm的转速下进行5min。发明人发现，在此条件下离心，能够充分分离正己烷层和甲醇-水层，从而防止油脂等物质干扰。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.2mol/L。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

根据本发明的实施例，所述液相色谱法检测条件如下：柱温箱：30～40℃；检测波长：293nm；进样量：20μL；色谱柱：C8，规格为250×4.6mm，5μm；流速：1.0mL/min。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够进一步准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

另外，本发明提出了另一种测定样品中脱氢乙酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)称取无水奶油或黄油5.0g于50mL离心管中，加入10mL的正己烷、5.0mL 60℃的热水以及5.0mL的甲醇，涡旋混合两分钟，在5000rpm离心约5min，将下层提取液吸入25mL容量瓶中；2)向所述离心管中加入5.0mL甲醇及5.0mL纯水，涡旋两分钟，在5000rpm离心约5min，将下层提取液吸入所述25mL容量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液将所述容量瓶中的溶液pH值调至8.2，然后用甲醇-水溶液(甲醇与水的体积均为50mL)定容到刻度，摇匀，过0.22μm有机系滤膜，得到待测液；3)利用液相色谱法分别测定脱氢乙酸标准品工作液及所述待测液，将所述标准品工作液的浓度和峰面积绘制标准曲线，并将所述待测液的峰面积代入所述标准曲线中，从而计算得到样品中脱氢乙酸的含量，其中，所述液相色谱法的检测条件如下：柱温箱：30～40℃；紫外检测器：293nm；进样量：20μL；色谱柱：迪马C8，规格为250×4.6mm，5μm；流速：1.0mL/min；流动相：含有10体积％的甲醇和90体积％的0.02mol/L乙酸铵溶液，所述乙酸铵溶液的pH值为7.8，所述流动相的pH值为8.2。由此，根据本发明实施例的测定样品中脱氢乙酸的方法能够准确地测定黄油、奶油中脱氢乙酸的含量，且操作快速、简便。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

实施例1

在该实施例中，按照下列方法测定无水奶油或黄油中脱氢乙酸含量：

1、实验仪器

高效液相色谱仪：配有紫外检测器(日立-2000系列)；十万分之一天平(梅特勒XP205)；

pH计(梅特勒XP8603)；离心机(Heal Force 23R)。

2、实验试剂与材料

脱氢乙酸标准品(sigma)；

甲醇：色谱纯；

正己烷：色谱纯；

乙酸铵：优级纯；

氢氧化钠：优级纯；

硫酸锌：分析纯；

冰乙酸：分析纯，99％；

实验室用水为去离子水。

3、溶液的配制

(1)标准储备溶液的配制(1000μg/ml)：

准确称取脱氢乙酸0.1g，用10ml 10g/L的氢氧化钠溶解，用水定容都100ml。

标准品工作液：将脱氢乙酸储备溶液稀释成适当浓度的标准品工作液。

(2)普通药品配置：

0.02mol/L乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵于1000mL容量瓶中，用水溶解到900ml，用冰乙酸调pH值到7.5-8.5之间，用水定容到刻度后混匀，用滤膜过滤后备用。

流动相：色谱纯甲醇和0.02mol/L乙酸铵溶液(pH为7.5～8.5)按照1:9的比例混合，所得到的流动相的pH值为8.2。

氢氧化钠(10g/L)：准确称取10g氢氧化钠，用水溶解到1000.0ml容量瓶中。

氢氧化钠(0.2mol/L)：准确称取8.0g氢氧化钠，用水溶解到1000.0ml容量瓶中。

硫酸锌：120g七水硫酸锌，用水溶解到1000.0ml容量瓶中。

4、色谱参考条件

柱温箱：30～40℃；

紫外检测器：293nm；

进样量：20μL；

色谱柱：迪马C8，规格为250×4.6mm，5μm；

流速：1.0mL/min。

5、操作步骤

1)称取无水奶油或黄油5.0g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入10mL的正己烷、5.0mL 60℃的热水以及5.0mL的甲醇，涡旋混合两分钟，在5000rpm离心约5min，用一次性滴管将下层提取液吸入25mL容量瓶中；

2)向离心管中加入5.0mL甲醇及5.0mL纯水，涡旋两分钟，在5000rpm离心约5min，用一次性滴管将下层提取液吸入25mL容量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液将容量瓶中的溶液pH值调至8.2，然后用甲醇-水溶液(甲醇与水的体积均为50mL)定容到刻度，摇匀，过0.22μm有机系滤膜，得到待测液；

3)利用液相色谱法分别测定脱氢乙酸标准品工作液及待测液，将标准品工作液的浓度和峰面积绘制标准曲线(如表1所示)，并将待测液的峰面积代入标准曲线中，从而计算得到样品中脱氢乙酸的含量。

表1标准曲线

组分	线性回归方程	相关系数(R2)	检出限(mg/kg)
				脱氢乙酸	Y＝15617.5X-3608.0	0.9996	1.98

实施例2

在该实施例中，按照下列方法测定回收率：

(1)将不含脱氢乙酸的无水奶油或黄油分别与脱氢乙酸标准品工作液进行混合，得到加标样品；

(2)利用实施例1的方法测定加标样品中脱氢乙酸含量；

(3)基于下列公式计算回收率：

回收率(％)＝加标样品中脱氢乙酸含量×100/理论值，

其中，理论值如表2中的“添加水平”。

结果如表2所示。可以看出，回收率均在90％～110％，从而表明本发明方法的准确性较高。

表2回收率

实施例3

按照实施例2的方法测定回收率，其中，脱氢乙酸是每个组分的添加水平，平行测定七次。

检测结果如表3所示，可以看出，相对标准偏差较低，说明本发明方法的精密度较高。

表3检测结果

对比例1

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，按照国标法测定加标样品中的脱氢乙酸含量。其中，脱氢乙酸每个组分的添加水平，平行测定七次。

结果如表4所示。可以看出，该方法检测黄油和无水奶油回收率及相对标准偏差较低，说明其准确性和精密度较低，主要原因为水在常温时不能将样品完全溶解，需要将水温控制在50～80℃，且甲醇提取效果优于氢氧化钠溶液。同时，国标法中多次转移反应体系，造成损失，导致检测结果的准确性和精密度较低。

表4对比例1的检测结果

对比例2

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤1)中，热水的温度为30℃。

结果如表5所示，热水温度过低，延长了黄油、无水奶油的溶化时间，导致检测效率较低。但是，热水的温度低时对检测结果的影响较小。

表5回收率

对比例3

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤1)中，热水的温度为100℃。

结果如表6所示，热水温度过高，脱氢乙酸不稳定，容易分解，回收率比较低。

表6回收率

对比例4

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤1)中，正己烷、甲醇和水的用量分别为：1～20ml、1ml、2ml。

结果如表7所示，甲醇和水的添加量一定时，随着正己烷的加入量增加，脱氢乙酸的回收率逐渐增加；当正己烷的量增加到10ml以后，回收率的结果稳定，说明正己烷的量增加到10ml以后，不再需要增加。但是，相比于实施例2而言，回收率整体偏低。说明甲醇和水的用量会影响检测结果的准确性。

表7回收率

正己烷(ml)	待测物	添加水平(mg/kg)	黄油回收率(％)	无水奶油回收率(％)
					1	脱氢乙酸	4	30.21	32.39
5	脱氢乙酸	4	55.27	54.23
					10	脱氢乙酸	4	80.09	81.56
15	脱氢乙酸	4	79.63	78.85
					20	脱氢乙酸	4	79.88	76.59

对比例5

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤2)中，甲醇与水的用量分别为：5:1、3:1、1:1、1:3、1:5。

结果如表8所示，当正己烷的为10ml时，甲醇与水只有在1:1的混合的条件下，脱氢乙酸的回收率符合检测要求；甲醇与水在其它比例的混合的条件下，回收率偏低。

表8回收率

甲醇：水(v/v)	待测物	添加水平(mg/kg)	黄油回收率(％)	无水奶油回收率(％)
					5:1	脱氢乙酸	4	79.21	78.45
3:1	脱氢乙酸	4	70.95	71.67
					1:1	脱氢乙酸	4	102.01	99.56
1:3	脱氢乙酸	4	70.61	70.78
					1:5	脱氢乙酸	4	67.88	65.28

对比例6

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤1)中，不含热水，甲醇的体积为10mL。

结果如表9所示，前处理过程中由于没有热水，样品没有被完全溶解，样品提取不完全，所以检测结果的回收率偏低，且重复性低。

表9回收率

对比例7

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤2)中，不调节pH值。

结果如表10所示，样品在检测时，是否调节流动相的pH值对于回收率影响不显著，但是保留时间总是相差0.2分钟，在检测过程中对目标峰的判定存在一定的影响。

表10标样与样品的保留时间对比

对比例8

按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，实施例1的步骤1)中，将甲醇替换为20g/L的氢氧化钠溶液。

结果如表11所示，在检测黄油和无水奶油中脱氢乙酸时，提取溶剂为甲醇时，回收率明显高于提取溶剂为20g/L的氢氧化钠溶液的回收率；且提取溶剂为甲醇时，检测样品的回收率满足检测要求。

表11回收率

实施例4研究流动相体系的影响

按照实施例1的方法测定黄油中的脱氢乙酸含量，其中，改变流动相中甲醇和乙酸铵溶液的配比及乙酸铵溶液的pH值，具体如表12～14所示。

可以看出，乙酸铵溶液85～99％，乙酸铵溶液的pH值为7.5～8.5时，所得到的流动相的pH值为7.0～8.5，样品的保留时间与标准品的保留时间一致，从而保证了检测结果的准确性。

表12乙酸铵溶液pH值7.5

表13乙酸铵溶液pH值8.0

表14乙酸铵pH值8.5

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种测定样品中脱氢乙酸的方法，其特征在于，包括：

1)称取无水奶油或黄油5.0g于50mL离心管中，加入10mL的正己烷、5.0mL 60℃的热水以及5.0mL的甲醇，涡旋混合两分钟，在5000rpm离心约5min，将下层提取液吸入25mL容量瓶中；

2)向所述离心管中加入5.0mL甲醇及5.0mL纯水，涡旋两分钟，在5000rpm离心约5min，将下层提取液吸入所述25mL容量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液将所述容量瓶中的溶液pH值调至8.2，然后用甲醇-水溶液(甲醇与水的体积均为50mL)定容到刻度，摇匀，过0.22μm有机系滤膜，得到待测液；

3)利用液相色谱法分别测定脱氢乙酸标准品工作液及所述待测液，将所述标准品工作液的浓度和峰面积绘制标准曲线，并将所述待测液的峰面积代入所述标准曲线中，从而计算得到样品中脱氢乙酸的含量，

其中，所述液相色谱法的检测条件如下：

柱温箱：30～40℃；

紫外检测器：293nm；

进样量：20μL；

色谱柱：迪马C8，规格为250×4.6mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

流动相：含有10体积％的甲醇和90体积％的0.02mol/L乙酸铵溶液，所述乙酸铵溶液的pH值为7.8，所述流动相的pH值为8.2。

2.一种测定样品中脱氢乙酸的方法，其特征在于，包括：

(1)将所述样品、正己烷、水及甲醇进行混合，并将所得到的混合液进行离心，得到具有上、下两层第一分离液的混合液，收集下层第一分离液；

(2)将甲醇、水和所述上层第一分离液进行混合，并将所得到的混合液进行离心，得到具有上、下两层第二分离液的混合液，收集下层第二分离液；

(3)合并所述下层第一分离液和下层第二分离液，用氢氧化钠溶液调节所述合并后溶液的pH值，并进行定容，得到待测液；以及

(4)利用液相色谱法对所述待测液进行检测，并基于检测结果确定所述样品中脱氢乙酸含量，

其中，所述样品为黄油或奶油，

所述用氢氧化钠溶液调节合并后溶液的pH值和所述液相色谱法所采用的流动相的pH值分别独立地为7.0～8.5。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱法所采用的流动相为甲醇-乙酸铵溶液，其中所述流动相中乙酸铵溶液含量为85～99质量％、pH值为7.5～8.5。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水的温度为50～80℃，优选60℃。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甲醇与水的体积比为1:1。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述正己烷、甲醇与水的体积比为2:1:1，

优选地，基于2～7g所述样品，步骤(1)中，所述正己烷、甲醇与水的用量分别为10mL、5mL及5mL。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，采用甲醇-水溶液进行所述定容，其中，所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述离心是在5000rpm的转速下进行5min。

9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.2mol/L。

10.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述液相色谱法检测条件如下：

柱温箱：30～40℃；

检测波长：293nm；

进样量：20μL；

色谱柱：C8，规格为250×4.6mm，5μm；

流速：1.0mL/min。