CN104090059A

CN104090059A - 一种食用香精香料中八种成分同时测定的方法

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Publication number: CN104090059A
Application number: CN201410362516.0A
Authority: CN
Inventors: 王素娟; 缪明明; 秦云华; 张承明; 夏建军; 李劲竹; 王岚; 蒋次清; 曹红云; 吴亿勤; 罗林
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2034-07-28
Also published as: CN104090059B

Abstract

本发明公开了一种食用香精香料中八种成分同时测定的方法，包括以下步骤：萃取溶液的配制、标准溶液的配制、样品溶液的制备、超高效液相色谱-串联质谱分析以及含量的计算。本发明通过对食用香精香料中八种成分测定方法的前处理条件、液相色谱条件和质谱条件的优化，建立了一种简便、快速、高通量的测定方法，本发明具有操作简单、灵敏度高、回收率好、重现性好且检测时间短、溶剂消耗小、检测通量高、检测效率高的优点。

Description

一种食用香精香料中八种成分同时测定的方法

技术领域：

本发明属于理化检验技术领域，具体涉及一种食用香精香料中八种成分硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸同时测定的方法。

背景技术：

硫脲即硫代尿素，是一种重要的化工原料，主要用于有机合成，纺织工业等，由于其具有一定的漂白功能，还可应用于纺织品的漂白。有报道称，接触硫脲可能造成甲状腺肿大等疾病，硫脲还对上呼吸道、眼、胃肠道有刺激性，对皮肤有损害，国家规定严格禁止将硫脲添加到食品中。硫脲的测定方法主要有液相色谱法、光度法、液相色谱-串联质谱法和电化学法等。

芝麻酚为芳香族酚类化合物，天然存在于芝麻油中，具有抗氧化的作用，是芝麻油重要的品质稳定剂，该物质具有较强的自由基清除能力，被广泛用于制备防霉抗菌剂、抗癌、抗高血压药品、高档洗发香波的头发调理剂等。基于该物质的致肿瘤可能性，2006年日本厚生劳动省将芝麻酚列入禁用的42种食品添加剂名单一。国标GB2760—2011《食品添加剂使用卫生标准》中也未将芝麻酚列入许可使用的食品添加剂名单。研究报道的芝麻酚的检测方法主要集中在气相色谱/质谱法，超高效液相色谱法等。

脱氢乙酸对霉菌、酵母菌、腐败菌均有一定的抑制作用。在食品中被用作防腐剂、防霉剂，用于以碳水化合物为主要成分的食品防腐，主要应用于酱菜、腐乳、果汁、糕点等。脱氢乙酸为酸型防腐剂，其效力随pH值而定，酸性越强效果越好，而在碱性条件下几乎无效。脱氢乙酸能迅速被人体所吸收，进入人体后即分散于血浆和许多器官中，有抑制体内多种氧化酶的作用。目前，欧共体已明确禁止使用，日本对其使用也进行了限制，我国在一定范围内允许其使用，但最大允许使用量为300μg/mL。脱氢乙酸的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法等。

甘素，学名为对乙氧基苯脲，是一种人工合成甜味剂，其甜度相当于蔗糖的200倍。甘素具有致癌性，因而被列为禁用物质。甘素的测定方法主要有液相色谱法、液质联用法、毛细管电泳法等。

邻氨基苯甲酸肉桂酯可作为调味剂或香味剂，从而被用于化妆品、食品等行业，在最终加香食品中浓度约为1.7-730mg/Kg。由于邻氨基苯甲酸肉桂酯是一种合成产品，一些研究表明该物质具有致癌性，对人体具有较大的危害，从而在多个国家被禁止使用。1940开始，邻氨基苯甲酸肉桂酯作为一种合成的调味剂用于葡萄或樱桃风味的食品中，并获得美国食品和药物管理局批准作为食品添加剂，欧盟也将邻氨基苯甲酸肉桂酯作为人工香味物质，建议使用浓度为25mg/Kg。1980年，英国国家癌症研究院研究发现高浓度地将邻氨基苯甲酸肉桂酯添加于食品中导致杂交小鼠体内肝细胞发生癌变，英国食品专家委员会因此而将其禁止应用于食品工业。随后，美国食品和药物管理局也将邻氨基苯甲酸肉桂酯列为食品中禁止使用的添加剂。邻氨基苯甲酸肉桂酯的检测方法主要有高效液相色谱法等。

正二氢愈创酸（NDGA）为抗氧化剂，是从常青灌木中提取的一种天然产物，具有多种生物活性，包括抑制脂氧化酶、***状瘤病毒、单纯疱疹病毒和降血糖的作用等。近年NDGA肿瘤血管生成抑制作用的发现,及其具有抑制多种肿瘤的发生和发展的作用,尤其是NDGA对人脑恶性胶质瘤的治疗作用,为***、癌症提供了新的途径。高效立体选择性的合成NDGA为发展新型***、癌症新药提供了物质基础,使抗癌新药的研发工作得以开展。正二氢愈创酸的测定方法主要有高液相色谱法、液相色谱-质谱法等。

马兜铃酸是硝基菲类化合物，具有提高机体抗菌能力，提高细胞免疫功能的作用，普遍存在于马兜铃科马兜铃属植物中。该类植物在中国、印度等国较广泛地用于医药配制。2000年5月美国食品药品管理局(FDA)禁止了包括关木通、马兜铃、青木香、天仙藤、广防己、木防己等同名异物、异名同物品种的相关草药和中成药的进口和销售。随后，英国、加拿大、澳大利亚、新西兰和马来西亚等国家也采取了同样的措施。在自然界发现的6种马兜铃酸中，马兜铃酸A的毒性最强。文献报道马兜铃酸类物质的检测方法已有很多，主要有薄层色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。

山梨酸是我国允许使用的食品防腐剂，其化学名称为2,4-己二烯酸，具有较好的稳定性。由于山梨酸对霉菌、酵母菌、好气性细菌具有较好的抑制作用，且其毒性较小、安全性较高，常作为食品的防腐剂使用，但过量、长期食用会危害人体肝脏、肾脏功能，国家标准GB2760-2007中明确规定了山梨酸的最大使用限量。山梨酸的防腐效果随pH值的升高而降低，其pH值一般为5.0-6.0。山梨酸含量的测定方法主要有分光光度法、色谱法、紫外吸收光度法等。

目前，国内外公开文献暂无关于这八种成分同时检测的方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种食用香精香料中八种成分硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸同时测定的方法。

本发明针对现有技术的不足，通过长期的研究和探索，在方法对比、优化的基础上提出了一种食用香精香料中八种成分（硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸）测定的方法，用于检测食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸。本发明考察研究了食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的前处理条件、液相色谱条件和质谱条件，为简便、快速、高通量的测定食用香精香料中的八种成分提供了技术支持。

本发明的技术方案为：所述的测定方法包括以下步骤：

A、萃取溶液的配制：取甲醇制备成体积比7:3的甲醇-水溶液即为萃取溶液；

B、标准溶液的配制：用含内标的萃取溶液分别配制硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的标准溶液；

C、样品溶液的制备：使用含内标的萃取溶液萃取食用香精香料样品，过有机相滤膜后得到样品溶液；

D、超高效液相色谱-串联质谱仪分析：利用超高效液相色谱-串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；

E、食用香精香料中八种成分硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸含量的计算。

B步骤中所述标准溶液的配制是：分别称取硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸各20mg，用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别得到单一标准储备液；称取水杨酸-d4 10mg，用甲醇溶解后转移至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到内标储备液；分别取单一标准储备液0.1-1mL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级混合标准溶液；取内标储备液1mL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级内标标准溶液；分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL的一级混合标准溶液至50mL棕色容量瓶中，每个棕色容量瓶均加入2mL一级内标标准溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准溶液。

取0.8mL内标储备液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含内标的萃取溶液。所述含内标的萃取溶液中的内标物为水杨酸-d4。

C步骤中所述样品溶液的制备方法是：称取0.5g试样于50mL具塞锥形瓶中，准确加入25mL含内标的萃取溶液，用150r/min振荡萃取20min，取上清液过有机相滤膜，滤液为样品溶液。所述的有机相滤膜为0.22μm聚醚砜滤膜。所述振荡萃取的振荡频率为120-180r/min，萃取时间为10-30min。

D步骤中所述的色谱分析条件为色谱柱采用C18，1.7μm，2.1×100mm色谱柱；流动相为甲醇A和0.05%甲酸水溶液B；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；样品温度：10℃；采用梯度洗脱程序，即初始A是10%，B是90%，1min时A是35%，B是65%，4min时A是65%，B是35%，6min时初始A是90%，B是10%，7min时A是90%，B是10%，8min时A是10%，B是90%，10min时A是10%，B是90%；所述的质谱条件为：电喷雾离子源（ESI）正离子模式，扫描方式为多反应监测模式，电喷雾电压为5500V，离子源温度600℃，气帘气：25Psi，雾化气：55Psi，辅助加热气：50Psi，硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A、山梨酸和水杨酸-d4的定量离子对分别为：m/z 60.0,109.1,127.1, 108.0,117.1,193.2,265.1,95.1，97.1。其它质谱参数见表1。

E步骤中所述含量的计算是：首先以标准溶液所检测出的目标物和内标物的色谱峰面积比对应其相应浓度比进行回归分析得到标准曲线线性方程，然后将样品溶液检出的目标物的色谱峰面积，代入标准曲线线性方程，即得到样品中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A、山梨酸的含量。

本发明针对现有技术的不足，通过对食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的前处理条件、色谱条件和质谱条件的优化，建立了一种简便、快速、高通量的测定方法，为食用香精香料中的八种成分的检测提供了技术支持。本发明具有操作简单、灵敏度高、回收率好、重现性好且检测时间短、溶剂消耗小、检测通量高、检测效率高的优点，对于监督食用香精香料的质量安全具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明的测定方法的流程图。

图2为硫脲的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图3为芝麻酚的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图4为脱氢乙酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图5为对乙氧基苯脲的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图6为邻氨基苯甲酸肉桂酯的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图7为正二氢愈创酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图8为马兜铃酸A的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图9为山梨酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。

图10为标准溶液中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

本发明所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，包括以下步骤：

（1）萃取溶液的配制：取甲醇制备成体积比7:3的甲醇-水溶液即为萃取溶液；

（2）标准溶液的配制：用含内标的萃取溶液分别配制硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的标准溶液；

（3）样品溶液的制备：使用含内标的萃取溶液萃取食用香精香料样品，过有机相滤膜后得到样品溶液；

（4）超高效液相色谱-串联质谱仪分析：利用超高效液相色谱-串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；

（5）食用香精香料中八种成分硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸含量的计算。

B步骤中所述标准溶液的配制是：分别称取硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸各20mg，用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别得到单一标准储备液；称取水杨酸-d4 10mg，用甲醇溶解后转移至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到内标储备液；分别取单一标准储备液0.1-1mL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级混合标准溶液；取内标储备液1mL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级内标标准溶液；分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL的一级混合标准溶液至50mL棕色容量瓶中，每个棕色容量瓶均加入2mL一级内标标准溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准溶液。所述分别取单一标准储备液0.1mL-1mL具体为分别取硫脲、芝麻酚、对乙氧基苯脲、正二氢愈创酸、马兜铃酸A、山梨酸单一标准储备液1mL和脱氢乙酸、邻氨基苯甲酸肉桂酯0.1mL。

C步骤中所述样品溶液的制备方法是：称取0.5g试样于50mL具塞锥形瓶中，准确加入25mL含内标的萃取溶液，用150r/min振荡萃取20min，取上清液过有机相滤膜，滤液为样品溶液。样品溶液用超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析。

所述的有机相滤膜为0.22μm聚醚砜滤膜。D步骤中所述的液相色谱分析条件为：色谱柱：C18，1.7μm，2.1×100mm色谱柱；流动相为甲醇A和0.05%甲酸水溶液B；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；样品温度：10℃；采用梯度洗脱程序，即初始A是10%，B是90%，1min时A是35%，B是65%，4min时A是65%，B是35%，6min时初始A是90%，B是10%，7min时A是90%，B是10%，8min时A是10%，B是90%，10min时A是10%，B是90%；所述的质谱条件为采用电喷雾离子源（ESI）正离子模式，扫描方式为多反应监测模式，电喷雾电压为5500V，离子源温度600℃，气帘气：25Psi，雾化气：55Psi，辅助加热气：50Psi，硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A、山梨酸和水杨酸-d4的定量离子对分别为：

m/z 60.0,109.1,127.1, 108.0,117.1,193.2,265.1,95.1，97.1。其它质谱参数见表1。

表1 食用香精香料中八种成分的质谱参数表

与标准曲线相对应的回归方程、相关系数等如表2所示。

表2 食用香精香料中八种成分的标准曲线方程和检出限

然后将样品测得的检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线线性方程，即得到样品中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的浓度，由此计算食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的含量。

食用香精香料样品中八种成分的含量计算公式如下：

式中：

Xi—样品中八种成分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

Ci—由标准工作曲线得出的样品中八种成分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

Ci0—由标准工作曲线得出的空白中八种成分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V—萃取溶液体积，单位为毫升（mL）；

m—试样质量，单位为克（g）。

本发明方法的精密度和加标回收率的检测方法如下：采用试样进行加标回收率试验，分别在试样中加入低、中、高三个不同浓度水平的标准溶液进行加标回收率试验，每个样品平行测定6次，分析条件同实施例1，然后计算食用香精香料中八种成分的加标回收率及加标后测定值的相对标准偏差，结果见表3。

表3 食用香精香料中八种成分的精密度和回收率（n=6）

由表3可以看出，在三个加标水平下，采用该方法测定食用香精香料中的八种成分的平均回收率分别为：91.55%、97.36%、97.34%、94.87%、97.83%、95.06%、95.03%、95.38 %，样品测定结果的相对标准偏差分别为：3.62%、3.34%、3.05%、3.20%、4.07%、2.66%、2.53 %、3.93%，说明该方法稳定，方法的回收率高、重现性好。

本发明通过实验考查了方法的重复性、再现性和普适性等，确定了食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，达到了以下效果：

（1）检测时间短：采用本发明测定食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸的含量周期仅10min。

（2）溶剂消耗小。

（3）检测通量高，检测效率高。

（4）本发明具有操作简单，灵敏度高，回收率好及重现性好等优点，八种成分均具有良好的线性关系，该方法的检出限在0.010-0.023mg/kg之间，平均回收率分别为：91.55%、97.36%、97.34%、94.87%、97.83%、95.06%、95.03%、95.38 %，样品测定结果的相对标准偏差分别为：3.62%、3.34%、3.05%、3.20%、4.07%、2.66%、2.53 %、3.93%。

（5）该方法的建立对于监督食用香精香料的质量安全具有非常重要的意义。

Claims

1.一种食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于B步骤中所述标准溶液的配制是：分别称取硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A和山梨酸各20mg，用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别得到单一标准储备液；称取水杨酸-d4 10mg，用甲醇溶解后转移至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到内标储备液；分别取单一标准储备液0.1-1mL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级混合标准溶液；取内标储备液1mL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级内标标准溶液；分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL的一级混合标准溶液至50mL棕色容量瓶中，每个棕色容量瓶均加入2mL一级内标标准溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准溶液。

3.根据权利要求1所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于取0.8mL内标储备液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含内标的萃取溶液。

4.根据权利要求1或3所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于所述含内标的萃取溶液中的内标物为水杨酸-d4。

5.根据权利要求1所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于C步骤中所述样品溶液的制备方法是：称取0.5g试样于50mL具塞锥形瓶中，准确加入25mL含内标的萃取溶液，用150r/min振荡萃取20min，取上清液过有机相滤膜，滤液为样品溶液。

6.根据权利要求1或5所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于所述的有机相滤膜为0.22μm聚醚砜滤膜。

7. 根据权利要求1所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于D步骤中所述的液相色谱分析条件为：色谱柱采用C18，1.7μm，2.1×100mm色谱柱；流动相为甲醇A和0.05%甲酸水溶液B；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；样品温度：10℃；采用梯度洗脱程序，即初始A是10%，B是90%，1min时A是35%，B是65%，4min时A是65%，B是35%，6min时初始A是90%，B是10%，7min时A是90%，B是10%，8min时A是10%，B是90%，10min时A是10%，B是90%；所述的质谱条件为采用电喷雾离子源（ESI）正离子模式，扫描方式为多反应监测模式，电喷雾电压为5500V，离子源温度600℃，气帘气：25Psi，雾化气：55Psi，辅助加热气：50Psi，硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A、山梨酸和水杨酸-d4的定量离子对分别为：m/z 60.0,109.1,127.1,108.0,117.1,193.2,265.1,95.1，97.1。

8.根据权利要求1所述食用香精香料中八种成分同时测定的方法，其特征在于E步骤中所述含量的计算是：首先以标准溶液所检测出的目标物和内标物的色谱峰面积比对应其相应浓度比进行回归分析得到标准曲线线性方程，然后将样品溶液检出的目标物的色谱峰面积，代入标准曲线线性方程，即得到样品中硫脲、芝麻酚、脱氢乙酸、对乙氧基苯脲、邻氨基苯甲酸肉桂酯、正二氢愈创酸、马兜铃酸A、山梨酸的含量。