CN108375644B - 一种神经肌肉阻滞剂中间体的分析方法 - Google Patents

一种神经肌肉阻滞剂中间体的分析方法 Download PDF

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Abstract

一种神经肌肉阻滞剂中间体的分析方法，所述方法包括采用高效液相色谱法进行米库氯铵中间体的分离的步骤。本发明方法可有效分离米库氯铵的中间体1‑5及杂质，同时对它们各自的含量进行测定，灵敏度高，准确性高，具有较好的分离度和杂质检测限度，可用于米库氯铵合成工艺的过程控制，有利于米库氯铵成品的质量控制，一次性即可完成米库氯铵中间体1‑5的纯度分析检测，操作简单，大大简化了分析过程和分析时间，提高了分析效率，节约了工艺周期和物力、人力成本。

Description

一种神经肌肉阻滞剂中间体的分析方法
技术领域
本发明涉及一种神经肌肉阻滞剂中间体的分析方法。
背景技术
神经肌肉阻滞剂为外科手术和气管插管提供骨骼肌松弛作用。米库氯铵是目前最短效的非去极化神经肌肉阻滞剂，可作为全身麻醉的辅助用药，使骨骼肌松弛，以利于气管插管和机械通气。临床剂量下无明显蓄积，促使组胺释放作用较小，对颅内压和眼内压无不良影响，易于控制肌松浓度和范围，术后恢复快。米库氯铵能灵活运用于各种手术中，除了一般病人，还可应用于神经肌肉疾患和血钾增高的病人；特别是在小儿手术中很少影响小儿的心血管，被视为琥珀胆碱的替代药。米库氯铵良好的临床表现，使其在麻醉手术中得到了越来越多的关注。
米库氯铵，其化学名称为Mivacurium chloride，(1R,1'R,)-2,2'-((((E)-4-烯基辛二酰基)双(氧基))双(正丙基-3,1-二取代))双(6,7-二甲氧基-2-甲基-1-(3,4,5-三甲氧苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-季铵)二氯盐，分子式为C58H80Cl2N2O14，分子量1100.17，结构式：
Figure BDA0001495086620000011
原研公司为Abbott，1992年首次在美国上市，其性状为白色或类白色粉末；有引湿性，在水或二氯甲烷中极易溶解，在正己烷中几乎不溶。
米库氯铵原料合成时用到了中间体1～5。通过研究发现，当米库氯铵的中间体含有杂质时，会通过缩合、成环、还原、甲基化等一系列反应，将这些杂质以及它们的衍生杂质引入到最终合成的米库氯铵原料中，从而影响米库氯铵相关制剂产品的质量。
Figure BDA0001495086620000012
Figure BDA0001495086620000021
若仅在米库氯铵原料药的质量标准中采用相关分析方法用于米库氯铵原料药成品杂质的检测，则无法从源头上控制杂质的含量。
文献(European Journal of Pharmaceutical Sciences,5(1997)253–266)报道了从中间体4合成中间体5的合成步骤，以及仅能用于监控此步骤反应和测定中间体5的纯度的HPLC方法。色谱柱为5mm silica column(Lichrosorb,E.Merck)，波长采用282nm，流动相为乙腈-水-磷酸(91:8:1)，流速为1.3～1.5ml/min。该方法的缺陷在于，仅适用于中间体5的控制，而不能应用于其他四个中间体，对米库氯铵的整个合成不能达成完整的过程控制的目的。
文献(化学试剂，2013，35(1)，94～96)报道了中间体4的含量测定方法。色谱柱为C18柱(Agilent 250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水(60:40)，检测波长是281nm，流速为1.0mL/min，柱温控制在25℃，并采用外标法进行计算。该方法为中间体4的含量测定方法，还需要拿到中间体4的对照品，才能计算其结果。首先该方法对于中间体4的杂质测定无益，其次不能达到高效快速地得到结果、为过程控制提供数据的目的，因此该方法不可能被应用于对合成工艺的过程控制。
从上述公开的文献来看，报道的方法仅能对以上所述的中间体中的某一个中间体进行分析检测，或仅仅能对其中的某一个反应步骤进行过程控制。并未见有检测方法可以同时对米库氯铵的这5个中间体进行质量分析检测，也未见有检测方法可以对这一系列的合成工艺进行过程监控。
5个中间体的结构极为相似，要对这一合成路线进行过程控制，在分析方法中对这几种物质进行分离是一件极具挑战性的事情。并且，还要对每个中间体进行质量控制使之符合标准，也急需要建立相应的分析方法。为了更好达到对米库氯铵合成工艺的过程控制和米库氯铵中间体的质量控制，有必要建立合理、高效的分析检测方法对上述合成工艺步骤进行控制和中间体的纯度进行检测分析。
发明内容
本发明开创性地开发了一种分析方法，能够分别或者同时对五个中间体进行纯度的检测，并且还能实现对从中间体1到中间体5的一系列合成步骤的过程控制。
本发明提供一种米库氯铵中间体的分离方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法进行米库氯铵中间体的分离的步骤，所述高效液相色谱法中，检测波长为250～300nm，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述流动相A为水溶液:有机溶剂＝100:0～50:50(v/v)，流动相B为水溶液:有机溶剂＝0:100～50:50(v/v)，梯度洗脱的条件为：
a.流动相B从0％～30％变化至45％～100％，此阶段的运行时间为10～30min；
b.在阶段a的基础上，流动相B保持45％～100％比例不变，此阶段的运行时间为10～30min；
其中，在每个阶段内，流动相B的百分比随着时间而变化或保持不变，流动相A所占百分比与流动相B所占百分比之和为100％。
可选地，上述的分离方法：所述高效液相色谱法中，以十八烷基键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶为固定相。
可选地，上述的分离方法：所述流动相A为水溶液:有机溶剂＝95:5～55:45(v/v)。
可选地，上述的分离方法：所述流动相B为水溶液:有机溶剂＝5:95～45:55(v/v)。
可选地，所述流动相A和流动相B中的水溶液各自独立地选自纯水、含酸缓冲液、含碱缓冲液、含盐缓冲液、含离子对试剂水溶液中的至少一。
可选地，所述流动相A和流动相B中的水溶液各自独立地选自纯水、含酸缓冲液、含盐缓冲液、含离子对试剂水溶液中的至少一种。
可选地，所述流动相A和流动相B中的有机溶剂各自独立地选自乙腈、醇类中的至少一种。
可选地，所述含酸缓冲液中的酸选自磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种。
可选地，所述含酸缓冲液中的酸选自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种。
可选地，所述含酸水溶液的浓度为0.005％～2％(v/v)，可选为0.01％～1％(v/v)。
可选地，所述含碱缓冲液中的碱选自氨、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、二乙胺、三乙胺中的至少一种。
可选地，所述含盐缓冲液中的盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸铵、甲酸铵、乙酸钠中的至少一种。
可选地，所述含盐缓冲液中的盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、乙酸铵、甲酸铵、乙酸钠中的至少一种。
可选地，所述含盐水溶液的浓度为1.0mol/L～0.005mol/L，可选为0.5mol/L～0.01mol/L。
可选地，所述含离子对试剂水溶液中的离子对选自戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠中的至少一种。
可选地，所述含离子对试剂水溶液的浓度为0.001mol/L～0.05mol/L，可选为0.002mol/L～0.01mol/L。
可选地，所述水溶液的pH为2.0～10.0，可选为2.0～7.0。
可选地，所述水溶液的pH值采用氨水、磷酸、氢氧化钠、甲酸、乙酸、氢氧化钾、三乙胺、二乙胺、三氟乙酸中的一种或一种以上进行调节。
可选地，所述醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
可选地，上述的分离方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100～70 0～30
5 80～60 20～40
10 70～40 30～60
15 65～20 35～80
20 55～0 45～100
40 55～0 45～100
或
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100～80 0～20
5 80～60 20～40
15 70～40 30～60
20 50～20 50～80
30 30～0 70～100
50 30～0 70～100
或
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100～75 0～25
10 80～60 20～40
15 65～40 35～60
25 50～15 50～85
30 35～0 65～100
45 35～0 65～100
其中，流动相B的百分比随着时间而变化或保持不变，流动相A所占百分比与流动相B所占百分比之和为100％。
可选地，上述的分离方法，其特征在于：
所述流动相的流速为0.5～2.0mL/min，可选为0.5～1.5mL/min，或可选为0.7～1.3mL/min；
所述检测波长为260～290nm，可选为270～290nm；
进样量为1-100μL，可选为5～50μL，或可选为20μL。
可选地，上述分离方法，其特征在于，所述米库氯铵中间体包括选自米库氯铵的中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5
Figure BDA0001495086620000061
本发明还提供一种米库氯铵中间体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用上述分离方法进行米库氯铵中间体的检测的步骤。
可选地，所述检测方法包括以下步骤：取待测样品，制成供试品溶液，吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，采用上述分离方法进行测定；
可选地，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取待测样品，用稀释液制成浓度为0.1mg/mL～5.0mg/mL的供试品溶液；
可选地，所述稀释液选自水溶液、有机溶剂中的至少一种；
可选地，所述水溶液选自纯水、含酸缓冲液、含碱缓冲液、含盐缓冲液、含离子对试剂水溶液中的至少一种；
可选地，所述含酸缓冲液中的酸选自磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种；可选地，所述含酸缓冲液中的酸选自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种；可选地，所述含酸水溶液的浓度为0.005％～2％(v/v)，可选为0.01％～1％(v/v)；
可选地，所述含碱缓冲液中的碱选自氨、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、二乙胺、三乙胺中的至少一种；
可选地，所述含盐缓冲液中的盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸铵、甲酸铵、乙酸钠中的至少一种；可选地，所述含盐缓冲液的浓度为1.0mol/L～0.001mol/L，可优选为0.5mol/L～0.005mol/L；
可选地，所述含离子对试剂水溶液中的离子对选自戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠中的至少一种；可选地，所述含离子对试剂水溶液的浓度为0.001mol/L～0.05mol/L，可选为0.002mol/L～0.01mol/L；
可选地，所述水溶液的pH为2.0～10.0，可选为2.0～7.0；
可选地，所述水溶液的pH值采用氨水、磷酸、氢氧化钠、甲酸、乙酸、氢氧化钾、三乙胺、二乙胺、三氟乙酸中的一种或一种以上调节。
可选地，上述的检测方法，其特征在于，所述米库氯铵中间体包括选自米库氯铵的中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5
Figure BDA0001495086620000071
本发明还提供一种米库氯铵中间体的纯度测定方法，其特征在于，所述纯度测定方法包括采用上述的检测方法进行米库氯铵中间体的纯度测定的步骤；可选地，所述纯度测定方法采用面积归一化法进行计算。
可选地，上述的纯度测定方法，其特征在于，所述米库氯铵中间体包括选自米库氯铵的中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5
Figure BDA0001495086620000072
本发明还提供一种米库氯铵的质量分析方法，其特征在于，包括杂质的分离步骤、检测步骤或测定步骤，其中，所述分离步骤包括按照上述分离方法进行分离，所述检测步骤包括按照上述检测方法进行检测，所述测定步骤包括按照上述纯度测定方法进行测定的步骤。
本发明米库氯铵的质量分析方法可以应用于米库氯铵原料药或米库氯铵制剂中杂质的分析。
本发明的米库氯胺中间体的分离、检测及含量测定方法具有以下优点：可有效分离米库氯铵的中间体1-5及杂质，同时对它们各自的含量进行测定，灵敏度高，准确性高，具有较好的分离度和杂质检测限度，可实现对从中间体1到中间体5的一系列合成步骤的过程控制，能够用于米库氯铵合成工艺的过程控制，有利于米库氯铵成品的质量控制，一次性即可完成米库氯铵中间体1-5的纯度分析检测，操作简单，大大简化了分析过程和分析时间，提高了分析效率，节约了工艺周期和物力、人力成本。
附图说明
图1是实施例1中间体1的供试品溶液的高效液相色谱图；
图2是实施例1中间体2的供试品溶液的高效液相色谱图；
图3是实施例1中间体3的供试品溶液的高效液相色谱图；
图4是实施例1中间体4的供试品溶液的高效液相色谱图；
图5是实施例1中间体5的供试品溶液的高效液相色谱图；
图6是实施例1中间体1～5的混合定位溶液的高效液相色谱图。
以上附图中，纵坐标为响应值，单位为AU，横坐标为保留时间，单位为min。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：纯水-乙腈(95:5)
流动相B：纯水-乙腈(25:75)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
5 80 20
10 70 30
15 65 35
20 55 45
40 55 45
波长：275nm
流速：0.5mL/min
稀释剂：0.45％乙酸水溶液(用氨试液调节PH至4.0)-乙腈(40:60)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含2.5mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000091
Figure BDA0001495086620000092
实施例2
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：1％磷酸水溶液(用磷酸调节PH至2.0)-甲醇(75:25)
流动相B：1％磷酸水溶液(用磷酸调节PH至2.0)-甲醇(10:90)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 70 30
5 60 40
10 40 60
15 20 80
20 0 100
40 0 100
波长：260nm
流速：1.3mL/min
稀释剂：1％磷酸水溶液(用磷酸调节PH至2.0)-甲醇(75:25)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.5mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000101
Figure BDA0001495086620000102
Figure BDA0001495086620000111
实施例3
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.5％甲酸水溶液(用氨试液调节PH至4.6)-甲醇(90:10)
流动相B：0.5％甲酸水溶液(用氨试液调节PH至4.6)-甲醇(30:70)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
5 65 35
10 60 40
15 40 60
20 35 65
40 35 65
波长：285nm
流速：0.7mL/min
稀释剂：0.5％甲酸水溶液(用氨试液调节PH至4.6)-甲醇(90:10)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含3.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000121
Figure BDA0001495086620000122
实施例4
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.25％乙酸水溶液(用氨试液调节PH至5.0)-甲醇(95:5)
流动相B：0.25％乙酸水溶液(用氨试液调节PH至5.0)-甲醇(10:90)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
5 65 35
15 45 55
20 20 80
30 5 95
50 5 95
波长：280nm
流速：1.0mL/min
稀释剂：纯水
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含1.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000131
Figure BDA0001495086620000132
实施例5
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.01％三氟乙酸水溶液(用氢氧化钠调节PH至3.0)-甲醇-乙腈(60:30:10)
流动相B：0.01％三氟乙酸水溶液(用氢氧化钠调节PH至3.0)-甲醇-乙腈(20:60:20)
梯度洗脱：
Figure BDA0001495086620000133
Figure BDA0001495086620000141
波长：269nm
流速：1.5mL/min
稀释剂：0.01％三氟乙酸水溶液(用氢氧化钠调节PH至3.0)-甲醇-乙腈(60:30:10)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.1mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各40μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000142
Figure BDA0001495086620000143
实施例6
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.005mol/L磷酸二氢钠水溶液(用氢氧化钠调节PH至7.0)-乙腈(85:15)
流动相B：0.005mol/L磷酸二氢钠水溶液(用氢氧化钠调节PH至7.0)-乙腈(5:95)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
5 80 20
15 70 30
20 50 50
30 30 70
50 30 70
波长：265nm
流速：0.6mL/min
稀释剂：0.005mol/L磷酸二氢钠水溶液(用氢氧化钠调节PH至7.0)-乙腈(85:15)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含2.5mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各25μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000151
Figure BDA0001495086620000152
实施例7
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节PH至2.5)-甲醇(90:10)
流动相B：0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节PH至2.5)-乙腈(30:70)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
10 80 20
15 65 35
25 50 50
30 35 65
45 35 65
波长：280nm
流速：1.2mL/min
稀释剂：0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节PH至2.5)-乙腈(30:70)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含5.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000161
Figure BDA0001495086620000162
Figure BDA0001495086620000171
实施例8
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.1mol/L甲酸铵水溶液(用甲酸或者氨试液调节PH至5.0)-乙腈(55:45)
流动相B：0.1mol/L甲酸铵水溶液(用甲酸或者氨试液调节PH至5.0)-甲醇(40:60)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 75 25
10 60 40
15 40 60
25 15 85
30 0 100
45 0 100
波长：285nm
流速：0.7mL/min
稀释剂：0.1mol/L甲酸铵水溶液(用甲酸或者氨试液调节PH至5.0)-甲醇(40:60)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含3.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各30μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000181
Figure BDA0001495086620000182
实施例9
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：1.0mol/L乙酸铵水溶液(用乙酸调节PH至3.0)-甲醇-乙腈(75:20:5)
流动相B：1.0mol/L乙酸铵水溶液(用乙酸调节PH至3.0)-甲醇-乙腈(20:40:40)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 97 3
10 80 20
15 45 55
25 20 80
30 5 95
45 5 95
波长：290nm
流速：1.0mL/min
稀释剂：1.0mol/L乙酸铵水溶液(用乙酸调节PH至3.0)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含2.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000191
Figure BDA0001495086620000192
实施例10
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.5mol/L乙酸钠水溶液(用氨试液调节PH至4.5)-甲醇-乙腈(60:30:10)
流动相B：0.5mol/L乙酸钠水溶液(用氨试液调节PH至4.5)-甲醇-乙腈(45:50:5)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 90 10
10 70 30
15 52 48
25 40 60
30 25 75
45 25 75
波长：270nm
流速：0.9mL/min
稀释剂：0.5mol/L乙酸钠水溶液(用氨试液调节PH至4.5)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.1mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各50μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000201
Figure BDA0001495086620000202
实施例11
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.001mol/L戊烷磺酸钠水溶液-乙腈(80:20)
流动相B：0.001mol/L戊烷磺酸钠水溶液-乙腈(45:55)
梯度洗脱：
Figure BDA0001495086620000203
Figure BDA0001495086620000211
波长：280nm
流速：1.0mL/min
稀释剂：0.001mol/L戊烷磺酸钠水溶液
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.5mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000212
Figure BDA0001495086620000213
实施例12
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.05mol/L戊烷磺酸钠水溶液-甲醇(90:10)
流动相B：0.05mol/L戊烷磺酸钠水溶液-甲醇(20:80)
梯度洗脱：
Figure BDA0001495086620000214
Figure BDA0001495086620000221
波长：282nm
流速：0.9mL/min
稀释剂：0.05mol/L戊烷磺酸钠水溶液-甲醇(90:10)
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含1.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各25μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000222
Figure BDA0001495086620000223
实施例13
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.002mol/L己烷磺酸钠水溶液-甲醇(95:5)
流动相B：0.002mol/L己戊烷磺酸钠水溶液-甲醇(25:75)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 90 10
5 70 30
10 45 55
15 30 70
20 0 100
40 0 100
波长：275nm
流速：1.1mL/min
稀释剂：0.002mol/L己戊烷磺酸钠水溶液
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.8mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000231
Figure BDA0001495086620000232
实施例14
主要实验仪器及色谱条件：
采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备G1312X二元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1315CD二极管阵列检测器，色谱分析处理***采用AgilentChemstation色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.01mol/L癸烷磺酸钠水溶液-乙腈(65:35)
流动相B：0.01mol/L癸烷磺酸钠水溶液-乙腈(10:90)
梯度洗脱：
梯度(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
10 75 25
15 60 40
25 35 65
30 10 90
45 10 90
波长：285nm
流速：1.0mL/min
稀释剂：0.01mol/L癸烷磺酸钠水溶液
供试品溶液：分别称取中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、中间体5的样品，精密称定，分别用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含1.0mg的单个中间体溶液；取中间体1～5的混合样品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含0.01mg混合样品的混合定位溶液。
测定法：分别精密量取各供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算。
测定结果：
Figure BDA0001495086620000241
Figure BDA0001495086620000242
Figure BDA0001495086620000251
从实施例1-14对单个中间体溶液和混合定位溶液的分析测试结果可以看出，本发明的分离和检测方法可以使中间体1-5分别或者同时得到很好地分离和检测，具有较好的分离度和杂质检测限度。由混合定位溶液的测试结果可以看出，本发明方法一次性即可完成米库氯铵中间体1-5的纯度分析检测，大大简化了分析过程和分析时间，提高了分析效率，节约了工艺周期和物理、人力成本。由单个中间体溶液的测试结果可以看出，本发明方法还检测出了多种杂质，并且定量分析了中间体1-5、杂质峰中面积最大的杂质的含量以及总的杂质含量，因此，本发明的分离、检测和含量测定方法可以对米库氯铵进行更加全面和准确的分析检测，可用于米库氯铵合成工艺的过程控制，有利于米库氯铵成品的质量控制。
以上详细描述了本发明优选地实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (27)

1.一种米库氯铵中间体的分离方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法进行米库氯铵中间体的分离的步骤，所述高效液相色谱法中，检测波长为260~290nm，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：纯水-乙腈体积比为95:5
流动相B：纯水-乙腈体积比为25:75
梯度洗脱：
Figure 769230DEST_PATH_IMAGE001
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用磷酸调节pH为2.0的1%磷酸水溶液-甲醇体积比为75:25
流动相B：用磷酸调节pH为2.0的1%磷酸水溶液-甲醇体积比为10:90
梯度洗脱：
Figure 538603DEST_PATH_IMAGE002
或者，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用氨试液调节pH为4.6的0.5%甲酸水溶液-甲醇体积比为90:10
流动相B：用氨试液调节pH为4.6的0.5%甲酸水溶液-甲醇体积比为30:70
梯度洗脱：
Figure 902589DEST_PATH_IMAGE003
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用氨试液调节pH为5.0的0.25%乙酸水溶液-甲醇体积比为95:5
流动相B：用氨试液调节pH为5.0的0.25%乙酸水溶液-甲醇体积比为10:90
梯度洗脱：
Figure 591059DEST_PATH_IMAGE004
或者，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用氢氧化钠调节pH为3.0的0.01%三氟乙酸水溶液-甲醇-乙腈体积比为60:30:10
流动相B：用氢氧化钠调节pH为3.0的0.01%三氟乙酸水溶液-甲醇-乙腈体积比为20:60:20
梯度洗脱：
Figure 306074DEST_PATH_IMAGE005
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用氢氧化钠调节pH为7.0的0.005mol/L磷酸二氢钠水溶液-乙腈体积比为85:15
流动相B：用氢氧化钠调节pH为7.0的0.005mol/L磷酸二氢钠水溶液-乙腈体积比为5:95
梯度洗脱：
Figure 242587DEST_PATH_IMAGE006
或者，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用磷酸调节pH为2.5的0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇体积比为90:10
流动相B：用磷酸调节pH为2.5的0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液-乙腈体积比为30:70
梯度洗脱：
Figure 461079DEST_PATH_IMAGE007
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用甲酸或者氨试液调节pH为5.0的0.1mol/L甲酸铵水溶液-乙腈体积比为55:45
流动相B：用甲酸或者氨试液调节pH为5.0的0.1mol/L甲酸铵水溶液-甲醇体积比为40:60
梯度洗脱：
Figure 461396DEST_PATH_IMAGE008
或者，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用乙酸调节pH为3.0的1.0mol/L乙酸铵水溶液-甲醇-乙腈体积比为75:20:5
流动相B：用乙酸调节pH为3.0的1.0mol/L乙酸铵水溶液-甲醇-乙腈体积比为20:40:40
梯度洗脱：
Figure 398128DEST_PATH_IMAGE009
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：用氨试液调节pH为4.5的0.5mol/L乙酸钠水溶液-甲醇-乙腈体积比为60:30:10
流动相B：用氨试液调节pH为4.5的0.5mol/L乙酸钠水溶液-甲醇-乙腈体积比为45:50:5
梯度洗脱：
Figure 899516DEST_PATH_IMAGE010
或者，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.001mol/L戊烷磺酸钠水溶液-乙腈体积比为80:20
流动相B：0.001mol/L戊烷磺酸钠水溶液-乙腈体积比为45:55
梯度洗脱：
Figure 739558DEST_PATH_IMAGE011
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.05mol/L戊烷磺酸钠水溶液-甲醇体积比为90: 10
流动相B：0.05mol/L戊烷磺酸钠水溶液-甲醇体积比为20: 80
梯度洗脱：
Figure 910777DEST_PATH_IMAGE012
或者，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.002mol/L己烷磺酸钠水溶液-甲醇体积为95: 5
流动相B：0.002mol/L己戊烷磺酸钠水溶液-甲醇体积比为25: 75
梯度洗脱：
Figure 334805DEST_PATH_IMAGE013
或者，
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.01mol/L癸烷磺酸钠水溶液-乙腈体积比为65:35
流动相B：0.01mol/L癸烷磺酸钠水溶液-乙腈体积比为10:90
梯度洗脱：
Figure 108726DEST_PATH_IMAGE014
其中，在每个阶段内，流动相B的百分比随着时间而变化或保持不变，流动相A所占百分比与流动相B所占百分比之和为100%；
所述米库氯铵中间体包括中间体5，和中间体1、中间体2、中间体3、中间体4中一种或多种；
Figure 301810DEST_PATH_IMAGE015
Figure 909509DEST_PATH_IMAGE016
Figure 53789DEST_PATH_IMAGE017
Figure 896980DEST_PATH_IMAGE018
Figure 944570DEST_PATH_IMAGE019
。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.5-2.0mL/min。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.5-1.5mL/min。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.7-1.3 mL/min。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述检测波长为270-290nm。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：进样量为1-100μL。
7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于：所述进样量为5-50μL。
8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于：所述进样量为20μL。
9.一种米库氯铵中间体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求1-8中任一项所述分离方法进行米库氯铵中间体的检测的步骤。
10.根据权利要求9所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：取待测样品，制成供试品溶液，吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，采用权利要求1-8中任一项所述分离方法进行测定。
11.根据权利要求10所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取待测样品，用稀释液制成浓度为0.1 mg/mL -5.0 mg/mL的供试品溶液。
12.根据权利要求11所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液选自水溶液、有机溶剂中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的水溶液选自纯水、含酸缓冲液、含碱缓冲液、含盐缓冲液、含离子对试剂水溶液中的至少一种；
所述稀释液所用的有机溶剂选自乙腈、醇类中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含酸缓冲液中的酸选自磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种；
所述稀释液所用的含碱缓冲液中的碱选自氨、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、二乙胺、三乙胺中的至少一种；
所述稀释液所用的含盐缓冲液中的盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸铵、甲酸铵、乙酸钠中的至少一种；
所述稀释液所用的含离子对试剂水溶液中的离子对选自戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠中的至少一种；
所述稀释液所用的醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含酸缓冲液中的酸选自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种。
16.根据权利要求13-15任一项所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含酸缓冲液的体积浓度为0.005%-2%。
17.根据权利要求16所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含酸缓冲液的体积浓度为0.01%-1%。
18.根据权利要求13或14所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含盐缓冲液的浓度为0.001mol/L-1.0 mol/L。
19.根据权利要求18所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含盐缓冲液的浓度为0.005 mol/L-0.5mol/L。
20.根据权利要求13或14所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含离子对试剂水溶液的浓度为0.001 mol/L-0.05 mol/L。
21.根据权利要求20所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的含离子对试剂水溶液的浓度为0.002mol/L-0.01 mol/L。
22.根据权利要求12或13所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的水溶液的pH为2.0-10.0。
23.根据权利要求22所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的水溶液的pH为2.0-7.0。
24.根据权利要求22所述的米库氯铵中间体检的检测方法，其特征在于，所述稀释液所用的水溶液的pH值采用氨水、磷酸、氢氧化钠、甲酸、乙酸、氢氧化钾、三乙胺、二乙胺、三氟乙酸中的一种或多种调节。
25.一种米库氯铵中间体的纯度测定方法，其特征在于，所述纯度测定方法包括采用权利要求9-24任一项所述的检测方法进行米库氯铵中间体的纯度测定的步骤。
26.根据权利要求25所述的米库氯铵中间体的纯度测定方法，其特征在于，所述纯度测定方法采用面积归一化法进行计算。
27.一种米库氯铵的质量分析方法，其特征在于，包括杂质的分离步骤、检测步骤或测定步骤，其中，所述分离步骤包括按照权利要求1-8中任一项所述分离方法进行分离，所述检测步骤包括按照权利要求9-24任一项所述检测方法进行检测，所述测定步骤包括按照权利要求25或26所述纯度测定方法进行测定的步骤。
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