CN108220333A - 一种高效植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效诱导植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法。本发明同时将胚特异性启动子ZmESP驱动荧光蛋白eGFP和胚乳糊粉层特异性启动子HvASP启动荧光蛋白DsRED双标记表达盒构成胚‑胚乳双荧光标记载体。基于此胚‑胚乳组织特异性双荧光标记的玉米、水稻、小麦和大麦孤雌生殖单倍体诱导系，可实现精确高效大规模单倍体鉴定筛选，在单倍体育种中具有独特优势。利用本发明的方法可以克服胚及胚乳颜色或油份含量筛选标记因遗传背景对籽粒花青素表达或油份含量影响的限制，实现稳定、高效筛选单倍体籽粒。本发明可应用于任何遗传背景下、任何颜色与油份的材料，克服了现有技术对受体的限制，对于双单倍体育种有重大意义。

Description

一种高效植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法

技术领域

本发明涉及一种高效诱导植物受体孤雌生殖诱导与单倍体筛选方法。

背景技术

玉米是重要的粮食作物，也是当前杂种优势利用应用最为广泛的作物。玉米双单倍体(DH)育种技术是利用自然发生或人工方法诱导产生的单倍体，再通过自然或化学加倍获得二倍体纯合自交系。该方法实现了被选自交系一代纯合，与传统自交选育的需要6-7世代相比，具备明显的技术优势，正在成为选系的主要策略之一。DH育种技术主要包括三个环节，即单倍体的诱导、单倍体筛选、单倍体加倍。高效、准确筛选单倍体是关键的技术环节。目前，单倍体鉴定方法主要有形态学鉴定、细胞学鉴定、遗传标记鉴定等多种方法。

形态学鉴定：单倍体植株由于含有单倍染色体细胞，植株较矮，相当于二倍体的70％。叶片狭窄上冲，雄穗分枝、节间数、苞叶数、穗行数、等相当于二倍体90％。但不同出发材料表型差异巨大，该方法往往很不可靠，育种实践中无法采用。

细胞学鉴定：该方法主要依据单倍体和二倍体染色体数目的差异，于发芽时切取胚芽尖或根尖进行显微细胞遗传学鉴定，主要是染色体数目。该方法鉴定准确，但由于其操作复杂繁琐，需有技术有经验的技术人员大量取根部材料，往往单个植株的所有根尖取样后，也未必能成功鉴定。因操作复杂，技术难度大，耗时费力，且取样会导致植株存活，工作效率也远不到育种实践的需要。因此，世界范围内六十年以来的双单倍体育种实践中也没有成功研发基于细胞学鉴定的技术体系。

遗传标记法：利用单倍体诱导系材料自身携带的遗传标记基因的性状特点，进行单倍体筛选，减少了形态筛选产生的误差，是实用高效的筛选方法。

(1)R1-nj标记：Coe等(1964)将控制籽粒糊粉层和形成胚芽色素的R1-nj基因和控制不定根、叶鞘和茎秆色素形成的ABP1基因导入孤雌生殖诱导系Stock6，使之具有籽粒和植株双显性遗传标记。该R1-nj标记(Navajo标记)体系是基于r1基因位点的R1-nj等位基因的鉴别体系。籽粒上花青素沉积需要显性的结构基因如a1，a2，c2和花青素合成通路中的调控基因如c1，r1。在显性基因a1，a2，c1，c2存在时，R1-nj的表达将造成籽粒乳顶端的紫色花青素沉积。胚的盾片区域同样会有花青素的表达。大多数的单倍体诱导系在A1/A2/C1/C2/R1-nj基因位点都是纯合的。由于普通玉米r1基因为隐性，一般多为黄色或白色籽粒，故用该诱导系诱导产生籽粒后代分三种类型：胚和胚乳均带有R1-nj标记，为杂合二倍体；胚乳具R1-nj标记，为正常受精的三倍体，胚无R1-nj标记，为孤雌生殖单倍体；胚和胚乳均不带R1-nj标记，为外源源花粉污染。初步鉴定的单倍体再经田间种植鉴定，淘汰紫色植株，保留绿色的单倍体和或双单倍体。故诱导系与目标材料杂交，即可从籽粒颜色标记来区分单倍体籽粒和二倍体杂交籽粒。但籽粒Navajo标记遗传复杂，存在显性互补基因，修饰基因及基因剂量效应。籽粒着色程度还受气候条件及发育情况影响，且有些遗传背景中Navajo标记表现不明显。虽ABP1显性控制的紫色植株标记可在苗期进一步鉴定单倍体，但时间滞后且工序增加，加大人力物力成本。对母本材料籽粒自身有色的品种尤其一些籽粒有色特种玉米无效。该标记也不能应用机械识别来筛选突变体，需要大量人工靠肉眼挑选单倍体籽粒。

(2)高油标记：国内外也有不同的研究单位尝试利用高油性状作为筛选方法。例如，陈绍江等在Stock6的基础上，经与高油群体BHO的杂交选育出农大高诱1号等诱导系品种，并利用籽粒含油量的显著花粉直感效应，建立了基于籽粒油分筛选鉴定的单倍体鉴定方法。由于玉米籽粒油分85％存在于胚中，诱导孤雌生殖的单倍体籽粒油分含量与杂交二倍体籽粒存在较大差异，通过核磁共振(NMR)仪可进行籽粒油分含量测定。杂交籽粒油分>自交籽粒>单倍体籽粒，故以自交籽粒含油量为标准，低于其含油量为单倍体。该法准确率达90％以上，高于Navajo标记的85％(陈绍江and宋同明，2003)。但含油量仍为多基因控制，稳定速度慢。且一些自交系花粉直感效应低，杂交籽粒与单倍体含油量的差异较小，影响鉴定准确率。

(3)荧光标记：国外有研究报道用单荧光蛋白标记进行单倍体筛选的技术。具体方法是将CAMV35S启动子驱动eGFP荧光蛋白基因组成型表达，并导入诱导系RWS获得eGFP纯合株系。但由于其荧光标记的组成型表达，胚乳糊粉层及淀粉胚乳等各个部分都有较强的荧光表达，在荧光显微镜下，整个籽粒都发射很强的eGFP绿色荧光，故在籽粒水平上无法分辨胚组织荧光有无，亦即无法区分单倍体，必须依靠苗期鉴定，同样工序多且增加人力物力成本。因其上述限制，未见到应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效诱导植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法。

本发明首先提供了一种DNA分子，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲自上游至下游依次包括如下元件：植物胚特异性启动子、荧光蛋白甲的编码基因和终止子；所述表达盒乙自上游至下游依次包括如下元件：植物胚乳糊粉层特异性启动子、荧光蛋白乙的编码基因和终止子。

表达盒甲中，所述荧光蛋白甲的编码基因为荧光蛋白eGFP基因；表达盒乙中，所述荧光蛋白乙的编码基因为荧光蛋白DsRED基因。

所述植物胚特异性启动子为ZmESP启动子，所述胚乳糊粉层特异性启动子为HvASP启动子。

所述终止子为NOS终止子。

所述胚特异性启动子如序列表的序列1自5’端第340-2275位核苷酸所示。

所述荧光蛋白甲的编码基因如序列表的序列1自5’端第2276-2995位核苷酸所示。

所述胚乳糊粉层特异性启动子如序列表的序列1自5’端第3351-4151位核苷酸所示。

所述荧光蛋白乙的编码基因如序列表的序列1自5’端第4152-4829位核苷酸所示。

所述终止子如序列表的序列1自5’端第3024-3276位和4836-5088位核苷酸所示。

所述DNA分子如序列表的序列1自5’端第340-5088位核苷酸所示。

本发明还保护含有以上任一所述DNA分子的重组载体(重组载体甲)。

所述重组载体(重组载体甲)具体可为序列表的序列1所示。

本发明还保护以上任一所述DNA分子或重组载体(重组载体甲)的应用，为如下(a1)-(a3)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖单倍体筛选；

(a2)制备单倍体诱导系；

(a3)双单倍体育种。

本发明还保护重组表达载体甲和重组表达载体乙在为如下(a1)-(a3)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖单倍体筛选；

(a2)制备单倍体诱导系；

(a3)双单倍体育种；

所述重组表达载体乙为能够沉默植物基因组中ZmMTL基因的重组表达载体。

所述重组表达载体乙为含有片段甲的重组表达载体。

所述片段甲如序列表的序列6自5’端第4691-6774位所示。

所述重组表达载体乙具体可如序列表的序列6所示。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法(方法甲)，包括如下步骤：将以上任一所述的DNA分子导入出发植物，得到转基因植物。

本发明还保护一种单倍体诱导系的构建方法(方法乙)，包括如下步骤：

(1)按照方法甲培育转基因植物；

(2)从步骤(1)得到的转基因植物中随机选择一个单拷贝单株为父本，单倍体诱导系甲为母本进行杂交，在后代中筛选阳性植株；

(3)从步骤(2)得到的阳性植株中随机选择一个单株为母本，单倍体诱导系甲为父本进行6-8次回交，筛选阳性植株；

(4)从步骤(3)得到的阳性植株随机选择一个单株自交，得到所述单倍体诱导系；

步骤(2)或步骤(3)中，阳性植株为籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙的植株。

所述单倍体诱导系甲可为现有技术中已有的单倍体诱导系，例如中国农大CAU5、H3。

所述方法乙制备得到的单倍体诱导系与受体杂交后籽粒中，胚乳显示荧光蛋白乙对应的荧光并且胚无荧光的荧光的为受体孤雌生殖单倍体；胚乳显示荧光蛋白乙对应的荧光并且胚显荧光蛋白甲对应的荧光籽粒为诱导系与受体杂交的二倍体；胚乳无荧光的为非诱导系花粉与受体杂交异受精二倍体。荧光可以通过手持式荧光激发灯或荧光色选机进行观察。

本发明还保护一种单倍体诱导系的构建方法(方法丙)，包括如下步骤：

(1)按照权利要求7所述的方法培育转基因植物；

(2)将权利要求6中所述的重组表达载体乙导入出发植物，实现对出发植物中ZmMTL基因的定向编辑，得到ZmMTL基因沉默的转基因株系；

(3)从步骤(1)得到的转基因植物中随机选择一个单拷贝单株为父本，步骤(2)得到的转基因株系中随机选择一个单株为母本，进行杂交，筛选阳性植株；阳性植株满足如下条件：(a1)籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙；(a2)含有ZmMTL基因编辑元件；

(4)从步骤(3)筛选的阳性植株中随机选择一株自交，筛选阳性植株，得到所述单倍体诱导系；阳性植株满足如下条件：(b1)籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙；(b2)ZmMTL基因纯合突变或双等位突变；(b3)无ZmMTL基因编辑元件。

所述ZmMTL基因纯合突变或双等位突变的检测方法为：提取植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物DH-F(cggtggctccgcaacaac)和引物DH-R(ttgggttgatggcagagacg)组成的引物对进行PCR扩增，扩增产物采用DH-F下游20bp的引物DHCS-F：atcttcatggcggccagctc进行测序，测序结果在DSDecodeM(http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/)进行突变分型和分析，从中分析找出纯合突变或双等位突变的植株。

以上任一所述籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙的检测方法具体可为：用带有480nm激发光和550nm激发光的手持式荧光灯分别对籽粒胚eGFP荧光蛋白和胚乳DsRED荧光蛋白进行检测，筛选荧光灯下胚和胚乳均发射荧光。

以上任一所述单拷贝单株的检测方法为：提取植物的基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行qPCR检测，采用引物BAR-F和引物BAR-R组成的引物对进行Bar基因检测，采用ADH1-F和ADH-R组成的引物对进行内参基因ADH1基因的检测。

ADH1-F(5’-3’)：atcctcttcacctcgctctg；

ADH-R(5’-3’)：gacagataagccgccaagaag；

BAR-F(5’-3’)：ctacacccacctctgaa；

BAR-R(5’-3’)：ccagaaacccacgtcatg。

根据分别构建的Bar基因和ADH1基因的定量标准曲线和ct值，计算待测试样拷贝数。待测试样拷贝数计算方法为LG＝K1×c t+K2(k1，k2常数)，LG(Bar)/LG(ADH1)为0.5左右的植株即为单拷贝单株。

含有ZmMTL基因编辑元件植株的筛选方法为：提取植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ZM-F和引物ZM-R组成的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，含有ZmMTL编辑元件的植株为检测结果为扩增出553bp大小的阳性条带的植株。

引物ZM-F(5’-3’)：CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAATTGGCCCTTACAAAATAGCTAGA；

引物ZM-R(5’-3’)：CGACCGGGTCACGCTGCACTGCACAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGG。

无ZmMTL基因编辑元件植株的筛选方法为：提取植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ZM-F和引物ZM-R组成的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，无ZmMTL编辑元件的植株为检测结果为未扩增出553bp大小的阳性条带的植株。

以上任一所述ZmMTL基因如序列表序列5所示。

方法丙制备的单倍体诱导系可用于单倍体诱导能力鉴定，与受体杂交后籽粒中，胚乳显示荧光蛋白乙对应的荧光并且胚无荧光的荧光的为受体孤雌生殖单倍体；胚乳显示荧光蛋白乙对应的荧光并且胚显荧光蛋白甲对应的荧光籽粒为诱导系与受体杂交的二倍体；胚乳无荧光的为非诱导系花粉与受体杂交异受精二倍体。荧光可以通过手持式荧光激发灯或荧光色选机进行观察。

可将将方法丙制备的单倍体诱导系与B背景的常规株系进行杂交，并用B背景常规株系做轮回亲本进行多代回交，回交过程中始终筛选保留双荧光标记和ZmMTL基因突变，多代回交至B材料遗传背景恢复后，再进行一代自交，即可在其后代中选出无ZmMTL基因编辑元件，ZmMTL基因突变纯合且双荧光标记纯合的单倍体诱导系。由于双荧光标记遗传表达盒为单一表达盒，与基因编辑技术配合，这种模式的转育十分方便有效。

以上任一所述植物具体可为玉米、水稻、小麦或大麦。

本发明的发明人同时将胚特异性启动子ZmESP驱动荧光蛋白eGFP和胚乳糊粉层特异性启动子HvASP启动荧光蛋白DsRED双标记表达盒构成胚-胚乳双荧光标记载体。通过农杆菌介导的遗传转化将双荧光标记载体转入受体材料，将获得的转基因阳性植株与现有的单倍体诱导系杂交，将转基因元件导入诱导系中，多代再经多代回交恢复诱导系遗传背景，再自交使标记纯合，即可获得基于组织特异双荧光标记单倍体筛选的新型诱导系。双荧光蛋白诱导系作父本与受体杂交后籽粒中，胚乳显红色荧光而胚无绿色荧光的为受体孤雌生殖单倍体；胚乳显红色而胚显绿色的双荧光籽粒为诱导系与受体杂交的二倍体；胚乳无荧光的为非诱导系花粉与受体杂交异受精二倍体。该双荧光蛋白标记***可以通过手持式荧光激发灯或荧光色选机高效筛选单倍体籽粒。

不同于前人组成型启动子驱动下的eGFP标记，胚-胚乳组织特异性双荧光标记在杂合子胚乳糊粉层激发红光，在杂合子胚上激发绿光，两种荧光相互独立，可在母本当代穗上或籽粒水平即可清晰准确辨别杂合二倍体和单倍体籽粒，省去了组成型启动子启动的单个荧光标记鉴定在发芽和出苗后鉴定的庞大工作量；同时，由于采用荧光蛋白作为标记，无遗传背景影响，应用范围广泛；更为重要的一点，该体系进行鉴别，解决了大规模单倍体鉴定的难点，通过针对荧光检测的分选仪器，可以快速进行大规模籽粒群体的单倍体的鉴定筛选；另外，组织特异性双荧光标记仅在胚和胚乳表达荧光蛋白，也减少不必要的诱导系生物能量浪费，对诱导系生长影响较小。综上，基于此胚-胚乳组织特异性双荧光标记的玉米、水稻、小麦和大麦孤雌生殖单倍体诱导系，可实现精确高效大规模单倍体鉴定筛选，在单倍体育种中具有独特优势。利用本发明的方法可以克服胚及胚乳颜色或油份含量筛选标记因遗传背景对籽粒花青素表达或油份含量影响的限制，实现稳定、高效筛选单倍体籽粒。本发明可应用于任何遗传背景下、任何颜色与油份的材料，克服了现有技术对受体的限制，对于双单倍体育种有重大意义。

附图说明

图1为胚特异性绿色荧光蛋白与糊粉层(胚乳)特异性红色荧光蛋白玉米离体瞬时表达活性鉴定；Bar＝50μm。

图2为胚特异性绿色荧光蛋白与糊粉层(胚乳)特异性红色荧光蛋白水稻离体瞬时表达活性鉴定；Bar＝50μm。

图3为胚特异性绿色荧光蛋白与糊粉层(胚乳)特异性红色荧光蛋白小麦离体瞬时表达活性鉴定；Bar＝50μm。

图4为胚特异性绿色荧光蛋白与糊粉层(胚乳)特异性红色荧光蛋白大麦离体瞬时表达活性鉴定；Bar＝50μm。

图5为胚特异性绿色荧光蛋白与糊粉层(胚乳)特异性红色荧光蛋白玉米籽粒(左)与籽粒纵切荧光观察。

图6为玉米成熟胚红色荧光蛋白与绿色荧光的组织特异性表达观察；En：胚乳；Em：胚；Pe：种皮；Al：糊粉层。

图7为双荧光单倍体诱导系回交转育步骤。

图8为ZmMTL的基因结构和代表性个体的突变情况；红色箭头：靶点位置，在原始自然突变上游附近位置；横线：靶点gRNA序列。

图9为诱导系诱导的母体单倍体、二倍体与异交串粉杂交籽粒的颜色分辨。

图10为基于双荧光标记筛选的基因编辑诱导系的构建。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

玉米自交系B73：参考文献：ChuanxiaoXie，Shihuang Zhang_，Minshun Li，XinhaiLi，ZhuanfangHao，Li Bai，DeguiZhang，Yehong Liang.Inferring Genome Ancestry andEstimating Molecμlar RelatednessAmong 187Chinese Maize Inbred Lines.Journalof Genetics and Genomics(Formerly ActaGeneticaSinica).2007，34(8)：738-748)；公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

水稻日本晴：参考文献：Higashi，T.，Sato，H.，Horisue，N.，&Fujimaki，H.(1981).Breeding of isogenic lines for blast resistance in rice.1.Comparison ofcharacters between B4F2lines and their recurrent，“Nipponbare”.Breed Sci，31(Supp.1)，46.；公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

小麦KN199：参考文献：陈俊男.(2012).小麦成熟胚再生体系优化和ppo-RNAi构件的遗传转化(Master′s thesis，山东农业大学).；公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

大麦六石准：参考文献：陈冬梅.(1991).特早熟小麦新品系邯87-.河北农业科技，5，021.；公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

玉米品种吉单96：参考文献：周旭东，张建新，岳尧海，马英杰，张志军，王绍平，&刘文国.(2017).高产耐密玉米新品种吉单96的选育.现代化农业，12，013.；公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、载体的构建

一、胚-胚乳特异性双荧光标记表达盒的构建

本发明提供的胚-胚乳特异性双荧光标记双表达盒，自上游至下游依次包括如下元件：胚特异性启动子ZmESP、荧光蛋白eGFP基因、NOS终止子、胚乳糊粉层特异性启动子HvASP、荧光蛋白DsRED基因和NOS终止子；由所述胚特异性启动子ZmESP启动荧光蛋白eGFP基因的表达，由所述胚乳糊粉层特异性启动子HvASP启动荧光蛋白DsRED基因的表达。

所述胚特异性启动子ZmESP如序列表的序列1自5’端第340-2275位核苷酸所示；所述荧光蛋白eGFP基因如序列表的序列1自5’端第2276-2995位核苷酸所示；所述胚乳糊粉层特异性启动子HvASP如序列表的序列1自5’端第3351-4151位核苷酸所示；所述荧光蛋白DsRED基因如序列表的序列1自5’端第4152-4829位核苷酸所示；所述NOS终止子如序列表的序列1自5’端第3024-3276位和4836-5088位核苷酸所示。

所述胚-胚乳特异性双荧光标记双表达盒如序列表的序列1自5’端第340-5088位核苷酸所示。

二、胚-胚乳特异性双荧光标记表达载体的构建

将步骤一中的胚-胚乳特异性双荧光标记表达盒***载体-Blunt SimpleCloning Vector(全式金，货号：CB111-01)上，得到胚-胚乳特异性双荧光标记表达载体blunt simple-ZmESPeGFP-HvASPDsRED(序列表的序列1所示的环状质粒，已经测序验证)。

三、对照载体的构建

1、构建空白对照载体Blunt Simple-UBI-NOS：采用片段甲(UBI启动子直接连接NOS终止子，序列表的序列2)代替序列1中自5’端第340-5088位所示的核苷酸，得到空白对照载体Blunt Simple-UBI-NOS(已经测序验证)。

2、构建组成型表达对照载体Blunt Simple-UBI-DsRED-NOS：采用片段乙(UBI启动子连接DsRED和NOS终止子，序列表的序列3)代替序列1中自5’端第340-5088位所示的核苷酸，得到组成型表达对照载体Blunt Simple-UBI-DsRED-NOS(已经测序验证)。

实施例2、组织特异性启动子体外活性鉴定

实验材料：玉米自交系B73、水稻日本晴、小麦KN199和大麦六石准。

1、将实验材料25天幼穗用70％酒精消毒5min，5％次氯酸钠溶液杀菌30min，再用无菌水洗涤数次，用手术刀及解剖针将玉米籽粒剥去果皮，并将胚及胚乳剥离，将剥去胚的胚乳纵切为二。

2、将步骤1处理得到的胚及胚乳分别摆放至预先配制好的MS固体高渗培养基(MS盐，MS有机，琼脂10g/l，山梨醇0.25mol/l)培养皿平板中(胚和胚乳各摆放36个平板，将组织置于平板中央2cm直径范围内)，每个平板约放入胚20个左右，每个平板约放入二分胚乳约10个左右，胚乳糊粉层朝上；将胚和胚乳28℃暗培养24h后用于基因枪轰击转化。

3、分别采用实施例1制备的胚-胚乳特异性双荧光标记表达载体、空白对照载体和组成型表达对照载体轰击胚、胚乳，采用Tungsten M-10Microcarriers(Bio-Rad：1652266)钨粉粒子配制微载体储存液，微载体溶液和微载体膜的制备依据伯乐pds-1000台式基因枪操作说明进行，具体如下：

(1)微载体储存液：称取30mg钨粉粒子，将其放入1.5ml的离心管内，在离心管内加入1ml70％(体积百分含量)乙醇水溶液，在涡旋混合器上充分震荡3-5分钟，震荡结束后静置15分钟，离心约5秒钟，弃上清，收集微载体沉淀。将微载体沉淀加入1ml蒸馏水中，充分震荡1分钟，震荡结束后静置1分钟，重复震荡洗涤三遍，在洗涤后的微载体沉淀中加入500μl经灭菌的50％(体积百分比)甘油，得到浓度为60mg/ml的微载体储存液，存于-20度。

(2)DNA包埋微载体：取50μl步骤(1)制备的微载体储存液，依次加入5μl载体的DNA(lug/μl)、50μl 2.5M CaCl₂水溶液、20μl 0.1M亚精胺水溶液，持续震荡2-3分钟，结束后静置1分钟，离心约2秒钟，弃上清。向沉淀中加入140μl 70％(体积百分被)乙醇水溶液(HPLC级或分光光度计级)，离心弃上清，再加入140μl 100％乙醇，离心弃上清。在得到的沉淀中加入48μl 100％乙醇，轻轻地拍打离心管管壁数次后，在低速的混合器上充分震荡2-3秒钟，得到经包埋处理的微载体溶液。

(3)载体膜的准备：准备一个带盖的经灭菌处理的60mm组织培养皿，在其底部铺上一层CaCl₂作为干燥剂，并在CaCl₂上放一张滤纸，然后将载体膜放在滤纸上，在震荡条件下用微量移液器吸取6μl(约500ug的微载体)步骤(2)经包埋处理的微载体溶液水平地滴在载体膜中央直径约1cm的范围内，完成铺涂后立刻盖上组织培养皿的盖子约10分钟，使乙醇挥发。

(4)基因枪轰击：将步骤(3)制备好的载体膜安装至伯乐pds-1000台式基因枪，基因枪采用1100psi破裂盘(Rupture Disks)，试验使用1100psi破裂盘(Rupture Disks)，由于氦气瓶的压力需要超过具体破裂盘对应压力200psi，故将基因枪破裂氦气压设为1300psi。

依次进行空白对照载体-双荧光标记载体-组成型对照载体的基因枪轰击。

5、将步骤4轰击后将组织置于28℃暗培养48h，培养结束后将胚轰击面进行手工切片处理，胚乳垂直于轰击面切超薄片，将切好的组织薄片置于载玻片上，盖上盖玻片，加入灭菌水至浸没组织切片，进行激光共聚焦显微镜(confocal)观察。

对所有样品进行切片并用蔡司LSM700激光共聚焦显微镜进行观察，共聚焦显微镜激发光设置为eGFP 554nm，DsRED激发光设置为488nm。先用野生型材料各组织样品将显微镜增益等参数进行“调零”，然后进行空白对照和实验组观察鉴定。

玉米的基因枪轰击实验果表明，在488nm和555nm的激发光波长下，空白对照载体无论轰击胚或是胚乳，均未检测到荧光信号，组成型表达载体驱动的红色荧光蛋白DsRED，在胚和胚乳中均能够表达。双荧光标记载体轰击后，ZmESP驱动的绿色荧光蛋白eGFP及HvASP驱动的红色荧光蛋白DsRED，表现出明显的组织特异性(图1)，尤其是ZmESP启动子驱动的eGFP蛋白，高度特异性的在胚中表达，而在胚乳中完全不表达。HvASP驱动的DsRED蛋白，在胚乳部分也较为特异的表达，但不得不说的是，其在体外试验中，在胚上亦有部分的表达，表明HvASP启动子至少在体外试验中不能仅在胚乳上驱动基因表达。因考虑到体外试验与体内有所差异，故仍需在稳定转化植株上来研究确认HvASP启动子的组织特异性。

水稻离体实验结果也与玉米类似(图2)，ZmESP启动子驱动的eGFP蛋白，高度特异性的在胚中表达，而在胚乳中完全不表达。HvASP驱动的DsRED蛋白，在胚乳部分也较为特异的表达，同时在胚上也有部分表达。

在小麦(图3)和大麦(图4)离体实验中，ZmESP启动子驱动的eGFP蛋白，高度特异性的在胚中表达，而在胚乳中完全不表达。HvASP驱动的DsRED蛋白，在胚乳部分特异的表达。

四种作物幼穗离体实验表明了两个组织特异性启动子在四个作物上的应用潜力。

实施例3、玉米稳定遗传转化

一、转基因植株的获得

1、构建含有双荧光表达盒的植物表达载体，命名为pCAMBIA3301-ZmESP-Egfp-HvASP-dsRED载体，如序列表的序列4所示，其中，第16-4764位为双荧光标记表达盒。将pCAMBIA3301-ZmESP-Egfp-HvASP-dsRED载体导入BMEHA105农杆菌感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC303-01)，得到重组菌。

2、采用N6液体培养基培养步骤1得到的重组农杆菌，得到菌液OD_600nm为0.8的重组农杆菌菌液，5000r/min离心10min，收集菌体，用配好的侵染buffer(1L侵染buffer是将4g含N6vitamin的N6盐，2mg 2，4-D，100mg肌醇，0.7gL-脯氨酸，68.4g蔗糖，36g葡萄糖，1mLAgNO₃(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)和水混匀得到的，pH5.2)悬浮菌体，使OD_600nm值为0.5左右，然后28℃、150r/min震荡0.5h，得到侵染液。

3、将玉米自交系B73长势良好的愈伤组织浸泡在侵染buffer浸泡中1h，然后转移至步骤2制备的侵染液中浸泡15min，晾干。

4、将步骤3侵染后的愈伤组织放至共培养基(1L共培养基是将4g含N6vitamin的N6盐，2mg2，4-D，30g蔗糖，8g琼脂，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)，3mL L-半胱氨酸(100mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)，20℃培养3天，转至恢复培养基(1L恢复培养基是将4gN6盐，1mlN6vitamin1000×，1.5mg 2，4-D，0.7gL-脯氨酸，30g蔗糖，5μMAgNO₃，0.5g MES，100mg头孢噻肟，100mg万古霉素，8g琼脂和水混匀得到的，pH5.8)，28℃培养10天，然后转至含有1.5mg/L草铵膦的恢复培养基，28℃暗培养7天，筛选阳性愈伤组织。

5、将步骤4得到的阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基(1L诱导胚状体培养基是将4.43g含MS vitamin(含肌醇)的MS盐，0.25mg2，4-D，30g蔗糖，5mg6-BA，4g植物凝胶，1mLCefo(250mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)，暗培养2周，然后转至分化培养基(1L分化培养基是将4.43g含MS vitamin(含肌醇)的MS盐，30g蔗糖，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)待长出绿苗后转移至生根培养基(1L生根培养基是将2.215g1/2MS，30g蔗糖，51.55mg MSvitamin，4g植物凝胶和水混匀得到的，pH5.8)生根，长到一定高度，暴露在空气中培养3天，移苗。

6、取植株叶片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer(来自bar基因检测试纸条)，***bar基因检测试纸条(北京奥创金标生物技术有限公司，货号：A07-13-413)，出现阳性条带的植株就为T₀代阳性植株。

二、转基因植株双荧光标记组织特异性鉴定

1、步骤一得到的T₀代阳性植株进行自交得到T₁代植株，取果穗，通过手持式荧光探照灯进行果穗的鉴定，经鉴定，胚乳糊粉层激发红光，胚激发绿光。

2、取步骤1中穗上胚和胚乳均有荧光的籽粒进行切片，使用Nikon SMZ1500体式显微镜进行荧光观察，用显微镜自带的480nm激发光滤片进行胚部eGFP观察，用自带的550nm激发光滤片进行DsRED观察。

结果如图5所示。图5中，左图四张为完整籽粒观察结果，右边四张为籽粒纵切侧面观察，红色为dsRED荧光，绿色为eGFP荧光。结果表明，在籽粒水平上，籽粒的胚乳糊粉层激发出较强的DsRED荧光，而胚上激发出较强的eGFP荧光。

3、取步骤2胚乳糊粉层激发出较强的DsRED荧光而胚上激发出较强的eGFP荧光的籽粒，用蔡司LSM700激光共聚焦显微镜观察，共聚焦显微镜eGFP激发光设置为554nm，DsRED激发光设置为488nm。

结果如图6所示。在共聚焦显微镜下，清楚的看到胚组织细胞特异性的激发出绿色ZmESP驱动的eGFP荧光，而胚乳糊粉层细胞被激发出HvASP驱动的DsRED红色荧光，在胚及淀粉胚乳中均未检出到DsRED荧光信号，荧光信号仅在胚乳糊粉层被检测到，表明HvASP启动子在玉米中能高度特异的启动胚乳糊粉层基因表达。

上述结果表明，经过对转基因植株的双荧光标记***的组织特异性的鉴定，证明了所设计的双荧光标记辅助单倍体筛选***的有效性。该组织特异性双荧光标记***能够在胚上特异性表达eGFP荧光蛋白，在胚乳糊粉层特异性的表达DsRED荧光蛋白。将含有双荧光标记的阳性株系作父本与现有单倍体诱导系中国农大CAU5、H3进行杂交，即可将其中的双荧光标记表达盒转育到受体中，之后再以对应诱导系做父本进行5-6轮回交使其遗传背景恢复，最终经过一代自交使其纯合，即可育成新型基于胚-胚乳组织特异性双荧光标记***的新型诱导系(原理如图7所示)，代替现有诱导系的R1-NJ标记和高油标记，克服鉴定单倍体鉴定筛选过程中的遗传背景影响或籽粒自身有色受体的应用限制，同时由于基于胚和胚乳分离的双荧光标记体系，有望提高单倍体鉴定准确度，具体方法如下：

1、从含有双荧光标记的株系中选择一株单拷贝植株作为父本，单倍体诱导系(如中国农大CAU5、H3)作为母本进行杂交，得到F1代植株，F1代植株果穗用带有480nm激发光和550nm激发光的手持式荧光灯分别对籽粒胚eGFP荧光蛋白和胚乳DsRED荧光蛋白进行检测，筛选荧光灯下胚和胚乳均发射荧光的阳性籽粒。

单拷贝植株的检测方法为：提取植物的基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行qPCR检测，采用引物BAR-F和引物BAR-R组成的引物对进行Bar基因检测，采用ADH1-F和ADH-R组成的引物对进行内参基因ADH1基因的检测。

ADH1-F(5’-3’)：atcctcttcacctcgctctg；

ADH-R(5’-3’)：gacagataagccgccaagaag；

BAR-F(5’-3’)：ctacacccacctctgaa；

BAR-R(5’-3’)：ccagaaacccacgtcatg。

根据分别构建的Bar基因和ADH1基因的定量标准曲线和ct值，计算待测试样拷贝数。待测试样拷贝数计算方法为LG＝K1×c t+K2(k1，k2常数)，LG(Bar)/LG(ADH1)为0.5左右的植株即为单拷贝植株。

2、从步骤1得到的阳性籽粒后代植株中随机选择一株为母本，与作为父本的步骤1中的单倍体诱导系进行回交，回交果穗用带有480nm激发光和550nm激发光的手持式荧光灯分别对籽粒胚eGFP荧光蛋白和胚乳DsRED荧光蛋白进行检测，筛选荧光灯下胚和胚乳均发射荧光的阳性籽粒。

3、从步骤2中的阳性籽粒后代植株中随机选择一株为母本，继续与作为父本的步骤1中的单倍体诱导系进行第二轮回交，回交果穗用带有480nm激发光和550nm激发光的手持式荧光灯分别对籽粒胚eGFP荧光蛋白和胚乳DsRED荧光蛋白进行检测，筛选荧光灯下胚和胚乳均发射荧光的阳性籽粒(共进行六轮左右回交)。

4、将步骤3中六轮回交后得到的表达荧光的阳性籽粒后代植株自交，得到带有双荧光标记的单倍体诱导系。

在单倍体鉴定过程中，如果原单倍体诱导系带有籽粒颜色标记筛选基因(如R1-nj标记)，可以同时先使用籽粒R1-nj标记筛选一次，选择标准是胚乳紫色和胚无色的为单倍体；再用双荧光标记筛选一次，选择标准是胚乳有红色荧光而胚无绿色荧光的为单倍体。两种鉴定方法下都鉴定为单倍体的籽粒，即为最终的单倍体籽粒。

实施例4、双荧光标记基因向基因编辑创制孤雌生殖单倍体诱导系转育及其单倍体鉴定应用

国内外研究者克隆了单倍体诱导的控制基因ZmMTL，突变该基因能够产生单倍诱导能力。本发明所开发的双荧光标记筛选***可以结合基因编辑技术创制ZmMTL基因突变与双荧光遗传标记特性，植株可产生单倍体诱导能力，将双荧光株系导入基因编辑诱导系中，获得基因编辑元件和ZmMTL突变双阳性植株，该方法克服了ZmMTL突变技术创制的单倍体诱导系没有单倍体选择标记的限制。结合本技术，可以在任何受体材料上创制高频诱导系，并使该诱导系具有配套的单倍体选择标记。该株系可作为新型基于胚-胚乳组织特异性双荧光标记筛选诱导系，新型诱导系不仅自身可进行单倍体诱导，同时带有ZmMTL基因编辑表达盒的株系可作为诱变材料对其他生产上常用品种进行大规模诱变筛选广泛遗传背景下的单倍体诱导系，由于单个荧光标记盒子，回交转育过程缩短，避免了复基因控制的紫色胚乳标记和高油标记的转育困难。

一、ZmMTL基因编辑载体构建

玉米单倍体诱导性状控制基因定位于1号染色体bin1.04位点的ZmMTL基因，自然突变发生在4号外显子1572和1573位之间，一个4bp(CGAG)的***造成了单倍体诱导表型。在该自然突变位点前进行移码突变均可造成单倍体诱导表型。ZmMTL(ZmPLA1)基因全长1789bp，共四个外显子，基因序列如序列表的序列5所示，91-449为1号外显子，569-746位为2号外显子，861-1022位3号外显子，1133-1720位为4号外显子。

通过利用CRIPSR-Cas9技术在原始突变附近设计编辑靶位点。

在CRISPR-P网站上设计得分较高的靶点：5’-gggtcaacgtggagacagggagg-3’，根据CRISPR的原理，取靶点NGG PAM前20bp，即5’-gggtcaacgtggagacaggg-3’为特异性识别的靶序列，用于基因编辑载体构建。利用该靶序列，预期将在自然突变位点上游5bp附近引入indel突变。

将gRNA表达盒的双链DNA分子***基因编辑基础载体CPB载体的HindIII酶切位点，得到重组质粒CPB-ZmMTL(经测序，如序列表的序列6所示)。

序列表的序列6中：第4691-6662位为UBI启动子，第447-4547位为Cas9蛋白序列，第115-367位为NOS终止子，此三部分为Cas9表达盒；第6795-7189位为U6-2启动子，第6775-6794位为gRNA靶序列，第6692-6774位为sgRNA骨架序列，此三部分为gRNA表达盒。

二、突变体的构建及鉴定

1、将重组质粒CPB-ZmMTL导入BMEHA105农杆菌感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC303-01)，得到重组农杆菌。

2、采用步骤1得到的重组农杆菌，以玉米自交系B73幼胚诱导的愈伤组织为转化受体，进行遗传转化，得到突变体再生植株。

3、经全基因组测序分析突变体再生植株，在61个突变体植株中，共获得纯合突变11株，双等位突变37株，此外还有杂合突变和嵌合突变若干，突变类型主要为若干碱基的删除，同时还有少量碱基***。

ZmMTL的基因结构和代表性个体(两个纯合突变13-8、13-54和两个双等位突变株系13-25、13-58)的突变情况见图8。红色箭头所示为靶点位置，在原始自然突变上游附近位置，横线标出的为靶点gRNA序列。

三、突变体单倍体诱导率鉴定

父本诱导系：步骤三筛选的13-8、13-54、13-25或13-58。

采用父本诱导系对吉单96进行授粉杂交，每株系杂交3穗，每个诱导系诱导后代随机取200粒发苗，进行流式细胞倍性鉴定。采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪(Flowcytometric)进行基因组大小检测，并用CellQuest(BD公司)软件获取数据，ModFit软件(YeritySoftwareHouse公司)分析结果。测定操作程序：取植株新鲜叶片1g，在2ml细胞裂解液中用锋利的刀片切碎、80μm孔径滤膜过滤、收集滤液，经4℃、1000r/min离心5min后，弃掉上清，收集沉淀细胞。用PI(Propidium iodide碘化丙啶)染液对细胞核DNA进行荧光标记，置于暗处染色20min后，用流式细胞仪进行待测样品倍性鉴定。用已知倍性的待测样品的起始材料或同种材料为对照样，通过调节参数将对照样横坐标固定，不改变任何参数，进行待测样检测，根据峰的位置并参考对照样品的峰值位置判断待测样倍性，单倍体峰的所处横坐标位置为二倍体的1/2处，据此判断单倍体。

诱导率鉴定结果如表1，经鉴定纯合突变株系13-8、13-54诱导率为5.11％和6.13％，双等位突变株系13-25、13-58诱导率为4.61％和6.25％。四个突变体株系平均诱导率为5.49％。在后期还可继续筛选其他类型突变，更换其他遗传背景，以提高基因编辑后代的单倍体诱导率。

表1诱导率评价结果

四、带有双荧光标记的单倍体诱导系的构建

1、对实施例3中含有双荧光标记的T0代株系进行检测，选择一株单拷贝植株。

单拷贝植株的检测方法同实施例3中记载的。

2、步骤1筛选出的单拷贝植株为父本，实施例四中得到的突变体株系13-58为母本进行杂交，F1代中选择含有双荧光标记和含有ZmMTL编辑元件的植株。

双荧光标记的检测方法为：用带有480nm激发光和550nm激发光的手持式荧光灯分别对籽粒胚eGFP荧光蛋白和胚乳DsRED荧光蛋白进行检测，筛选荧光灯下胚和胚乳均发射荧光。

含有ZmMTL编辑元件的筛选方法为：提取植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ZM-F和引物ZM-R组成的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，以野生型植株作为阴性对照。含有ZmMTL编辑元件的植株为检测结果为扩增出553bp大小的阳性条带的植株。

引物ZM-F(5’-3’)：CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAATTGGCCCTTACAAAATAGCTAGA；

引物ZM-R(5’-3’)：CGACCGGGTCACGCTGCACTGCACAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGG。

3、将步骤2得到的ZmMTL转基因阳性植株自交，得到F2代，检测同时含有双荧光标记、ZmMTL基因纯合突变或双等位突变，且无ZmMTL转基因元件的植株即为带有双荧光标记的单倍体诱导系。

双荧光标记的检测方法为：用带有480nm激发光和550nm激发光的手持式荧光灯分别对籽粒胚eGFP荧光蛋白和胚乳DsRED荧光蛋白进行检测，筛选荧光灯下胚和胚乳均发射荧光。

ZmMTL基因纯合突变或双等位突变的检测方法为：提取F2代基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物DH-F(cggtggctccgcaacaac)和引物DH-R(ttgggttgatggcagagacg)组成的引物对进行PCR扩增，扩增产物采用DH-F下游20bp的引物DHCS-F：atcttcatggcggccagctc进行测序，测序结果在DSDecodeM(http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/)进行突变分型和分析，从中分析找出纯合突变或双等位突变的植株。

无ZmMTL转基因元件的检测方法为：提取植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ZM-F和引物ZM-R组成的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，以野生型植株作为阴性对照。无ZmMTL编辑元件的植株为检测结果为未扩增出553bp大小的阳性条带的植株。

带有双荧光标记的单倍体诱导系用于单倍体诱导能力鉴定，诱导受体为吉单96。在受体诱导穗上可以通过荧光标记区分胚及胚乳均有荧光的二倍体、均无荧光的串粉籽粒和胚乳有荧光胚无荧光的单倍体，结果如图9所示。

由于含基因编辑元件的株系，具有诱变其他野生型材料的能力。利用该特点，可以将本研究所提出和获得的基于双荧光标记筛选的基因编辑单倍体诱导系整个***转移到任何其他材料背景中，具体方法如图10所示，将含双荧光标记及ZmMTL编辑元件的株系与B背景的常规株系进行杂交，并用B背景常规株系做轮回亲本进行多代回交，回交过程中始终筛选保留双荧光标记和ZmMTL基因突变，多代回交至B材料遗传背景恢复后，再进行一代自交，即可在其后代中选出无ZmMTL基因编辑元件，ZmMTL基因突变纯合且双荧光标记纯合的单倍体诱导系。由于双荧光标记遗传表达盒为单一表达盒，与基因编辑技术配合，这种模式的转育十分方便有效。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种高效植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法

<160> 6

<210> 1

<211> 8803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctgc 240

ccttgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 300

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatg ggtagagaaa gcaagggaga 360

ctgaccctaa agccaagcta ggtcagggta agaagcgtgc ggccttctgg cagctacttg 420

ggccgcacca aagaaacaca acccacacga cctatgtcgt cgtcacggct tgcacatttt 480

tatgaccatg ccggccagcc aacatagctt ctaccggctt ataagtcttc cttcttcaga 540

gaaagcaatc gtggtcaaat gctcctgcca gtgtcaaatt gaggcaactt tttgcgcgag 600

cagacgtggg tccgatgtgt gcaaaactaa tggtggctgt catgtgggcg cccgtagtct 660

gcaatgtggg cccaacgtcc ggagtgtgtg atagcttgca cgataggaat ggctgaatgg 720

gaatggggga ttttgtcaca tgggaccgga gtgccccaag tcaggagttg ctcgacgtcc 780

cgcgtcacag aatgtgatgg tttgccggac agcagcggtg gaagagccat tatggcttag 840

tgtggcatca gccatacctt acttttaata actctcatat tttctactat aacatcaaaa 900

taagatgtat gttgtctctt atctagcagg tcttgaggtc gattcacaat tcttgcagat 960

ttcatttttt gagccataac agggataagg gcaaacagga aaatgaaaaa aggcataaca 1020

gaaaatggta gactacccta acagaaaatg gtagactacc cttaccgtct taataagtag 1080

tagagatttg ttcagcaggc cgcttttagc tagtttcgag tcgtcgaaat cagcttctgc 1140

taggtaacaa cgtgtttggt ttgtcggaca acggcgtccg gaatcatccg atcctatatc 1200

tgaacctaat atatttgttt ggtttacatc atagatctgt gtcgtccgac atcagatgct 1260

ctatgtagcg ctggttagaa gtacaattat gcagcatcga tttactccca gaaaaacaac 1320

ggacgacctc acacaggagc agctcatgcc ggatcaactg aatttgcaac caaacacgtc 1380

ctaaatgttt tgcttttcat agtctatttt tttgttagaa tcgtttatgt aaaaatcaca 1440

tgtaaatata gaatctatcg atgataggat aaatatgatg ctccgcgtag actcctttgg 1500

gcccgtgtgt ttcagctttt ttctgaccag cttttctgag aatttagccg cggagagaat 1560

ctggctgtat agagaatctg agtattatta ggattacgtg cagataaaga taaagttgtc 1620

catgtggctc aggatctata aagtgacgaa ttactactat tgcgacgact caaccgatta 1680

tatgtttatg ttgattttga atgattttta tataaacgaa ttttatagaa actggctgaa 1740

aagctgagtg tttcgtagtc tgcaacagct tttggtagca agaagctgcg aaaagccgaa 1800

acaaacaacg actttatctt ctttagcaca taaatggtat aaaaaaatgt cgtaacagct 1860

atttttttaa gaatccagtt tctcggagat ctttggaaaa aagttctctg aaacagcccc 1920

gcgtcgctac gtgcagctcc atctgctccg tgttgtcccc accccaatca ccgctgtcgc 1980

ttcgccgcag gcatcccagc agcgagctag catgcacgca cgcacgcaag cacacggcgg 2040

cagctgcacg gatgcggccg agtgcggcag cacagcagcg cgcgcgcgct ccacatcgcc 2100

ttcgctagtt cgctccgcca cgtacgcggc ccggcctcca cctggcggcg cgcatggctg 2160

cgaccctcgc cgcgccacct cttcatatac gctgcagctc gcctcgaacc ctcgcatcga 2220

acgcacactc gcactcgcac gtacaccaca ctagttacca cagacgacgg gcgccatggt 2280

gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 2340

cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 2400

gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 2460

gaccaccttc acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 2520

cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 2580

ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 2640

ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 2700

ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 2760

caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 2820

ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 2880

gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 2940

ggagttcgtg accgccgccg ggatcactca cggcatggac gagctgtaca agtaagagct 3000

cggtaccgag ctcgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 3060

tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 3120

atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 3180

tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 3240

aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attcgtaatc atgtcatagc 3300

tgtttcctga agggcagctt caattcgccc tatagaacgt cgtgactggc gatctcgatg 3360

tgtagtctac gagaagggtt aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc taaaaataag 3420

ccgatgagga taaataaaat gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact catcaagagg 3480

atgcttttcc gatgagctct agtagtacat cggacctcac atacctccat tgtggtgaaa 3540

tattttgtgc tcatttagtg atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg ttttgacatt 3600

tcagttttgc cactcttagg ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa aagcaaaaca 3660

attttatttt acttttacca ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc cactctagaa 3720

attctgttta tgccacagaa tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc caaggtgttc 3780

atggcatgga aatgtgacat aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg tactcctcgt 3840

aacaagagac ggaaacatca tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat cacctttgga 3900

tgatgcgcat gaatggagtc gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca ctgagtccgg 3960

gcggcaacta ccatcggcga acgacccagc tgacctctac cgaccggact tgaatgcgct 4020

accttcgtca gcgacgatgg ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg catggcggca 4080

catggcgagc tcagaccgtg cgtggctggc tacaaatacg taccccgtga gtgccctagc 4140

tagaaactta catggcctcc tccgagaacg tcatcaccga gttcatgcgc ttcaaggtgc 4200

gcatggaggg caccgtgaac ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc 4260

cctacgaggg ccacaacacc gtgaagctga aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg 4320

cctgggacat cctgtccccc cagttccagt acggctccaa ggtgtacgtg aagcaccccg 4380

ccgacatccc cgactacaag aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga 4440

tgaacttcga ggacggcggc gtggcgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggct 4500

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agaagaagac catgggctgg gaggcctcca ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc 4620

tgaagggcga gacccacaag gccctgaagc tgaaggacgg cggccactac ctggtggagt 4680

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cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 8400

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 8460

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 8520

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 8580

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<210> 2

<211> 2416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct tgcatgcctg 60

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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tagcttctac cggcttataa gtcttccttc ttcagagaaa gcaatcgtgg tcaaatgctc 240

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tttagctagt ttcgagtcgt cgaaatcagc ttctgctagg taacaacgtg tttggtttgt 840

cggacaacgg cgtccggaat catccgatcc tatatctgaa cctaatatat ttgtttggtt 900

tacatcatag atctgtgtcg tccgacatca gatgctctat gtagcgctgg ttagaagtac 960

aattatgcag catcgattta ctcccagaaa aacaacggac gacctcacac aggagcagct 1020

catgccggat caactgaatt tgcaaccaaa cacgtcctaa atgttttgct tttcatagtc 1080

tatttttttg ttagaatcgt ttatgtaaaa atcacatgta aatatagaat ctatcgatga 1140

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ttattaggat tacgtgcaga taaagataaa gttgtccatg tggctcagga tctataaagt 1320

gacgaattac tactattgcg acgactcaac cgattatatg tttatgttga ttttgaatga 1380

tttttatata aacgaatttt atagaaactg gctgaaaagc tgagtgtttc gtagtctgca 1440

acagcttttg gtagcaagaa gctgcgaaaa gccgaaacaa acaacgactt tatcttcttt 1500

agcacataaa tggtataaaa aaatgtcgta acagctattt ttttaagaat ccagtttctc 1560

ggagatcttt ggaaaaaagt tctctgaaac agccccgcgt cgctacgtgc agctccatct 1620

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agctagcatg cacgcacgca cgcaagcaca cggcggcagc tgcacggatg cggccgagtg 1740

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cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt 2040

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gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc 2220

cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg 2280

cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga 2340

cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa 2400

cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca 2460

caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg 2520

cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa 2580

agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat 2640

cactcacggc atggacgagc tgtacaagta agagctcggt accgagctcg aatttccccg 2700

atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 2760

tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 2820

tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 2880

cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 2940

tgttactaga tcgggaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgaaggg cagcttcaat 3000

tcgccctata gaacgtcgtg actggcgatc tcgatgtgta gtctacgaga agggttaacc 3060

gtctcttcgt gagaataacc gtggcctaaa aataagccga tgaggataaa taaaatgtgg 3120

tggtacagta cttcaagagg tttactcatc aagaggatgc ttttccgatg agctctagta 3180

gtacatcgga cctcacatac ctccattgtg gtgaaatatt ttgtgctcat ttagtgatgg 3240

gtaaattttg tttatgtcac tctaggtttt gacatttcag ttttgccact cttaggtttt 3300

gacaaataat ttccattccg cggcaaaagc aaaacaattt tattttactt ttaccactct 3360

tagctttcac aatgtatcac aaatgccact ctagaaattc tgtttatgcc acagaatgtg 3420

aaaaaaaaca ctcacttatt tgaagccaag gtgttcatgg catggaaatg tgacataaag 3480

taacgttcgt gtataagaaa aaattgtact cctcgtaaca agagacggaa acatcatgag 3540

acaatcgcgt ttggaaggct ttgcatcacc tttggatgat gcgcatgaat ggagtcgtct 3600

gcttgctagc cttcgcctac cgcccactga gtccgggcgg caactaccat cggcgaacga 3660

cccagctgac ctctaccgac cggacttgaa tgcgctacct tcgtcagcga cgatggccgc 3720

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agctgaaggt gaccaagggc ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagt 4020

tccagtacgg ctccaaggtg tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacaagaagc 4080

tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg 4140

cgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg acggctgctt catctacaag gtgaagttca 4200

tcggcgtgaa cttcccctcc gacggccccg tgatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg 4260

cctccaccga gcgcctgtac ccccgcgacg gcgtgctgaa gggcgagacc cacaaggccc 4320

tgaagctgaa ggacggcggc cactacctgg tggagttcaa gtccatctac atggccaaga 4380

agcccgtgca gctgcccggc tactactacg tggacgccaa gctggacatc acctcccaca 4440

acgaggacta caccatcgtg gagcagtacg agcgcaccga gggccgccac cacctgttcc 4500

tgtagaagct tgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg 4560

ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta 4620

acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat 4680

acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg 4740

cggtgtcatc tatgttacta gatcgggaat taaactatca gtgtttgaca ggatatattg 4800

gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac ggatatttaa aagggcgtga 4860

aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc ccctcgggat 4920

caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg acgttcagtg 4980

cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca ggctgccgcc 5040

ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta gaatacttgc 5100

gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct gctgggctat 5160

gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac gggccgaact gcacgcggcc 5220

ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg cccggagctg 5280

gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag gctagaccgc 5340

ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc gcatccagga ggccggcgcg 5400

ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg ccgcatggtg 5460

ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga ccgcacccgg 5520

agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc taccctcacc 5580

ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac cgtgaaagag 5640

gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga gcgcagcgag 5700

gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc attgaccgag 5760

gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg aaaccgcacc 5820

aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag atgatcgcgg 5880

ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg 5940

ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg 6000

agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg 6060

ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat 6120

cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg 6180

cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc 6240

ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc 6300

gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc 6360

gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc 6420

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gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa 6540

aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct 6600

tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt 6660

tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat 6720

taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg 6780

ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca 6840

gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg 6900

aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg 6960

cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg 7020

aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg 7080

aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac 7140

tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa 7200

tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc 7260

ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa 7320

tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca 7380

agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata 7440

gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg 7500

aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca 7560

tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca 7620

tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg 7680

cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag 7740

aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga 7800

acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa 7860

agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg 7920

agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg 7980

atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag 8040

ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt 8100

tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg 8160

aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg 8220

aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg 8280

aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt 8340

acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac 8400

acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa 8460

aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag 8520

ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt 8580

cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc 8640

taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca 8700

ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 8760

acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 8820

gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 8880

tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 8940

gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 9000

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 9060

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 9120

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caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 9300

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9360

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gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9720

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9780

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcattcta 9840

ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat aatattttat tttctcccaa tcaggcttga 9900

tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat actgttcttc cccgatatcc tccctgatcg 9960

accggacgca gaaggcaatg tcataccact tgtccgccct gccgcttctc ccaagatcaa 10020

taaagccact tactttgcca tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg 10080

aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat 10140

ctttaaatgg agtgtcttct tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca 10200

gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata 10260

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ccgtcatttt taaatatagg ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag 10560

acattccttc cgtatctttt acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg 10620

atattctcat tttagccatt tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc 10680

ccaagaagct aattataaca agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct 10740

taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc 10800

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tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa 12000

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gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttgaac 12480

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caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa 12900

tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaattcga gctcggtacc cggggatcct 12960

ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 13020

tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 13080

tggcgtaata gcgaa 13095

<210> 5

<211> 1789

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

agttcatcac taatcacact tattgtgccc tcgacgagta tctatagcta gctcattaat 60

cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120

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gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360

gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420

cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc 480

atccatccag catcgtacgt acgtcctcta tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt 540

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agcctatcat cttctctacc tacgacgtac gtacgtcgtc acgaatgatt catctgtacg 780

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cccagtgaag ccgtcgaact gccgcaggtt cctggtgctg tccatcggga cggggtcgac 1260

gtccgagcag ggcctctaca cggcgcggca gtgctcccgg tggggtatct gccggtggct 1320

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gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaat 1789

<210> 6

<211> 16875

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 60

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacat gattacgaat tcccgatcta 120

gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt 180

ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata 240

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aacgatcggg gaaattcgag ctcggtaccg agctcttact ttttcttttt tgcctggccg 420

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tcgtacaggc cggtgatgct ctggtggatc agggtggcgt ccagcacctc tttggtgctg 540

gtgtacctct tccggtcgat ggtggtgtca aagtacttga aggcggcagg ggctcccaga 600

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tgcttgttgt aggcggacag cactttgtcc agattagcgt cggccaggat cactctcttg 720

gagaactcgc tgatctgctc gatgatctcg tccaggtagt gcttgtgctg ttccacaaac 780

agctgtttct gctcattatc ctcgggggag cccttcagct tctcatagtg gctggccagg 840

tacaggaagt tcacatattt ggagggcagg gccagttcgt ttcccttctg cagttcgccg 900

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cccttatccc acacgatctc cccggtttcg ccgtttgtct cgatcagagg ccgcttccgg 1380

atctcgccgt tggccagggt aatctcggtc ttgaaaaagt tcatgatgtt gctgtagaag 1440

aagtacttgg cggtagcctt gccgatttcc tgctcgctct tggcgatcat cttccgcacg 1500

tcgtacacct tgtagtcgcc gtacacgaac tcgctttcca gcttagggta ctttttgatc 1560

agggcggttc ccacgacggc gttcaggtag gcgtcgtggg cgtggtggta gttgttgatc 1620

tcgcgcactt tgtaaaactg gaaatccttc cggaaatcgg acaccagctt ggacttcagg 1680

gtgatcactt tcacttcccg gatcagcttg tcattctcgt cgtacttagt gttcatccgg 1740

gagtccagga tctgtgccac gtgctttgtg atctgccggg tttccaccag ctgtctcttg 1800

atgaagccgg ccttatccag ttcgctcagg ccgcctctct cggccttggt cagattgtcg 1860

aactttctct gggtaatcag cttggcgttc agcagctgcc gccagtagtt cttcatcttc 1920

ttcacgacct cttcggaggg cacgttgtcg ctcttgcccc ggttcttgtc gcttctggtc 1980

agcaccttgt tgtcgatgga gtcgtccttc agaaagctct gaggcacgat atggtccaca 2040

tcgtagtcgg acagccggtt gatgtccagt tcctggtcca cgtacatatc ccgcccattc 2100

tgcaggtagt acaggtacag cttctcgttc tgcagctggg tgttttccac ggggtgttct 2160

ttcaggatct ggctgcccag ctctttgatg ccctcttcga tccgcttcat tctctcgcgg 2220

ctgttcttct gtcccttctg ggtggtctgg ttctctctgg ccatttcgat cacgatgttc 2280

tcgggcttgt gccggcccat cactttcacg agctcgtcca ccaccttcac tgtctgcagg 2340

atgcccttct taatggcggg gctgccggcc agattggcaa tgtgctcgtg caggctatcg 2400

ccctggccgg acacctgggc tttctggatg tcctctttaa aggtcaggct gtcgtcgtgg 2460

atcagctgca tgaagtttct gttggcgaag ccgtcggact tcaggaaatc caggattgtc 2520

ttgccggact gcttgtcccg gatgccgttg atcagcttcc ggctcagcct gccccagccg 2580

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tccagaatgt cctcgttttc ctcattgtcc aggaagtcct tgtccttgat aattttcagc 2760

agatcgtggt atgtgcccag ggaggcgttg aaccgatctt ccacgccgga gatttccacg 2820

gagtcgaagc actcgatttt cttgaagtag tcctctttca gctgcttcac ggtcactttc 2880

cggttggtct tgaacagcag gtccacgatg gcctttttct gctcgccgct caggaaggcg 2940

ggctttctca ttccctcggt cacgtatttc actttggtca gctcgttata cacggtgaag 3000

tactcgtaca gcaggctgtg cttgggcagc accttctcgt tgggcaggtt cttatcgaag 3060

ttggtcatcc gctcgatgaa gctctgggcg gaagcgccct tgtccaccac ttcctcgaag 3120

ttccaggggg tgatggtttc ctcgctcttt ctggtcatcc aggcgaatct gctgtttccc 3180

ctggccagag ggcccacgta gtaggggatg cggaaggtca ggatcttctc gatcttttcc 3240

cggttgtcct tcaggaatgg gtaaaaatct tcctgccgcc gcagaatggc gtgcagctct 3300

cccaggtgga tctggtgggg gatgctgccg ttgtcgaagg tccgctgctt ccgcagcagg 3360

tcctctctgt tcagcttcac gagcagttcc tcggtgccgt ccatcttttc caggatgggc 3420

ttgatgaact tgtagaactc ttcctggctg gctccgccgt caatgtagcc ggcgtagccg 3480

ttcttgctct ggtcgaagaa aatctctttg tacttctcag gcagctgctg ccgcacgaga 3540

gctttcagca gggtcaggtc ctggtggtgc tcgtcgtatc tcttgatcat agaggcgctc 3600

aggggggcct tggtgatctc ggtgttcact ctcaggatgt cgctcagcag gatggcgtcg 3660

gacaggttct tggcggccag aaacaggtcg gcgtactggt cgccgatctg ggccagcagg 3720

ttgtccaggt cgtcgtcgta ggtgtccttg ctcagctgca gtttggcatc ctcggccagg 3780

tcgaagttgc tcttgaagtt gggggtcagg cccaggctca gggcaatcag gtttccgaac 3840

aggccattct tcttctcgcc gggcagctgg gcgatcagat tttccagccg tctgctcttg 3900

ctcagtctgg cagacaggat ggccttggcg tccacgccgc tggcgttgat ggggttttcc 3960

tcgaacagct ggttgtaggt ctgcaccagc tggatgaaca gcttgtccac gtcgctgttg 4020

tcggggttca ggtcgccctc gatcaggaag tggccccgga acttgatcat gtgggccagg 4080

gccagataga tcagccgcag gtcggccttg tcggtgctgt ccaccagttt ctttctcagg 4140

tggtagatgg tggggtactt ctcgtggtag gccacctcgt ccacgatgtt gccgaagatg 4200

gggtgccgct cgtgcttctt atcctcttcc accaggaagg actcttccag tctgtggaag 4260

aagctgtcgt ccaccttggc catctcgttg ctgaagatct cttgcagata gcagatccgg 4320

ttcttccgtc tggtgtatct tcttctggcg gttctcttca gccgggtggc ctcggctgtt 4380

tcgccgctgt cgaacagcag ggctccgatc aggttcttct tgatgctgtg ccggtcggtg 4440

ttgcccagca ccttgaattt cttgctgggc accttgtact cgtcggtgat cacggcccag 4500

cccacagagt tggtgccgat gtccaggccg atgctgtact tcttgtcggc tgctgggact 4560

ccgtggatac cgaccttccg cttcttcttt ggggccatct tatcgtcatc gtctttgtaa 4620

tcaatatcat gatccttgta gtctccgtcg tggtccttat agtccatcgg ggatcctcta 4680

gagtcgacct gcagaagtaa caccaaacaa cagggtgagc atcgacaaaa gaaacagtac 4740

caagcaaata aatagcgtat gaaggcaggg ctaaaaaaat ccacatatag ctgctgcata 4800

tgccatcatc caagtatatc aagatcaaaa taattataaa acatacttgt ttattataat 4860

agataggtac tcaaggttag agcatatgaa tagatgctgc atatgccatc atgtatatgc 4920

atcagtaaaa cccacatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc atccatctta 4980

aactcgtaac tatgaagatg tatgacacac acatacagtt ccaaaattaa taaatacacc 5040

aggtagtttg aaacagtatt ctactccgat ctagaacgaa tgaacgaccg cccaaccaca 5100

ccacatcatc acaaccaagc gaacaaaaag catctctgta tatgcatcag taaaacccgc 5160

atcaacatgt atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcatcttcaa ttcgtaacta 5220

tgaatatgta tggcacacac atacagatcc aaaattaata aatccaccag gtagtttgaa 5280

acagaattaa ttctactccg atctagaacg accgcccaac cagaccacat catcacaacc 5340

aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat 5400

aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc 5460

cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg attccccaaa gagaaacact ggcaagttag 5520

caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc 5580

taacacaaac acggatctaa cacaaacatg aacagaagta gaactaccgg gccctaacca 5640

tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt 5700

accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg 5760

ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg 5820

ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg gaaaggaatc ccccgtagct gccggtgccg 5880

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tctggatgcc gacagcggag caagtccaac ggtggagcgg aactctcgag aggggtccag 6000

aggcagcgac agagatgccg tgccgtctgc ttcgcttggc ccgacgcgac gctgctggtt 6060

cgctggttgg tgtccgttag actcgtcgac ggcgtttaac aggctggcat tatctactcg 6120

aaacaagaaa aatgtttcct tagttttttt aatttcttaa agggtatttg tttaattttt 6180

agtcacttta ttttattcta ttttatatct aaattattaa ataaaaaaac taaaatagag 6240

ttttagtttt cttaatttag aggctaaaat agaataaaat agatgtacta aaaaaattag 6300

tctataaaaa ccattaaccc taaaccctaa atggatgtac taataaaatg gatgaagtat 6360

tatataggtg aagctatttg caaaaaaaaa ggagaacaca tgcacactaa aaagataaaa 6420

ctgtagagtc ctgttgtcaa aatactcaat tgtcctttag accatgtcta actgttcatt 6480

tatatgattc tctaaaacac tgatattatt gtagtactat agattatatt attcgtagag 6540

taaagtttaa atatatgtat aaagatagat aaactgcact tcaaacaagt gtgacaaaaa 6600

aaatatgtgg taatttttta taacttagac atgcaatgct cattatctct agagaggggc 6660

acgaccgggt cacgctgcac tgcacaagct taaaaaaagc accgactcgg tgccactttt 6720

tcaagttgat aacggactag ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacccctgt 6780

ctccacgttg acccggagcg gtggtcgcag ctgaacttat aagccggtgt ctgcaatgct 6840

cgctggccgg tctggtacta gttctcggtt cgtcccttga tcccttcccc cgcaagccgt 6900

agcgacgacg cgcacgcccg cgtgggctgg atgcttaggc gcggcccata catcacgcgt 6960

tgccttccct cgtggtcgtg tacctatcgc aagcccagac aacgtagatt gttgttgcct 7020

gcactgcaca tgctgaagat cgaatcccct gcatagcatg aatgacgacg gatcagctgc 7080

agttattacc aagtttcatc tgcggactga atcggaggag acacaagttg atattcaggg 7140

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gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 7320

caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga tcagattgtc 7380

gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta 7440

agagaaaaga gcgtttatta gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc 7500

gttcgtccat ttgtatgtgc atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg 7560

atccaacccc tccgctgcta tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct 7620

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tggcgttttc ttgtcgcgtg ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg 7740

agacattacg ccatgaacaa gagcgccgcc gctggcctgg tgggctatgc ccgcgtcagc 7800

accgacgacc aggacttgac caaccaacgg gccgaactgc acgcggccta tgaggtaaag 7860

agaaaatgag caaaagccaa acacgctaag tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa 7920

ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca actttcagtt 7980

gccggagctg gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag 8040

gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc gcatccagga 8100

ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg 8160

ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga 8220

ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc 8280

taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac 8340

cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga 8400

gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc 8460

attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg 8520

aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag 8580

atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat 8640

gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag cttggccgct 8700

gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt 8760

catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca 8820

tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc 8880

atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc 8940

agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc gttgtcggca 9000

tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga 9060

tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg 9120

tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg acatatgggc caccgccgac ctggtggagc 9180

tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc 9240

gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc 9300

tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg 9360

gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg 9420

ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag 9480

cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc 9540

cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca 9600

caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga 9660

atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag 9720

cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc 9780

ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgcc tgccggccct 9840

gcaatggcac tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg agcggtcgca aaccatccgg 9900

cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca 9960

ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc 10020

cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag 10080

gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg 10140

cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg 10200

acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg 10260

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aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg 10380

tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga 10440

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gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc accccgatta 10680

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cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct 10920

gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc 10980

cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa 11040

cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg 11100

gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta 11160

aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg 11220

ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg 11280

ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg 11340

gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc 11400

acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc 11460

agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc 11520

agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg 11580

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ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 11700

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agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 11820

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 11880

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 11940

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 12000

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 12060

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 12120

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 12180

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 12240

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 12300

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 12360

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 12420

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 12480

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggctgatgaa 12540

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tcaaatggtt tcgcgaaaaa tcaataatca gacaacaaga tgtgcgaact cgatatttta 12660

cacgactctc tttaccaatt ctgccccgaa ttacacttaa aacgactcaa cagcttaacg 12720

ttggcttgcc acgcattact tgactgtaaa actctcactc ttaccgaact tggccgtaac 12780

ctgccaacca aagcgagaac aaaacataac atcaaacgaa tcgaccgatt gttaggtaat 12840

cgtcacctcc acaaagagcg actcgctgta taccgttggc atgctagctt tatctgttcg 12900

ggcaatacga tgcccattgt acttgttgac tggtctgata ttcgtgagca aaaacgactt 12960

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ttcccgcttt cagagcaatg ttcaaagaaa gctcatgacc aatttctagc cgaccttgcg 13080

agcattctac cgagtaacac cacaccgctc attgtcagtg atgctggctt taaagtgcca 13140

tggtataaat ccgttgagaa gctgggttgg tactggttaa gtcgagtaag aggaaaagta 13200

caatatgcag acctaggagc ggaaaactgg aaacctatca gcaacttaca tgatatgtca 13260

tctagtcact caaagacttt aggctataag aggctgacta aaagcaatcc aatctcatgc 13320

caaattctat tgtataaatc tcgctctaaa ggccgaaaaa atcagcgctc gacacggact 13380

cattgtcacc acccgtcacc taaaatctac tcagcgtcgg caaaggagcc atgggttcta 13440

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cgaatgcaga ttgaagaaac cttccgagac ttgaaaagtc ctgcctacgg actaggccta 13560

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cttcaactaa catgttggct tgcgggcgtt catgctcaga aacaaggttg ggacaagcac 13680

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atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 13980

ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 14040

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ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 14220

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caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 14940

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tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 15060

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tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 15180

taatgtactg aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg 15240

gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag 15300

ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg 15360

ggaactactc acacattatt atggagaaac tcgagtcaaa tctcggtgac gggcaggacc 15420

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 15480

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 15540

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gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 15660

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 15720

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gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggctcatggt agactcgaga 15960

gagatagatt tgtagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 16020

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cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 16140

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ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata 16320

ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat 16380

tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttcac atcaatccac ttgctttgaa 16440

gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg 16500

ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat 16560

ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa 16620

tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg 16680

tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg 16740

ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 16800

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 16860

atgtgagtta gctca 16875

Claims (9)

1.一种DNA分子，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲自上游至下游依次包括如下元件：植物胚特异性启动子、荧光蛋白甲的编码基因和终止子；所述表达盒乙自上游至下游依次包括如下元件：植物胚乳糊粉层特异性启动子、荧光蛋白乙的编码基因和终止子。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：表达盒甲中，所述荧光蛋白甲的编码基因为荧光蛋白eGFP基因；表达盒乙中，所述荧光蛋白乙的编码基因为荧光蛋白DsRED基因。

3.如权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子如序列表的序列1自5’端第340-5088位核苷酸所示。

4.含有权利要求1至3任一所述DNA分子的重组载体。

5.权利要求1至3任一所述DNA分子或权利要求4所述的重组载体的应用，为如下(a1)-(a3)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖单倍体筛选；

(a2)制备单倍体诱导系；

(a3)双单倍体育种。

6.重组表达载体甲和重组表达载体乙在为如下(a1)-(a3)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖单倍体筛选；

(a2)制备单倍体诱导系；

(a3)双单倍体育种；

所述重组表达载体甲为权利要求4所述的重组载体；

所述重组表达载体乙为能够沉默植物基因组中ZmMTL基因的重组表达载体。

7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1至3任一所述的DNA分子导入出发植物，得到转基因植物。

8.一种单倍体诱导系的构建方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求7所述的方法培育转基因植物；

(2)从步骤(1)得到的转基因植物中随机选择一个单拷贝单株为父本，单倍体诱导系甲为母本进行杂交，在后代中筛选阳性植株；

(3)从步骤(2)得到的阳性植株中随机选择一个单株为母本，单倍体诱导系甲为父本进行6-8次回交，筛选阳性植株；

(4)从步骤(3)得到的阳性植株随机选择一个单株自交，得到所述单倍体诱导系；

步骤(2)或步骤(3)中，阳性植株为籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙的植株。

9.一种单倍体诱导系的构建方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求7所述的方法培育转基因植物；

(2)将权利要求6中所述的重组表达载体乙导入出发植物，实现对出发植物中ZmMTL基因的定向编辑，得到ZmMTL基因沉默的转基因株系；

(3)从步骤(1)得到的转基因植物中随机选择一个单拷贝单株为父本，步骤(2)得到的转基因株系中随机选择一个单株为母本，进行杂交，筛选阳性植株；阳性植株满足如下条件：(a1)籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙；(a2)含有ZmMTL基因编辑元件；

(4)从步骤(3)筛选的阳性植株中随机选择一株自交，筛选阳性植株，得到所述单倍体诱导系；阳性植株满足如下条件：(b1)籽粒胚中表达荧光蛋白甲且胚乳中表达荧光蛋白乙；(b2)ZmMTL基因纯合突变或双等位突变；(b3)无ZmMTL基因编辑元件。