CN106234209A - 一种新的玉米单倍体诱导系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新的玉米单倍体诱导系及其应用，本发明包括：以表达荧光蛋白基因、抗虫基因和抗除草剂基因的转基因玉米为父本(♂)与单倍体诱导系母本(♀)杂交，产生杂交一代，经多次回交、筛选和自交，获得新的玉米单倍体诱导系。本发明解决了以前***中单倍体难鉴定，准确度不高，速度慢，依赖于有经验的研究人员等问题。可以通过简单的装置来快速鉴定，不需要有经验的研究人员，准确度高，省时省力，可以进行大规模的单倍体生产，应用于玉米育种。同时本发明中的单倍体诱导系具有抗虫、抗除草剂的特点，有利于田间管理及提高单倍体诱导的数量及质量。

Description

一种新的玉米单倍体诱导系及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新的玉米单倍体诱导系的产生及其应用。
背景技术
众所周知，单倍体植物基因组只含有一组染色体，因此通常不育。但通过自然染色体加倍或者人工加倍后，可以形成双单倍体。由于染色体加倍是将单倍体植株的基因组倍增，因此形成的二倍体植株的两个染色体组完全相同(纯和)。这有区别于通过杂交形成的杂合二倍体(一个染色体组来自母本，一个来自父本)。双单倍体由于完全纯和，因此在植物育种上是很好的自交系材料，可以直接用于配制杂交组合。
过去，植物育种学家主要通过选择和杂交进行育种。在植物育种中，自交系的获得是配制杂交组合的关键。而通常这一过程要经过6-8代的回交或自交，而得到的自交系仅有99％的纯和度。玉米在北方一般一年仅种一代，6-8代需要6-8年的时间，即使在南方加代，每年二代，仍然需要3-4年的时间。在筛选自交系过程中往往需要种植大量的个体，占用大量的农地，耗费大量的人力物力。传统方法周期长，工作量大，效率低下。单倍体技术的应用能够明显缩短育种年限，提高选择效率，并可以达到100％纯和度，因此在玉米育种中被普遍采用(Chang and Coe,2009,Geiger and Gordillo,2009,Zhang等2008，Prasanna等2012，Robert等2005)。
目前单倍体诱导的方法有遗传诱导，人工修饰，人工诱导，花粉(药)培养，远源杂交和孤雌生殖等。玉米单倍体最早发现于自然群体中，Chase(1949)发现玉米自然群体中有小于0.1％的单倍体发生频率。通过花药培养可以大量获得玉米单倍体，如中国科学院遗传研究所401组(1975)及中国科学院植物研究所(1978)分别报道花药培养获得可以遗传的单倍体。但体外诱导的方法具有很大的局限性，如单倍体诱导受植物基因型的影响，在组培中易产生体细胞突变，需要耗费大量的人力物力及效率低等(Barret等2004，Beckert等1994)。这些局限严重影响了玉米单倍体技术在玉米常规育种中的应用。
玉米单倍体诱导系的发现为玉米单倍体育种提供了可能。最初的玉米单倍体诱导系来源于1959年美国科学家Ed Coe发现的Stock6(Coe,1959)。Stock6作为父本和其他玉米材料杂交，在后代中有约2％为单倍体。单倍体基因组全部染色体都来自于母本材料，因为父本染色体在形成单倍体过程中被消除(Zhang等2008)。单倍体的诱导效率曾经是很多研究的重点，而且已经获得很大的突破。经过多次改造形成了一系列诱导频率更高的单倍体诱导系，如KMS和ZMS(Tyrnov and Zavalishina,1984)，WS14(Lashermes and Beckert,1988)，KEMS(Sarkar等1994)，MHI和M751H(Eder and Chalyk,2002)，RWS(Rober等2005)，UH400(Chang and Coe，2009)，PK6(Barret等2008)，HZI 1(Zhang等2008)，CAUHOI(Chenand Song，2003)，PHI(Rotarenco等2010)。高效率诱导系的产生为单倍体技术在玉米育种中的大规模应用提供了保障。
玉米单倍体诱导系的另外一个研究重点是单倍体的筛选体系，即如何在大量的二倍体子代中挑选出单倍体的个体。目前普遍使用的单倍体筛选***是利用R1-nj标记。R1-nj是玉米花青素合成调控基因R1的一个等位基因，R1-nj的表达在玉米籽粒上表现在籽粒的顶部胚乳为紫色，及紫色胚。R1-nj可作为筛选玉米单倍体的标记。如单倍体诱导系含有纯和的R1-nj基因，而被诱导的母本为无颜色的籽粒时，由于单倍体的胚没有经过受精或受精后父本染色体被排除，胚没有R1-nj基因，为无色，但胚乳是经过受精的，因而有R1-nj基因表达，为紫色。相反，正常二倍体种子的胚及胚乳都是经过受精的，都有R1-nj表达，因而都有紫色的标记。但该***的应用受到以下因素的影响：1.被诱导的母本材料不能有色素表达，因为这会掩盖R1-nj标记；2.R1-nj基因的表达受环境因素的影响(Kebede et al.,2011；Prigge et al.,2011；Prigge et al.,2012；2005)；3.R1-nj的表达受其他花青素合成及调控基因的影响，如c1-I,c2-Idf和in-1D(Burr et al.,1996；DellaVedova et al.,2005；Paz-Ares et al.,1990)；4.单倍体的鉴定往往需要有经验的人员进行鉴定。为克服R1-nj***的缺点，有人提出通过种子含油量或通过幼苗期B1和PL1标记来作为替代筛选标记，但这些***也并不稳定和准确(Rotarenco et al.,2010；Rotarencoet al.,2007)。
另外，目前的单倍体诱导系多不抗虫及除草剂，因此在诱导系的生长发育及杂交过程中，杂草管理困难，容易发生虫害，影响诱导系的繁殖及单倍体的诱导。
发明内容
本发明旨在克服上述***诱导及筛选存在的缺陷，提供一种高效诱导及筛选玉米单倍体的方法，更准确更快速的生产鉴定单倍体，并通过秋水仙素诱导单倍体染色体加倍形成可遗传的双单倍体(DH)，应用于玉米遗传育种。
本发明技术方案如下：
一种新的玉米单倍体诱导系的产生及筛选方法，原理如下：
通过基因工程构建同时表达荧光蛋白(EGFP)基因、抗虫基因(BT)和抗除草剂基因(Bar)的载体，并通过农杆菌介导的基因转化将这3个基因转化到玉米中，以此转基因植物为父本，与玉米单倍体诱导系RWS杂交，并通过多次回交到RWS母本中，筛选同时表达这3个基因和R-nj基因并具有单倍体诱导能力的个体，通过2次自交，筛选得到纯和的含有荧光蛋白基因、抗虫基因和抗除草剂基因的新的单倍体诱导系，即为本发明的新的玉米单倍体诱导系。
以该诱导系为父本(♂)，与为母本的被诱导玉米(♀)杂交产生F1代种子，萌发F1代种子，观察EGFP基因在种子幼根中的表达；其中表达EGFP的种子为正常二倍体，不表达EGFP的种子为单倍体，将单倍体染色体鉴定，确定含有10条染色体的为单倍体，含有20条染色体的为二倍体，撇开二倍体，将单倍体植株经秋水仙素处理进行染色体加倍后移植于温室或田间进行自交，加倍后的双单倍体可以正常结子，即得到双单倍体纯系。
其中单倍体诱导系和杂交后代都具有抗虫的特性，有效地保护了单倍体诱导系的生长、繁殖和用于单倍体诱导花粉的数量，也有效地保护了杂交后代免受害虫危害，增加了单倍体的数量和质量。新的诱导系中的抗除草剂基因可以提供该诱导系抗除草剂的能力，有利于在种植过程中清除杂草和其他玉米植株，有效地进行田间管理。
进一步的，一种新的玉米单倍体诱导系的产生及筛选方法，具体步骤如下：
步骤一、以上述表达EGFP/Bt/Bar的转基因玉米父本(♂)与单倍体诱导系RWS母本(♀)杂交产生杂交一代F1；
步骤二、F1作为父本(♂)回交到单倍体诱导系RWS(♀)，产生回交一代BC1；
步骤三、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC1个体，
步骤四、以步骤三筛选的BC1个体为父本(♂)再次回交到单倍体诱导系RWS(♀)，产生回交二代BC2；
步骤五、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC2个体，
步骤六、以步骤五筛选的BC2个体为父本(♂)再次回交到RWS(♀)产生回交三代BC3；
步骤七、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3个体进行自交，产生BC3F1；
步骤八、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3F1个体进行自交，产生BC3F2，；
步骤九、筛选BC3F2中的纯和个体并进行繁殖，即为新的纯和单倍体诱导系；
具体分述如下：
1.通过设计表达载体克隆EGFP和Bt基因到含有Bar基因的农杆菌表达载体上(图2)，所述表达载体含有三个基因表达框：EGFP基因的表达通过2x35S启动子驱动，利用AMV增强子序列加强基因的表达(Datla等1993)，利用NosT终止子终止基因转录；Bt基因的表达通过2x35S启动子驱动，利用NosT终止子终止基因转录；抗除草剂基因Bar的表达通过2x35S启动子驱动，利用NosT终止子终止基因转录，Bar基因作为玉米转化筛选的标记。
其中，LB和RB分别为农杆菌双元载体Bin19的左、右边界序列，2x35S为双重花椰菜花叶病毒35S启动子，AMV是苜蓿花叶病毒序列用于增强基因的表达，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因，NosT是基因转录终止子，Bt是Cry1Ab毒素蛋白基因，Bar是抗除草剂基因(bialaphos resistance)。
2.通过农杆菌介导的基因转化，得到稳定表达EGFP、Bt和Bar基因的转基因玉米(图3)
3.通过多次回交和自交把EGFP、Bt和Bar基因转移到玉米单倍体诱导系中，形成新的玉米单倍体诱导系(图4)
4.以新诱导系为父本同其他玉米杂交，获得杂交后代
5.通过EGFP标记筛选杂交后代中的单倍体
可以利用产生紫外激发光的LED手电筒对表达EGFP的材料进行照射，然后在暗室中用肉眼通过防紫外线的眼镜进行观察筛选(图5)
6.通过染色体加倍技术对筛选到的单倍体植株进行加倍得到双单倍体(DH)(附图6)
7.双单倍体可以作为纯系，应用于玉米育种(附图7)
其中玉米单倍体的筛选是通过诱导系中的EGFP基因的表达。由于杂交后代中的所有正常二倍体都是经过双受精，因此二倍体的胚及胚乳都有EGFP基因的表达。相反，在单倍体中，由于胚乳是正常受精的三倍体，因此含有父本来源的EGFP、Bar和Bt基因，因此可以检测到绿色荧光蛋白的表达和具有抗虫的特点，而单倍体的胚仅含有母本来源的单组染色体，因此没有来自父本的转基因成分，所以并不表达EGFP。但所有杂交后代籽粒的三倍体胚乳中都有Bt基因的表达，因此杂交后代都具有抗虫的特点，因而减少了因虫害而引起的单倍体后代的损失，与以前的***相比可以增加单倍体后代的数量和质量。对同诱导系杂交后代的种子进行萌发，检测胚来源的胚根中EGFP的表达，可以快速确定是否为单倍体。EGFP的检测可以使用荧光显微镜，荧光解剖镜，或在暗室中利用发射蓝色激发光的手电筒照射激发萌发种子胚根荧光来确定。荧光的观察可以使用防紫外眼镜通过肉眼观察。
所述步骤6中的单倍体加倍是通过秋水仙素处理萌发4-5天的幼苗进行；将萌发并有约2厘米长胚芽的幼苗在胚芽1厘米处切除以露出生长点，同时在离种子约1厘米处将幼根切除，将切除胚芽及胚根的幼苗浸泡在含0.04％秋水仙素和0.5％DMSO的水溶液中，在室温黑暗中浸泡12小时，然后用自来水流水中冲洗1小时，种植于含泥炭土的穴盘中，在培养箱中培养至3叶期，培养条件为每天16小时光照，8小时黑暗，光照温度28℃，黑暗温度25℃。培养时间为1--2周。
本发明的关键点
1.表达荧光蛋白基因、抗虫基因和抗除草剂基因的玉米单倍体诱导系
2.利用新诱导系生产玉米单倍体的方法
3.用于通过EGFP检测玉米单倍体的装置
本发明的优点及积极效果
通过玉米单倍体诱导系诱导单倍体具有效率高，易操作，不受基因型限制，省时省力，易于规模化生产等优点。但现有体系中的单倍体筛选体系并不能快速准确的鉴定出单倍体，且受到环境和遗传背景的影响，限制了其在玉米育种中的应用。本发明通过在高效单倍体诱导系中植入EGFP标记，解决了以前***中单倍体难鉴定，准确度不高，速度慢，依赖于有经验的研究人员等问题。可以通过简单的装置来快速鉴定，不需要有经验的研究人员，准确度高，省时省力，可以进行大规模的单倍体生产，应用于玉米育种。针对目前单倍体诱导系易受虫害的问题，本发明通过表达抗虫基因，使得诱导系本身及与诱导系杂交的后代籽粒都具有抗虫的优点，可以提高诱导系的生长发育质量，而且杂交后的种子具有抗虫特性，增加种子数量和质量；针对单倍体诱导系在生长过程中杂草的管理，由于该新的诱导系具有抗除草剂的特点，可以通过喷洒除草剂有效去除杂草和其他玉米植株，有利于诱导系的田间管理；单倍体经过秋水仙素处理加倍后形成双单倍体(DH)，这些双单倍体不含转基因基因成分，作为纯系将可直接利用于玉米的育种。
本发明利用转基因技术，成功地将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)抗除草剂基因(Bar)和Bt毒素蛋白基因在玉米中表达，并通过多次回交，把EGFP、Bar和Bt基因转移到单倍体诱导系中，而又不影响单倍体诱导的效率，形成新的玉米单倍体诱导系。既保留原诱导系高效率诱导单倍体的优点，又克服了原***利用R1-nj标记基因的局限性，对于准确快速的筛选玉米单倍体提供了一个非常有效的方法。使用该新的诱导***，可以提高诱导系的生长发育质量，而且杂交后的种子具有抗虫特性，增加种子数量和质量；通过对杂交后代进行EGFP的表达分析，从而快速而准确的筛选出单倍体；单倍体经过秋水仙素处理加倍后形成双单倍体(DH)，这些双单倍体不含转基因成分，作为纯系将可直接利用于玉米的育种。
附图说明
图1为本发明以EGFP为标记的玉米单倍体诱导及单倍体鉴定的***图。
其中，诱导系为父本同母本杂交(A)产生F1代种子(B),种子萌发后检测EGFP在幼根中的表达,有EGFP表达的个体为正常二倍体(C)，不表达EGFP的个体为单倍体(D)，单倍体可通过染色体鉴定，含10条染色体，而正常二倍体含20条染色体。
图2为本发明EGFP/Bt/Bar基因表达载体示意图。
其中，LB和RB分别为农杆菌双元载体Bin19的左、右边界序列，2x35S为双重花椰菜花叶病毒35S启动子，AMV是苜蓿花叶病毒序列用于增强基因的表达，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因，NosT是基因转录终止子，Bt是Cry1Ab毒素蛋白基因，Bar是抗除草剂基因(bialaphos resistance)。
图3为本发明玉米转基因愈伤组织EGFP的表达图片。
其中，箭头指示表达EGFP的转基因愈伤组织，三角指示为非转基因愈伤组织。
图4为本发明通过回交和自交把EGFP/Bt/Bar基因转移到玉米单倍体诱导系RWS中的示意图
图5为本发明用于玉米单倍体检测的紫外LED手电筒及防紫外线眼镜。
其中，LED手电筒产生395纳米的紫外激发光可以激发EGFP发出绿色荧光，肉眼通过防紫外线眼镜在暗室中观测。
图6为本发明单倍体诱导加倍中幼苗胚根及胚芽的部分切除示意图
图7为本发明染色体加倍后的双单倍体纯系(右)及非单倍体来源的杂合体(左)玉米示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步说明本发明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，还可以使用其他的实施例，或者对本文列举的实施例进行结构和功能上的修改，而不会脱离本发明的范围和实质。
实例1转基因载体的构建及玉米的基因转化
表达EGFP/Bt/Bar的载体构建如图2。载体含有三个基因表达框：EGFP基因的表达通过2x35S启动子驱动，利用AMV增强子序列加强基因的表达(Datla等1993)，利用NosT终止子终止基因转录；Bt基因的表达通过2x35S启动子驱动，利用NosT终止子终止基因转录；抗除草剂基因Bar的表达通过2x35S启动子驱动，利用NosT终止子终止基因转录。Bar基因作为玉米转化筛选的标记。
含有EGFP/Bt/Bar表达框的载体通过冻融法(Weigel and Glazebrook,2006)转化根癌农杆菌EHA101菌株(Hood et al.,1986)。根癌农杆菌介导的玉米HiII品种(Amstrong等1991)幼胚转化参照Frame等(2002)的方法。1.5-2毫米大小的玉米幼胚经农杆菌感染后，放共培养培养基(N6大量元素和维生素,1.5mg/L 2,4-D,0.7g/L L-proline,30g/L蔗糖,0.5g/L 2-(4-morpholino)-ethane sulfonic acid(MES),100μg/ml乙酰丁香酮,3g/Lgelrite,pH 5.8)上23℃黑暗共培养3天，转入玉米愈伤组织筛选培养基(N6大量元素和维生素,1.5mg/L 2,4-D,0.7g/L L-proline,30g/L蔗糖,0.5g/L 2-(4-morpholino)-ethanesulfonic acid(MES),0.85mg/L硝酸银,100mg/L cefotaxime,100mg/L vancomycin,3g/Lgelrite,Bialaphos,pH 5.8)上28℃暗培养诱导愈伤组织的形成，并每3周转入新鲜的玉米愈伤组织筛选培养基上继代培养。
抗性愈伤组织中EGFP的表达可以通过荧光解剖镜检查筛选(图3)。
表达EGFP的转基因愈伤组织转到分化培养基(MS培养基大量元素及维生素,60g/L蔗糖,100mg/L myo-inositol,and 3g/L gelrite，pH 5.8)上分化出小苗，并移栽到温室中培养，转基因植株经自交后收集种子，用于下一步同单倍体诱导系的杂交及回交。
实例2通过回交和自交把EGFP/Bt/Bar基因转移到玉米单倍体诱导系RWS中
表达EGFP/Bt/Bar的转基因玉米(♂)与单倍体诱导系RWS(♀)杂交产生杂交一代F1；F1作为父本(♂)回交到RWS(♀)产生回交一代BC1；筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC1个体，并以该个体为父本(♂)回交到RWS(♀)产生回交二代BC2；筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC2个体，并以该个体为父本(♂)回交到RWS(♀)产生回交三代BC3；筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3个体进行自交，产生BC3F1；筛选10株同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3F1个体进行自交(其中部分为纯和体)，产生BC3F2(图4)。如果BC3F1个体为纯和，其自交所产生的BC3F2后代应全部表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar。10株BC3F1个体中有三株的自交后代全部同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar，为纯和体，其自交后代BC3F2作为新的纯和单倍体诱导系。该子代个体含有87％的原RWS单倍体诱导系的基因组及纯和的EGFP/Bt/Bar基因，将进一步进行下面的单倍体诱导测试和抗虫试验。
实例3检测玉米EGFP表达的装置(图5)
EGFP的检测一般可以在荧光显微镜或荧光解剖镜下进行，但荧光显微镜及解剖镜价格昂贵，不易携带，操作复杂，不利于大量检测玉米单倍体。对于检测玉米籽粒及幼苗中的EGFP表达可以利用产生紫外激发光的LED手电筒对表达EGFP的材料进行照射，然后在暗室中用肉眼通过防紫外线的眼镜进行观察筛选。
实例4利用含EGFP/Bt/Bar标记的单倍体诱导系诱导玉米单倍体的测试
如图1所示，将新的单倍体诱导系与G1-1xB73母本材料杂交，收获F1代杂种，通过EGFP标记利用荧光显微镜、解剖镜或荧光激发装置(图5)筛选单倍体，并通过染色体观察确定单倍体鉴定的准确率。在F1代153个种子中，有137个在胚根中有EGFP表达，另外16个无EGFP表达。对36个表达EGFP的个体和12个不表达EGFP的个体进行染色体鉴定发现36个表达EGFP的个体全部是二倍体，而12个不表达EGFP的个体中有11个为单倍体，另外一个为非整倍体，以EGFP标记进行单倍体鉴别的准确率达到91.7％。
实例5通过含EGFP/Bt/Bar标记的新单倍体诱导系诱导甜玉米单倍体
以新诱导系为父本，与5个市场上的甜玉米杂交种进行杂交，并对杂交后代通过EGFP标记进行单倍体的筛选，数据列入表1。183个不表达EGFP的个体被筛选出来作为可能的单倍体个体，对其中18个进行了染色体鉴定，发现有13个为真正的单倍体，其他的为非整倍体。平均单倍体诱导率7.9％。
表1、超甜玉米单倍体诱导
实例6新单倍体诱导系抗虫分析
新单倍体诱导系和原诱导系比较具有抗虫的优点，取种子萌发后新单倍体诱导系和原诱导系的幼苗叶片进行室内抗虫试验。每个培养皿放4片叶片，用水润湿，然后放入30头孵化后不超过12小时的亚洲玉米螟幼虫，放置于温度26-28度，相对湿度为70％的环境中培养，每2天更换一次新鲜玉米叶片，并观察幼虫存活情况，统计死亡率(表2)。
对田间生长的新单倍体诱导系和原诱导系在不施杀虫剂情况下雌、雄穗虫害发生的情况进行调查发现，含Bt基因的单倍体诱导系雌、雄穗虫害发生率明显降低，因虫害而引起的雄穗折断率明显降低。这将显著影响在单倍体诱导中诱导系花粉的产量及单倍体诱导系自己的繁殖。
表2.新玉米单倍体诱导系抗虫试验
表3.含Bt基因与不含Bt基因单倍体诱导系田间虫害发生率(平均值)对比
实例7新诱导系杂交后代抗虫表现
分别以新、旧诱导系为父本，与甜玉米杂交品种进行杂交，在不施杀虫剂的情况下对授粉后20天的幼穗虫害发生情况进行田间调查，发现以含Bt基因的诱导系杂交的幼穗染虫率明显降低。对成熟杂交后代籽粒数量分析发现，与含Bt基因的诱导系杂交的平均每穗籽粒数明显增加。
表4.含Bt基因与不含Bt基因单倍体诱导系与甜玉米杂交幼穗田间虫害发生率(平均值)和杂交后代籽粒数
实例8通过染色体加倍单倍体植株产出双单倍体
单倍体加倍通过秋水仙素处理萌发4-5天的幼苗进行。将萌发并有约2厘米长胚芽的幼苗在胚芽1厘米处切除以露出生长点，同时在离种子约1厘米处将幼根切除(图6)。将切除胚芽及胚根的幼苗浸泡在含0.04％秋水仙素和0.5％DMSO的水溶液中，在室温黑暗中浸泡12小时，然后用自来水流水中冲洗1小时，种植于含泥炭土的穴盘中，在培养箱中培养至3叶期，培养条件为每天16小时光照，8小时黑暗，光照温度28℃，黑暗温度25℃。培养时间1-2周。总共有55株处理过的幼苗存活下来，并移栽到大田，并对每个可育的植株进行自交(同时产生花粉和雌穗)。有14株成功自交并结实，种子成熟后收获。
超甜玉米大部分含有纯和的Sh2基因(Tracy,1997)，籽粒皱褶凹陷(图7右)。来自超甜玉米母本的单倍体应含有Sh2基因，染色体加倍后的双单倍体应含纯和Sh2基因，因此保留籽粒皱褶凹陷的特点。由于部分幼苗为非整倍体，因此含有杂合的Sh2基因，这些个体的自交后代中会表现出Sh2基因的分离，在自交子代个体中表现为部分籽粒皱褶凹陷(Sh2纯和)和部分正常籽粒(Sh2杂合)(如图7左)，这些个体并不是双单倍体，因此在收获后即丢掉。而真正的双单倍体将被保留下来作为纯系用于育种。在本次试验中，一共产生7个双单倍体纯系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等同替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：
1)该新的诱导系同时表达荧光蛋白基因、抗虫基因和抗除草剂基因；
2)以该诱导系为父本与任何玉米母本杂交，所得的后代个体胚乳中也都表达上述3个基因；
3)以该诱导系为父本与任何玉米母本杂交，所得的部分后代个体胚和植株为单倍体，这些个体中不含有上述3个基因；
4)上述3)中个体种子萌发后形成的幼苗根和芽中不含荧光蛋白，可以通过激发和观测荧光蛋白的装置和其他个体区分出来；
5)上述3)和4)中的单倍体个体可以通过诱导染色体加倍技术，形成双单倍体(DH)；
6)上述5)中所述的双单倍体是可育的纯和子，可以作为自交系应用于玉米的杂交育种。
2.根据权利要求1所述的一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：其产生及筛选方法操作步骤如下：
步骤一、表达EGFP/Bt/Bar的转基因玉米父本(♂)与单倍体诱导系RWS母本(♀)杂交产生杂交一代F1；
步骤二、F1作为父本(♂)回交到单倍体诱导系RWS(♀)，产生回交一代BC1；
步骤三、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC1个体，
步骤四、以步骤三筛选的BC1个体为父本(♂)再次回交到单倍体诱导系RWS(♀)，产生回交二代BC2；
步骤五、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC2个体，
步骤六、以步骤五筛选的BC2个体为父本(♂)再次回交到RWS(♀)产生回交三代BC3；
步骤七、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3个体进行自交，产生BC3F1；
步骤八、筛选同时表达R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3F1个体进行自交，产生BC3F2，；
步骤九、筛选BC3F2中的纯和个体并进行繁殖，即为新的纯和单倍体 诱导系。
3.根据权利要求1所述的一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：该诱导系具有抗虫、抗除草剂的特点。
4.根据权利要求1所述的一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：以此诱导系为父本和被诱导玉米母本杂交所形成的种子表达抗虫基因，并具有抗虫的特性。
5.根据权利要求1所述的一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：以此新的单倍体诱导系为父本可以和任何玉米材料(自交系和杂交种)为母本杂交，诱导产生单倍体，并通过荧光蛋白基因的筛选标记进行单倍体的筛选。
6.根据权利要求1所述的一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：所述步骤中筛选荧光蛋白基因在种子幼根中的表达，其筛选工具可以使用荧光显微镜，荧光解剖镜，或在暗室中利用发射蓝色激发光的LED手电筒照射激发萌发种子胚根荧光来确定，荧光的观察可以在暗室中使用防紫外眼镜通过肉眼观察筛选。
7.根据权利要求1所述的一种新的玉米单倍体诱导系，其特征在于：上述诱导并筛选出的单倍体可以通过染色体加倍形成双单倍体。
8.一种新的玉米单倍体诱导系的应用，其特征在于：采用权利要求1--7所述的新的玉米单倍体诱导系所获得的玉米双单倍体应用于玉米遗传育种中。
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