CN108218939B

CN108218939B - 联苯核苷氨基磷酸酯化合物的新晶型及制备方法

Info

Publication number: CN108218939B
Application number: CN201711317525.8A
Authority: CN
Inventors: 赵立文; 储刚; 朱玉成; 张圣淼; 高毅平
Original assignee: Nanjing Huicheng Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Nanjing Huicheng Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN108218939A

Abstract

本发明涉及联苯核苷氨基磷酸酯化合物的新晶型及制备方法。具体地说，本发明涉及(S)‑2‑[[[(S)‑(1,1’‑联苯基‑4‑氧基)]‑[((2R,3R,4R,5R)‑5‑(2,4‑二氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑基)‑4‑氟‑3‑羟基‑4‑甲基四氢呋喃‑2‑基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯晶型与制备方法，所述晶型具有优异的抗病毒活性，对细胞的毒性小，可用于治疗黄病毒科病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染。

Description

联苯核苷氨基磷酸酯化合物的新晶型及制备方法

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及具有肝炎病毒抑制作用的联苯核苷氨基磷酸酯化合物的几种新晶型及其制备方法、包含所述晶型的组合物，以及所述晶型或其组合物在药物制备中的用途。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界范围内流行的疾病，全球慢性感染者已超过2亿，埃及的慢性感染率为15％，巴基斯坦为4.8％，中国为3.2％，位列世界前三。丙型肝炎病毒感染的临床表现多样，轻至炎症，重至肝硬化、肝癌。慢性丙型肝炎还可以并发某些肝外表现，包括类风湿性关节炎、干燥性结膜角膜炎、扁平苔藓、肾小球肾炎、混合型冷球蛋白血症、B细胞淋巴瘤和迟发性皮肤卟啉症等，可能是机体异常免疫反应所致。且丙肝肝硬化失代偿期时，可以出现各种并发症，如腹水腹腔感染，上消化道出血，肝性脑病，肝肾综合征，肝衰竭等表现。

HCV属于黄病毒科肝病毒属病毒，其与黄病毒科中的另外两个属即瘟病毒属和黄病毒属的基因结构相似。目前，治疗HCV感染的标准方法有干扰素以及干扰素和利巴韦林联合疗法。不过，仅50％的治疗者对该方法有反应，且干扰素具有明显的副作用，例如流行性感冒样症状、体重减低以及疲乏无力，而干扰素和利巴韦林联合疗法则产生相当大的副作用，包括溶血、贫血症和疲乏等。

另外，已开发的用于治疗HCV感染的药物包括蛋白酶抑制剂、噻唑烷衍生物、噻唑烷和N-苯甲酰苯胺、菲醌、解旋酶抑制剂、核苷聚合酶抑制剂和胶霉毒素、反义硫代磷酸酯寡核苷酸、依赖于IRES的翻译的抑制剂、核酶以及核苷类似物等。目前，核苷磷酸酯类化合物用于治疗黄病毒科病毒尤其是HCV感染是本领域的重要研发方向。

CN104031104A公开了一种如式1所示的新型核苷氨基磷酸酯化合物，其化学名称为(2S)-2-((([1,1'-联苯基]-4-基氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(以下简称“式1化合物”)，

CN104031104A报道了(2S)-2-((([1,1'-联苯]-4-基氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯具有优异的抗病毒活性，对细胞的毒性小，可用于治疗黄病毒科病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染。

手性药物的异构体及其不同形态具有不同的药效学、药代动力学和毒理学性质，因此，合成式1化合物的立体异构体及其各种形态，并对它们进行生物活性、毒性和副作用的研究，对于该类化合物的成药性研究具有重要的指导意义。

发明内容

第一方面，本发明提供式1a的化合物，其是式1化合物的立体异构体，化学名称为(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯(以下简称“式1a化合物”)，适合用于丙型肝炎病毒感染患者的治疗，

本发明的发明人使用CN105985355A中实验例1和2的方法测定式1a化合物对HCV1b和1a复制子的抑制活性，结果显示式1a化合物对HCV病毒具有明显优于式1化合物的抑制活性。

在对式1a化合物的晶型研究中，本发明的发明人发现多种晶型，其物理化学稳定性良好，适合制剂开发。

第二方面，本发明还提供一种(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯命名为B型晶型的晶型及其制备方法，所述的B型晶型具有良好的稳定性，适合制剂开发。

本发明提供的B型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为5.13°±0.2°、5.75°±0.2°、7.04°±0.2°、8.17°±0.2°、10.39°±0.2°处显示特征峰。

进一步地，本发明提供的B型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为5.13°±0.2°、5.75°±0.2°、7.04°±0.2°、8.17°±0.2°、10.39°±0.2°、15.43°±0.2°、16.84°±0.2°、17.15°±0.2°、17.80°±0.2°、18.24°±0.2°、20.01°±0.2°、20.37°±0.2°、20.99°±0.2°、25.48°±0.2°处显示特征峰。在一个具体的实施方案中，本发明的B型晶型的X-射线衍射图谱如图1所示。

本发明提供的B型晶型的制备方法，包括以下步骤：

1).将式1a化合物加入到选自以下的溶剂体系中：酯类，卤代烃，脂肪烃类化合物的单一或它们的混合体系，然后进行结晶；

2).过滤、洗涤并干燥；

所述溶剂优选为氯仿、乙酸乙酯、正庚烷中的一种或多种，结晶方法优选为悬浮搅拌法、高聚物诱导法等方法。干燥方法采用本领域常规的干燥步骤，例如真空干燥，或在室温下静置即可，真空干燥温度优选为20-40℃。

在一种方法中，采用悬浮搅拌法制备本发明的B型晶型，包括用有机溶剂处理式1a化合物制得悬浮液，搅拌后分离固体并干燥。优选地，所述的有机溶剂选自卤代烃、酯类或脂肪烃类中的一种或多种溶剂；更优选地，所述的有机溶剂选自氯仿正庚烷溶液或乙酸乙酯正庚烷溶液。优选地，将获得的悬浮液在15℃-60℃下搅拌后分离固体。在一个具体的实施方案中，所述的有机溶剂为体积比为1:2的氯仿正庚烷溶液。在另一个具体的实施方案中，所述的有机溶剂为体积比为1:2的乙酸乙酯正庚烷溶液。例如用体积比为1:2的氯仿正庚烷混合溶液，例如0.5mL，处理式1a化合物，例如15mg，制得悬浮液，然后室温下或者50℃下搅拌3天，离心分离固体，真空30℃干燥。

在另一种方法中，采用高聚物诱导法制备本发明的B型晶型，包括用良溶剂处理式1a化合物制得澄清溶液，加入高聚物，挥发，分离固体并干燥。在一些实施方案中，所述良溶剂为氯仿。在一些实施方案中，所述的高聚物为由聚己酸丙酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、海藻酸钠和羟乙基纤维素混合的混合物。在一个具体的实施方案中，所述的高聚物为由聚己酸丙酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、海藻酸钠和羟乙基纤维素等质量混合的混合物(高聚物A)。例如用氯仿，例如0.1mL，处理式1a化合物，例如15mg，制得澄清溶液后，加入高聚物A，例如2mg，使用扎有小孔的封口膜盖住，然后室温下放置13天，离心分离固体，真空25℃干燥。

第三方面，本发明提供一种(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯命名为C型晶型的晶型，所述的C型晶型具有良好的稳定性，适合制剂开发。

本发明提供的C型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为5.01°±0.2°、5.64°±0.2°、6.03°±0.2°、、9.97°±0.2、18.12°±0.2°处显示特征峰。

进一步地，本发明提供的C型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ约为5.01°±0.2°、5.64°±0.2°、6.03°±0.2°、9.97°±0.2°、17.24°±0.2°、18.12°±0.2°、19.88°±0.2°、24.77°±0.2°处显示特征峰。在一个具体的实施方案中，本发明的C型晶型的X-射线衍射图谱如图2所示。

本发明提供的C型晶型的制备方法，包括以下步骤：

1).将式1a化合物加入到选自以下的溶剂体系中：卤代烃，芳香类化合物的单一或它们的混合体系，然后进行结晶；

2).过滤、洗涤并干燥；

所述溶剂优选为二氯甲烷、氯仿、甲苯中的一种或多种溶剂；结晶方法优选为缓慢降温法等方法制备。干燥方法采用本领域常规的干燥步骤，例如真空干燥，或在室温下静置即可，真空干燥温度优选为20-50℃。

根据本发明的缓慢降温法，包括用氯仿甲苯溶液处理式1a化合物，40-60℃下搅拌，过滤，将滤液缓慢降温，分离所得固体并干燥。在一些具体的实施方案中，根据本发明的制备式1a化合物C型晶型的缓慢降温法，包括用体积比为1:3的氯仿甲苯溶液处理式1a化合物，约50℃下搅拌约2h后过滤，取滤液以约0.1℃/min的速度从约50℃降温至约5℃并在约5℃恒温，分离所得固体。例如用体积比为1:3的氯仿甲苯溶液，例如1.0mL，处理式1a化合物，例如30mg，50℃下搅拌2h后过滤，取滤液以0.1℃/min的速度从50℃降温至5℃并在5℃恒温，分离所得固体，30℃真空干燥。

第四方面，本发明提供一种(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯命名为D型晶型的晶型，所述的D型晶型具有良好的稳定性，适合制剂开发。

本发明提供的D型型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为4.97°±0.2°、5.65°±0.2°、8.00°±0.2°、16.58°±0.2°、16.92°±0.2°处显示特征峰。

进一步地，本发明提供的D型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为4.97°±0.2°、5.65°±0.2°、8.00°±0.2°、12.03°±0.2°、16.58°±0.2°、16.92°±0.2°、17.16°±0.2°、19.54°±0.2°、19.84°±0.2°处显示特征峰。在一个具体的实施方案中，本发明的D型晶型的X-射线衍射图谱如图3所示。

本发明提供的D型晶型的制备方法，包括以下步骤：

1).将式1a化合物加入到选自以下的溶剂体系中：醚类，芳香类化合物的单一或它们的混合体系，然后进行结晶；

2).过滤、洗涤并干燥；

所述溶剂优选为甲基叔丁基醚、***、甲苯中的一种或多种混合溶剂。结晶方法优选为反溶剂添加法、悬浮搅拌法、常温挥发法等方法制备。干燥方法采用本领域常规的干燥步骤，例如真空干燥，或在室温下静置即可，真空干燥温度优选为20-50℃。

在一种方法中，采用反溶剂添加法制备上述D型晶型，包括用良溶剂处理式1a化合物，完全溶解后加入反溶剂，搅拌，然后分离出析出的沉淀并干燥。优选地，在低温下搅拌，例如在2-10℃下搅拌。在一个具体的实施方案中，所述良溶剂为甲基叔丁基醚，所述反溶剂为甲苯。例如用甲基叔丁基醚，例如2.9mL，处理式1a化合物样品，例如15mg，固体完全溶解后，缓慢滴加甲苯，例如15.0mL，在5℃下搅拌，转移至室温下挥发，分离出析出的沉淀，35℃真空干燥。

在另一种方法中，采用悬浮搅拌法制备上述的D型晶型，包括用甲基叔丁基醚处理式1a化合物制得悬浮液，搅拌，然后分离固体并干燥。例如用甲基叔丁基醚，例如0.5mL，处理式1a化合物，例如15mg，制得悬浮液，然后室温下搅拌3天，离心分离固体，30℃真空干燥。

在另一种方法中，采用常温挥发法制备上述的式1a化合物的D型晶型，包括用甲基叔丁醚处理式1a化合物，得到澄清溶液，室温下缓慢挥发，分离所得固体并干燥。例如用甲基叔丁基醚，例如2.5mL，处理式1a化合物，例如15mg，完全溶解后的澄清溶液用扎孔的封口膜盖住，室温下放置14天，分离所得固体，40℃真空干燥。

第五方面，本发明提供一种(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯命名为E型晶型的晶型，所述的E型晶型具有良好的稳定性，适合制剂开发。

本发明提供的E型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为5.15°±0.2°、5.41°±0.2°、5.65°±0.2°、10.25°±0.2°处显示特征峰。

进一步地，本发明提供E型晶型，使用Cu-Ka辐射，其X-射线粉末衍射在衍射角2θ为5.15°±0.2°、5.41°±0.2°、5.65°±0.2°、10.25°±0.2°、20.12°±0.2°、20.84°±0.2°处显示特征峰。在一个具体的实施方案中，本发明的E型晶型的X-射线衍射图谱如图4所示。

本发明提供的式1a化合物E型晶型的制备方法，包括以下步骤：

2).过滤、洗涤并干燥；

所述溶剂优选为二氯甲烷、氯仿或正庚烷中的一种或多种溶剂。干燥方法采用本领域常规的干燥步骤，例如真空干燥，或在室温下静置即可，真空干燥温度优选为20-40℃。结晶方法优选为低温缓慢挥发方法制备。优选地，所述低温缓慢挥发方法是在2-10℃下进行挥发的。在一个具体的实施方案中，采用低温缓慢挥发法制备上述的式1a化合物的E型晶型，包括用体积比为4:1的二氯甲烷正庚烷溶液处理式1a化合物，完全溶解后，4℃下缓慢挥发，分离晶体，35℃真空干燥。

本发明提供的晶型可以为溶剂合物，例如可以为甲基叔丁基醚溶剂合物或正庚烷溶剂合物。

第六方面，本发明提供含有本发明的晶型与至少一种药学上可接受的载体形成的药用组合物。

本发明提供的药物组合物，其包含本发明的晶型以及药学上可接受的载体。例如，式1a化合物的晶型和药学上可接受的载体组成的药物组合物，将式1a化合物的晶型与药学上可接受的载体混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过口服，通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体。

第七方面，本发明提供本发明的晶型以及包含上述晶型与至少一种药学上可接受的载体形成的药用组合物用于治疗和/或预防病毒感染的方法以及在制备预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用。

本发明提供本发明的式1a化合物的晶型以及包含式1a化合物晶型的药物组合物用于预防和/或治疗病毒感染的方法以及在制备预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用，包括向病毒易感人群或病毒感染患者施用本发明的式1a化合物的晶型或包含式1a化合物晶型的药物组合物，以有效降低病毒感染发生率，改善病毒感染患者生活质量。在一些具体的实施方案中，所述病毒感染是肝炎病毒感染，例如丙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒混合感染。

为了帮助理解本申请公开的各种实施方案，提供以下说明：

本发明提供的晶型的制备方法中，对使用的式1a化合物的形态种类没有特别限定，可以是任意其他晶型、溶剂合物或无定型固体。

“式1a化合物的溶剂合物”，又称“式1a化合物的溶剂化物”，是式1a化合物与有机溶剂或水通过氢键、盐键相互作用而形成的物质。

“异构体”是指具有相同分子式但是在其原子的键合性质或键合顺序或其原子空间排列方面有区别的化合物。在其原子空间排列方面不同的异构体被称作“立体异构体”。彼此为非镜象的立体异构体被称作“非对映体”，彼此为不重叠镜像的那些被称作“对映体”。当化合物具有不对称中心时，例如，如果碳原子与四个不同基团键合时，可能存在一对对映体。对映体可以其不对称中心的绝对构型为特征并且通过Cahn和Prelog的R和S顺序规则进行描述，或通过其中分子使偏振光平面旋转并被指定为右旋或左旋(即，分别为(+)或(-)异构体)的方式进行描述。手性化合物可以单独的对映体存在或作为对映体的混合物存在。包含相等比例的对映体的混合物被称作“外消旋混合物”。

在这里需要特别说明的是，X-射线粉末衍射图谱对于特定的晶型具有特征性。判断是否与已知晶型相同时，应该注意的是峰的相对位置(即2θ)而不是它们的相对强度。这是由于谱图(尤其在低角度)的相对强度会因为晶体条件、粒径和其它测定条件的差异产生的优势取向效果而变化，衍射峰的相对强度对晶型的确定并非是特征性的。另外，本领域知道，用X射线衍射测定化合物的结晶时，由于测定的仪器或测定的条件等的影响，同一个晶型的2θ值可存在一定的测量误差，约为±0.2°，相对强度的测定误差可为±20％。因此，在确定每种结晶结构时，应该将此误差考虑在内。在XRD图谱中通常用2θ角或晶面距d值表示峰位置，两者之间具有简单的换算关系：d＝λ/2sinθ，其中d代表晶面间距d值，λ代表入射X射线的波长，θ为衍射角。还应特别指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，一条谱带也可能对给定的晶体是特征性的。

附图说明

图1是(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯B型晶型的X-射线衍射图。

图2是(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯C型晶型的X-射线衍射图。

图3是(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯D型晶型的X-射线衍射图。

图4是(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯E型晶型的X-射线衍射图。

图5是(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯正庚烷溶剂合物单晶的不对称结构单元示意图。

具体实施方式

以下实施例使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

实验所用的测试仪器

1.X-射线粉末衍射谱

仪器型号：PANalytical Empyrean X射线粉末衍射分析仪

X射线：Cu，kα，Kα1(

):1.540598；Kα2(

):1.544426；Kα2/Kα1强度比例:0.50X射线光管设定：45kV，40mA

发散狭缝：自动

单色器：无

扫描模式：连续

扫描范围：3°-40°2θ

步长：0.013°2θ

扫描时间：约4min

3.单晶X-射线衍射

仪器型号：Agilent Super单晶衍射仪

测试条件：铜靶，管压40kv，管流40mA。

实施例1：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的制备

步骤1(S)-2-[[(1,1'-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的合成

于50L玻璃反应釜中，氮气保护下，加入三氯氧磷(1.53kg,10mol)和二氯甲烷(10L)，搅拌，降温至-30℃以下。滴加三乙胺(1.01kg,10mol)的二氯甲烷(5L)溶液，滴加过程，保持内温低于-30℃。滴加完毕，缓慢滴加4-羟基联苯(1.7kg,10mol)的四氢呋喃(3.4L)溶液，滴毕搅拌30min。控制内温低于-30℃，加入L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.68kg,10mol)，滴加三乙胺(2.02kg,20mol)的二氯甲烷(8.0L)溶液，搅拌30min。升温至0℃左右，滴加五氟苯酚(1.84kg,10mol)，三乙胺(1.01kg,10mol)的二氯甲烷(7.0L)溶液，滴加过程中，反应放热升温，滴加完毕，內温升至室温，反应完全后，过滤，滤饼用二氯甲烷2.5L×4洗涤，合并滤液，将滤液用25L纯化水洗涤，分液，有机相减压浓缩，加入庚烷5L×2带溶剂，离心，真空干燥，称重，得类白色固体状标题化合物。

步骤2(S)-2-[[(S)-(1,1'-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的合成

于30L反应釜中，氮气保护下，加入(S)-2-[[(1,1’-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯(3.70kg,7.0mol)，甲基叔丁基醚(2.40kg)，正庚烷(9.0kg)，三乙胺(77g,0.7mol)，五氟苯酚(43g,0.21mol)，加热至40℃，强力机械搅拌。反应完全后，离心，真空干燥，得标题化合物。

步骤3(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的合成

于50L玻璃反应釜中，加入1-[(2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟甲基-3-甲基四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮成品(1.30kg,5.0mol)，四氢呋喃(15.6L)，搅拌，氮气保护，降温至-10℃以下。滴加叔丁基氯化镁溶液(8.0L,8.0mol)，滴毕，0～5℃继续反应1h。加入(S)-2-[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯成品(2.12kg,4.0mol)，滴加完毕，5～10℃反应，10～11h后取样，HPLC监控，反应完全后，降温至0℃以下，向反应液中加入2N盐酸(4.0L,8.0mol)淬灭反应。淬灭过程控制温度在0～10℃。滴加完毕，搅拌10min。减压浓缩，蒸干得固液残余物，加入乙酸乙酯(40.0L)，和纯化水(20.0L)，分液。向有机相中加入5％碳酸钠水溶液(10.0L)洗涤，然后水洗，过滤，旋干，再次加入二氯甲烷7.0L，浓缩，得油状发泡物，向油状发泡物中加入乙酸异丙酯(15.0L)，溶清后，降温，析出大量白色沉淀。降温，过滤，干燥滤饼。继续用乙酸异丙酯溶解，加热搅拌。加入活性炭，搅拌30min，趁热过滤，降温，过滤，干燥滤饼，得白色固体，纯度大于98％。

ESI-MS m/z:604.2[M+H]^-

¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:11.48(s,1H),7.67(d,2H),7.64-7.62(m,2H),7.59(d,1H),7.47(t,2H),7.37(t,1H),7.33(d,2H),6.04(d,1H),6.02(d,1H),5.83(d,1H),5.57(d,1H),4.89-4.84(m,1H),4.42-4.39(m,1H),4.29-4.24(m,1H),4.05-4.02(m,1H),3.88-3.82(m,2H),1.29-1.24(m,6H),1.16-1.15(m,6H)。

实施例2：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的构型确证

称取15mg式1a化合物于3mL小瓶中，加入5mL体积比为2：1的二氯甲烷/正庚烷的混合溶剂体系中，震荡得到的澄清溶液，用封口膜盖住小瓶并在上面扎孔，室温下放置6天，得到晶体。

将上述方法得到的单晶样品进行X-ray单晶衍射数据收集并解析其单晶结构。表1列出了式1a化合物正庚烷溶剂合物的单晶结构数据和结构精修参数。单晶结构解析确定了式1a化合物中的手性中心的绝对构型，即如图5所示，P1(S),C20(R),C21(R),C22(R)C24(R),C13(S)。其不对称结构单元中，包含两个式1a化合物分子和两个正庚烷分子。

表1：式1a化合物单晶结构数据表

实施例3：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯B型晶型的制备

方法1：称取15mg式1a化合物于1.5mL反应瓶中，加入2.5mL体积比为1:2的乙酸乙酯正庚烷溶液，室温下搅拌3天，分离出析出的沉淀，30℃真空干燥，制得B型晶型。

方法2：称取15mg实施例1制得的式1a化合物于3mL反应瓶中，加入0.1mL氯仿，溶解后加入2mg高聚物(由聚己酸丙酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、海藻酸钠和羟乙基纤维素等质量混合的混合物)，用封口膜盖住反应瓶并在上面扎孔3-4个，室温下挥发13天，分离出析出的沉淀，30℃真空干燥，制得B型晶型。

上述方法制备得到的B型晶型具有图1所示的X-射线衍射图，其峰值见表2。峰值强度取决于样品形态及粒度，且有所变化，其中低强度峰值(强度小于20％)在某些情况下可能不存在。

表2

实施例4：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯C型晶型的制备

称取30mg式1a化合物于3mL反应瓶中，加入1.0mL体积比为1:3的氯仿甲苯混合溶液，50℃下搅拌2h后过滤，取滤液以0.1℃/min的速度从50℃降温至5℃并在5℃恒温，分离所得固体，30℃真空干燥，制得C型晶型。

上述方法制备得到的C型晶型具有图2所示的X-射线衍射图，其峰值见表3。峰值强度取决于样品形态及粒度，且有所变化，其中低强度峰值(强度小于20％)在某些情况下可能不存在。

表3

2θ角(°)	强度(％)	2θ角(°)	强度(％)
				5.01	100	5.64	31.49
6.03	20.29	9.97	16.91
				11.03	6.33	14.96	11.61
16.56	11.22	16.77	11.52
				17.24	23.12	18.12	28.68
19.88	25.36	20.28	11.16
				21.56	5.89	22.16	7.18
23.09	4.66	24.77	10.84
				25.57	8.33	30.10	3.73。

实施例5：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯D型晶型的制备

方法1：称取15mg式1a化合物于20mL反应瓶中，加入2.9mL甲基叔丁基醚，溶解后缓慢滴加15.0mL甲苯，分离所得固体，30℃真空干燥，制得D型晶型。

方法2：称取15mg式1a化合物于1.5mL反应瓶中，加入0.5mL甲基叔丁基醚，室温下搅拌3天，分离所得固体，30℃真空干燥，制得D型晶型。

方法3：称取15mg式1a化合物于3mL反应瓶中，加入2.5mL甲基叔丁基醚，完全溶解后用封口膜盖住小瓶并扎孔3-4个，室温下挥发14天，分离所得固体30℃真空干燥，制得D型晶型。

上述方法制备得到的D型晶型具有图3所示的X-射线衍射图，其峰值见表4。峰值强度取决于样品形态及粒度，且有所变化，其中低强度峰值(强度小于20％)在某些情况下可能不存在。

表4

实施例6：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯E型晶型的制备

称取15mg式1a化合物于1.5mL反应瓶中，用1mL体积比为4:1的二氯甲烷正庚烷的混合溶液溶解，过滤，将滤液置于4℃缓慢挥发一周，分离所得固体，35℃真空干燥，制得E型晶型。

上述方法制备得到的E型晶型具有图4所示的X-射线衍射图，其峰值见表5。峰值强度取决于样品形态及粒度，且有所变化，其中低强度峰值(强度小于20％)在某些情况下可能不存在。

表5

实验例1本发明的化合物的抗HCV-1b复制子活性检测

参照中国专利申请CN105985355A公开的方法检测本发明的化合物抗HCV-1b复制子的活性。具体测试步骤见CN105985355A的实施例1，该篇专利申请以其全部内容引入本文作为参考。

如CN105985355A中所述，HCV 1b复制子细胞，即稳定转入HCV基因型1b复制子的Huh7细胞系，由药明康德(上海)新药开发有限公司提供。

以上实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用100％DMSO配制成10mM母液后，用含0.5％DMSO的完全培养液稀释至10μM，然后依次3倍稀释，共10个浓度。HCV-1b复制子细胞每孔接种8X10³个细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。实验重复三次。

实验结果显示，本发明的式1a化合物对HCV 1b复制子的EC₅₀值为0.036μM，明显优于式1化合物的EC₅₀值0.120μM。在测定浓度范围内，本发明的式1a化合物没有显示出细胞毒性，CC₅₀值大于最高检测浓度10μM。

实验例2本发明的化合物的抗HCV-1a复制子活性检测

参照中国专利申请CN105985355A实施例2的方法检测本发明的化合物抗HCV-1a复制子的活性。

如CN105985355A中所述，HCV 1a复制子细胞，即稳定转入HCV基因型1a复制子的Huh7细胞系，由药明康德(上海)新药开发有限公司提供。

以上实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用100％DMSO配制成10mM母液后，用含0.5％DMSO的完全培养液稀释至10μM，然后依次3倍稀释，共10个浓度。HCV-1a复制子细胞每孔接种8X10³个细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。实验重复三次。

实验结果显示，本发明的式1a化合物对HCV 1a复制子的EC₅₀值为0.01μM，明显优于式1化合物的EC₅₀值0.05μM。在测定浓度范围内，本发明的式1a化合物没有显示出细胞毒性，其对HCV 1a复制子的CC₅₀值＞10μM。

从以上实验可以看出，本发明的化合物对丙肝病毒1b亚型和1a亚型表现出良好的抑制活性，同时对宿主细胞具有非常低的毒性，有效性高，安全性好，适合用于治疗和/或预防与HCV感染相关的疾病。

实验例3：(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的四种晶型的稳定性测试

将式1a化合物的D、E型晶型各称取3份0.5g开口平铺于称量瓶中，分别敞口放置于25℃/60％相对湿度(RH)、40℃/75％相对湿度(RH)和80℃鼓风干燥箱中，考察含量和晶型的变化情况。D型晶型和E型晶型在25℃/60％相对湿度(RH)、40℃/75％相对湿度(RH)条件下放置1、3个月后，式1a化合物的D型晶型和E型晶型的含量均大于98.65％，纯度没有下降，晶型没有变化。将D型晶型和E型晶型放置80℃鼓风干燥箱中7天，D型晶型和E型晶型的纯度以及晶型均未发生变化。

将式1a化合物的B、C型晶型各称取1份0.5g开口平铺于称量瓶中，敞口放置于25℃/60％相对湿度(RH)，考察含量和晶型的变化情况。B型晶型和C型晶型在25℃/60％相对湿度(RH)条件下放置3天后，式1a化合物的B型晶型和C型晶型的含量均大于98.40％，纯度没有下降，且晶型也未发生变化。

实验表明，本发明的(S)-2-[[[(S)-(1,1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的B型晶型、C型晶型、D型晶型和E型晶型具有良好的化学稳定性和物理稳定性。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims

1.式1a化合物的B型晶型，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在5.13°±0.2°、5.75°±0.2°、7.04°±0.2°、8.17°±0.2°、10.39°±0.2°、15.43°±0.2°、16.84°±0.2°、17.15°±0.2°、17.80°±0.2°、18.24°±0.2°、20.01°±0.2°、20.37°±0.2°、20.99°±0.2°、25.48°±0.2°处有特征峰：