CN110090227A - 人羊膜上皮细胞在治疗移植物抗宿主病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人羊膜上皮细胞(hAECs)在治疗移植物抗宿主病(aGVHD)中的用途。本发明公开了使用有效剂量的羊膜上皮细胞或含有羊膜上皮细胞的细胞制剂单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善移植物抗宿主病的方法，可以采用静脉注射或者脊髓腔内注射的方法将羊膜上皮细胞给予患者，每次给予的剂量范围为大约10³‑10⁹细胞，能有效减轻aGVHD导致的炎症细胞对靶器官的浸润，同时也明显减轻了靶器官病变，同时还发现hAECs对多个白血病细胞系具有促凋亡作用，能够用于治疗移植物抗宿主病。

Description

人羊膜上皮细胞在治疗移植物抗宿主病中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人羊膜上皮细胞在治疗移植物抗宿主病中的用途。

背景技术

造血干细胞移植(Hematopoietie stem cell transplantation，HSCT)最早由美国科学家Thomas教授于20世纪50年代开始引入临床，经过几十年的发展，HSCT用于治疗大量的恶性血液***疾病以及代谢先天缺陷等，是现有惟一的肿瘤根治手段。

在造血移植中，移植物抗白血病(graft-versus-leukaemia，GVL)或移植物抗肿瘤(graft-versus-tumour，GVT)是其治疗癌症的主要机理。与此相对，造血干细胞移植后的主要并发症移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)，是移植后死亡的最主要原因，据统计，约50％接受造血移植的病人会出现GVHD症状，因此严重限制了这种重要疗法的普遍开展。

GVHD是一类影响多个器官***的免疫失调症，包括胃肠管道，肝，皮肤和肺，严重威胁到病人移植后的生活质量和生存时间。一般依据临床症状发生时间长短,GVHD可分为两类：急性GVHD(aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)。

GVHD的起因是：捐献者T细胞对接受者细胞上遗传决定性蛋白(主要是HLA人体白细胞抗原，组织相容性抗原)的应答导致的免疫反应，因此普遍的aGVHD的发病频率与HLA的不匹配水平直接相关。而理想的捐献者和接受者是HLA-A/B/C/DRB1全匹配。

GVHD发病可以概括为三个过程：一、抗原呈递细胞(APCs，antigen-presentingcells)的激活；二、捐献者T细胞的激活，增殖，分化以及迁移；三、靶器官的损伤。

从动物实验上看，T细胞在GVHD的发病上起核心作用。现有三种去除T细胞的策略：体外去除T细胞后进行移植；体外分选CD34+干细胞进行；体内通过抗体特异性去除T细胞。这些策略针对GVHD(无论aGVHD还是cGVHD)都显示了很好疗效，然而，不幸的是这些治疗方案却以高移植失败率、移植后感染和高复发率作为代价。此外防治GVHD的另一些主要方法是对接受者进行免疫抑制处理，如环孢菌素A(cyclosporin-A，CsA),霉酚酸酯/吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil,MMF),类固醇(steroids)等，但这些方案也同时减弱了GVL效应，结果显示增加了癌症复发概率。近年来，采用如Treg,调节性γδT细胞(γδTreg)、间充质干细胞(MSC)等细胞治疗方案，在实验动物和临床均显示了较好的疗效。

在T细胞各亚群中，CD4+亚群被广泛报道与GVHD密切相关,其四个主要亚群Th1，Th2，Th17和Treg之间的极化平衡对GVHD的发病率和病情严重程度的影响极大。在临床上，据报道称影响CD4+分化的根本原因是，移植时捐献者与接受者之间MHC和MiHA的配型程度。配型程度通过影响CD4+亚群极化进而影响CD4+和CD8+效应细胞，最终达到对GVHD甚至是GVL的调控。在作为一个炎症过程的急性GVHD中，检测发现CD4+往Th1极化。近年来研究新发现一类可以产量IL-17的CD4+细胞亚群，即Th17。后续小鼠疾病模型和临床研究发现其在急性GVHD中，对炎症起始以及组织损伤起到重要作用。而有研究显示，Th2在GVHD中，与肺损伤以及慢性GVHD相关。而在CD4+的4个主要亚群中，只有Treg从被鉴定之初到发现其与GVHD相关联，被广泛认为其对GVHD有抑制和改善功效,同时依然保留GVL的效能。综上，对CD4+亚群极化改变的研究显得格外重要。

由于供者选择优化、预处理方案改进、移植物抗宿主病(GVHD)预防方案的优化及支持治疗手段的提高，目前Allo-HSCT的临床应用已取得很大进步，但急性移植物抗宿主病(aGVHD)仍是移植后的主要死亡原因之一，亟需发展新的临床治疗方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有移植物抗宿主病治疗难题，提供新的治疗药物或方法。

一方面，本发明提供了一种利用人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelialcells，hAECs)在治疗移植物抗宿主病中的用途。

同种异体造血干细胞移植是现今治愈恶性白血病的唯一手段，但是移植物抗宿主病是造血干细胞移植主要的副作用，是限制造血干细胞移植的瓶颈。由于羊膜上皮细胞具有抑制淋巴细胞混合反应，抑制自身免疫性疾病以及抗实体瘤等特性，因此本申请发明人希望利用羊膜上皮细胞上述特点，探寻其是否对移植物抗宿主病具有治疗效应。

通过系列研究，发明人惊喜地发现，本发明所述的方法不仅减轻了aGVHD导致的炎症细胞对靶器官的浸润，同时也明显减轻了靶器官病变。同时还发现hAECs对多个白血病细胞系具有促凋亡作用。因此本申请发明人认为hAECs是治疗移植物抗宿主病的有效方法，可以作为该类疾病细胞治疗的候选来源，因此完成了本发明。

人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)是从胎盘上最靠近胎儿一侧的羊膜上分离而来的细胞。胎盘属于孕妇生产后的废弃物，故此来源的细胞不存在伦理问题。

胎盘在解剖学上，从内向外主要可分为三层组织结构:羊膜上皮层,绒毛膜(chorion),和子宫蜕膜(decidua)而每一层组织的来源却截然不同。子宫蜕膜来自母体，绒毛膜源自滋养层(trophoblast)，而羊膜上皮层来自受精后八天的上胚层(epiblast)，即与胚胎干细胞一样(embryonic stem cells，ESCs)都来源于胚胎内细胞团(inner cellmass)，而hAECs在分化为羊膜上皮后，能长期保持多潜能性。Miki等证实hAECs可以表达多能干细胞(如胚胎干细胞)主要的表面maker(如Oct4，Sox2，Nanog,SSEA-3,SSEA-4等),表明它具有胚胎干细胞所特有的向三个胚层组织分化的潜能。体外分化实验显示，无论从转录水平还是表达水平均显示hAECs具有体外三胚层分化潜能。然而与ESCs不同的是，hAECs体内成畸胎瘤实验却成阴性，主要原因是因为其无端粒酶活性，因此无法分化成具有三胚层分化的组织结构。也正因如此hAECs用作细胞治疗，不具有致瘤性(包括良性瘤、肉瘤和癌)。

此外，hAECs细胞表面几乎不表达MHCII型分子，不会引起炎症、过敏和免疫反应，因此免疫原性很低，适合移植细胞治疗。hAECs分离过程较为简单，在刮洗以后的羊膜上除了少量血液细胞团块几乎不存在其他类型细胞污染，而血液细胞在未受刺激的情况下属于悬浮细胞，因此可以通过细胞培养后，换液去除。根据发明人和国外科学家实验统计，每张人的羊膜约有8000万到3亿个hAECs细胞。在EGF存在的条件下，hAECs具有较强的增殖能力，约36小时可以增殖一个代次，并能在前代次(约10代内)保持旺盛的增殖能力。这些优势保证了本申请能够获取足够数量单一细胞类型,以满足临床治疗的要求。

除了干性，hAECs还有一类重要的性质就是免疫调节性。早在20世纪初叶，就开始陆续有研究人员尝试利用羊膜作为临时的移植材料替代患者自己的皮肤以修复损伤，并取得了很好的疗效。在这样的现象背后，研究者发现羊膜具有抗排斥和抑制伤口细菌滋生的作用，这提示羊膜可能具有某种免疫调节性。Ueta等人发现，羊膜具有抑制淋巴细胞混合反应的性质。之后Li等发现，羊膜的主要构成细胞hAECs自身可以分泌免疫抑制因子，其可抑制中性粒细胞和巨噬细胞的趋化性，并抑制T，B细胞受有丝***原刺激后的增殖。另有科学家报道，羊膜也可以致使IFNγ激活的巨噬细胞凋亡。最近发现，hAECs具有免疫调节性，可明显改善自身免疫性疾病病情。有趣的是，hAECs还具有抗癌的性质。Kang等发现hAECs在体外可以抑制乳腺癌细胞系的增殖，体内可以抑制裸鼠上乳腺癌瘤体的增大并延长小鼠的存活时间。最近发现通过对一系列实体瘤细胞系的实验发现，羊膜具有抑制多种实体瘤细胞系增殖。关于抑制肿瘤，现在主要认为hAECs是通过抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡两方面起作用。

综上，hAECs具有干性和低免疫原性，因此可以作为修复造血移植病人因辐照损伤的天然材料而不引起免疫反应，这可以帮助患者加速身体恢复。其具有免疫调节性，可以改善造血移植后最大副效应的GVHD。其具有抗菌性，可以在一定程度上帮助受移植者抵抗外来微生物侵袭，防止移植后感染。而其抗癌性，可以在治疗GVHD的同时，兼具GVL的功能。

因此，本发明首次将人羊膜上皮细胞hAECs应用于移植物抗宿主病的治疗中，并且具有良好的效果，为当前该类疾病的治疗提供了一种方案。

一方面，本发明公开了由人羊膜上皮细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善移植物抗宿主病的药物中的用途。使用有效剂量的人羊膜上皮细胞或其细胞制剂可单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善移植物抗宿主病。有效剂量是指足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

在本发明另一实施方案中，所述的具有移植物抗宿主病的动物是指哺乳动物。在更为优选的实施方案中，所述的动物为牛、马、羊、猴子、狗、大鼠、小鼠、兔子或人类。在最优选的实施方案中，所述的具有移植物抗宿主病的动物是指人类。

在发明的另一实施方案中，所述的细胞制剂包括人羊膜上皮细胞和药学可接受的载体。本发明所述的药学可接受的载体是指适合用于人和/或动物，无过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)的具有合适的有益/风险率的物质，例如药学可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂，有利于细胞存活，能递送所配制的细胞到人或动物。载体依合适地计划的给药方式而选择。本发明的载体包括但不限于各种生理缓冲液，如生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液或是全血清、脐带血清等。还可包括各种人工支架，包括但不限于明胶海绵、脱钙骨、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及它们的共聚物。

考虑到要治疗的疾病的类型，本领域的技术人员可以适当选择羊膜上皮细胞的合适状态：未经任何处理的收集的细胞(粗提部分)；部分纯化的细胞；纯化的细胞然后经培养扩增。

在发明的一个优选实施方案中，提供了一种从羊膜组织中分离羊膜上皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮细胞。

本发明所述的羊膜上皮细胞来源于人类。可从离体的人胎盘分离羊膜，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，机械剔除残留绒毛膜和血管。分离指的是从组织样品中移出细胞且与另外的组织分开。使用任何常规技术或方法从完整人羊膜上皮层组织分离出单细胞，这些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶(liberase)和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。

在本发明一个优选的实施方案中，人羊膜的获取应经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，通过机械分离得到整张羊膜。

在本发明另一个优选的实施方案中，可对步骤2中获得人羊膜上皮细胞继续培养，优选的培养条件为：以1×10⁶-1×10⁸个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。

本领域技术人员可用已知的其它方法将活性细胞群体浓缩。这些加工后洗涤/浓缩步骤可单独或同时施行。除了上述方法以外，还可在细胞洗涤后或培养后，进一步纯化或富集活性细胞群体，减少杂细胞和死细胞。分离悬浮液中的细胞可通过以下技术来实现：浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(FACS)或其它技术。这些不同技术以及进行这些技术的装置的实例可参见现有技术和上市商品。

对本发明使用的基础培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的培养基包括DMEM培养基和NPBM培养基。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括F-12、FCS和神经存活因子等。

在本发明的另一个优选实施方案中，向上面提到的基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。在这种情况下，可以加入一种或者两者都加入。上面提到的bFGF或EGF的举例浓度是1ng/ml至100ng/ml，优选的浓度为10ng/ml。对添加的时间和方法没有限制。优选地，在将上面提到的羊膜上皮细胞在基础培养基中培养时每天加入试剂。

可以采用任意适合的方法将羊膜上皮细胞给予患者，例如静脉注射或者脊髓腔内注射等。通常这些细胞是包含在药学上可接受的液体培养基中。细胞给予可以重复或连续进行(例如，通过连续灌输注入脑脊液中)。一般而言，多重给药方式通常要间隔至少7-10天分别使用。另外一种方法为将细胞种植在生物可吸收材料如明胶海绵里，采用手术将种有细胞的生物可吸收材料植入所需的部位。上述两种方法可结合应用，可取得更好的疗效。

羊膜上皮细胞的适合用量将根据患者的年龄、性别、体重、健康状况以及其它因素而改变。通常，每次给予的剂量范围为大约10³-10⁹细胞，典型的是大约10⁶-10⁷细胞。

在本发明的一些实施方案中，将羊膜上皮细胞与一种或多种药物一起施用给患者，所述的药物选自甲基强的松龙、环孢素、他克莫司、麦考酚酸酯、甲氨蝶呤、糖皮质激素、硫唑嘌呤、沙利度胺、抗T细胞单克隆抗体(抗CD3单抗)、抗白细胞介素-2受体的抗体等中的一种或其组合。

本发明使用有效剂量的羊膜上皮细胞或含有羊膜上皮细胞的细胞制剂单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善移植物抗宿主病。利用本发明的动物模型证明该方法能有效减轻aGVHD导致的炎症细胞对靶器官的浸润，同时也明显减轻了靶器官病变，同时还发现hAECs对多个白血病细胞系具有促凋亡作用，能够用于治疗移植物抗宿主病，在临床应用上将具有广泛的前景。本发明将人羊膜上皮细胞用于移植物抗宿主病的治疗，充分发挥了人羊膜上皮细胞的优点，其中人羊膜上皮细胞主要具有以下几个方面的优势：

(1)能长期保持多潜能性并具有胚胎干细胞所特有的向三个胚层组织分化的潜能；

(2)细胞表面几乎不表达MHCII型分子，因此不会引起炎症、过敏和免疫反应，移植配型要求也相应降低；

(3)具有调节体内和体外免疫反应的能力，在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白；

(4)具有低免疫原性，可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生；

(5)不表达端粒酶逆转录酶，没有致瘤性(包括良性瘤、肉瘤和癌)；

(6)具有较强的增殖能力，并能在前代次(约10代内)保持旺盛的增殖能力；

(7)来源广泛，取材容易，没有应用限制，不存在伦理问题。

附图说明

图1各组别中CD3和CD45占比图示

图2各组别小鼠外观图示

图3各组别小鼠体重随时间变化图示

图4各组别小鼠存活率随时间变化图示

图5流式细胞术显示各组别小鼠体内Th1，Th17及Treg占比图示。aGVHD＝PBMC组，aGVHD preventing＝PBMC+hAECs组,aGVHD treating＝PBMC+hAECs(Day7)组。

图6组织免疫荧光各组别小鼠内皮粘附分子表达图示

图7各组别小鼠靶器官切片HE染色图示

图8各组别小鼠器官病理评分图示

图9各组别小鼠肺部Masson染色图示

图10各组别小鼠主要aGVHD靶器官石蜡切片CD3(红棕色)免疫组化染色

图11 hAECs慢病毒感染图示

图12 hAECs在小鼠体内定位图示

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1原代羊膜上皮细胞分离及培养

1、人羊膜的来源

为了避免产道微生物污染，选用了剖腹产胎儿胎盘。由于足月后分娩信号刺激，羊膜会发生凋亡，因此宜用早产胎儿胎盘(38周以前)。经产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

2、hAECs的分离(全程要求无菌操作)

获取39周以前剖腹产婴儿胎盘，从胎盘内面剥离羊膜，将之浸入含有F12/DMEM(含1X青霉素-链霉素和两性霉素)基础培养基的离心管中。4℃冷链运送至实验室细胞间。

将羊膜取出，并将每张羊膜置于40ml CMF-HBSS(含1X青霉素-链霉素和两性霉素)中清洗去粘液，并用镊子刮去贴近绒毛膜层的间充质层及粘液，重复3次，每次洗涤均换新容器和新HBSS液。

将洗净的羊膜转入新容器，加10ml 0.05％胰酶/EDTA，颠倒30s，弃液。

将羊膜转入新容器，加20ml 0.05％胰酶/EDTA，37℃水浴孵育10min弃液。

羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。

初次消化后羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。

加入等体积消化终止液(F12/DMEM含5％FBS，1xL-谷氨酸，1x丙酮酸)，400g离心10min。弃液，用羊膜完全培养基：F12/DMEM含5％KSR(KnockOut Serum Replacement)，1xL-谷氨酰胺，1x丙酮酸,10ng/ml hEGF，1Xps(Penicillin-Streptomycin),重悬沉淀。

加入等体积消化终止液，400g离心10min。弃液，完全培养基重悬沉淀。

过100um筛，计数，以10⁵cells/cm2接种至培养皿或置于冻存液(90％FBS,10％DMSO)中液氮冻存备用。

3、hAECs的接种培养及冻存

细胞培养：接种1×10⁷个细胞后，待hAECs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm dish加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，300g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进-80℃冰箱，12h后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。

实施例2人外周血单个核细胞分离、培养及冻存

无菌抽取捐献者外周血至含抗凝剂的收集带中。

在50ml离心管中加入5ml的Ficoll液，用无菌巴氏吸管吸取血液轻柔滴加于Ficoll液上。

无离心加速度，室温400g离心30min，直至血液出现明显分层。

新巴氏吸管小心吸取分层中的白膜层，加入含有10ml的DPBS(含1xPS)中混合均匀。室温300g离心5min，弃液。

10ml的DPBS(含1xPS)重悬沉淀，室温300g离心5min，弃液。

用完全培养基(1640,10％FBS，PS)重悬备用，或用冻存液液重悬后冻存于液氮。

实施例3小鼠模型建立及aGVHD小鼠评分标准

1、NOD/SCID小鼠辐照损伤模型建立

自公司购买6～8周龄NOD/SCID小鼠移送至动物房饲养1周以适应环境。饮用水加入庆大霉素(32x10^4U/L)和红霉素(250mg/L)。

一周后小鼠用2.7Gray剂量的X射线进行全身性的亚致死剂量辐照。

次日经尾静脉向每只小鼠注射hAECs 2X10^6个每只小鼠。对照组则注射对应的体积的PBS。

2、NCG小鼠急性GVHD模型建立

自公司购买6～8周龄NCG小鼠移送至动物房饲养1周以适应环境。饮用水加入庆大霉素(32x10^4U/L)和红霉素(250mg/L)。

一周后经尾静脉向每只小鼠注射10^7个人外周血单个核细胞(PBMC)，疾病预防组则另外注射hAECs 2X10^6个每只小鼠。疾病治疗组则在注射完PBMC一周后，再每隔一天注射2X10^6个hAECs，每只小鼠共注射6x10^6个hAECs。对照组则注射对应的体积的PBS。

3、aGVHD小鼠评分标准

aGVHD小鼠临床表型评分标准(依据KR.Cook评分***,共10分，每隔一天观测一次。)

体重减轻：小鼠体重减轻小于10％认定为正常得0分；体重减轻在10％～25％之间得1分；减轻程度大于25％得2分。

姿态变化：小鼠姿态无异常认定为正常得0分；只在休息时呈弓背状态得1分；严重弓背以致于影响正常活动得2分。

毛发纹理变化：小鼠毛发纹理无异常认定为正常得0分；轻微皱褶得1分；严重皱褶得2分。

活动力：小鼠活动力正常得0分；活动力轻微减弱得1分；若无刺激则不活动得2分。

皮肤完整性：小鼠皮肤无异常认定为正常得0分；尾部或脚掌出现皮肤剥落得1分；皮肤出现明显剥落区域得2分

aGVHD小鼠器官病理评分标准(共4分)

肺：正常无病变认定为正常得0分；血管周有少量白细胞聚集得0.5分；血管周白细胞聚集程度为1-2细胞厚(涉及15％血管周)，得1分；血管周白细胞聚集程度为1-2细胞厚(涉及15％血管周)，并浸润到实质组织中，得1.5分；血管周白细胞聚集程度为2-3细胞厚(涉及15％血管周)，并浸润到实质组织中，得2分；血管周白细胞聚集程度为2-3细胞厚(涉及25％-50％血管周)，并浸润到实质组织中，得2.5分；血管周白细胞聚集程度为4-5细胞厚(涉及25％-50％血管周)，并浸润到实质组织中，得3分；血管周白细胞聚集程度为6-7细胞厚(涉及50％血管周)，并浸润到实质组织中，严重破坏组织正常结构得3.5分；血管周白细胞聚集程度为6-7细胞厚(涉及超过50％血管周)，并浸润到实质组织中，严重破坏组织正常结构得4分。

肠：正常无病变认定为正常得0分；偶尔出现引窝细胞坏死，极少炎症细胞浸润至粘膜下层及小肠绒毛，得0.5分；引窝细胞坏死达到15％，炎症细胞浸润到20％粘膜下层及小肠绒毛，得1分；引窝细胞坏死达到15％，炎症细胞浸润到3分之1粘膜下层及小肠绒毛，得1.5分；引窝细胞坏死达到25％，炎症细胞浸润到3分之1粘膜下层及小肠绒毛，得2分；引窝细胞坏死达到25％-50％，炎症细胞浸润到3分之1粘膜下层及小肠绒毛，得2.5分；引窝细胞坏死大于50％，炎症细胞浸润到3分之1粘膜下层及小肠绒毛，得3分；引窝细胞坏死大于50％，炎症细胞浸润到50％粘膜下层及小肠绒毛，得3.5分；引窝细胞坏死大于50％，炎症细胞浸润到大于50％粘膜下层及小肠绒毛，得4分。

脾：正常无病变认定为正常得0分；每平方毫米组织有10个坏死或凋亡细胞得1分；每平方毫米组织有10个坏死或凋亡细胞并偶有溶血，得1.5分；每平方毫米组织有10-20个坏死或凋亡细胞,偶有溶血并伴随组织结构损坏，得2分；每平方毫米组织有10-20个坏死或凋亡细胞,有溶血并伴随25％以下的组织结构损坏，得2.5分；每平方毫米组织有20-40个坏死或凋亡细胞,有溶血并伴随25％-50％的组织结构损坏，同时有低于25％组织纤维化，得3分；每平方毫米组织有20-40个坏死或凋亡细胞,有溶血并伴随50％的组织结构损坏，同时有25％-50％组织纤维化，得3.5分；组织大面积(大于50％)坏死或凋亡细胞,有溶血并伴随大于50％的组织结构损坏，同时有大于50％组织纤维化，得4分。

肝：正常无病变认定为正常得0分；病灶区实质组织聚集1-2个单个核细胞每0.5cm组织得1分；每0.5cm组织存在一条内皮炎血管，每条血管内皮下至少有2个炎症细胞浸润得2分；每0.5cm组织存在3条内皮炎血管，每条血管内皮下至少有3个炎症细胞深度浸润得3分；几乎所有血管均存在内皮炎，每条血管内皮下至少有3个炎症细胞深度浸润得4分。

实施例4 aGVHD小鼠模型实验分组

采用体内无成熟T细胞，B细胞，NK细胞的NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju小鼠(NCG mice)作为模型鼠，植入人外周血单个核细胞(PBMC)建立了人源化aGVHD小鼠模型。将实验分为四组：1.以PBMC单独移植组作为aGVHD疾病模型组；2.hAECs与PBMC同时移植作为aGVHD疾病预防组；3.先移植PBMC，一周后再移植hAECs作为aGVHD疾病治疗组；4.注射相应体积的培液作为空白对照组。

结果显示，在PBMC植入2周后，FACS结果表明在aGVHD模型鼠中，CD3和CD45(CD45分子在所有白细胞上都有表达并且嵌合率高达50％以上(图1)。而同时植入hAECs和一周后植入hAECs都未明显影响PBMC的植入(图1)。此外发现，植入的所有CD45+细胞几乎都共表达CD3(图1)。

在PBMC植入两周后，观察到单独植入PBMC的小鼠开始逐渐出现一系列aGVHD典型的临床表征：体重减轻，活动力下降，精神萎靡，严重弓背，脱毛，腹泻等，而同时共移植hAECs(即预防组)以后各项疾病表征均有非常明显地改善。而一周后移植hAECs的治疗组虽治疗效果不及预防组，但较之疾病组还是有较明显改观。然而在弓背，腹泻(这与后面组织染色一致)，活动力上治疗组与预防组相差不大(图2,图3)。发明人对此表型进行临床评分，结果预防组和治疗组与疾病组显示了明显差别。

hAECs的植入除了改善了疾病小鼠的生存质量，更重要的是延长了aGVHD小鼠的生存时间并明显提高了其生存率，同样预防组的效果要比治疗组更好(图4)。

实施例5流式细胞术

1、细胞表面标志物染色

如果样品为组织或血液细胞需要裂解红细胞。向管中细胞加入3ml红细胞裂解液(ACK)重悬细胞，冰上孵育5～20min。

向管中加入10ml细胞染色液(含2％FBS的PBS)以终止ACK裂解。350g室温离心5min，弃上清。如有需要，可加入ACK重复裂解一遍。

重复步骤2洗细胞一遍。

活细胞计数后，加细胞染色液调整细胞数浓度在5-10x10^6cells/ml，以每管100ul的细胞液分装到流式管中。

加入适量的有荧光标记偶联的一抗到备好的细胞悬液里。冰上避光孵育20-30min。

加入2ml的细胞染色液洗2次，350g室温离心，5min，弃上清。

加入0.5ml的Cell Staining Buffer重悬细胞，流式细胞仪分析。

2、胞内因子染色

收集刺激活化的细胞，这些细胞可以是体内刺激的组织，也可以是经体外刺激的培养细胞。在刺激过程的最后4-6小时，加入蛋白运输抑制剂brefeldin A或monensin，以抑制细胞因子分泌到胞外。根据需要分管染色。

在固定破膜和胞内染色之前，对活细胞进行表面染色。

在进行胞内染色之前，用Fixation Buffer固定细胞，每管0.5m l固定液，室温避光孵育固定20min。350g离心5minutes，弃上清。

如果有中止实验的需要，可在此步暂停保存，以备之后继续操作实验。用CellStaining Buffer洗一遍细胞，350g，离心5minutes，弃上清。Cell Staining Buffer重悬细胞，可在4℃短期保存。或者用90％FCS/10％DMSO在-80度较长期保存。

用Permeabilization Wash Buffer重悬固定的细胞，350g离心5-10minutes，弃上清。

重复步骤6。

100ul Permeabilization Wash Buffer重悬固定破膜后的细胞，加入特定的荧光标记抗体(抗体量根据说明书加)，室温避光20min。

用2ml Permeabilization Wash Buffer把细胞洗两遍。350g离心5minutes，弃上清。

用0.5ml Cell Staining Buffer重悬固定染色后的细胞，上流式细胞仪分析。

通过流式细胞术来研究hAECs转变T细胞亚群在体内分群并影响CD4+T细胞激活，通过流式细胞术来研究hAECs转变T细胞亚群在体内分群并影响CD4+T细胞激活，结果显示hAECs治疗后aGVHD小鼠中CD4+T细胞激活受抑制(图5-1)、Th1亚群比例降低(图5-2)、Treg亚群比例升高(图5-3)，但对Th17亚群(图5-4)和Th2亚群(图5-5)比例没有显著影响。上述结果显示hAECs通过抑制T细胞激活和转变T细胞各亚群比例而改善aGVHD。

实施例6免疫荧光

1、细胞免疫荧光

每孔细胞(24孔板)抽吸取培液，加入1ml PBS晃洗后弃液。

加入1ml 4％多聚甲醛(PBS稀释)，置于室温孵育30min。

弃液，并用PBS晃洗2次，弃液。

加入500ul 0.2％的Triton X-100(PBS稀释)室温孵育15min(若抗原为膜蛋白则跳过此步)。

弃液，并用PBS晃洗2次，弃液。

加入10％FBS(或3％山羊血清或2％马血清)封闭1～2h。

弃液，加入PBS后，放置于水平摇床60rpm室温洗5min重复3次

10％FBS或3％马血清稀释一抗，每孔加250ul。室温孵育1h(或4°过夜)。

弃液，加入500ul wash buffer，放置于水平摇床60rpm室温洗5min，共洗3次。

10％FBS或3％马血清稀释荧光偶联二抗，每孔加250ul。室温避光孵育1h。(此步开始后续所有步骤均避光操作。)

弃液，加入500ul wash buffer，放置于水平摇床60rpm室温洗5min，共洗3次。

加入PBS稀释的DAPI，每孔加250ul，室温孵育5min。

弃液，加入500ul wash buffer，放置于水平摇床60rpm室温洗5min，共洗2次。

弃液，每孔加入250ul PBS后镜检。若为细胞爬片，则将封片液滴加至盖玻片上，将爬片取出使细胞面朝向盖玻片放置，此步操作主要尽量不要产生气泡，如果产生气泡则用镊子小心将气泡挤出，镜检。

2、组织免疫荧光

组织自体内取出后，迅速置于用PBS中洗去血污，小心将组织切分为合适大小(注意不要用力捏取组织)。将组织置于装有冰冻切片包埋剂(OCT)的包埋盒中。将包埋盒置于干冰预冷的异戊烷中，直至OCT和组织完全冻结。

将包埋好的组织固定于冰冻切片机，切为0.5um的切片，并将切片贴于粘附性载玻片上。

切片染色前需室温放置30min，以使切片与玻片充分粘附。

将样品放于丙酮中，-20℃，固定10min(若组织在包埋前已固定，则直接进行后续操作)。

切片取出，用PBS洗3次，每次5min。

组织先用油性笔圈住，后在组织上滴加一抗(一抗用5％HBS+1％BSA的PBS稀释)，置于湿盒4℃过夜；

切片取出，用PBS洗3次，每次5min；

除去切片表明水分，滴加荧光偶联二抗(用5％HBS+1％BSA的PBS稀释)，置于湿盒室温避光孵育1h。(此步开始的后续操作均避光操作)

切片取出，用PBS洗3次，每次5min。

DAPI用PBS稀释后，滴加至切片上，室温孵育3min，后用PBS清洗2次，每次5min；

封片液封片，荧光显微镜镜检。

收取各实验组和对照组小鼠的胸主动脉，对其进行了冰冻切片以及粘附分子的免疫荧光染色。结果发现相比阴性对照组(即注射PBS组)，植入PBMC的aGVHD组其血管内皮上粘附分子I-CAM1和V-CAM1的表达明显升高，而和发明人预期的一样hAECs与PBMC共移植以后明显减弱了内皮I-CAM1和V-CAM1的表达(图6)。因此认为hAECs可以抑制内皮粘附分子表达从而减轻血管GVHD。

实施例7组织石蜡包埋及切片

组织经体内取出后，迅速置于10％***中清洗去血污。共清洗3次。

将组织置于10％***或4％PFA中室温固定。

捞出组织，经PBS清洗后，用70％乙醇室温脱水。

经乙醇梯度脱水后，置于二甲苯中透化。

透化好的组织经石蜡包埋，置于4℃凝固。

将石蜡块于切片机，依据不同实验需要切成5-10μm不等的切片。

经摊片，载玻片捞片，干燥诸步骤，获得石蜡切片成品。

实施例8 HE染色

将石蜡切片置于65℃环境1h以便脱蜡。

切片经三次二甲苯溶液脱蜡，依次浸泡10min，10min，5min。

将切片取出经100％乙醇5min、100％乙醇5min和95％乙醇2min进行水化。后经流水冲洗5min。

切片经苏木精染核5min，后流水冲洗5min去除多余染料。

将切片置于盐酸乙醇溶液浸泡2s进行分化，经流水冲洗5min。

稀氨水浸泡6s，流水冲洗5min，入95％乙醇4min。

切片经伊红染40s。

过95％乙醇2min、95％乙醇2min、100％乙醇4min、100％乙醇4min。

分别过二甲苯溶液，各5min，5min，5min。

用中性树脂封片后镜检。

结果显示，aGVHD模型组小鼠肝脏门静脉处出现了大面积内皮炎症病灶。肺部的肺泡出现炎症细胞浸润和内皮周围出现坏死节结。肾脏出现局部水肿。小肠中发现小肠绒毛钝化。而在PBMC与hAECs同时移植的预防组，发现肝脏内皮炎症病灶几乎消失。肺泡炎症细胞浸润明显减少，内皮周围的坏死面积明显减小。而肾脏和小肠未发现明显病变。而在PBMC移植一周后再植入hAECs的治疗组发现对肝脏，肺的病变的治疗虽不及预防组，但相比疾病组仍然明显减轻了病变程度(图7，图8)。发明人发现治疗组对于肾脏病理改变并无明显影响；而对小肠的改善作用与预防组一样明显，这与在临床上观察到的治疗组体重变化小以及无腹泻的症状是一致的(图2,图3)。

实施例9 Masson染色

将石蜡切片置于65℃环境1h以便脱蜡。

切片经三次二甲苯溶液脱蜡，依次浸泡10min，10min，5min。

将切片取出经100％乙醇5min、100％乙醇5min和95％乙醇2min进行水化。后经流水冲洗5min。

试剂A染核5min，流水冲洗5min。

切片放入65℃烘箱至玻片表面水分蒸发，切片表面发白即可。

切片水平放置在湿盒中，在切片上滴加试剂B覆盖标本，室温染10-20min。

向切片滴加试剂C，孵育3min，弃液，重复2次。

去除切片表面水分，滴加试剂D溶液孵育3-5min。

吸去试剂D，加试剂E孵育5-15s。

滴加试剂C水溶液，弃液，使染色清晰即可。

切片经乙醇梯度脱水、二甲苯透化、用中性树胶封片后镜检。

结果显示，aGVHD模型组出现大量阳性染色区域(蓝色)，这提示疾病组肺部可能出现了纤维化病变，而预防组阳性染色明显减少。意外的是，虽然治疗组肺部的HE染色和CD3免疫组化染色结果显示其病理改善不及预防组，然而在指示纤维化的Masson染色上，治疗组却明显好于预防组(图9，10)。

实施例10免疫组织化学染色

将石蜡切片置于65℃环境1h以便脱蜡。

切片经三次二甲苯溶液脱蜡，依次浸泡10min，10min，5min。

将切片取出经100％乙醇5min、100％乙醇5min和95％乙醇2min进行水化。后经流水冲洗5min。

将切片置于预热至98℃的抗原修复液中，98℃恒温孵育30min。

冷却至室温，切片经PBS室温浸洗5min。

切片滴加3％双氧水孵育10min。

用PBS清洗2min x 3次。

甩干切片，滴加一抗，4℃过夜孵育。用PBS清洗2min x 3次。

滴加试剂1，室温孵育20min，用PBS清洗2min x 3次。

滴加试剂2，室温孵育20min，用PBS清洗2min x 3次。

滴加DAB显色5-20min。

经流水冲洗5min、苏木精复染、乙醇梯度脱水、二甲苯透化以及用中性树脂封片后镜检。

实施例11 MACS分选

PBMC用培液重悬至10^7个细胞每100ul后装入无菌管，每100ul加入10ul抗体，冰上孵育15min。

重悬磁珠使之混匀，每100ul加入10ul磁珠，冰上孵育15min。

加入3ml MojoSort^TMBuffer与细胞混匀。

将细胞放置于磁铁吸附5min。

将液体倒出至收集管，用同体积培液混合，350g离5min。(如需提高回收率可以重复第3-5步)

弃液，用完全培养基重悬后培养或冻存。

实施例12 CFSE检测增殖

1mlCFDA SE标记液重悬10^6-5x10^6个细胞。

用CFDA SE标记液稀释CFDA SE储存液(1000X)至2X。

将1ml CFDA SE储存液(2X)加至1中，轻柔混匀，37℃孵育10min。

加入完全培养基(含血清)以终止反应，颠倒数下混匀。

300g离心5min，弃液。

加入10ml完全培养基重悬。

300g离心5min，弃液。

加入10ml完全培养基重悬，37℃孵育5min，以便促进CFDA SE在细胞内驻留以及未反应的CFDA SE进入完全细胞培养基。

300g离心5min，弃液。

根据需要培养标记好的细胞。

收取细胞，FACS检测细胞内平均荧光强度。

实施例13慢病毒感染及hAECs在靶器官中的定位

病毒相关各元件质粒以及载体质粒，经DH5α扩繁后，用endotoxin free质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。

接种293T至10cm盘长至约80％左右。

将病毒各质粒混均匀后，与水和钙转试剂混合，室温孵育2min。

将上述两种溶液摇晃均匀。

37℃培养过夜，换液并在合适时间收取病毒。

将病毒与适量polybrene混合后，加入目的细胞感染48-72h后，检测标签蛋白表达，以确定感染效率。

病毒感染的hAECs其形态较为正常，而绿色荧光显微镜照片则指示了高的感染效率(图11)。将带有GFP标记的hAECs单独或与PBMC共同植入到NCG小鼠体内，一周后取各小鼠器官，抽提mRNA并反转录为cDNA，以RT-PCR检测了GFP在各组织的表达情况，以此指示hAECs在各组织的定位情况。结果显示GFP在肾脏，肺，肝脏中高表达，而在小肠，脾，***中表达极低，在骨髓中几乎未发现表达。这提示hAECs主要定位在肾脏，肺，肝脏中(图12)。

本发明研究了人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)在移植物抗宿主病的治疗中的潜在能力并挖掘其治疗机理。结果显示，hAECs与PBMC共移植的预防组和治疗组对aGVHD较好的抑制效果，相比于疾病组显著改善了小鼠的临床表型和病理表型，同时明显提高了小鼠的生存率。

利用本发明的动物模型证明人羊膜上皮细胞能有效减轻aGVHD导致的炎症细胞对靶器官的浸润，同时也明显减轻了靶器官病变，同时还发现hAECs对多个白血病细胞系具有促凋亡作用，能够用于治疗移植物抗宿主病，在临床应用上将具有广泛的前景。

在此说明书中，本发明已参照特定的实施例作了描述，实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。本发明的说明是说明性的而非限制性的，本领域技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下轻易的做出改进和修饰，但这些改进和修饰也都落入本发明权利要求保护的范围内。

Claims (10)

1.人羊膜上皮细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善移植物抗宿主病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：使用有效剂量的人羊膜上皮细胞或其细胞制剂单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善移植物抗宿主病。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的羊膜上皮细胞的合适状态为未经任何处理的收集的细胞、部分纯化的细胞或者纯化的细胞然后经培养扩增。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：可以采用任意适合的方法将羊膜上皮细胞给予患者，例如静脉注射或者脊髓腔内注射等。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：细胞给予可以重复或连续进行，多重给药方式通常要间隔至少7-10天分别使用。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：羊膜上皮细胞每次给予的剂量范围为10³-10⁹细胞。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：将羊膜上皮细胞与一种或多种药物一起施用给患者，所述的药物选自甲基强的松龙、环孢素、他克莫司、麦考酚酸酯、甲氨蝶呤、糖皮质激素、硫唑嘌呤、沙利度胺、抗T细胞单克隆抗体(抗CD3单抗)、抗白细胞介素-2受体的抗体等中的一种或其组合。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于：所述的羊膜上皮细胞由包括以下步骤的方法制备得到：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮细胞。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：对步骤2中获得人羊膜上皮细胞继续培养，优选的培养条件为：以1×10⁶-1×10⁸个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：可在基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。