CN108148899A - 一种基因组简化与二代测序snp复合检测体系和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,包括如下步骤:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。本发明能够对基因组进行准确的测序。
Description
技术领域
本发明涉及基因组测序技术领域,尤其涉及一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法。
背景技术
DNA测序作为一种重要的实验技术,在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构(Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术,但是当时的操作流程复杂,没能形成规模。Sanger法因为既简便又快速,并经过后续的不断改良,成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展,传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点,454FLX的测序片段比较长,高质量的读长(read)能达到400bp;Solexa测序性价比最高,不仅机器的售价比其他两种低,而且运行成本也低,在数据量相同的情况下,成本只有454测序的1/10;SOLID测序的准确度高,原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%,是目前第二代测序技术中准确度最高的。为此,我们提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法。
发明内容
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,包括如下步骤:
S1:选取目标DNA,并利用内切酶对目标DNA进行酶切,以便获得目标DNA片段,完成后,将其置于零下10-零下2摄氏度的无菌储存箱内,备用;
S2:再次选取DNA模板,并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液,且DNA模板制备液需均匀涂抹,以保证反应的准确度;
S3:向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶,并在15-25摄氏度的环境下,能够将目标DNA片段末端进行修复,然后再次向其中添加碱基,并将其储存3-6h,然后备用;
S4:将S3中储存后的目标DNA片段取出,并在放置在15-25摄氏度的反应器皿内,并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接,从而获取的连接产物;
S5:将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内,并将目标DNA片段结合到扩增引物表面,然后将目标DNA片段进行扩增,从而能够形成扩增产物;
S6:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,以获取信号;
S7:将S6中释放的光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法,具体步骤如下:
A、选取动物细胞,并将动物细胞置于离心管或PCR管中,然后在50-60摄氏度的条件下保温10-13min;
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液,并实时进行晃动,且蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml;
C、在70-85摄氏度的条件下保温30-55min后,离心取上清,形成上清液,然后再次向上清液中添加DNA模板制备液,完成后,即得到DNA模板。
优选的,在S2中对目标DNA片段进行修复前,需要预先对目标DNA片段进行纯化,以保证目标DNA片段的干净度。
优选的,在S4中的甲基化引物序列为:
引物序列P1:CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2:ATCGATACGACGACGATCAG。
优选的,在S5中的扩增引物序列为:
引物序列P1:CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2:ACTGTACTGACGACGTTCGA,
引物序列P3:ACTGATCGGCATACAGTGCA。
本发明提出的一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,有益效果在于:该基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法能够对基因组进行准确的测序,在测序前,能够对基因组进行多次预处理,从而有效保证了测序的效率以及质量,通过多种酶的使用,能够将基因组序列显示在我们眼前,符合现在发展的需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,包括如下步骤:
S1:选取目标DNA,并利用内切酶对目标DNA进行酶切,以便获得目标DNA片段,完成后,将其置于零下10摄氏度的无菌储存箱内,备用;
S2:再次选取DNA模板,并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液,且DNA模板制备液需均匀涂抹,以保证反应的准确度;
S3:向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶,并在15摄氏度的环境下,能够将目标DNA片段末端进行修复,然后再次向其中添加碱基,并将其储存3h,然后备用;
S4:将S3中储存后的目标DNA片段取出,并在放置在15摄氏度的反应器皿内,并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接,从而获取的连接产物;
S5:将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内,并将目标DNA片段结合到扩增引物表面,然后将目标DNA片段进行扩增,从而能够形成扩增产物;
S6:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,以获取信号;
S7:将S6中释放的光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法,具体步骤如下:
A、选取动物细胞,并将动物细胞置于离心管或PCR管中,然后在50摄氏度的条件下保温10min;
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液,并实时进行晃动,且蛋白酶K终浓度为1.0mg/ml;
C、在70摄氏度的条件下保温30min后,离心取上清,形成上清液,然后再次向上清液中添加DNA模板制备液,完成后,即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前,需要预先对目标DNA片段进行纯化,以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为:
引物序列P1:CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2:ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为:
引物序列P1:CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2:ACTGTACTGACGACGTTCGA,
引物序列P3:ACTGATCGGCATACAGTGCA。
实施例2
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,包括如下步骤:
S1:选取目标DNA,并利用内切酶对目标DNA进行酶切,以便获得目标DNA片段,完成后,将其置于零下8摄氏度的无菌储存箱内,备用;
S2:再次选取DNA模板,并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液,且DNA模板制备液需均匀涂抹,以保证反应的准确度;
S3:向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶,并在18摄氏度的环境下,能够将目标DNA片段末端进行修复,然后再次向其中添加碱基,并将其储存4h,然后备用;
S4:将S3中储存后的目标DNA片段取出,并在放置在18摄氏度的反应器皿内,并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接,从而获取的连接产物;
S5:将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内,并将目标DNA片段结合到扩增引物表面,然后将目标DNA片段进行扩增,从而能够形成扩增产物;
S6:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,以获取信号;
S7:将S6中释放的光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法,具体步骤如下:
A、选取动物细胞,并将动物细胞置于离心管或PCR管中,然后在53摄氏度的条件下保温11min;
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液,并实时进行晃动,且蛋白酶K终浓度为1.0mg/ml;
C、在75摄氏度的条件下保温35min后,离心取上清,形成上清液,然后再次向上清液中添加DNA模板制备液,完成后,即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前,需要预先对目标DNA片段进行纯化,以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为:
引物序列P1:CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2:ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为:
引物序列P1:CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2:ACTGTACTGACGACGTTCGA,
引物序列P3:ACTGATCGGCATACAGTGCA。
实施例3
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,包括如下步骤:
S1:选取目标DNA,并利用内切酶对目标DNA进行酶切,以便获得目标DNA片段,完成后,将其置于零下6摄氏度的无菌储存箱内,备用;
S2:再次选取DNA模板,并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液,且DNA模板制备液需均匀涂抹,以保证反应的准确度;
S3:向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶,并在22摄氏度的环境下,能够将目标DNA片段末端进行修复,然后再次向其中添加碱基,并将其储存5h,然后备用;
S4:将S3中储存后的目标DNA片段取出,并在放置在22摄氏度的反应器皿内,并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接,从而获取的连接产物;
S5:将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内,并将目标DNA片段结合到扩增引物表面,然后将目标DNA片段进行扩增,从而能够形成扩增产物;
S6:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,以获取信号;
S7:将S6中释放的光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法,具体步骤如下:
A、选取动物细胞,并将动物细胞置于离心管或PCR管中,然后在57摄氏度的条件下保温12min;
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液,并实时进行晃动,且蛋白酶K终浓度为2.0mg/ml;
C、在80摄氏度的条件下保温45min后,离心取上清,形成上清液,然后再次向上清液中添加DNA模板制备液,完成后,即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前,需要预先对目标DNA片段进行纯化,以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为:
引物序列P1:CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2:ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为:
引物序列P1:CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2:ACTGTACTGACGACGTTCGA,
引物序列P3:ACTGATCGGCATACAGTGCA。
实施例4
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,包括如下步骤:
S1:选取目标DNA,并利用内切酶对目标DNA进行酶切,以便获得目标DNA片段,完成后,将其置于零下2摄氏度的无菌储存箱内,备用;
S2:再次选取DNA模板,并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液,且DNA模板制备液需均匀涂抹,以保证反应的准确度;
S3:向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶,并在25摄氏度的环境下,能够将目标DNA片段末端进行修复,然后再次向其中添加碱基,并将其储存6h,然后备用;
S4:将S3中储存后的目标DNA片段取出,并在放置在25摄氏度的反应器皿内,并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接,从而获取的连接产物;
S5:将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内,并将目标DNA片段结合到扩增引物表面,然后将目标DNA片段进行扩增,从而能够形成扩增产物;
S6:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,以获取信号;
S7:将S6中释放的光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法,具体步骤如下:
A、选取动物细胞,并将动物细胞置于离心管或PCR管中,然后在60摄氏度的条件下保温13min;
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液,并实时进行晃动,且蛋白酶K终浓度为3.0mg/ml;
C、在85摄氏度的条件下保温55min后,离心取上清,形成上清液,然后再次向上清液中添加DNA模板制备液,完成后,即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前,需要预先对目标DNA片段进行纯化,以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为:
引物序列P1:CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2:ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为:
引物序列P1:CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2:ACTGTACTGACGACGTTCGA,
引物序列P3:ACTGATCGGCATACAGTGCA。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:选取目标DNA,并利用内切酶对目标DNA进行酶切,以便获得目标DNA片段,完成后,将其置于零下10-零下2摄氏度的无菌储存箱内,备用;
S2:再次选取DNA模板,并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液,且DNA模板制备液需均匀涂抹,以保证反应的准确度;
S3:向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶,并在15-25摄氏度的环境下,能够将目标DNA片段末端进行修复,然后再次向其中添加碱基,并将其储存3-6h,然后备用;
S4:将S3中储存后的目标DNA片段取出,并在放置在15-25摄氏度的反应器皿内,并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接,从而获取的连接产物;
S5:将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内,并将目标DNA片段结合到扩增引物表面,然后将目标DNA片段进行扩增,从而能够形成扩增产物;
S6:将形成的扩增产物内添加底物,从而能够合成第一个碱基,并清除所有游离的碱基,在测序时,选取PTP平板,且PTP平板表面含有160万个光纤孔,光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物,然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板,假如发生碱基配对,会释放焦磷酸,焦磷酸在酶的作用下,形成氧化荧光素,同时释放光信号,以获取信号;
S7:将S6中释放的光信号,实时利用高灵敏度CCD捕获,碱基和PTP平板进行配对,然后捕获到一分子的光信号,由此一一对应,能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的DNA模板的制备方法,其特征在于:具体步骤如下:
A、选取动物细胞,并将动物细胞置于离心管或PCR管中,然后在50-60摄氏度的条件下保温10-13min;
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液,并实时进行晃动,且蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml;
C、在70-85摄氏度的条件下保温30-55min后,离心取上清,形成上清液,然后再次向上清液中添加DNA模板制备液,完成后,即得到DNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法,其特征在于:在S2中对目标DNA片段进行修复前,需要预先对目标DNA片段进行纯化,以保证目标DNA片段的干净度。
4.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法,其特征在于:在S4中的甲基化引物序列为:
引物序列P1:CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2:ATCGATACGACGACGATCAG。
5.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法,其特征在于:在S5中的扩增引物序列为:
引物序列P1:CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2:ACTGTACTGACGACGTTCGA,
引物序列P3:ACTGATCGGCATACAGTGCA。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180612 |
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