CN108148899A - 一种基因组简化与二代测序snp复合检测体系和检测方法 - Google Patents

一种基因组简化与二代测序snp复合检测体系和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，包括如下步骤：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。本发明能够对基因组进行准确的测序。

Description

一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法
技术领域
本发明涉及基因组测序技术领域，尤其涉及一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法。
背景技术
DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构(Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454FLX的测序片段比较长，高质量的读长(read)能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94％，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999％，是目前第二代测序技术中准确度最高的。为此，我们提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法。
发明内容
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，包括如下步骤：
S1：选取目标DNA，并利用内切酶对目标DNA进行酶切，以便获得目标DNA片段，完成后，将其置于零下10-零下2摄氏度的无菌储存箱内，备用；
S2：再次选取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液，且DNA模板制备液需均匀涂抹，以保证反应的准确度；
S3：向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶，并在15-25摄氏度的环境下，能够将目标DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存3-6h，然后备用；
S4：将S3中储存后的目标DNA片段取出，并在放置在15-25摄氏度的反应器皿内，并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接，从而获取的连接产物；
S5：将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内，并将目标DNA片段结合到扩增引物表面，然后将目标DNA片段进行扩增，从而能够形成扩增产物；
S6：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，以获取信号；
S7：将S6中释放的光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法，具体步骤如下：
A、选取动物细胞，并将动物细胞置于离心管或PCR管中，然后在50-60摄氏度的条件下保温10-13min；
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液，并实时进行晃动，且蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml；
C、在70-85摄氏度的条件下保温30-55min后，离心取上清，形成上清液，然后再次向上清液中添加DNA模板制备液，完成后，即得到DNA模板。
优选的，在S2中对目标DNA片段进行修复前，需要预先对目标DNA片段进行纯化，以保证目标DNA片段的干净度。
优选的，在S4中的甲基化引物序列为：
引物序列P1：CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2：ATCGATACGACGACGATCAG。
优选的，在S5中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2：ACTGTACTGACGACGTTCGA，
引物序列P3：ACTGATCGGCATACAGTGCA。
本发明提出的一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，有益效果在于：该基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法能够对基因组进行准确的测序，在测序前，能够对基因组进行多次预处理，从而有效保证了测序的效率以及质量，通过多种酶的使用，能够将基因组序列显示在我们眼前，符合现在发展的需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，包括如下步骤：
S1：选取目标DNA，并利用内切酶对目标DNA进行酶切，以便获得目标DNA片段，完成后，将其置于零下10摄氏度的无菌储存箱内，备用；
S2：再次选取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液，且DNA模板制备液需均匀涂抹，以保证反应的准确度；
S3：向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶，并在15摄氏度的环境下，能够将目标DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存3h，然后备用；
S4：将S3中储存后的目标DNA片段取出，并在放置在15摄氏度的反应器皿内，并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接，从而获取的连接产物；
S5：将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内，并将目标DNA片段结合到扩增引物表面，然后将目标DNA片段进行扩增，从而能够形成扩增产物；
S6：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，以获取信号；
S7：将S6中释放的光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法，具体步骤如下：
A、选取动物细胞，并将动物细胞置于离心管或PCR管中，然后在50摄氏度的条件下保温10min；
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液，并实时进行晃动，且蛋白酶K终浓度为1.0mg/ml；
C、在70摄氏度的条件下保温30min后，离心取上清，形成上清液，然后再次向上清液中添加DNA模板制备液，完成后，即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前，需要预先对目标DNA片段进行纯化，以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为：
引物序列P1：CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2：ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2：ACTGTACTGACGACGTTCGA，
引物序列P3：ACTGATCGGCATACAGTGCA。
实施例2
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，包括如下步骤：
S1：选取目标DNA，并利用内切酶对目标DNA进行酶切，以便获得目标DNA片段，完成后，将其置于零下8摄氏度的无菌储存箱内，备用；
S2：再次选取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液，且DNA模板制备液需均匀涂抹，以保证反应的准确度；
S3：向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶，并在18摄氏度的环境下，能够将目标DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存4h，然后备用；
S4：将S3中储存后的目标DNA片段取出，并在放置在18摄氏度的反应器皿内，并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接，从而获取的连接产物；
S5：将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内，并将目标DNA片段结合到扩增引物表面，然后将目标DNA片段进行扩增，从而能够形成扩增产物；
S6：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，以获取信号；
S7：将S6中释放的光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法，具体步骤如下：
A、选取动物细胞，并将动物细胞置于离心管或PCR管中，然后在53摄氏度的条件下保温11min；
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液，并实时进行晃动，且蛋白酶K终浓度为1.0mg/ml；
C、在75摄氏度的条件下保温35min后，离心取上清，形成上清液，然后再次向上清液中添加DNA模板制备液，完成后，即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前，需要预先对目标DNA片段进行纯化，以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为：
引物序列P1：CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2：ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2：ACTGTACTGACGACGTTCGA，
引物序列P3：ACTGATCGGCATACAGTGCA。
实施例3
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，包括如下步骤：
S1：选取目标DNA，并利用内切酶对目标DNA进行酶切，以便获得目标DNA片段，完成后，将其置于零下6摄氏度的无菌储存箱内，备用；
S2：再次选取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液，且DNA模板制备液需均匀涂抹，以保证反应的准确度；
S3：向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶，并在22摄氏度的环境下，能够将目标DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存5h，然后备用；
S4：将S3中储存后的目标DNA片段取出，并在放置在22摄氏度的反应器皿内，并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接，从而获取的连接产物；
S5：将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内，并将目标DNA片段结合到扩增引物表面，然后将目标DNA片段进行扩增，从而能够形成扩增产物；
S6：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，以获取信号；
S7：将S6中释放的光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法，具体步骤如下：
A、选取动物细胞，并将动物细胞置于离心管或PCR管中，然后在57摄氏度的条件下保温12min；
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液，并实时进行晃动，且蛋白酶K终浓度为2.0mg/ml；
C、在80摄氏度的条件下保温45min后，离心取上清，形成上清液，然后再次向上清液中添加DNA模板制备液，完成后，即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前，需要预先对目标DNA片段进行纯化，以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为：
引物序列P1：CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2：ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2：ACTGTACTGACGACGTTCGA，
引物序列P3：ACTGATCGGCATACAGTGCA。
实施例4
本发明提出了一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，包括如下步骤：
S1：选取目标DNA，并利用内切酶对目标DNA进行酶切，以便获得目标DNA片段，完成后，将其置于零下2摄氏度的无菌储存箱内，备用；
S2：再次选取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液，且DNA模板制备液需均匀涂抹，以保证反应的准确度；
S3：向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶，并在25摄氏度的环境下，能够将目标DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存6h，然后备用；
S4：将S3中储存后的目标DNA片段取出，并在放置在25摄氏度的反应器皿内，并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接，从而获取的连接产物；
S5：将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内，并将目标DNA片段结合到扩增引物表面，然后将目标DNA片段进行扩增，从而能够形成扩增产物；
S6：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，以获取信号；
S7：将S6中释放的光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
本发明还提出了一种DNA模板的制备方法，具体步骤如下：
A、选取动物细胞，并将动物细胞置于离心管或PCR管中，然后在60摄氏度的条件下保温13min；
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液，并实时进行晃动，且蛋白酶K终浓度为3.0mg/ml；
C、在85摄氏度的条件下保温55min后，离心取上清，形成上清液，然后再次向上清液中添加DNA模板制备液，完成后，即得到DNA模板。
在S2中对目标DNA片段进行修复前，需要预先对目标DNA片段进行纯化，以保证目标DNA片段的干净度。
在S4中的甲基化引物序列为：
引物序列P1：CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2：ATCGATACGACGACGATCAG。
在S5中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2：ACTGTACTGACGACGTTCGA，
引物序列P3：ACTGATCGGCATACAGTGCA。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：选取目标DNA，并利用内切酶对目标DNA进行酶切，以便获得目标DNA片段，完成后，将其置于零下10-零下2摄氏度的无菌储存箱内，备用；
S2：再次选取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制备液，且DNA模板制备液需均匀涂抹，以保证反应的准确度；
S3：向S1中处理的目标DNA片段内添加DNA修复酶，并在15-25摄氏度的环境下，能够将目标DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存3-6h，然后备用；
S4：将S3中储存后的目标DNA片段取出，并在放置在15-25摄氏度的反应器皿内，并将目标DNA片段分别与甲基化引物相连接，从而获取的连接产物；
S5：将S4中产生的连接产物置于S2中的DNA模板内，并将目标DNA片段结合到扩增引物表面，然后将目标DNA片段进行扩增，从而能够形成扩增产物；
S6：将形成的扩增产物内添加底物，从而能够合成第一个碱基，并清除所有游离的碱基，在测序时，选取PTP平板，且PTP平板表面含有160万个光纤孔，光纤孔内载有化学发光反应所需的各种酶以及底物，然后将碱基依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，假如发生碱基配对，会释放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化荧光素，同时释放光信号，以获取信号；
S7：将S6中释放的光信号，实时利用高灵敏度CCD捕获，碱基和PTP平板进行配对，然后捕获到一分子的光信号，由此一一对应，能够准确、快速的确定待测模板的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的DNA模板的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
A、选取动物细胞，并将动物细胞置于离心管或PCR管中，然后在50-60摄氏度的条件下保温10-13min；
B、然后向其中加入蛋白酶K溶液，并实时进行晃动，且蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml；
C、在70-85摄氏度的条件下保温30-55min后，离心取上清，形成上清液，然后再次向上清液中添加DNA模板制备液，完成后，即得到DNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种基因组简化与二代测序SNP复合检测体系和检测方法，其特征在于：在S2中对目标DNA片段进行修复前，需要预先对目标DNA片段进行纯化，以保证目标DNA片段的干净度。
4.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：在S4中的甲基化引物序列为：
引物序列P1：CTACGACGAGATGACATATT,
引物序列P2：ATCGATACGACGACGATCAG。
5.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：在S5中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CGACTACGAGATGTCATATC,
引物序列P2：ACTGTACTGACGACGTTCGA，
引物序列P3：ACTGATCGGCATACAGTGCA。
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