CN104694635A - 一种高通量简化基因组测序文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，用限制性内切酶对不同样品的基因组DNA酶切，获得5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；3’末端添加碱基A，将不同样品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有不同条形码序列的接头相连，连接产物PCR，扩增产物纯化、混合，再进行低循环PCR扩增，获得接头和接头二聚体比例大幅减少的目的片段扩增产物；再分离纯化，纯化产物构成高通量简化基因组测序文库。该方法的优点在于通量高、成本低，产生的文库测序质量高，在实现高通量SNP检测及标记开发、遗传图谱绘制、功能基因定位等研究中具有非常广阔的应用前景。

Description

一种高通量简化基因组测序文库的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高通量简化基因组测序文库的构建方法。

背景技术

随着二代测序技术，特别是Illumina测序平台的发展和不断升级，群体遗传学研究发生了革命性的变化，利用二代测序可以获得数十万甚至是数百万的SNPs信息，越来越多重要经济动物和经济作物定位到与重要经济性状紧密关联的候选区域。当前，可用于群体遗传学研究的二代测序文库构建方法主要有全基因重测序(WGR，Whole genomeresequencing)、RAD-Seq(Restriction-site-association DNA sequencing)、GBS(Genotyping-by-Sequencing)等，然而，这些方法各自存在着不同的问题，例如，WGR需要有较高质量的参考基因组序列且建库成本高；RAD-seq虽然可用于没有参考基因组的物种，但基因组DNA用量大、流程复杂且测序质量差，有将近一半的原始数据会因为测序错误而被丢弃；GBS虽然步骤相对简单，但只能收集短的酶切片段且酶切片段偏少。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量简化基因组测序文库构建方法。

本发明提供的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括以下步骤：

(1)用限制性内切酶分别对不同样品的基因组DNA进行酶切，获得5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；

(2)分别对不同样品的5’磷酸化平末端DNA片段的3’末端添加碱基A，获得具有粘性末端A的DNA片段；

(3)分别将不同样品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有可以区分样品的唯一条形码序列的接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；

(4)含有不同条形码的连接产物进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，纯化，定量，根据实际需要将其混合；进行琼脂糖凝胶分离纯化，获得特定长度的片段；

(5)对特定长度片段进行低循环PCR扩增，获得接头和接头二聚体比例大幅减少的目的片段扩增产物；进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成高通量简化基因组测序文库。本发明构建方法流程图见图11。

本发明方法中，步骤(1)所述的基因组DNA浓度为20～100ng/μL。所述基因组DNA是经过琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计法检测后再进行稀释的。

所述限制性内切酶是一种或多种平末端限制性内切酶，其酶切产生的限制性片段是具有5’末端磷酸化修饰的平末端DNA片段。

本发明的高通量简化基因组测序文库的构建方法中，步骤(3)接头的序列含有8碱基条形码序列的正链和8碱基条形码序列的负链。

所述接头的序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

负链：

P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACYYYYYYYYATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；

其中：正链中的XXXXXXXX代表正链条形码序列，负链中的YYYYYYYY代表负链条形码序列。

上述正、负链的条形码序列是A、T、C、G四种碱基的随机组合，可以根据本领域技术人员的实际需要进行设计；正、负链的条形码序列需同时使用来区分样品，即区分样品的识别序列为：YYYYYYYYXXXXXXXX。本申请实施例中所用的正、负链条形码序列见下表1，在具体使用过程中，依据16个碱基中有3个碱基测序错误仍能正确区分样品的原则进行两两随机组合。

表1

本发明方法中，步骤(4)和步骤(5)中，PCR扩增所用的引物序列为：

引物序列P1：CAAGCAGAAGACGGCATACG

引物序列P2：AATGATACGGCGACCACCGA。

本发明方法的步骤(4)和步骤(5)中，纯化后扩增产物的定量检测方法可以是紫外分光光度计法、核酸荧光定量法、琼脂糖凝胶电泳检测。

步骤(4)的特地长度的片段是指350～650bp的DNA片段。

步骤(4)的PCR扩增的条件为：98℃3min；98℃10s，65℃30s，72℃30s，18个循环；72℃5min。

本发明方法中，步骤(5)中的减少接头和接头二聚体比例的方法是磁珠法纯化PCR扩增产物和对低循环PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶分离纯化。

本发明利用平末端限制性内切酶酶切DNA可以产生5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段。具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有不同条形码序列的接头相连可以获得区分样品来源的连接产物。由于在整个文库构建流程中PCR前不需要纯化，即酶切反应、加A反应、连接反应、PCR均不涉及片段随机丢失，保证了个体间测序片段较好的均一性。磁珠法纯化含有不同条形码序列的PCR扩增产物可以去除大部分接头二聚体序列，减少了接头二聚体对样品混合前定量准确性的影响。低循环PCR扩增产物切胶可以进一步减少接头和接头二聚体的比例。

与WGR和RAD-Seq方法相比，大大简化了文库构建流程，该方法不需要DNA片段的随机打断及末端修复等步骤，高度简化了文库准备步骤；与GBS方法相比，该方法仅需一套barcode-adapter体系，而不用GBS方法中所使用的两套adapters体系(barcode-adapter和Common-adapter)；与RAD-Seq和GBS相比，该方法最大的优势在于测序reads几乎可以全长使用，除了5’端前两个或前三个碱基为已知的酶切位点碱基，其余碱基序列都可用于开发SNP标记。本发明的测序文库通量高、成本低，产生的文库测序质量高，在实现高通量SNP检测及标记开发、遗传图谱绘制、功能基因定位等研究中具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1部分样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，图中每个泳道对应的数字(214、215……324等)分别代表对应的样品编号。

图2为实施例1部分样品PCR纯化产物琼脂糖凝胶电泳图，图中每个泳道对应的数字(214、215……324等)分别代表对应的样品编号。

图3为实施例1混合PCR纯化产物切胶前电泳图。

图4为实施例1混合PCR纯化产物切胶后电泳图。

图5为实施例1低循环PCR产物切胶前电泳图。

图6为实施例1低循环PCR产物切胶后电泳图。

图7为实施例1文库质量控制检测图。

图8为实施例1测序产生的reads碱基质量得分(Quality score)图。

图9为实施例2所有样品测序产生的reads碱基质量得分≧30(Q30)的百分比统计图。

图10为实施例2每个样品测序reads中带有接头的reads比例。

图11为本发明高通量简化基因组测序文库构建方法流程图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所用的生化试剂均为市售。

实施例1梅F1群体遗传图谱的高通量简化基因组测序文库构建

选择梅(Prunus mune)F1群体387个子代及其两个亲本为实验材料，高通量简化基因组测序文库构建包括如下步骤：

第1步：梅F1群体387个子代及其两个亲本基因组DNA被稀释成50ng/μL备用；基因组DNA片段化：利用平末端限制性内切酶HaeIII和Hpy166II对稀释的基因组DNA进行酶切，酶切反应体系为：

混合体系置于37℃恒温水浴孵育5小时。

第2步：向第1步酶切反应产物中补加产生3’末端粘性A末端所需的反应试剂，包括：

混合体系置于37℃恒温水浴孵育30min。

第3步：步骤2的加A反应产物中补加接头连接所需的反应试剂，包括：

混合体系置于20℃恒温金属浴孵育30min，65℃失活20min。

向连接产物中补加100μL ddH₂O。

本实施例的带有条形码的接头序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

负链：

P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACYYYYYYYYATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；

其中：正链中的XXXXXXXX代表正链条形码序列，负链中的YYYYYYYY代表负链条形码序列。正、负链条形码选择表1中X和Y对应的任意一条条形码。

第4步以上述连接产物为模板，在96孔板中对各样品进行PCR扩增，包括：

引物P1：CAAGCAGAAGACGGCATACG

引物P2：AATGATACGGCGACCACCGA。

PCR扩增循环条件为：98℃3min；98℃10s，65℃30s，72℃30s，18个循环；72℃5min。

取6μL PCR产物进行琼脂糖凝胶(1.8％)电泳检测，如图1所示。

PCR产物磁珠纯化及检测，包括：

1)取20μL PCR产物转入新的96孔板中，加入20μL AMPure XP磁珠，吹打混匀，室温静置5分钟。

2)磁力架上静置5分钟，轻轻吸弃上清。

3)加入100μL 80％乙醇缓慢吹吸清洗磁珠，磁力架上静置5分钟，轻轻吸弃上清。

4)重复步骤3)，这一步要将残留的乙醇吸干净。

5)室温静置5分钟使乙醇尽量挥发干净。

6)加入17μL Tris-HCl缓冲液，充分吹吸混匀，室温静置5分钟。

7)磁力架上静置5分钟，将上清转入一个新的96孔板中。

8)取3.5μL纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2；取1.5μL纯化产物进行Nanodrop定量。

PCR纯化产物混合及切胶选片段，包括：

1)2个亲本和384个子代的PCR纯化产物按照10∶3的质量比进行混合。

2)取600ng混合PCR纯化产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳分离(如图3)，切取350bp-430bp的片段(如图4)。

3)QIAquick Gel Extraction Kit纯化切胶片段，35μL Elution Buffer洗脱。

第5步低循环PCR扩增及二次切胶纯化，包括：

1)以上述胶纯化片段产物为模板，进行低循环PCR扩增，包括：

PCR扩增循环条件为：

2)低循环PCR产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳分离(如图5)，切取350bp-430bp的片段(如图6)。

3)MinElute Gel Extraction Kit纯化切胶片段，30μL Elution Buffer洗脱，获得最终测序文库。

文库质量控制

将第5步中获得的测序文库在Agilent 2100 Bioanalyzer上进行质量检测，检测结果如图7所示，片段范围基本符合350～430bp范围，由于琼脂糖凝胶电泳分辨率相对较低，在两翼出现轻微延伸为正常结果。

测序将通过质检的文库稀释成适当浓度进行测序，测序平台为Illumina HighSeq2500，测序长度为双端101bp，测序产生的Reads碱基质量得分(Quality score)图见图8；碱基质量得分是衡量测序质量的重要指标，质量得分越高代表碱基被测错的概率越小，纵坐标质量得分20和30分别代表碱基被测错的概率为1％和1‰；如图8所示，每个位置质量得分超过30(即被测错的概率低于1‰)的碱基都占绝对优势。

实施例2亚麻遗传图图谱的高通量简化基因组测序文库构建

本实施例选择亚麻F2群体115个子代及其两个亲本为实验材料，按照实施例1中第1步稀释基因组DNA；基因组DNA片段用RsaI和HaeIII双酶切，反应体系与实施例1相同；按照实施例1中第2步进行3’末端加A；按照实施例1中第3步给每个样品连接带有条形码的接头；按照实施例1中第4步进行PCR反应(PCR反应的引物和条件同实施例1)；纯化PCR产物并检测；2个亲本和115个子代的PCR纯化产物按照40∶8的质量比进行混合及切胶选片段，选择450-550bp的片段；按照实施例1中第5步进行低循环PCR扩增及二次切胶纯化；文库质量控制与测序参见实施例1对应的方法。

测序结果显示，所有样品共产生252.86M条原始reads，其中，质量得分≧20(Q20)的碱基占91.26％，质量得分≧30(Q30)的碱基占85.32％；所有样品测序产生的reads碱基质量得分≧30(Q30)的百分比统计如图9所示，从中可以看出所有样品的Q30都大于83％，大部分样品(约80％)的Q30大于85％，图10显示了每个样品测序reads中带有接头的reads比例，从中可以看出99.15％的样品有接头的reads比例小于4％，最多不超过5.2％，由此可以看出本文库构建方法可产生高质量的测序结果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括以下步骤：

(1)用限制性内切酶分别对不同样品的基因组DNA进行酶切，获得5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；

(2)分别对不同样品的5’磷酸化平末端DNA片段的3’末端添加碱基A，获得具有粘性末端A的DNA片段；

(3)分别将不同样品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有可以区分样品的唯一条形码序列的接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；

(4)含有不同条形码的连接产物进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，纯化，定量，根据实际需要将其混合；进行琼脂糖凝胶分离纯化，获得特定长度的片段；

(5)对特定长度片段进行低循环PCR扩增，获得接头和接头二聚体比例大幅减少的目的片段扩增产物；进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成高通量简化基因组测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的基因组DNA浓度为20～100ng/μL。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述限制性内切酶是一种或多种平末端限制性内切酶，其酶切产生的限制性片段是具有5’末端磷酸化修饰的平末端DNA片段。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)接头的序列含有8碱基条形码序列的正链和8碱基条形码序列的负链。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述接头的序列为：

正链：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXAC

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

负链：

P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACYYYY

YYYYATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；

其中：正链中的XXXXXXXX代表正链条形码序列，负链中的YYYYYYYY代表负链条形码序列。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，正链条形码序列XXXXXXXX和负链条形码序列YYYYYYYY选择以下对应的任意一个条形码：

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)中，PCR扩增所用的引物序列为：

引物序列P1：CAAGCAGAAGACGGCATACG

引物序列P2：AATGATACGGCGACCACCGA。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，纯化后扩增产物的定量检测方法可以是紫外分光光度计法、核酸荧光定量法、琼脂糖凝胶电泳检测。

9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，减少接头和接头二聚体比例的方法是磁珠法纯化PCR扩增产物和对低循环PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶分离纯化。

10.根据权利要求1或9所述的，其特征在于，所述的低循环PCR扩增反应所用的循环数不超过8个。