CN108138137A - 增强的脐带来源的粘着干细胞、其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开的是增强的脐带来源的粘附干细胞、其制备方法及其用途。所述增强的脐带来源的粘附干细胞具有抗炎效应、血管再生效应或神经再生效应，从而可用于治疗或预防各种疾病的药物组合物或细胞治疗剂。

Description

增强的脐带来源的粘着干细胞、其制备方法及其用途
发明领域
本公开涉及增强的脐带来源的粘附干细胞、其制备方法及其用途。
发明背景
细胞治疗剂是用于预防或治疗特定疾病目的的药物，所述预防或治疗通过离体增殖或选择细胞的方法来改变细胞的特征以恢复细胞和组织功能进行，并且最近已经在难治性疾病和再生药物领域受到了很多关注。细胞治疗剂可根据分化程度分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂，并且干细胞治疗剂可分为胚胎干细胞治疗剂和成体干细胞治疗剂。
到目前为止，大多数关于成体干细胞的研究都是在骨髓中进行的。在一些情况下，培养和施用从脂肪组织或脐带血分离的干细胞。然而，通过侵入性方法从骨髓和脂肪组织收集干细胞，并且从成年或衰老患者中分离的干细胞具有降低的分化和增殖能力。脐带血虽然易于收集，但脐带血中干细胞的含量较低。
与骨髓或脂肪来源的细胞不同，脐带(UC)是非侵入性的且易于提取，因为它是从已经从身体分离的组织中提取的。与胚胎干细胞不同，UC不存在道德问题。最近，UC作为难治性或再生医学的有用材料受到了很多关注。由于UC来源的细胞是同时满足增殖和分化能力的原始细胞，优势在于它们可以用于器官再生，并还可以根据器官特征在分化后使用。然而，UC是存在许多不同类型细胞的组织，并因此，需要进行研究以找出作为治疗剂的最佳细胞，并以展示可作为同质细胞群分离或提取的细胞的新特征。
发明概述
一方面提供了增强的脐带来源的粘附干细胞或其细胞群。
另一方面提供了制备增强的脐带来源的粘附干细胞的方法，所述方法包括在培养板中贴壁培养分离的脐带；通过将培养的脐带与解离酶接触来分离增强的脐带来源的粘附干细胞；和在含有成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)和肝素的培养基中传代培养所述分离的增强的脐带来源的粘附干细胞。
另一方面提供了药物组合物，其包含增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
技术问题
技术方案
一方面提供了增强的脐带来源的粘附干细胞。
所述增强的脐带来源的粘附干细胞可具有选自以下(a)至(e)的一个或多个特征：
a)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33；
b)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1；
c)在传代培养过程中维持粘附成纤维细胞的形态；
d)具有分化为脂肪细胞、骨细胞，或软骨细胞的能力，和
e)具有一种或多种选自下组的表面抗原特征：CD200+、Tra-1-60-、CD3-、CD1a-、CD11c-、CD16-、CD86-、CD8a-、CD40-、CD141+、CD61+、CD87+、MIC A/B-，和SSEA4+。
所述增强的脐带来源的粘附干细胞还可具有一个或多个选自以下(f)至(i)的特征：
f)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：S100A10、BNIP3、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3；
g)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：IL8、ALDH1A1、DLC1、CTHRC1，和CPA4；
h)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：SNCA、DSG2、NRP2，和PLAT；和
i)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：TPMT、NAGK，和ANXA4。
e)增强的脐带来源的粘附干细胞的表面抗原特征还可以包含Oct4-或Nanog-。此外，e)表面抗原特征的CD61+可以是缺氧条件下过表达的表面抗原特征。
如本文所用，术语“脐带”指连接母亲和腹部以使哺乳动物胎儿在胎盘中生长的管，并且通常是指由三个容器组成的组织，即由脐带胶质包围的两根脐动脉和一根脐静脉。因此，本公开中，“增强的脐带来源的粘附干细胞(增强的脐带粘附干细胞)”或“脐带来源的粘附干细胞(脐带粘附干细胞)”指源自脐带或脐带的脐带胶质组织的细胞并具有分化为多种不同的细胞和在培养板表面上粘附生长特性的能力。
本发明中提供的至少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％，或约99％的增强的脐带来源的粘附干细胞可以表达CD200、CD141、CD61、CD87，或SSEA4阳性表面标志物，所述标志物是在细胞表面表达的细胞标志物，并且至少约70％或更少、至少约60％或更少、至少约50％或更少、至少约40％或更少、至少约30％或更少、至少约20％或更少、至少约10％或更少、至少约5％或更少，或至少约1％或更少的所述干细胞可以表达Oct4、Nanog、Tra-1-60、CD3、CD1a、CD11c、CD16、CD86、CD8a、MIC A/B，或CD40阴性表面标志物，该标志物是干细胞标志物。如本文所用，关于干细胞标志物，术语“阳性”意指与其它非干细胞中的标志物量或浓度作为参照物相比，细胞标志物以大量或高浓度存在。也就是说，任何标志物都存在于细胞的内部或表面，并因此，如果可以通过使用标志物将细胞与一种或多种其它细胞相区分，则该细胞对于所述标志物可以是阳性的。此外，术语“阳性”意指细胞具有比背景强度更高强度的信号，例如，细胞具有足以在细胞测量装置中检测到的量的标志物。例如，可以用CD200特异性抗体可检测地标记细胞，并且当来自这些抗体的信号可检测地强于对照的信号(如背景强度)时，该细胞是“CD200+”。如本文所用，术语“阴性”意指尽管使用了特异性针对特定细胞表面标志物的抗体，与背景强度相比，不能检测到该标志物。例如，如果用CD3特异性抗体不能可检测地标记细胞，则该细胞是“CD3-”。
可以通过本公开所属领域中已知的常用方法来确定上述免疫学特性。例如，可以使用各种方法，如流式细胞术、免疫组织化学染色、RT-PCR等。
与骨髓来源的干细胞相比，根据具体实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞可具有选自下组的一种或多种基因或蛋白质的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33。特别地，与骨髓来源的干细胞相比，细胞可具有选自下组的两种或更多种或三种或更多种基因或蛋白质的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33，或者更具体地，与骨髓来源的干细胞相比所有基因或蛋白质的高表达水平。与骨髓来源的干细胞相比，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞中高表达的基因还可以包含S100A10、SQSTM1、DSTN、DCN、PHGDH、FBLN1、MFGE8、HLA-A、VASN，或KIAA1199。目前还没有关于上述基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞与骨髓来源的干细胞之间的基因表达水平间的差异可以是两倍或更高。例如，表达水平的差异可以通过比较mRNA水平的基因表达水平来确定。另外，可以通过例如微阵列分析来确定表达水平的差异。
此外，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞相较于骨髓来源的干细胞可以具有选自下组的一种或多种基因或蛋白质的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1。具体地，所述细胞相较于骨髓来源的干细胞可以具有选自下组的两种或更多种或三种或更多种基因或蛋白质的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1，或更具体地，相较于骨髓来源的干细胞，所有基因或蛋白质的低表达水平。与骨髓来源的干细胞相比，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞中较差表达的基因或蛋白质可以包括MTA2A、TM4SF1、HIST1H4C，和NME1。没有关于上述基因或蛋白质与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞和骨髓来源的干细胞之间的基因或蛋白质之间的表达水平的差异可以是两倍或更高。例如可以通过比较mRNA水平上基因表达水平来确定表达水平的差异。此外，例如可以通过微阵列分析来确定表达水平的差异。
此外，增强的脐带来源的粘附干细胞在传代培养过程中可以具有成纤维细胞的形态。在特定的实施方案中，细胞可具有需要与表面粘附以在体外生长的细胞的特性，并可以展示出纺锤形的成纤维细胞特异性形态。
在另一特定的实施方案中，增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有集落形成能力。与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，细胞可以具有高的集落形成能力。
此外，增强的脐带来源的粘附干细胞可以分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等。可以诱导所述细胞分化成特定的细胞谱系，例如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、造血细胞、肌细胞、血管细胞、神经元或肝细胞。
如本文所用，术语“分化”指细胞通过***和增殖在细胞生长过程中变得结构或功能更加特化的过程，即活体的细胞、组织等发生形状或功能改变以进行给定任务的过程。可以通过本领域众所周知的方法来完成确定分化为特定细胞谱系，并且可以通过已知的方法诱导来分化成特定的细胞。另外，可以通过以下来确定分化：通过使用如流式细胞术或免疫细胞化学测量细胞表面标志物(如用组织特异性或细胞标志物特异性抗体对细胞染色)和形态变化，或通过使用光学显微镜或共聚焦显微镜来测量细胞形态，或通过使用本领域已知技术(如PCR和基因表达序型分析)来测量基因表达变化。
此外，增强的脐带来源的粘附干细胞可以分泌IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、VEGF、GRO、IFNγ、IL-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12(p40)、IL12(P70)、IL-13、IL-14、IFNα2、MDC、sIL-2Ra、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、Flt-3配体、MCP-1、MIP-1a、MIP1b、RANTE、fractalkine、IP-10、EGF、FGF-2、IGF-1SR、EpCAM、IGFBP3，或这些蛋白质的组合。此外，增强的脐带来源的粘附干细胞例如可以分泌两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种选自下组的蛋白质：IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、VEGF、和GRO，以及所有所述蛋白质。
此外，与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，在缺氧条件下培养的增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有选自下组的一种或多种基因或蛋白质的增加的表达水平：S100A10、BNIP3、IGFBP5、PGK1、TPI1、DCN、PGM1、PFKFB3、LOC644774、MME、MIR1978、SLC2A3、BHLHB2、BNIP3L、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3。具体地，与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，在缺氧条件下培养的增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有选自下组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种基因或蛋白质的增加的表达水平：S100A10、BNIP3、IGFBP5、PGK1、TPI1、DCN、PGM1、PFKFB3、LOC644774、MME、MIR1978、SLC2A3、BHLHB2、BNIP3L、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3，或所有所述基因或蛋白质的增加的表达水平。没有关于上述基因或蛋白质与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。表达水平的差异可以是两倍或更高。例如可以通过比较mRNA水平上或蛋白质水平上基因和蛋白质表达水平来确定表达水平的差异。此外，例如可以通过微阵列分析和蛋白质组分析来确定表达水平的差异。
此外，与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，在缺氧条件下培养的增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有选自下组的一种或多种基因或蛋白质的降低的表达水平：IL8、ALDH1A1、NQO1、DLC1、CTHRC1，和CPA4。具体地，与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，在缺氧条件下培养的增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有选自下组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种基因或蛋白质的增加的表达水平：IL8、ALDH1A1、NQO1、DLC1、CTHRC1，和CPA4。没有关于上述基因或蛋白质与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。表达水平的差异可以是两倍或更高。例如可以通过比较mRNA水平上或蛋白质水平上基因和蛋白质表达水平来确定表达水平的差异。此外，例如可以通过微阵列分析和蛋白质组分析来确定表达水平的差异。
另一方面提供了增强的脐带来源的粘附干细胞的细胞群。
所述脐带来源的粘附干细胞与上述相同。
另一方面提供了制备增强的脐带来源的粘附干细胞的方法，所述方法包括：在培养板中粘附培养分离的脐带；通过将培养的脐带与解离酶接触来分离增强的脐带来源的粘附干细胞；在含有成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)和肝素的培养基中传代培养所述分离的增强的脐带来源的粘附干细胞。
脐带可以是在分娩后分离自健康母亲(如HIV、HCV、HBV阴性母亲)的脐带。也即是说，“分离的脐带”可以指分娩后分离自母体的脐带。分离的脐带可以在分离后立即储存在带冰的无菌容器中。
从胎盘分离和获得脐带的方法可以包括例如从分离的胎盘分离脐带；除去分离的脐带的外部血液；从除去血液的脐带除去动脉和静脉；和/或以预先确定的尺寸(如1mm至20mm)切割已经去除了动脉和静脉的脐带。可以通过使用无Ca/Mg的DPBS或含庆大霉素的无Ca/Mg的DPBS进行血液的去除。
接着，可以从切割为小尺寸的脐带(如分离的脐带)来分离干细胞。增强的脐带来源的粘附干细胞的分离可以包括在培养板中粘附培养分离的脐带5天至20天，例如10天至20天，例如10天至15天；证实细胞从培养的脐带组织延伸；和/或用解离酶处理脐带组织。
解离酶可以包括胶原酶。胶原酶可以指切割胶原蛋白肽键的酶，并且可以包括I型、II型、III型、IV型胶原酶或其组合。此外，解离酶可以包括5U/ml至30U/ml(例如5U/ml至25U/ml、10U/ml至25U/ml，或20U/ml)的胶原酶。此外，解离酶可以包括胰蛋白酶和/或分散酶。此外，包含解离酶的溶液可以包含含有胶原酶、胰蛋白酶和/或分散酶的水、盐水，例如HBSS(汉克平衡盐溶液)。此外，解离酶的处理时间例如可以是1小时至20小时、2小时至10小时、4小时至9小时，或5小时至6小时。
在特定的实施方案中，组织与解离酶之间的反应可以允许在震荡下进行，并且所述震荡例如可以在约20℃至约40℃、约30℃至约40℃，或约35℃至约40℃，例如37℃下进行约5分钟至约60分钟或约10分钟至约30分钟，例如约10分钟至约30分钟两次。
另外，在组织和解离酶反应后，可以进一步进行失活解离酶的过程，并且例如，可以通过添加FBS来终止酶促反应。此外，可以通过本领域已知的常用方法进行从酶反应溶液中分离组织细胞的方法，例如分离增强的脐带来源的粘附干细胞。例如，离心后可以通过使用细胞过滤器来分离细胞。
如本文所用，术语“增强的脐带来源的粘附干细胞的分离”意指除去至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的未处理的哺乳动物脐带中通常与干细胞关联的细胞。当未处理的器官中通常与干细胞关联的其它细胞少于整个细胞的50％时，含有获得自一个器官的干细胞的细胞群可称为是“分离的”。
接着，可以通过将分离的增强的脐带来源的粘附干细胞作为P0来进行传代培养。
传代培养还可以包括在用于传代培养的细胞移植之前处理无动物组分(ACF)的重组酶。如本文所用，术语“无动物组分的酶”意指酶来源于非动物，这意指酶不是从动物供应来源纯化的。无动物组分的酶可以源自重组，例如源自细菌、酵母或植物。来源于重组的酶可以意指通过包括使用微生物，如细菌、病毒、酵母、植物等的重组DNA技术所生产的任何酶。酶可以是无动物组分的重组胰蛋白酶，例如在玉米中生产的重组胰蛋白酶。无动物组分的重组胰蛋白酶可商购获得，并且例如其可以是TrypLETM Select(GIBCO Invitrogen),TrypLETM Express(GIBCO Invitrogen),TrypZeanTM(Sigma Aldrich)，或重组TrypsinSolutionTM(Biological Industries)。
传代培养可以包括在干细胞培养基中(例如在补充有成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)和肝素的培养基中)培养细胞。FGF-4在培养基中的浓度可以是约10ng/ml至约40ng/ml，或约20ng/ml至约30mg/ml，例如25ng/ml。培养基中肝素的浓度可以是约0.5μg/ml至约2μg/ml，或约0.5μg/ml至约1.5μg/ml，例如约1μg/ml。培养基还可以包括例如胎牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素、庆大霉素等)。在具体的实施方案中，可以使用补充有10％胎牛血清、50μg/ml的庆大霉素、1μg/ml的肝素和25ng/ml的FGF-4的CS-CM培养基。传代培养可以在约20℃至约40℃、约30℃至约40℃，或约35℃至约40℃，例如约37℃下进行，并且每个传代培养的培养时间可以是例如2天至7天，或3天至5天。
在制备根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的方法中，传代培养的传代次数没有特别的限制，并且可以根据所希望的增殖细胞数适当选择传代数。通常，传代数可以是至少1代或更多代，或者10代或更多代。例如，可以进行1代至20代或3代至15代以获得临床上需要增殖细胞的累积数量。
另外，传代培养时，也可以如上所述另外进行无动物组分的重组酶处理。即，在传代培养细胞到下一阶段之前的每个传代培养阶段，用无动物组分的重组酶处理并收获细胞以增加细胞纯度。例如，无动物组分的重组酶可以在从P1到P2阶段转移用于P2的细胞之前进行处理。
传代培养可以是比21％的含氧量正常条件更低的氧水平的缺氧条件下的传代培养。术语“缺氧”意指氧分压低于21％(其是一般含氧量正常条件)的氧分压。缺氧条件可以是具有1％至15％,1％至12％,1％至10％，或1％至5％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％，或9％氧分压的条件。
在具体的实施方案中，当在缺氧条件下培养细胞时，与在含氧量正常条件下培养那些细胞时相比，选自下组的一种或多种的表达水平可以是增加的：S100A10、BNIP3、IGFBP5、PGK1、TPI1、DCN、PGM1、PFKFB3、LOC644774、MME、MIR1978、SLC2A3、BHLHB2、BNIP3L、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3，或者选自下组的一种或多种的表达水平可以是降低的：IL8、ALDH1A1、NQO1、DLC1、CTHRC1，和CPA4。
通过以上制备方法制备的增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有以上描述的特征，并且例如所述制备的增强的脐带来源的粘附干细胞可以具有选自以下(a)至(e)的一个或多个特征：
a)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33；
b)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1；
c)在传代培养过程中维持粘附成纤维细胞的形态；
d)具有分化为脂肪细胞、骨细胞，或软骨细胞的能力，和
e)具有一种或多种选自下组的表面抗原特征：CD200+、Tra-1-60-、CD3-、CD1a-、CD11c-、CD16-、CD86-、CD8a-、CD40-、CD141+、CD61+、CD87+、MIC A/B-，和SSEA4+。
增强的脐带来源的粘附干细胞还可以具有一个或多个选自以下(f)至(i)的特征：
f)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：S100A10、BNIP3、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3；
g)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：IL8、ALDH1A1、DLC1、CTHRC1，和CPA4；
h)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：SNCA、DSG2、NRP2，和PLAT；和
i)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：TPMT、NAGK，和ANXA4。
增强的脐带来源的粘附干细胞的e)表面抗原特征还可以包括Oct4-或Nanog-。此外，e)表面抗原特征的CD61+可以是在缺氧条件下过表达的表面抗原特征。
另一方面提供了细胞治疗剂，或药物组合物或试剂，其包含增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
另一方面提供了增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物在制备细胞治疗剂，或药物组合物或试剂中的用途。
例如，提供的是细胞治疗剂，或药物组合物或试剂，其包含具有选自以下(a)至(e)的一个或多个特征的增强的脐带来源的粘附干细胞，或其细胞群：
a)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33；
b)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1；
c)在传代培养过程中维持粘附成纤维细胞的形态；
d)具有分化为脂肪细胞、骨细胞，或软骨细胞的能力，和
e)具有一种或多种选自下组的表面抗原特征：CD200+、Tra-1-60-、CD3-、CD1a-、CD11c-、CD16-、CD86-、CD8a-、CD40-、CD141+、CD61+、CD87+、MIC A/B-，和SSEA4+。
增强的脐带来源的粘附干细胞还可以具有一个或多个选自以下(f)至(i)的特征：
f)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：S100A10、BNIP3、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3；
g)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：IL8、ALDH1A1、DLC1、CTHRC1，和CPA4；
h)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：SNCA、DSG2、NRP2，和PLAT；和
i)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：TPMT、NAGK，和ANXA4。
此外，上述方面包括包含增强的脐带来源的粘附干细胞的培养物的药物组合物。此外，例如提供的是用于治疗或预防炎性疾病、缺血性疾病，和/或神经变性性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
另一方面提供了增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物在制备用于治疗或预防疾病，例如炎性疾病、缺血性疾病，和/或神经变性性疾病的药物中的用途。
另一方面提供了治疗或预防疾病，例如炎性疾病、缺血性疾病，和/或神经变性性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用作为有效成分的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物。
增强的脐带来源的粘附干细胞与上述相同。
根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞可以释放有利于如上所述的疾病治疗的蛋白质(例如，IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、VEGF或GRO)，并且可以具有迁移到受损组织中的显著能力，以及抗炎、血管再生和神经再生效果。因此，增强的脐带来源的粘附干细胞可以有效地应用于细胞治疗剂或用于预防或治疗包括炎性疾病、缺血性疾病，和/或神经变性性疾病在内的各种疾病的药物组合物。
疾病的例子可以包括炎性疾病、缺血性疾病，和/或神经变性性疾病。炎性疾病的例子可以包括支气管炎、胃炎、动脉硬化、关节炎、炎性肠病(IBD)、肝炎、胆囊炎、真菌感染、胃溃疡、哮喘、特应性皮炎、肌腱炎，或肾炎。缺血性疾病的例子可以包括缺血性中风、心肌梗塞、缺血性心脏病、缺血性脑病、缺血性心力衰竭、缺血性肠炎、缺血性血管疾病、缺血性眼病、缺血性视网膜病、缺血性青光眼、缺血性肾衰竭，或缺血性肢体病。“缺血性中风”或“中风”可以指持续一段时间或更长时间的由脑血流减少而导致的坏死脑组织或细胞引起的疾病，并可以与“脑梗塞”互换使用。
神经变性性疾病的例子可以包含脊髓损伤、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、额颞痴呆、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病，和拳击员痴呆(DP)。
基于增强的脐带来源的粘附干细胞，根据具体的实施方案的细胞治疗剂或药物组合物的剂量可以是1.0X 103至1.0X 1010细胞/kg(体重)或受试者，或1.0X 107至1.0X 108细胞/kg(体重)或受试者。然而，可以基于各种因素不同地规定剂量，所述因素诸如配制方法、施用模式、患者年龄、体重、性别、疾病病患、饮食、施用时间、施用途径、***率，和反应敏感性，并且考虑到这些因素，本领域技术人员可以适当调整剂量。在临床允许的副作用范围内，施用频率可以是一次或两次以上，并且可以对一个或两个或更多位点施用。对于非人动物的剂量/kg或剂量/受试者可以与人类的相同，或者可以转换自以上描述的剂量，例如基于人和动物受试者的器官(心脏等)之间的体积比(例如平均值)。根据具体的实施方案治疗的动物可以以人和其它所需的哺乳动物为例，并且具体地可以包含人、猴、小鼠、大鼠、兔、棉羊、牛、狗、马、猪等。
根据具体的实施方案的细胞治疗剂或药物组合物可以包含增强的脐带来源的粘附干细胞和药学上可接受的载体和/或添加剂作为活性组分，并且例如可以包含无菌水、生理盐水、标准缓冲液(如磷酸盐、柠檬酸或其它有机盐)、稳定剂、盐、抗氧化剂(如抗坏血酸等)、表面活性剂、悬浮剂、等渗剂、防腐剂等。对于局部施用，细胞治疗剂或药物组合物优选与以下物质组合：有机物质(诸如生物聚合物)、无机物质(诸如羟基磷灰石)，特别是胶原基质、聚乳酸的聚合物或共聚物、聚乙二醇的聚合物或共聚物，及其化学衍生物。当根据具体的实施方案的细胞治疗剂或药物组合物以注射剂配制时，细胞群可以溶解在药学上可接受的载体中或者可以以溶液态冷冻，其中细胞群溶于所述溶液。
根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞可用于各种种类的治疗方案中以通过植入、移植或注射所需的细胞群来增强、治疗或替换身体的组织或器官，所述所需的细胞群例如干细胞或干细胞来源的细胞群。增强的脐带来源的粘附干细胞可用于替换或增强已存在的组织，使得所述组织可以变成新改变的组织或可与生物组织或结构结合。此外，在使用来源于除脐带以外的组织的干细胞的治疗方案中，可以用本公开的增强的脐带来源的粘附干细胞来替代所述干细胞。
取决于施用模式和配方，根据具体的实施方案的细胞治疗剂或药物组合物可以包含(若需要)悬浮剂、增溶助剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、镇痛剂、缓冲液、还原剂、抗氧化剂等。除以上描述的那些以外，适用于本公开的药学上可接受的载体和药剂在文献中详细描述[Remington’s PharmaceuticalSciences,19th ed.,1995]。
可以根据本公开所属领域的技术人员可以容易实施的方法，使用药学上可接受的载体和/或赋形剂将根据具体的实施方案的细胞治疗剂或药物组合物配制为单位剂量形式或配制到多剂量容器中。在这方面，制剂可以是在油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。此外，细胞治疗剂可以制备成可注射制剂。在这种情况下，可以使用已知用于制剂的普通成分，并且该制剂可以通过常规方法制备。
本发明的有益效果
根据一个方面的增强的脐带来源的粘附干细胞可具有抗炎，血管再生和神经再生作用，从而可有效地用于治疗或预防各种疾病的药物组合物或细胞治疗剂。
可以使用根据另一方面的制备增强的脐带来源的粘附干细胞的方法来增加来自脐带组织的干细胞的纯度、产率和增殖速率。
附图简述
图1a显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的分离中解离酶处理之前和之后的细胞形态；
图1b显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的分离中根据解离酶的处理时间的细胞形态，G1：Col I处理组，G2：组织附着后Col I处理组；
图2显示了在培养根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞中缺氧条件和含氧量正常条件之间的比较：3％：低氧分压(3％O2)，21％：正常氧分压(21％O2)；
图3显示了用于检查根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的遗传稳定性的核型分析的结果；
图4显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的表面蛋白的分析结果；
图5显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的多能性的分析结果；
图6显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的蛋白表达的比较和分析结果；
图7a显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的抗炎性效果的分析结果；
图7b显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的血管再生效果的分析结果；和
图7c显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的神经再生效果的分析结果。
实施例
在下文中，将更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明的范围并不意图受这些实施例的限制。
实施例1：增强的脐带来源的粘附干细胞的制备、其表征，以及抗炎、神经再生、血管再生效果分析
1.增强的脐带来源的粘附干细胞的制备和根据培养方法的比较
(1.1)增强的脐带来源的粘附干细胞1的分离和培养
在已经正常分娩并直接给出了有关研究的信息的女性签署了知情同意书后，从正常胎盘分娩过程中收集的胎盘组织中分离了脐带。用无Ca/Mg的DPBS清洗取出的脐带两次或五次以除去血液，并且然后除去两条动脉和一条静脉而不除去外部羊膜层，并且然后将脐带切割为1mm至5mm大小。然后，将脐带在培养板中经受粘附培养10天至15天。在确认了细胞从培养的组织伸出后，用200U/ml的胶原酶I处理5小时至6小时以分离增强的脐带来源的粘附干细胞。胶原酶I处理前和处理后，在光学显微镜下以40x，100x放大倍数检查细胞形态以确认从脐带粘附组织伸出的细胞，并且在图1a中显示了结果。
图1a显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的分离中解离酶处理之前和之后的细胞形态。
之后，将分离的细胞作为P0在37℃缺氧培养条件下(O2 3％)培养于含有25ng/mlFGF4、1ug/ml肝素，和10％FBS的MEM alpha GlutaMAX(CS-CM培养基)中。之后，每3天至4天替换CS-CM培养基以除去不与烧瓶底部粘附的细胞。通过用无动物组分(ACF)的重组酶TrypLE(Invitrogen)在第一代在37℃培养箱中处理短暂的时间(3分钟)来传代培养细胞。
(1.2)增强的脐带来源的粘附干细胞2的分离和培养
除了在将脐带附着至(1.1)中的培养板之前进行胶原酶I的处理以外，以与(1.1)中相同的方式分离和培养增强的脐带来源的粘附干细胞。
(1.3)增强的脐带来源的粘附干细胞3的分离和培养
除了在含氧量正常条件(O2 21％)下培养在(1.1)中分离的干细胞以外，以与(1.1)中相同的方式分离和培养增强的脐带来源的粘附干细胞。
(1.4)根据解离酶的处理时间的比较分析
为了比较(1.1)和(1.2)中分离的干细胞的细胞回收率，将(1.2)和(1.1)中分离的干细胞分别命名为G1和G2。在光学显微镜下以40x，100x放大率检查其细胞形态并且在图1b中显示了结果。
图1b显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的分离中根据解离酶的处理时间的细胞形态。
此外，比较了G1和G2的组织重量、解离酶处理后的细胞数量以及细胞(P0)数量。
[表1]
如图1b和表1所示，当在脐带培养之前用解离酶处理时，大多数细胞具有鹅卵石形的形态并且缓慢增殖以显示低细胞产率。当脐带培养之后用解离酶处理时，细胞具有均一的细胞形态并且增殖迅速以显示高细胞产率。
(1.5)根据缺氧和含氧量正常条件下的比较分析
为了比较(1.1)的缺氧条件下和含氧量正常条件(1.2)下粘着细胞传代培养1代至20代(P1至P20)的生长曲线和倍增时间，将每组相同数量的细胞接种在6孔板中，并且当它们占据平板的70％～80％的底部区域时收获细胞。之后，将10μl样品与10μl台盼蓝相混合，并且将10μl注射到血球计的一个测量部分。通过使用自动细胞计数器来计数细胞的数量。此时，还记录了计算倍增时间的时间。倍增时间(其是细胞加倍所需的时间)是使用细胞总数和测量数量的时间来计算的。在图2a和2b中显示了结果。
此外，为了分析细胞的集落形成能力，将150个细胞/盘铺在100mm培养皿上，并且在12ml的培养基中培养10天至14天。在显微镜下检查细胞集落形成。接着，用DPBS洗涤细胞，并且向皿中的细胞添加2ml至3ml的戊二醛与结晶紫的混合溶液并染色30分钟。用无菌水小心清洗细胞并且在显微镜下计数集落数，并以平均值呈现以分析结果。结果在图2c中显示。
此外，为了分析细胞迁移至受损组织的能力，转孔(transwell)过滤器的上表面在37℃下用0.1％明胶涂覆1小时。将5x 105个细胞重悬于100μl无血清培养基中，并且接种到转孔***物(insert)的上部隔室。接种前，细胞在无血清培养基中饥饿过夜。将含有600μl培养基(CS-CM)的恒化器添加到下部隔室。在培养箱中过夜培养细胞。通过使用用冷PBS浸泡的棉签去除保持在过滤器上侧的细胞。通过使用解剖刀来切割转孔过滤器，之后用姬姆萨染色。底部朝上放在载玻片上并安装。通过在光学显微镜下计数染色细胞的数量来检查迁移细胞。结果在图2d中显示。
图2显示了在培养根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞中缺氧条件和含氧量正常条件之间的比较。如图2a和2b所示，缺氧条件下培养的细胞显示出短倍增时间的快速细胞增值率。此外，如图2c所示，集落数量增加了大约两倍，并且如图2d所示，细胞迁移至受损组织的能力增加了约1.6倍。
2.增强的脐带来源的粘附干细胞的表征
(2.1)增强的脐带来源的粘附干细胞的遗传稳定性分析
为了分析(1.1)和(1.3)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的遗传稳定性，进行了GTG-Banding分析。
具体来说，通过使用Promega DNA提取试剂盒从P7和P14的细胞中提取DNA，并用作样品。使用Illumina HumanOmni1-Quad芯片和扫描仪用于测量。首先，通过全基因组扩增来扩增400ng的每个DNA样品，并且通过化学方法随机片段化，并然后通过2-丙醇沉淀来纯化。用缓冲溶液预处理芯片，并且然后将DNA样品应用至芯片。孵育约16小时后，进行染色、等位基因特异性引物延伸(ASPE)、杂交、靶物去除(target removal)和洗涤。之后，通过IlluminaiScan进行扫描，并且通过使用软件来分析数据。结果在图3中显示。
图3显示了用于检查根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的遗传稳定性的核型分析的结果；
如图3所示，通过根据具体的实施方案的制备方法制备的增强的脐带来源的粘附干细胞直到培养至P14未显示出遗传异常。
(2.2)增强的脐带来源的粘附干细胞的表面蛋白分析
为了分析(1.1)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的表面蛋白，进行了流式细胞术和免疫荧光染色分析。
具体来说，对于流式细胞术，用DPBS洗涤细胞，并且然后在冰上与含2％FBS的DPBS的Tra-1-60、CD3、CD1a、CD11c、CD16、CD14、CD86、CD8a、CD19、CD40、CD80、CD200、CD141、CD61、CD87、MIC A/B、SSEA4标志物反应20分钟。然后，通过FACS Calibur(BectonBickinson)分析表面抗原，并且结果在图4a中显示。
为了检测Oct4和Nanog(两者是胚胎干细胞标志物)的表达，进行了免疫荧光染色。首先，用DPBS洗涤细胞三次，并且然后在培养板中用4％多聚甲醛室温下固定10分钟。固定后，用DPBS洗涤细胞三次。接着，在室温下用0.2％Triton X-100溶液渗透细胞10分钟，并且用DPBS洗涤细胞三次。通过在室温下使用10％正常山羊血清进行封闭30分钟。添加一抗(Oct4,Nanog)，并且4℃黑暗下反应过夜。之后，用DPBS洗涤细胞三次，并且向其添加二抗，并且在室温下反应1小时。最后，用DPBS洗涤细胞三次，并且在荧光显微镜下观察。结果在图4b中显示。
图4显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的表面蛋白的分析结果；
如图4a所示，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞是对CD200、CD141、CD61、CD87、SSEA4选择性阳性，以及对TRA-1、CD3、CD1a、CD11c、CD16、CD86、CD8a、CD40、MIC A/B选择性阴性，并且另外，缺氧条件下对CD61选择性阳性的细胞。此外，如图4b所示，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞不表达作为胚胎干细胞特异性标志物的Oct4和Nanog蛋白质。
(2.3)增强的脐带来源的粘附干细胞的分化能力分析
(2.3.1)脂肪细胞分化能力分析
如下进行了增强的脐带来源的粘附干细胞的脂肪细胞分化能力分析。
(1.1)和(1.3)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞培养于脂肪形成分化培养基(Adipogenesis Differentiation Kit,Life Technology)中2周，其中每3天更换培养基。然后，除去培养基并且用无Ca/Mg的DPBS洗涤细胞，并且在室温下与4％多聚甲醛反应15分钟。用60％异丙醇洗涤细胞并且然后与油红O反应10分钟。然后用纯水洗涤细胞，并且在显微镜下观察脂肪细胞。结果在图5中显示。
(2.3.2)骨细胞分化能力分析
如下进行了增强的脐带来源的粘附干细胞的骨细胞分化能力分析。
(1.1)和(1.3)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞培养于骨形成分化培养基(Osteogenesis Differentiation Kit,Life Technology)中2周，其中每3天更换培养基。然后，除去培养基并且用无Ca/Mg的DPBS洗涤细胞，并且在室温下与4％多聚甲醛反应15分钟。反应后，用纯水洗涤细胞，并与1％硝酸银溶液室温下反应15分钟。用纯水洗涤细胞并且然后用5％硫代硫酸钠溶液室温下反应5分钟。然后，用纯水洗涤细胞，并且与0.1％nuclear fast red溶液在室温下反应5分钟。然后，用纯水洗涤细胞，并且在显微镜下观察钙沉积样品。结果在图5中显示。
(2.3.3)软骨细胞分化能力分析
如下进行了增强的脐带来源的粘附干细胞的软骨细胞分化能力分析。
将2x 105个(1.1)和(1.3)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞置于15ml管中，并且在1,500rpm下离心5分钟。弃掉上清液，并且仅将细胞培养于软骨形成分化培养基(Chondrogenesis Differentiation Kit,Life Technology)中3周，每3天更换培养基，其中松散密封盖子。然后将细胞团块制成石蜡块并切割，然后阿辛蓝染色。之后，通过光学显微镜分析染成蓝色的软骨细胞并且在图5中显示了结果。
图5显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的多能性分析结果；
如图5所示，分析脂肪细胞分化能力的结果显示了在红色中鉴定大物质和小物质(脂肪)，像液滴。此外，分析骨细胞分化能力的结果显示了粉色背景上黑棕色钙颗粒沉积。此外，软骨细胞分化能力的结果显示了分化为软骨细胞的过程中，分泌了代表软骨刚性和弹性的糖蛋白并在蓝色中得以鉴定。这些结果显示了根据具体的实施方案的由(1.1)和(1.3)的方法制备的增强的脐带来源的粘附干细胞可以分化为脂肪细胞、骨细胞，或软骨细胞，说明了多能性。
(2.4)增强的脐带来源的粘附干细胞的分泌蛋白的序型分析(profiling)和定量分析
为了分析(1.1)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的分泌蛋白，进行了多重珠分析(MILLIPLEX Human Cytokine/Chemokine Panel 1,Merck Millipore,Billerica,Ma,USA)。
具体来说，将增强的脐带来源的粘附干细胞培养24小时，并且将其培养物与抗体包被的捕获珠在室温下温育2小时，然后洗涤。将所述珠与生物素标记的抗人细胞因子和趋化因子抗体温育1小时并与链霉亲合素藻红蛋白温育30分钟。最后，洗涤珠，并且对于定量，使用了Luminex 200程序以分析分泌蛋白的表达水平。结果显示在表2中。
[表2]
如表2中所示，可以看出，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞分泌IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-1、MCP-3、VEGF、GRO、IGF-1SR、EpCAM、IGFBP3等。
(2.5)增强的脐带来源的粘附干细胞的基因表达分析
通过与骨髓干细胞的那些基因表达相比较来分析(1.1)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的基因表达
具体来说，为了通过与骨髓干细胞的那些基因表达相比较来分析增强的脐带来源的粘附干细胞中基因特异性表达，从增强的脐带来源的粘附干细胞和骨髓干细胞提取RNA，然后标记和纯化。将标记的cDNA与illumina表达珠芯片(beadchip)杂交以获得结果。对数据进行统计学分析，并且在以下表3和图6中示出。
[表3]
如表3和图6中所示，与骨髓干细胞相比，在增强的脐带来源的粘附干细胞中观察到COL1A1、IGFBP4、TAGLN、S100A10、SQSTM1、DSTN、DCN、PHGDH、FBLN1、MFGE8、HLA-A、VASN、KIAA1199、STC1、LRRC17、IL33、SNCA、DSG2、NRP2、PLAT的高表达，并且在增强的脐带来源的粘附干细胞中观察到CCND1、SERPINE1、PRNP、MT2A、TM4SF1、HIST1H4C、NME1、CXCL6、NTSR1、PTGS2、CYP1B1、TPMT、NAGK、ANXA4的低表达。
在这些基因中，COL1A1(其是高表达的基因)是alpha-1I型胶原，并且已知在包括软骨的***胶原中表达。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，IGFBP4(其是高表达的基因)是***结合蛋白，并且被称为抑制各种癌细胞的蛋白质。有报道称，在脐带血的血清中检测到IGFBP4，然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，TAGLN(其是高表达的基因)是在成纤维细胞和平滑肌中表达的基因，并且其功能尚未被揭示。有报道称TAGLN在骨髓干细胞中表达，然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，CCND1(其是较差表达的基因)是细胞周期蛋白D1。CCND1的过表达导致细胞周期从G1期快速转变为S期以促进细胞生长。有报道称CCND1在癌细胞中高度表达，并且脐带血干细胞通过下调CCND1抑制C6胶质瘤。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，SERPINE1(其是较差表达的基因)被称为内皮纤溶酶原激活物抑制剂，并且已知起到组织型纤溶酶原激活物(tPA)的作用。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，PRNP(其是较差表达的基因)是主要的朊病毒蛋白(CD230)，并且已知在各种组织以及神经***中表达。据报道，PRNP基因的异常引起神经紊乱。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
以如上相同的方式比较和分析了(1.1)和(1.3)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的基因表达，并且结果示于以下表4和图6中。
[表4]
如表4和图6所示，与在含氧量正常条件下的那些细胞相比，在缺氧条件下培养的增强的脐带来源的粘附干细胞中观察到S100A10、BNIP3、IGFBP5、PGK1、TPI1、DCN、PGM1、PFKFB3、LOC644774、MME、MIR1978、PGK1、SLC2A3、BHLHB2、BNIP3L、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3的高表达，以及在缺氧条件下培养的增强的脐带来源的粘附干细胞中观察到IL8、ALDH1A1、NQO1、DLC1、CTHRC1，和CPA4的低表达。
这些基因中，S100A10(其是高表达的基因)是S100钙结合蛋白A10，并且调节细胞周期和分化。此外，已知S100A10在胞吐作用和内吞作用中起作用。S100A10被研究作为在骨髓干细胞向骨分化过程中高表达的蛋白之一。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，当基因表达在UCB-MSC(脐带的脐带血来源的干细胞)和UCB-MNC(脐带的脐带血来源的血细胞)的mRNA水平比较时，BNIP3(其是高表达的基因)已知在UCB-MSC中高度表达。此外，在缺氧条件下收集羊膜干细胞，并且然后经受mRNA微阵列分析。作为结果，已知BNIP3基因在缺氧条件下显著增加。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，IGFBP5(其是高表达的基因)是***结合蛋白5，并且在发育中起作用并定位于细胞外空间。报道了IGFBP5基因在骨髓干细胞中的表达，但没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，IL8(其是较差表达的基因)据报道当暴露于炎症环境时，从吞噬细胞和间充质细胞中释放，以活化诱导趋化性的嗜中性粒细胞。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
这些基因中，ALDH1A1(其是较差表达的基因)是醛脱氢酶家族1，成员A1，并且是一种参与酒精代谢主要氧化途径的酶。然而，目前还没有关于该基因与增强的脐带来源的粘附干细胞之间的关联的报道。
3.增强的脐带来源的粘附干细胞的抗炎、血管再生，和神经再生效果分析
(3.1)增强的脐带来源的粘附干细胞的抗炎效果分析
为了分析(1.1)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的抗炎效果，分析了PBMC增殖抑制能力和从活化的PBMC分泌的IL-10。
具体来说，如下分析了PBMC增殖抑制能力。首先，将增强的脐带来源的粘附干细胞以不同浓度接种于24孔板并培养24小时。之后，通过添加PHA来刺激CFSE染色的PBMC，并与增强的脐带来源的粘附干细胞共培养5天。之后，研究了存在或不存在转孔下炎症是否由增强的脐带来源的粘附干细胞分泌的细胞因子所抑制或由直接的细胞至细胞接触所抑制。图7a中显示了结果。
此外，为了分析分泌自活化的PBMC的IL-10，进行5小时和5天的共培养，并且然后收集了条件化培养基。通过使用人IL-10ELISA kit(R&D Systems)来测量分泌的IL-10的量，并且在图7A中显示了结果。
图7a显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的抗炎性效果的分析结果。
如图7a所示，与对照组相比，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞抑制了PBMC增殖。此外，当增强的脐带来源的粘附干细胞:PBMC的比率为1:10时，通过间接共培养观察到高达约30.51±1.74％的PBMC增殖抑制。此外，对分泌自活化的PBMC的IL-10分析的结果显示了活化的PBMC分泌抗炎细胞因子(IL-10)，并且增强的脐带来源的粘附干细胞起作用以增加PBMC的IL-10分泌。
结果显示，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞可以有效地用于治疗炎性疾病。
(3.2)增强的脐带来源的粘附干细胞的血管再生效果分析
为了分析(1.1)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的血管再生效果，分析了血管上皮细胞增殖。
具体来说，收集了增强的脐带来源的粘附干细胞的EBM-2和条件化培养基并制备为样品。之后，在96孔板中接种血管内皮细胞(HUVEC)。当细胞增殖约1天时，分别向其添加增强的脐带来源的粘附干细胞的EBM-2和培养基并培养4天。以培养基的10％的量向培养基中添加Cyto XTM细胞活力测定试剂盒(WST-1)的试剂，并允许在培养箱中反应2小时至3小时。之后，通过使用缩微阅读器(microreader)在450nm处分析了血管内皮细胞增殖率，并且在图7b中显示了结果。
图7b显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的血管再生效果的分析结果。
如图7b所示，当将在EBM-2培养基中培养的血管内皮细胞的增殖率视为100％时，增强的脐带来源的粘附干细胞的条件化培养基中培养的血管内皮细胞增殖率为172±15.22％。
结果显示，根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞具有血管再生效果。
(3.3)增强的脐带来源的粘附干细胞的神经再生效果分析
为了分析(1.1)中制备的增强的脐带来源的粘附干细胞的神经再生效果，分析了神经细胞增殖。
具体来说，收集了增强的脐带来源的粘附干细胞的MEM和条件化培养基并制备为样品。之后，在96孔板中接种神经细胞(SH-SY5Y)。当细胞增殖约1天时，分别向其添加增强的脐带来源的粘附干细胞的MEM和条件化培养基并培养4天。以培养基的10％的量向培养基中添加Cyto XTM细胞活力测定试剂盒(WST-1)的试剂，并允许在培养箱中反应2小时至3小时。之后，通过使用缩微阅读器(microreader)在450nm处分析了神经细胞增殖率，并且在图7c中显示了结果。
图7c显示了根据具体的实施方案的增强的脐带来源的粘附干细胞的神经再生效果的分析结果。
如图7c所示，当将在MEM培养基中培养的神经细胞的增殖率视为100％时，增强的脐带来源的粘附干细胞的条件话培养基中培养的神经细胞增殖率为302±15.97％。
结果显示，根据具体的实施方案，增强的脐带来源的粘附干细胞具有神经再生效果。

Claims (22)

1.增强的脐带来源的粘附干细胞，其具有选自以下(a)至(e)的一个或多个特征：
a)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33；
b)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1；
c)在传代培养过程中维持粘附成纤维细胞的形态；
d)具有分化为脂肪细胞、骨细胞，或软骨细胞的能力，和
e)具有一种或多种选自下组的表面抗原特征：CD200+、Tra-1-60-、CD3-、CD1a-、CD11c-、CD16-、CD86-、CD8a-、CD40-、CD141+、CD61+、CD87+、MIC A/B-，和SSEA4+。
2.权利要求1的增强的脐带来源的粘附干细胞，其还具有一个或多个选自以下(f)至(i)的特征：
f)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：S100A10、BNIP3、IGFBP5、NDUFA4L2、DPYD，和SCARA3；
g)与在含氧量正常条件下培养的那些细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：IL8、ALDH1A1、DLC1、CTHRC1，和CPA4；
h)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：SNCA、DSG2、NRP2，和PLAT；和
i)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：TPMT、NAGK，和ANXA4。
3.权利要求1的增强的脐带来源的粘附干细胞，其中特征a)和b)显示通过微阵列分析测量，与骨髓干细胞表达水平的表达水平差异是两倍或更多。
4.权利要求2的增强的脐带来源的粘附干细胞，其中缺氧条件下特征c)和d)显示通过微阵列分析或蛋白质组分析测量，与含氧量正常条件下表达水平的表达水平差异是两倍或更多。
5.权利要求1的增强的脐带来源的粘附干细胞，其中所述细胞具有集落形成能力。
6.权利要求1的增强的脐带来源的粘附干细胞，其中所述细胞分泌IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、VEGF、GRO、IFNγ、IL-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12(p40)、IL12(P70)、IL-13、IL-14、IFNα2、MDC、sIL-2Ra、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、Flt-3配体、MCP-1、MIP-1a、MIP1b、RANTE、fractalkine、IP-10、EGF、FGF-2、IGF-1SR、EpCAM、IGFBP3，或其组合。
7.权利要求1的增强的脐带来源的粘附干细胞，其中所述细胞源自哺乳动物脐带的脐带胶质组织。
8.制备增强的脐带来源的粘附干细胞的方法，所述方法包括：
在培养板中粘附培养分离的脐带；
通过将培养的脐带与解离酶接触来分离增强的脐带来源的粘附干细胞；和
在含有成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)和肝素的培养基中传代培养所述分离的增强的脐带来源的粘附干细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述传代培养还包括在用于传代培养的细胞移植之前处理无动物组分(ACF)重组酶。
10.权利要求8的方法，其中所述传代培养在比21％的含氧量正常条件更低的氧水平的缺氧条件下维持。
11.权利要求8的方法，其中所述增强的脐带来源的粘附干细胞具有选自以下(a)至(e)的一个或多个特征：
a)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的高表达水平：COL1A1、IGFBP4、TAGLN、STC1、LRRC17，和IL33；
b)与骨髓干细胞相比，具有选自下组的一种或多种的低表达水平：CCND1、SERPINE1、PRNP，和CYP1B1；
c)在传代培养过程中维持粘附成纤维细胞的形态；
d)具有分化为脂肪细胞、骨细胞，或软骨细胞的能力，和
e)具有一种或多种选自下组的表面抗原特征：CD200+、Tra-1-60-、CD3-、CD1a-、CD11c-、CD16-、CD86-、CD8a-、CD40-、CD141+、CD61+、CD87+、MIC A/B-，和SSEA4+。
12.权利要求8的方法，其中进行所述传代培养3至15代。
13.权利要求8的方法，其中所述解离酶是胶原酶。
14.试剂，其包含权利要求1所述的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
15.用于治疗或预防炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述炎性疾病选自下组：支气管炎、胃炎、动脉硬化、关节炎、炎性肠病(IBD)、肝炎、胆囊炎、真菌感染、胃溃疡、哮喘、特应性皮炎、肌腱炎，和肾炎。
17.用于治疗或预防缺血性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述缺血性疾病选自下组：缺血性中风、心肌梗塞、缺血性心脏病、缺血性脑病、缺血性心力衰竭、缺血性肠炎、缺血性血管疾病、缺血性眼病、缺血性视网膜病、缺血性青光眼、缺血性肾衰竭，和缺血性肢体病。
19.用于治疗或预防神经变性性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述神经变性性疾病选自下组：脊髓损伤、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、额颞痴呆、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病，和拳击员痴呆。
21.权利要求1所述的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物作为有效成分在制备用于治疗或预防炎性疾病、缺血性疾病，或神经变性性疾病的药物中的用途。
22.治疗或预防炎性疾病、缺血性疾病，或神经变性性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用作为有效成分的权利要求1所述的增强的脐带来源的粘附干细胞、其细胞群，或其培养物。
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