WO2024080661A1 - 신규한 혈관 형성 줄기세포 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to vMSC, a pluripotent stem cell with newly identified angiogenic properties.
- New blood vessels are created by the processes of angiogenesis, arteriogenesis, and vasculogenesis.
- the angiogenesis process involves the proliferation and proliferation of vascular endothelial cells growing from already existing mature endothelial cells. It is related to migration, and arteriogenesis is the process of remodeling existing arteriolar connections into collateral vessels, and angiogenesis is the differentiation of endothelial progenitor cells into mature vascular endothelial cells. It progresses through a process. Therefore, vascular endothelial progenitor cells that come out of the bone marrow and circulate are moved to the site of vascular damage and participate in the formation of new blood vessels through direct insertion into newly formed blood vessels or secretion of various angiogenic and trophic factors.
- vascular endothelial progenitor cells are attracting attention as potential targets in the field of regenerative medicine and for therapeutic purposes through revascularization. Accordingly, research is underway to increase the function of vascular endothelial progenitor cells. For example, research has been conducted on the production of recombinant EPCs with ex vivo genetic modification, and vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor) , VEGF) or hypoxiainducible factor-1 ⁇ (hypoxiainducible factor-1 ⁇ ) has been studied to increase the proangiogenic capacity of EPCs.
- VEGF vascular endothelial growth factor
- hypoxiainducible factor-1 ⁇ hypoxiainducible factor-1 ⁇
- EPC endothelial progenitor cells
- mesenchymal stem cells There are mesenchymal stem cells.
- existing EPCs are very difficult to expand in vitro, and it is difficult to maintain function during cell expansion.
- allogeneic and xenogeneic cells they are a cell group prone to problems such as immune rejection, and have difficulties in differentiating and functioning into blood vessels with complex structures.
- treatments developed based on existing mesenchymal stem cells targeting ischemic diseases do not engraft and are lost, so they do not show a clear therapeutic effect in clinical practice because they rely on paracrine effects rather than treatment through angiogenesis. .
- Cell therapy products refer to live autologous, allogeneic, or xenogeneic cells that are proliferated or selected in vitro or produced by other methods to restore the function of cells and tissues. It is defined as a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as changing the biological characteristics of the body.
- each cell material consisting of a large number of cells that can replace various tissues that make up the body expressed as tissue similar to the normal or healthy state in the body is separated, prepared, and in vitro. Through a culture process in the environment, a series of actions that change the biological characteristics of cells are performed, and the transplants are injected into recipients or used for treatment by making human tissue from these cells.
- Stem cell therapy refers to cell therapy, especially the use of stem cells.
- representative application areas include neurological diseases, heart diseases, lung diseases, liver diseases, and cancer, where recovery and regeneration of lost cells is essential, but they cannot be regenerated well.
- Active research is being conducted in areas that are not currently available.
- Stem cells have the potential for multipotency and have great potential in cell therapy in that they can induce differentiation into necessary cells in damaged tissues.
- the survival rate after transplantation into the body is not high, so they are not widely used in clinical applications. It is difficult to find examples of stable success.
- the purpose of the present invention is to provide novel stem cells.
- an object of the present invention is to provide a cell therapeutic composition for blood vessel regeneration or blood vessel formation.
- an object of the present invention is to provide a graft material for blood vessel regeneration.
- an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases or vascular dysfunction.
- an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cranial nervous system diseases.
- an object of the present invention is to provide a novel method for producing stem cells.
- an object of the present invention is to provide use of stem cells expressing the CD141 cell surface antigen for vascular regeneration or blood vessel formation.
- an object of the present invention is to provide a method for blood vessel regeneration or blood vessel formation.
- an object of the present invention is to provide a method of treating vascular disease or vascular dysfunction.
- the purpose of the present invention is to provide a method of treating cranial nervous system diseases.
- the present invention provides stem cells expressing CD141 cell surface antigen.
- the present invention provides a cell therapeutic composition for vascular regeneration or blood vessel formation containing the stem cells.
- the present invention provides a graft material for blood vessel regeneration.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases or vascular dysfunction.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cranial nervous system diseases.
- the present invention provides a method for producing stem cells expressing CD141 cell surface antigen.
- the present invention provides the use of stem cells expressing CD141 cell surface antigen for vascular regeneration or blood vessel formation.
- the present invention provides a method for blood vessel regeneration or blood vessel formation.
- the present invention provides a method of treating vascular disease or vascular dysfunction.
- the present invention provides a method of treating cranial nervous system diseases.
- Multipotent stem cells obtained by culturing under the specific culture conditions of the present invention share several characteristics with conventional MSCs (mesenchymal stem cells or mesenchymal stromal cells), but unlike conventional MSCs, they express the CD141 cell surface antigen.
- MSCs meenchymal stem cells or mesenchymal stromal cells
- vMSC has excellent cell expansion ability, has a direct vascular endothelial formation effect, and has a paracrine effect of vascular regeneration-related factors by other MSCs and, unlike conventional stem cells, also has an autocrine effect of vascular regeneration-related factors. Therefore, it has a higher survival and retention rate in tissues than conventional stem cell treatments, and can be used as a stem cell treatment for blood vessel regeneration that directly forms blood vessels.
- Figure 1 is a diagram showing the colony morphology of CD141 + vMSC formed in various extracellular matrices.
- Figure 2 is a diagram confirming cell characteristics according to marker expression of CD141 + vMSC.
- Figure 3 is a diagram showing the results of discovering a new marker specific to CD141+vMSC, which is distinct from BM-MSC, through marker screening.
- Figure 4 is a diagram evaluating the cell expansion ability of CD141 + vMSC
- Figure 5 is a diagram evaluating pluripotency, which is a stem cell characteristic of CD141 + vMSC.
- Figure 7 is a diagram measuring the autocrine HGF expression level of CD141 + vMSC and analyzing signaling activity through the c-MET receptor:
- Figure 7a HGF concentration in the culture medium when CD141 + vMSC were cultured with EGM-2-FBS + 2%hPL medium;
- Figure 7b HGF concentration in culture medium when BM-MSCs were cultured with StemMACS medium
- Figure 7c HGF concentration in the culture medium when CD141 + vMSC and BM-MSC at passage 3 were cultured under the same conditions in medium lacking angiogenic growth factors (MEM alpha +0.2% hPL);
- Figure 7d Expression level of HGF receptor (c-Met) and c-Met activity (phosphorylation) in CD141 + vMSC and BM-MSC by passage;
- Figure 7f Quantification of activity (phosphorylation) of C-Met.
- Figure 8 is a diagram analyzing blood vessel sprouting ability by HGF in CD141 + vMSC spheroids and BM-MSC spheroids:
- FIG. 8A CD141+vMSC
- Figure 9 is a diagram analyzing the blood vessel sprouting ability of CD141 + vMSC spheroids by bFGF secreted by BM-MSCs.
- Figure 10 is a diagram confirming the blood vessel sprouting ability of CD141 + vMSC spheroids by VEGF or bFGF:
- Figure 10a and c Vascular sprouting ability of vMSC spheroids by VEGF or bFGF;
- Figure 10b and d Vascular sprouting ability of BM-MSC spheroids by VEGF or bFGF;
- Figure 10E mRNA expression of VEGFR2 in vMSCs and BM-MSCs (control: HUVECs).
- Figure 11 is a diagram confirming the promotion of vascular sprouting ability of HUVEC spheroids by HGF secreted by vMSC
- Figure 12 is a diagram showing the results of comparing the characteristics of EPC and CD141 + vMSC previously reported in the literature.
- Figure 15 is from adipose tissue This is a schematic diagram showing the process of separating CD141+vMSC.
- Figure 16 is a diagram comparing cell shapes of CD141 + vMSC and AD-MSC by passage.
- Figure 17 is a diagram comparing the cumulative cell numbers of CD141 + vMSCs and AD-MSCs.
- Figure 18 is a diagram comparing cell surface markers of CD141 + vMSC and AD-MSC.
- Figure 19 is a diagram comparing the angiogenic ability of CD141 + vMSC and AD-MSC.
- Figure 20 is a diagram establishing a critical limb ischemia animal model.
- Figure 21 is a diagram evaluating the efficacy of foot preservation in a critical limb ischemia model by treatment with composite stem cells combining CD141 + vMSCs and BM-MSCs.
- Figure 22 is a diagram evaluating the grade of ischemic lesion necrosis in a severe limb ischemia model by treatment with composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC.
- Figure 23 is a diagram analyzing blood flow changes in a critical limb ischemia model by treatment with composite stem cells combining CD141 + vMSCs and BM-MSCs.
- Figure 24 is a diagram evaluating the foot preservation efficacy of composite stem cells combining CD141 + vMSCs and BM-MSCs to determine the minimum effective dose as a stem cell treatment.
- Figure 25 is a diagram evaluating ischemic lesion necrosis grade and blood flow to determine the minimum effective dose of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC as a stem cell treatment.
- Figure 26 is a diagram evaluating the effect of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC compared to individual administration of each cell in terms of foot preservation efficacy.
- Figure 27 is a diagram evaluating the effect of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC compared to single administration of each cell in terms of ischemic lesion necrosis grade.
- Figure 28 is a diagram evaluating the effect of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC compared to single administration of each cell in terms of blood flow.
- Figure 29 is a diagram visually confirming the blood vessel formation of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC in a severe limb ischemia model:
- Figure 30 is a diagram confirming blood vessel formation of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC in a severe limb ischemia model by immunofluorescence staining:
- Figure 31 is a diagram confirming the in vivo blood vessel formation of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC in a critical limb ischemia model by tissue immunostaining:
- Figure 31a Structure of blood vessels and respective markers
- FIG. 31b Tissue immunostaining results.
- Figure 32 is a diagram analyzing the in vivo blood vessel formation of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC in a severe limb ischemia model, classified according to blood vessel diameter.
- Figure 33 is a diagram confirming the safety of composite stem cells combining CD141 + vMSC and BM-MSC.
- the present invention relates to stem cells expressing CD141 (thrombomodulin TM) cell surface antigen.
- the stem cells expressing the cell surface antigen CD141 may be vasculogenic multipotent stem cells (vMSCs).
- the cells may be CD141 + vMSCs (Vasculogenic Multipotent Stem Cells) deposited under accession number KCLRF-BP-00524.
- vMSCs Vasculogenic Multipotent Stem Cells
- the vMSCs may be derived from umbilical cord blood, umbilical cord, fat, or bone marrow, and are more preferably derived from bone marrow or fat.
- the vMSCs may have vascular regeneration or blood vessel formation ability.
- the vMSCs may have pluripotency and may have the ability to differentiate into adipocytes, osteocytes, chondrocytes, or myocytes.
- the vMSCs may overexpress HGF (Hepatocyte growth factor) and its receptor compared to other stem cells.
- HGF Hepatocyte growth factor
- the cells may have a population doubling time (PDT) of 0.5 to 1.5 days.
- PDT population doubling time
- the vMSCs can be differentiated into vascular endothelium in vivo, and the vascular endothelium can be CD31 positive.
- the vMSCs may promote neovascularization by basic fibroblast growth factor (bFGF) or HGF.
- bFGF basic fibroblast growth factor
- HGF HGF
- the vMSCs do not express CD31, CD309, CD34, eNOS, VE-cadherin or VEGF receptor, but may express CD105, CD90, CD29, CD73 or CD44.
- the vMSCs may not form new blood vessels due to VEGF.
- the stem cells may be adult stem cells, and may be or have characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs).
- MSCs mesenchymal stem cells
- the mesenchymal stem cells are umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (UCB-MSC), umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC), , may be adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC).
- UB-MSC umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells
- UC-MSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
- AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
- BM-MSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
- stem cell refers to a cell that can differentiate into various cells that make up biological tissues, and is an undifferentiated cell that can regenerate indefinitely to form specialized cells of tissues and organs. refers to them.
- Stem cells are pluripotent or pluripotent cells capable of development. Stem cells proliferate into mature, complete cells of tissue.
- the term "mesenchymal stem cell” refers to an undifferentiated cell with multipotency derived from adult cells of mammals, including humans, preferably human, including adipocytes, It refers to stem cells with multipotency that can differentiate into osteocytes, cartilage cells, muscle cells, nerve cells, and cardiomyocytes.
- Mesenchymal stem cells can be derived from a variety of adult cells, for example, bone marrow, blood, brain, skin, fat (i.e., adipose tissue or adipocytes), umbilical cord blood, and Wharton's jelly of the umbilical cord. .
- differentiation used in the present invention refers to a phenomenon in which less specialized cells develop into specific cells and the size, shape, membrane potential, metabolic activity, and response to signals change to a specific type of cell.
- differentiation refers to the phenomenon in which stem cells develop directionally into cells with specific functions.
- the term “expression” generally refers to the cellular process by which a biologically active polypeptide is produced from a DNA sequence and exhibits biological activity in a cell.
- gene expression not only involves transcription and translation processes, but also includes post-transcriptional and post-translational processes that can affect the biological activity of the gene or gene product. These processes include, but are not limited to, RNA synthesis, processing and transport, as well as polypeptide synthesis, transport and post-translational modifications of polypeptides.
- the term "overexpression” refers to a significant up-regulation of the mRNA or protein expression of a specific gene by intracellular transcription or translation. .
- not expressed refers to the significant "down-regulation" of the expression of a specific gene into mRNA or protein by intracellular transcription or translation. This means that the amount of expression is almost non-existent.
- the expression is performed using a polymerase using a nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, a primer pair, a probe, or a primer pair and probe that specifically recognizes a fragment of the nucleic acid sequence and the complementary sequence.
- vascular regeneration used in the present invention refers to repairing damage to damaged blood vessels.
- angiogenesis that is, regeneration of damaged blood vessels is promoted, and already damaged blood vessels are further damaged by continuous external forces, etc. It means preventing something from happening.
- the “angiogenesis” or “angiogenesis” refers to a natural healing process that forms new blood vessels to supply blood to organs or damaged tissues.
- Angiogenesis plays an important role in the progression and treatment of many diseases. .
- the vMSCs of the present invention have angiogenic ability even in media lacking angiogenic growth factors, and the cells themselves secrete high concentrations of HGF, an angiogenic growth factor, and overexpress its receptor, c-Met, making HGF an autocrine factor.
- vMSCs of the present invention have blood vessel regeneration, angiogenesis, or angiogenesis effects through autocrine and paracrine effects.
- angiogenesis may be achieved by the autocrine and paracrine effects of vMSC.
- vMSCs have the ability to form blood vessels even in media lacking angiogenic growth factors, and the cells themselves secrete high concentrations of HGF, an angiogenic growth factor, and overexpress its receptor, c-Met, using HGF as an autocrine factor.
- Blood vessel sprouting is promoted.
- vascular sprouting of mature vascular endothelial cells (HUVEC) is promoted by HGF secreted by vMSC, thereby having a paracrine effect.
- HGF secreted by vMSCs since blood vessel sprouting is promoted by bFGF secreted by BM-MSCs, it has a paracrine effect.
- the present invention relates to a cell therapeutic composition for vascular regeneration or blood vessel formation, comprising the stem cells of the present invention as an active ingredient.
- the composition may further include bone marrow-derived mesenchymal stem cells or adipose-derived mesenchymal stem cells.
- the bone marrow-derived mesenchymal stem cells or adipose-derived mesenchymal stem cells may not express the CD141 cell surface antigen.
- the stem cells (vMSC) of the present invention and the bone marrow-derived mesenchymal stem cells or adipose-derived mesenchymal stem cells may be included in a ratio of 1:10 to 10:1 based on the number of cells, and 1: It is preferable to include it at a ratio of 1 to 10:1, more preferably at a ratio of 1:1 to 3:1, and most preferably at a ratio of 2:1.
- the composition may additionally include HGF or bFGF.
- vascular regeneration may include arterial regeneration, arteriole regeneration, vein regeneration, capillary regeneration, blood-brain barrier (BBB) regeneration, or retinal vascular regeneration.
- BBB blood-brain barrier
- the stem cells may be stem cells cultured in 3D.
- the cell therapy composition can be stored frozen and used for vascular regeneration.
- the cell therapy agent can be administered to the human body through any general route as long as it can reach the target tissue, and can be administered parenterally or orally.
- the cell therapy agent can be administered by enclosing the cells in a transplant material, etc.
- the present invention relates to a cell therapeutic composition for treating brain nervous system diseases, comprising the stem cells of the present invention as an active ingredient.
- the cranial nervous system disease may be a degenerative brain disease, mental illness, or developmental disorder.
- the degenerative brain disease includes cognitive dysfunction, Alzheimer's disease, Dementia with Lewy bodies, frontotemporal dementia, Parkinson's disease, and Creutzfeldt disease.
- -It may be Creutzfeldt-Jakob disase (CJD), Huntington's disease, multiple sclerosis, or Gilllain-Barre Syndrome (GBS).
- the mental disorder includes bipolar disorder, autism, depression, hyperactivity, attention deficit disorder, autism, post-traumatic stress disorder (PTSD), anxiety disorder, sleep disorder, panic disorder, intellectual disability, poor memory, drug addiction, schizophrenia. It may be an illness, obsessive-compulsive disorder, grandiose delusions, personality disorder, alcoholism, or bipolar disorder.
- the developmental disorder is epilepsy, cerebral palsy, developmental language disorder, disorder of sense, learning disorder, attention deficit hyperactivity disorder. It may be attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), autism spectrum disorder (ASD), intellectual disability, cognitive impairment, or impulse control disorders.
- ADHD attention deficit hyperactivity disorder
- ASD autism spectrum disorder
- stem cell therapy used in the present invention refers to the process of proliferating and selecting in vitro using living autologous, allogenic, or xenogenic stem cells to restore tissue and function of cells. It refers to a therapeutic agent used for tissue regeneration treatment by introducing it into the body.
- the present invention relates to a transplant material for vascular regeneration comprising the stem cells of the present invention or the cell therapeutic composition of the present invention as an active ingredient.
- the implant material is a film, membrane, sheet, rod, screw, anchor, pin, implant, stent, surgical suture, scaffold for tissue regeneration, bio nanofiber, hydrogel, bio sponge, and bone plate. and surgical implants such as bone grafts, medical supplies, or medical devices.
- the graft material when the graft material is a hydrogel, it can be administered orally and used to promote vascular regeneration of internal organs.
- the implant material may further include a biodegradable polymer.
- the graft material may be a composite scaffold for tissue engineering, and the composite scaffold for tissue engineering may contain the stem cells of the present invention or the cell therapy composition of the present invention in a scaffold made by molding a biodegradable polymer.
- the graft material may be a graft material in which the stem cells or cell therapy of the present invention is inoculated into a composite scaffold for tissue engineering.
- the polymer forming the hydrogel is polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polyhydroxyethyl methacrylate (PHEMA), polyacrylic acid (PAA), and polyvinyl Alcohol (PVA), poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), polyvinylpyrrolidone (PVP), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone (PCL), gelatin, hyaluronic acid.
- PEG polyethylene glycol
- PEO polyethylene oxide
- PHEMA polyhydroxyethyl methacrylate
- PAA polyacrylic acid
- PVA polyvinyl Alcohol
- PVP poly (N-isopropylacrylamide)
- PVP polyvinylpyrrolidone
- PLA polylactic acid
- PGA polyglycolic acid
- PCL polycaprolactone
- It may be ronic acid, alginate, carrageenan, chitosan, hydroxyalkylcellulose, alkylcellulose, silicone, rubber, agar, carboxyvinyl copolymer, polydioxolane, polyacrylic acetate, polyvinyl chloride, or maleic anhydride/vinyl ether.
- biodegradable polymer used in the present invention refers to a polymer that spontaneously and slowly decomposes in vivo after a certain period of time, and refers to one of biocompatibility, blood compatibility, anti-calcification properties, cellular nutrients, and the ability to form an intercellular matrix. It refers to a polymer that has the above characteristics.
- biodegradable polymers are not specifically limited in the present invention, but representative examples include fibrin, collagen, gelatin, chitosan, alginate, hyaluronic acid, dextran, polylactic acid, poly(glycolic acid) (PGA), Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA, poly- ⁇ -(caprolactone), polyanhydride, polyorthoester, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyurethane , polyacrylic acid, poly-N-isopropylacrylamide, poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) copolymer, copolymers thereof, mixtures thereof, etc. can be used.
- the composite support is manufactured by known methods, such as solvent-casting and particle-leaching technique, gas forming technique, and polymer mesh by turning polymer fibers into non-woven fabric.
- Manufactured by molding biodegradable polymers according to the fiber extrusion and fabric forming process, thermally induced phase separation technique, emulsion freeze drying method, and high pressure gas expansion method. can do.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular disease or vascular dysfunction, comprising the stem cells of the present invention or the cell therapeutic composition of the present invention as an active ingredient.
- the vascular disease may be traumatic vascular injury, peripheral vascular disease, cardiovascular disease, cerebrovascular disease, or ischemic disease
- the ischemic disease may be ischemic myocardial infarction, ischemic heart disease, ischemic vascular disease, ischemic enteritis, and ischemic eye disease.
- ischemic glaucoma ischemic renal failure, ischemic retinopathy, ischemic stroke, or ischemic lower extremity disease.
- the vascular disease or vascular dysfunction is critical limb ischemia, diabetic angiogenesis disorder, vascular dementia, diabetic organ damage, arteriosclerosis, angina pectoris, peripheral cardiovascular disease, hypertension, cerebral infarction, brain injury sequelae, heart failure, peripheral It may be circulatory disorder, myocardial infarction, arterial occlusive disease, stroke, spinal cord injury, spinal nerve sequelae, degenerative disease, cerebral infarction sequelae, peripheral nerve disorder, diabetic ulcer, presbyopia, degenerative hearing loss, brain surgery sequelae, ischemic attack, or subarachnoid hemorrhage. there is.
- the composition may induce angiogenesis or angiogenesis, promote vascular regeneration or tissue regeneration, improve vascular function, increase tissue perfusion and new blood vessel formation.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cranial nervous system diseases, comprising the stem cells of the present invention or the cell therapy composition of the present invention as an active ingredient.
- the cranial nervous system disease may be a degenerative brain disease, mental illness, or developmental disorder.
- the degenerative brain disease includes cognitive dysfunction, Alzheimer's disease, Dementia with Lewy bodies, frontotemporal dementia, Parkinson's disease, and Creutzfeldt disease.
- -It may be Creutzfeldt-Jakob disase (CJD), Huntington's disease, multiple sclerosis, or Gilllain-Barre Syndrome (GBS).
- the mental disorder includes bipolar disorder, autism, depression, hyperactivity, attention deficit disorder, autism, post-traumatic stress disorder (PTSD), anxiety disorder, sleep disorder, panic disorder, intellectual disability, poor memory, drug addiction, schizophrenia. It may be an illness, obsessive-compulsive disorder, grandiose delusions, personality disorder, alcoholism, or bipolar disorder.
- the developmental disorder is epilepsy, cerebral palsy, developmental language disorder, disorder of sense, learning disorder, attention deficit hyperactivity disorder. It may be attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), autism spectrum disorder (ASD), intellectual disability, cognitive impairment, or impulse control disorders.
- ADHD attention deficit hyperactivity disorder
- ASD autism spectrum disorder
- the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
- pharmaceutically effective amount refers to an amount that is sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and does not cause side effects
- the effective dose level is the amount of the individual's Factors including health status, type and severity of vascular disease or vascular dysfunction, activity of drug, sensitivity to drug, method of administration, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs combined or used simultaneously, and other medical It can be determined based on factors well known in the field.
- composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
- the pharmaceutical composition of the present invention may contain a carrier, diluent, excipient, or a combination of two or more commonly used in biological products.
- a carrier diluent, excipient, or a combination of two or more commonly used in biological products.
- pharmaceutically acceptable means that the composition exhibits non-toxic properties to cells or humans exposed to the composition.
- the carrier is not particularly limited as long as it is suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
- saline solution sterilized water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these ingredients can be mixed and used, and if necessary, other ingredients such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents. Normal additives can be added.
- diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants can be additionally added to formulate dosage forms such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
- it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
- the pharmaceutical composition may be one or more formulations selected from the group including oral formulations, topical formulations, suppositories, sterile injectable solutions, and sprays.
- composition of the present invention may also include carriers, diluents, excipients, or combinations of two or more commonly used in biological products.
- Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited as long as they are suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
- the compounds described in, saline solution, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these ingredients can be mixed and used, and if necessary, other ingredients such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents. Normal additives can be added.
- diluents can be additionally added to formulate dosage forms such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
- dosage forms such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
- it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
- composition of the present invention may additionally contain one or more active ingredients that exhibit the same or similar functions.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include pharmaceutically acceptable additives, wherein the pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, and calcium hydrogen phosphate. , lactose, mannitol, taffy, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, Calcium stearate, white sugar, dextrose, sorbitol, and talc can be used.
- the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably contained in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
- composition of the present invention can be administered parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) depending on the desired method, and the dosage is determined by the patient's weight, age, gender, health condition, diet, and administration. The range varies depending on time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
- the daily dosage of the composition according to the present invention is 0.0001 to 10 mg/ml, preferably 0.0001 to 5 mg/ml, and it is more preferable to administer it once or several times a day.
- the present invention is a method of mixing bone marrow mononuclear cells (cryopreserved, BM-MNCs) or fat-derived stroma vascular fraction (SVF) with human platelet lysate. It relates to a method for producing stem cells expressing CD141 cell surface antigen, comprising culturing in a medium containing and not containing serum.
- BM-MNCs bone marrow mononuclear cells
- SVF fat-derived stroma vascular fraction
- the invention relates to the use of stem cells expressing the CD141 cell surface antigen for use in vascular regeneration or angiogenesis.
- the present invention relates to a method for blood vessel regeneration or blood vessel formation, comprising administering stem cells expressing CD141 cell surface antigen to a subject.
- the present invention relates to a method of treating vascular disease or vascular dysfunction, comprising administering stem cells expressing the CD141 cell surface antigen to an individual suffering from vascular disease or vascular dysfunction.
- the present invention relates to a method of treating a cranial nervous system disease, comprising administering stem cells expressing the CD141 cell surface antigen to an individual suffering from a cranial nervous system disease.
- Example 1 Isolation of novel multipotent stem cells derived from bone marrow
- BM-MNCs human bone marrow mononuclear cells
- BM-MNCs are obtained by density gradient centrifugation with Ficoll-paque (Cytiva, MA, USA).
- the BM-MNC thus obtained was added to a TC-treated (Tissue culture treated) flask with 2% human platelet lysate (PL bioscience, GmbH, Germany) and 2 unit/mL heparin (Sigma-Aldrich, St. Louis).
- vMSCs Vasculogenic Multipotent Stem Cells
- the novel multipotent stem cells of the present invention begin to be observed from 3 to 5 days of culture, and the vMSCs cells forming the colonies observed during primary culture are spindle-shaped and long. It was observed that the colonies varied greatly in size and expanded significantly between 7 and 10 days.
- the first subculture of vMSCs is performed when the majority of colonies show a density of 80-90% or more.
- they are separated into single cells using trypsin or a trypsin substitute, and then transferred to a new flask at 1.0% density. Divide at 5.0
- EPC endothelial progenitor cells
- the vMSCs of the present invention exclude FBS from EGM-2 and are cultured in human PL (human PL). It is characterized by culturing with the addition of platelet lysate.
- HumaTein 100 ⁇ g/mL, ROKIT healthcare, Seoul, Republic of Korea
- ECM complex derived from human fibroblast, human type I collagen (0.2 ⁇ g/cm 2 ) (Corning, NY, USA), Fibronectin (1 ⁇ g/cm 2 ) (Sigma-Aldrich), porcine collagen type 1-P (Cellmatrix Type IP) (Nitta Gelatin, Osaka, Japan), rat tail-derived collagen type 1 (Collagen type I) from rat tail) (50-825 ⁇ g/mL) (ThremoFisher, MA, USA) and collagen type 1 peptide (Corning).
- ECM-coated flask As described above, more colonies were obtained than in a regular TC-treated flask, but there was no significant difference ( Figure 1).
- the initial culture yield may vary depending on the presence and type of ECM coating, but there was little difference in the proliferation rate after P1 depending on the type and presence of the coating.
- the novel vMSCs of the present invention cannot maintain the characteristics of CD141+vMSCs when cultured using FBS from the existing EGM-2 bullet kit instead of human PL, and the expression of CD141 further increases due to the addition of human PL, so their culture medium It is essential to add human PL to the EGM-2 bullet kit (Lonza) and exclude FBS. Since there is no problem with growth even if IGF and VEGF are removed, IGF and VEGF can be excluded.
- EPC and vascular endothelial cell markers in the vMSC of the present invention was confirmed by flow cytometry, and the expression of eNOS and VE-cadherin expressed by mature vascular endothelial cells was confirmed by immunofluorescence staining analysis, which was confirmed by BM- They were compared with MSC (bone marrow mononuclear cells) and HUVEC (Human umbilical cord endothelial cells), respectively.
- MSC bone marrow mononuclear cells
- HUVEC Human umbilical cord endothelial cells
- vMSCs and BM-MSCs were each resuspended in PEB buffer containing 2mM EDTA and 0.5% BSA (Bovine serum albumin) (Sigma-Aldrich), and then incubated with human FcR blocking reagent (Miltynyi biotec). Blocked at 4°C for 10 minutes. Then, Alexa flour 488-conjugated vWF antibody (Abcam, 1:500), fluorescein-labeled UEA-1 (Vectorlabs, 3:100), and allophycocyanin (APC)-conjugated CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, and CD73.
- BSA Bovine serum albumin
- CD90, CD105, and CD309 antibodies (Miltenyl Biotec, 1:50), respectively.
- Isotype IgG combined with APC (Miltenyl Biotec. 1:50) and Alexa flour 488 (Abcam, 1:500) was used as a control group.
- cells were washed with PEB buffer and centrifuged at 1,000 ⁇ g and 4 °C for 5 minutes. Finally, the cells were resuspended in PEB buffer and analyzed using a NovoCyte 3000 flow cytometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) and NovoExpress software.
- vMSCs and HUVECs were each cultured on a cover slip, fixed with 3.7% formaldehyde (Sigma-Aldrich), and the cell membrane was permeabilized with 0.2% Triton X-100.
- reaction was performed with 20% NGS (normal goat serum) at room temperature for 1 hour, and e-NOS (Cell Signaling Technology, MA, USA, 1:400) and VE- diluted in 20% NGS were used as primary antibodies. Each was reacted with cadherin (Cell Signaling Technology, 1:400) at 4°C overnight.
- Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen, MA, USA, 1:1000) diluted in 20% NGS at room temperature for 1 hour.
- the samples were mounted with a mounting solution containing DAPI (Vector Laboratories, CA, USA), and images were obtained using a fluorescence microscope (Leica).
- vMSCs of the present invention expressed CD105, CD90, CD29, CD73, and CD44, all known as MSC markers, and did not express CD31, CD309, and CD34, which are commonly expressed by previously reported EPCs.
- Figure 2a immunofluorescence staining analysis results showed that vMSCs of the present invention did not express eNOS and VE-cadherin, unlike HUVECs, which were the positive control group ( Figure 2c). Through this, it can be seen that vMSC shares more markers with MSC than with EPC.
- vMSC-specific markers of the present invention that are distinct from BM-MSCs.
- MACS®Marker Screen human, version 02 (Miltenyi Biotec), which can analyze 378 surface antigen markers using flow cytometry, was used, and the experiment was performed according to the manufacturer's instructions.
- vMSCs (5.7x10 7 ) and BM-MSCs (5.7x10 7 ) of Passage 3 derived from the same donor were resuspended in PEB buffer and then blocked with human FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) at 4°C for 10 minutes. .
- 6 isotype controls and 378 antibodies were distributed to four 96-well plates at 1.2x10 5 /well and reacted at 4°C for 20-30 minutes. After washing with PEB buffer, centrifugation at 300 and analyzed.
- CD282 was not expressed in BM-MSCs, but was expressed in as little as 30% to as much as 90% of vMSCs, showing large variation between donors ( Figure 3c).
- PEAR1 is expressed in 70 to 99% of vMSCs, but in BM-MSCs, it is expressed in as little as 20% to as much as 90%, showing very large variation between donors ( Figure 3d).
- CD141 + vMSC were cultured from 20 or more donors to passage 3 by the method described in Example 1 above, and BM-MNC were grown at the same time as the primary CD141 + vMSC culture.
- StemMACSTM expansion media, XF (Miltenyi Biotec , Bergisch Gladbach , Germany) (StemMACS) was distributed at 4.0-7.0 It was carried out at the same time as.
- the PDT population doubling time
- the number of primary cultured MNCs for each passage of the CD141 + vMSCs and BM-MSCs were fixed at 1x10 7 and the cumulative cell number up to passage 3 was measured.
- CD141 + vMSCs and BM-MSCs derived from the same donor were cultured in adipogenic differentiation induction medium.
- CD141 + vMSCs were dispensed into 6-well plates with EGM-2-FBS+2%hPL medium
- BM-MSCs were dispensed with StemMACS medium at 1.0x10 3 /cm 2 and a density of almost 100% was reached.
- the medium was replaced with StemProTM Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco) medium, which is an adipogenic differentiation induction medium, and cultured for 14 days, replacing the medium with new medium every 3-4 days.
- CD141 + vMSCs and BM-MSCs derived from the same donor were cultured in osteogenic differentiation induction medium.
- CD141 + vMSCs were dispensed into 6-well plates with EGM-2-FBS+2%hPL medium
- BM-MSCs were dispensed with StemMACS medium at 1.0x10 3 /cm 2 and a density of 80-90% was reached.
- the medium was replaced with the StemProTM Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco) medium, which is an osteogenic differentiation induction medium, and cultured for 21 days, replacing the medium with new medium once every 3-4 days.
- CD141 + vMSCs and BM-MSCs derived from the same donor were cultured in chondrogenic differentiation induction medium.
- CD141 + vMSCs were dispensed into 6-well plates with EGM-2-FBS+2%hPL medium
- BM-MSCs were dispensed with StemMACS medium at 1.0x10 3 /cm 2 and a density of almost 100% was reached.
- the cartilage differentiation inducing medium, StemProTM Chobdrogenesis Differentiation Kit (Gibco) was replaced and cultured for 21 days, replaced with new medium every 3-4 days.
- the novel CD141 + vMSC of the present invention possesses pluripotency that has not been reported in existing EPCs and differentiates into fat, bone, and cartilage like MSC.
- Matrigel tube formation assay was performed. Specifically, Matrigel (Corning Inc, NY, USA) was treated at 10 ⁇ l per well on a ⁇ -slide (ibidi, Grafelfing, Germary), and CD141 + vMSC, BM-MSC, and HUVEC were each deficient in growth factors and incubated with 0.2% hPL.
- BM-MSCs were unable to form a vascular network structure in both media, and HUVEC, a vascular endothelial cell, formed a vascular network structure very well in EGM2 medium containing angiogenic growth factors, but lack of angiogenic growth factors. While it was shown that the vascular network structure was not maintained in the MEM ⁇ +0.2% hPL medium without addition, in the case of the CD141 + vMSC of the present invention, a very thick and large vascular network structure was formed in the EGM2 medium, and a small and large vascular network structure was formed in the MEM ⁇ +0.2% hPL medium. It was shown to form many vascular network structures (Figure 6). In other words, CD141 + vMSCs were shown to have angiogenic ability even in medium lacking angiogenic growth factors.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Molecular Device, SpectraMax ABS) according to the manufacturer's instructions, and then divided by the number of cells to analyze the amount of HGF secreted per cell. In this way, the cells were cultured until passage 4, and the culture supernatant was collected just before passage, and the level of HGF secretion was analyzed.
- CD141 + vMSC was found to secrete 14 to 130 times more HGF than BM-MSC ( Figures 7a and b), and under the same conditions, CD141 + vMSC It was found to secrete HGF about 9 times higher than these BM-MSCs ( Figure 7c).
- CD141 + vMSCs and BM-MSCs were cultured, and the cells obtained for each passage were lysed using 2mM PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride, Sigma-Aldrich) and lysis buffer (Cell signaling tech.) Protein lysate was obtained by centrifuging at 14,000 xg at 4°C for 10 minutes and collecting only the supernatant. Protein lysates adjusted to the same concentration by BCA analysis (Thermo Fisher Scientific) were separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane.
- PMSF phenylmethylsulphonyl fluoride
- lysis buffer Cell signaling tech.
- C-Met cell signaling tech, 1:1000
- phosphor-c-Met cell signaling, 1:1000
- Antibodies against ⁇ -tubulin Sigma-Aldrichi, 1:4000
- HRP-conjugated secondary antibody at room temperature for 1 hour
- the membrane on which the antibody reaction was completed was treated with EZ-western Lumi pico (Dogen, Seoul, Korea) to emit light, and the signal was detected with a chemilluminator and imaged using Image J software.
- EZ-western Lumi pico Dogen, Seoul, Korea
- CD141 + vMSC cells (CD141 + vMSC) were found to express significantly more HGF receptor (c-Met) than BM-MSC cells ( Figures 7d and e). There appeared to be no difference in activity between the two cells ( Figures 7d and f). Therefore, it was confirmed that CD141 + vMSC not only secretes a large amount of HGF on its own, but also expresses a large amount of the HGF receptor (c-Met), and can use HGF as an autocrine factor.
- CD141 + vMSC spheroids and BM-MSC spheroids were prepared using the hanging drop method, and then treated with HGF or HGF-neutralizing antibodies for inhibition of HGF to perform in vitro spheroid sprouting analysis. assay) was performed. Specifically, CD141 + vMSCs and BM-MSCs were grown at 2x10 cells/mL in 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 1% P/S, and 0.2% methylcellulose (Sigma-Aldrich, St.
- CD141 + vMSC and BM-MSC spheroids formed after 24 hours of culture were cultured using 3 mg/mL Collagen type I-A (final concentration 1.44 mg/mL; Nitta Gelatin) and methylcellulose (final concentration 0.48%; Sigma-Aldrich) (Collagen gel). mixture) and dispensed 0.7 mL each into a 24-well plate.
- the collagen gel mixture containing spheroids was polymerized in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 30 minutes.
- 500 ng/mL of HGF neutralizing antibody MAB294, R&D systems; Anti-HGF Ab
- HGF neutralizing antibody control group: 500ng/mL mouse IgG, IgG
- M199 Sigma-Aldrich
- the vMSC spheroids of the present invention showed a significant increase in blood vessel sprouting upon treatment with HGF, and a decrease in blood vessel sprouting when simultaneously treated with HGF and an HGF-neutralizing antibody (Figure 8a).
- BM-MSC (MSCs) spheroids showed no change in blood vessel sprouting following treatment with HGF or its neutralizing antibody ( Figure 8b).
- CD141 + vMSCs have HGF-dependent germination ability. They secrete a lot of HGF and express a lot of c-Met, so they can germinate using HGF as an autocrine factor. You can see that it is possible.
- Example 6-3-1 in vitro spheroid sprouting assay was performed using BM-MSC and/or PD173074 (Tocris), a bFGF receptor inhibitor. , Bristol, UK) was diluted in M199 medium (Sigma-Aldrich) and applied at 100 ⁇ l on top of the collagen gel mixture, cultured for 48 hours, and the effect of bFGF secreted by BM-MSC on spheroid germination of CD141 + vMSC was analyzed. The impact was confirmed.
- M199 medium Sigma-Aldrich
- the bFGF receptor inhibitor PD173074 inhibits the paracrine effect of BM-MSC on blood vessel sprouting of vMSC, and when CD141 + vMSC of the present invention is used in combination with HGF, bFGF or BM-MSC, blood vessel formation It was inferred that a synergistic effect would occur.
- CD141 + vMSC spheroids and BM-MSC spheroids did not respond to VEGF ( Figures 10a to d), which was consistent with the results that BM-MSCs and CD141 + vMSCs did not express the VEGF receptor ( Figures 10e).
- the neovascularization ability of CD141 + vMSC spheroids increased with bFGF treatment, but the BM-MSC spheroids showed no increase in neovascularization ability ( Figures 10a to d).
- HUVEC cells were cultured as spheroids using the hanging drop method as in Example 6-3-1 above, and non-contact with vMSC. After co-culture, spheroid sprouting assay was performed. At this time, in order to neutralize HGF among the secreted proteins of vMSC, 500 ng/mL of HGF neutralizing antibody (MAB294, R&D systems; Anti-HGF Ab) was mixed with M199 medium and polymerized to form a collagen gel containing HUVEC spheroids.
- HGF neutralizing antibody MAB294, R&D systems; Anti-HGF Ab
- HGF in the secreted proteome of vMSC has a cell sprouting effect on vascular endothelial cells (HUVEC), that is, it is a substance that promotes new blood vessel function.
- bone marrow-derived vMSC secrete an excessive amount of HGF related to angiogenesis, which has a paracrine effect in promoting new blood vessel sprouting of HUVEC.
- the CD141 + vMSC and EPC of the present invention have functionally similar characteristics, but the culture conditions and cell morphology (morphology) and the expression of cell surface markers was completely different.
- CD309 and CD31 which are expressed in all types of EPC, were hardly expressed in the CD141 + vMSC of the present invention.
- the CD141 + vMSCs of the present invention did not have their sprouting promoted by VEGF and did not express the VEGF receptor.
- CD141 + vMSCs possess pluripotency that has not been reported in existing EPCs. Therefore, it can be seen that the CD141 + vMSC cells of the present invention are functionally similar to generally known EPCs, but are a completely different type of cell from EPCs (FIG. 12).
- the novel stem cells CD141 + vMSC identified in the present invention do not express CD31, CD309, and CD34, unlike EPCs, and do not express eNOS and VE-cadherin, unlike vascular endothelial cells, and are mesenchymal stem cells. Unlike mesenchymal stem cells, they express CD141, overexpress HGF and its receptor cMET compared to mesenchymal stem cells, and have multipotency and angiogenesis-promoting effects. Therefore, they were named CD141 + Vasculogenic Mesenchymal Stem Cells by the Korea Cell Line Research Foundation (KCLRF). ) and was given the deposit number KCLRFBP00524.
- KCLRF Korea Cell Line Research Foundation
- BM-MSC was added, and Matrigel vascular network formation analysis was performed to confirm the optimal mixing ratio of the two types of cells. Specifically, Matrigel was dispensed onto a ⁇ -slide at 10 ⁇ l per well, gelled at 37°C for 30 minutes, and CD141 + vMSCs and BM-MSCs were seeded in ⁇ -MEM (MEM ⁇ +0.2%hPL) containing 0.2% hPL.
- BM-MSCs did not form a vascular network alone and tended to aggregate as the ratio of BM-MSCs increased compared to CD141 + vMSCs ( Figure 13a).
- CD141 + vMSC cells alone have excellent tube formation ability in vitro, but a loose structure was observed.
- BM-MSCs are added, a tighter and more mature vascular network is formed. appeared to form ( Figure 13b).
- CD141 + vMSCs alone have excellent in vitro blood vessel formation ability in a normal environment, a tighter and more mature vascular network can be formed by mixing BM-MSCs in an appropriate ratio.
- Stem cells from mesodermal tissue of adipose tissue can generate bone, cartilage, muscle, and fat tissue, and adipose tissue-derived stem cells, ASC (adipose-derived stem cells), have the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells (cell shape, expression markers, secreted cytokines, etc.), the initial tissue yield is higher than that of bone marrow, and are currently used as a bone marrow substitute due to the advantage of enabling cell transplantation at a faster passage. Therefore, adipose-derived vMSC were used in Example 1 above. It was separated similarly.
- adipose tissue (approximately 1.5 g) was obtained from the patient, chopping it with scissors, separating it into single cells using collagenase I, and centrifuging them to obtain SVF (stromal vascular fraction).
- Adipose-derived CD141 + vMSCs were obtained by culturing them in FBS (Fetal bovine serum)-depleted EGM2 (LONZA) + 2% PL (Platelet lysate, BioScience GmbH) medium coated with Humatein (Rokit healthcare) ( Figure 15) .
- FBS Fetal bovine serum
- EGM2 Longitrate
- PL Plate-depleted EGM2
- PL PL
- CD141 + vMSCs and AD-MSCs were analyzed by flow cytometry, and both types of cells showed characteristics of CD34 - , CD45 - , CD29 + , CD44 + , CD73 + and CD90 + , while CD141 + and PEAR1 expression was high in CD141 + vMSC (EGM2-FBS+2%hPL) and low in AD-MSC (HUMA) (Figure 18), comparing these two markers with adipose-derived CD141 + vMSC and AD-MSC. It was confirmed that it can be used as an important distinguishing marker.
- adipose-derived CD141 + vMSCs and AD-MSCs were grown singly (6,000 cells) or in a 2:1 ratio (vMSCs 4,000 cells + AD-MSCs). 2,000 cells) were mixed and dispensed into Matrigel with 1% hPL + 500 pg/ml TNF- ⁇ , and the shapes of blood vessels that appeared 24 hours later were compared.
- Model 1 in Figure 20 is a model in which the upper part of the common femoral artery and the superficial femoral artery is ligated using silk. In most mouse individuals, blood flow appears to recover over a certain period of time, making it a model for observing blood vessel formation and evaluating effectiveness.
- Model 2 critical limb ischemia, CLI
- CLI critical limb ischemia
- CD141 + vMSC + BM-MSC The effectiveness of CD141 + vMSC + BM-MSC as a combined stem cell treatment was evaluated in the critical limb ischemia mouse model (Model 2) prepared in Example 10, and the effect was observed for up to 24 weeks.
- a control group (G0) and a CD141 + vMSC + BM-MSC (cell count 2:1) administration group (G1) were set, and after creating a severe lower extremity ischemia model, ischemia occurred immediately with a dose of 1.2x10 5 cells. (position of blood vessel removal) Insulin was administered intramuscularly once using a syringe.
- the foot preservation rate in the control group was 0%, and most subjects showed foot/lower limb loss, but in the G1 group, foot preservation (Limb salvage) was observed. It was found to be about 63% or more (Figure 21).
- Example 11-1 After administration to the severe limb ischemia mouse model as in Example 11-1, it was graded into 7 levels according to the severity of ischemic necrosis in the area where ischemia occurred.
- Example 11-1 After administration to the mouse model of severe lower extremity ischemia as in Example 11-1, the blood flow between the contralateral side where ischemia did not occur and the foot where ischemia occurred (Ischemic side) was compared and calculated as a ratio (%). As a result, after creating the severe limb ischemia mouse model, the blood flow was G0: 52.4 ⁇ 4.9 and G1: 47.3 ⁇ 1.4, and a rapid decrease in blood flow was confirmed in both groups.
- a control group G0
- a high-dose group 1.2x10 Divided into 6 cells/50 ⁇ L, 24,000/ ⁇ L
- G1 medium dose group
- G2 medium dose group
- G3 low dose group
- D0 the foot preservation rate was 0% in the control group, and most foot/lower extremity loss was observed, whereas in the G1 and G2 groups, it was 42.9% and 75%, respectively.
- Example 12 Comparison of the effect of combined stem cell administration compared to administration of single stem cells
- CD141 + vMSCs and BM-MSCs were set and administered at a dose of 1.2x10 5 Cells.
- the foot preservation rate in the control group was 0%, and most individuals showed foot/lower limb loss, whereas in the G1 group, foot preservation (Limb salvage) was observed. It was found to be about 87.5% or more, and in the G2 group, the foot preservation rate was 25% and phalanx loss was relatively good at 25%, and in the G3 group, the foot preservation rate was 0% and phalanx loss was 25%. ( Figure 26).
- each group was Although there was no statistically significant difference between the groups, the G1 group began to show a statistically significant difference compared to the G0 group from day 2, and it was confirmed that the significant difference was maintained until day 28 ( Figure 27) (2 days after administration, G0 :3.5 ⁇ 0.2 VS G1:1.0 ⁇ 0, P ⁇ 0.001; and 28 days, G0: 4.8 ⁇ 0.3 VS G1: 0.4 ⁇ 0.4, P ⁇ 0.001).
- the G1 group showed statistically significant results compared to the G3 group from day 3 to day 28 (day 3, G1 VS G3: 2.9 ⁇ 0.4, P ⁇ 0.001; and day 28, G1 VS G3: 4.3 ⁇ 0.5, P ⁇ 0.001), in comparison with the G2 group, a statistically significant difference was confirmed at 3, 14, and 28 days (Figure 27) (3 days, G1 VS EPC G2: 2.2 ⁇ 0.3, P ⁇ 0.001; and 28 days, G1 VS G2: 2.7 ⁇ 0.6, P ⁇ 0.01).
- the G1 group showed a statistically significant improvement compared to the G3 group from day 7 to 28, and in comparison with the G2 group, a statistically significant difference was confirmed to appear on day 28 (Figure 28 ) (7 days, G1: 79.4 ⁇ 6.8 VS G3: 28.8 ⁇ 11.0, p ⁇ 0.05; 28 days, G1: 104.6 ⁇ 5.5 VS G3: 33.6 ⁇ 10.1, p ⁇ 0.001, G2: 53.9 ⁇ 9.3, p ⁇ 0.001) .
- CD141 + vMSC and BM-MSC were combined (CD141 + vMSC + BM-MSC) at the ischemic site of the mouse model of severe lower extremity ischemia, where blood vessels were removed, and the formation of blood vessels in vivo was observed 4 weeks after administration.
- CD31 + blood vessel staining of the entire muscle was performed in each group of mice in Example 13-1 using 3D immunofluorescence staining to observe blood vessel density.
- CD141 + vMSC + BM-MSC were used as a mouse model for severe limb ischemia.
- anti-human-CD31 antibody against CD31 a marker of vascular endothelial cells
- anti-A-SMA Alpha-smooth muscle actin
- CD141 + vMSC and BM-MSC were combined and administered to the muscle of the ischemic lesion in a mouse model of severe limb ischemia as in Example 13-3. Afterwards, the muscle in the ischemic lesion was stained using an immunofluorescence staining method using an antibody against TAGLN (Transgelin), a marker for smooth muscle cells, cells that make up blood vessels, and TAGLN + blood vessels were analyzed.
- TAGLN Transgelin
- the group administered CD141 + vMSC + BM-MSC in the ischemic lesion muscle showed a statistically significant increase in the number of TAGLN + blood vessels compared to the control group (Control) ( Figure 32) (Control: 31.6 ⁇ 3.0 VS composite stem cell : 57 ⁇ 6.8, p ⁇ 0.01).
- the results of measuring the inner diameter of blood vessels showed that the size of the inner diameter of blood vessels in the CD141 + vMSC + BM-MSC administration group was significantly larger than that in the control group ( Figure 32) (Control: 15.9 ⁇ 1.9 ⁇ M VS composite stem cells: 36.8 ⁇ 8.4 ⁇ m , p ⁇ 0.5).
- the number of blood vessels was measured by classifying the blood vessels according to the size of the vessel diameter.
- the diameter was 20 ⁇ m or less and 20 ⁇ m to 50 ⁇ m or less
- the control group and the CD141 + vMSC + BM-MSC administration group Although the number of blood vessels was not statistically significant, it was confirmed that the number was higher in the CD141 + vMSC + BM-MSC administration group.
- the number of blood vessels in the CD141 + vMSC + BM-MSC administration group was found to be significantly higher than the control group ( Figure 32) (Control: 0 VS CD141 + vMSC + BM-MSC:7 ⁇ 2, p ⁇ 0.05) .
- CD141 + vMSC and BM-MSC not only increases the number of blood vessels, but also increases blood flow in the ischemic area by forming blood vessels with a large inner diameter of 50 ⁇ m or more.
- toxicity was confirmed for 26 weeks after a single dose of 1.2x10 5 cells, 6x10 5 cells, or 1.2x10 6 cells was administered into the muscle.
- tumor formation and potential were observed for up to 26 weeks after a single subcutaneous administration at a dose of 1x10 7 cells and a single intramuscular administration at a dose of 2.4x10 6 cells.
- IHC analysis results showed that significantly more CD31 + blood vessels and Alpha-SMA + blood vessels were formed by combined/combined administration of CD141 + vMSCs and BM-MSCs compared to the control group (G0) (FIG. 33).
- the 1st week was the highest, and it was found to decrease until the 4th week and then remain at a similar level until the 26th week (total blood vessel count in Figure 33).
- complex stem cells were detected only in the muscles at the administration site at all observation points, and were not detected in other organs and tissues. The administered cells were detected in all subjects up to 4 weeks, but at 13 and 26 weeks.
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Abstract
본 발명은 신규하게 동정한 혈관 형성 특성을 가진 줄기세포 vMSC에 관한 것으로, 본 발명의 특정 배양 조건으로 배양하여 동정한 vMSCs는 종래의 MSCs와 달리 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 신규한 MSCs이고, vMSC는 세포확장력이 우수하며, 직접 혈관 형성 효과를 가지고, 다른 MSC에 의한 측분비 효과와 함께 종래의 줄기세포와 달리 자가분비 효과도 가지므로, 종래의 줄기세포 치료제들보다 조직 내 생존 및 잔류율이 높고, 직접 혈관을 형성하는 혈관 재생용 줄기세포치료제로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 신규하게 동정한 혈관 형성 특성을 가진 다능성 줄기세포 vMSC에 관한 것이다.
새로운 혈관은 혈관 신생(angiogenesis), 동맥신생(arteriogenesis) 및 맥관형성(vasculogenesis) 과정에 의해 생성되는데, 혈관 신생 과정은 이미 존재하는 성숙한 혈관내피세포(endothelial cell)들로부터 자라나는 혈관내피세포의 증식 및 이동과 관련이 있으며, 동맥신생은 이미 존재하는 소동맥 연결(arteriolar connection)을 측부혈관(collateral vessels)으로 리모델링하는 과정이고, 맥관형성은 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells)가 성숙한 혈관 내피세포로 분화되는 과정을 통해 진행된다. 따라서 골수로부터 나와서 순환하는 혈관내피전구세포는 혈관 손상 부위로 이동하고, 새롭게 형성되는 혈관으로의 직접적인 삽입 또는 다양한 신생혈관 형성 및 영양 인자들의 분비를 통해 새로운 혈관 형성에 관여한다. 따라서 혈관내피전구세포는 재생의학 분야 및 재혈관 신생을 통한 치료목적에 잠재적인 표적으로 주목받고 있다. 이에 혈관내피전구세포의 기능을 증가시키기 위한 연구가 진행되고 있는데, 일 예로 생체 외(ex vivo) 유전자를 변형시킨 재조합 EPCs의 제조에 대한 연구가 진행된 바 있고, 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 또는 저산소증 유도인자-1α(hypoxiainducible factor-1α)를 이용하여 EPCs의 혈관 신생능(proangiogenic capacity)을 증가시키는 기술이 연구된 바 있다. 현재 허혈성 혈관 질환에서의 세포치료로 이용되는 것은 크게 2 가지 세포로 나누어진다. 혈관 재생 역할을 하는 혈관내피전구세포 (Endothelial progenitor cell; EPC)와 혈관 생성에 기여하는 성장인자(growth factor)를 다량으로 분비하여 간접적으로 혈관 형성의 도움을 주는 측분비 효과(paracrine effect) 방식의 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell)가 있다. 그러나, 기존 EPC는 in vitro 세포 확장이 매우 어렵고 또한 세포 확장 중 기능을 유지하기가 어려우며, 동종 및 이종의 경우 면역 거부 등의 문제가 높은 세포군이고, 복잡한 구조의 혈관으로의 분화 및 기능이 어려운 한계가 있다. 또한, 허혈성 질환을 타겟으로한 기존 중간엽줄기세포 기반으로 개발된 치료제는 생착되지 않고 소실되기 때문에 혈관생성에 의한 치료방식이 아닌 측분비 효과에 의존하므로 임상에서 뚜렷한 치료 효과를 나타내지 못하고 있는 실정이다.
줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제(Cell therapy product)란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 세포치료제를 이용한 세포치료 이식술에서는 신체 내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질 발현된 신체를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들로 구성되는 각 세포 재료를 분리, 준비하고, 체외 환경에서 배양과정을 통해, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 가하여, 이식물을 수령할 개체에게 주입하거나, 이들 세포로 인체조직을 만듦으로써 치료용으로 쓰이게 된다. 줄기세포 치료제는 세포치료제 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심장질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이나 잘 재생되지 않는 분야에서 활발하게 연구가 진행되고 있다. 줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.
본 발명의 목적은 신규한 줄기세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 재생용 이식재를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신규한 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 혈관 재생 또는 혈관 형성에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 재생 또는 혈관 형성 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 치료 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 뇌신경계 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관 재생용 이식재를 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 혈관 재생 또는 혈관 형성에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관 재생 또는 혈관 형성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 뇌신경계 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 배양 조건으로 배양하여 수득한 vMSCs(multipotent stem cells)는 종래의 MSCs((mesenchymal stem cells or mesenchymal stromal cells)와 와 여러 특성을 공유하지만 종래의 MSCs와는 달리 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 신규한 MSCs이고, vMSC는 세포확장력이 우수하며, 직접 혈관내피 형성 효과를 가지고, 다른 MSC에 의한 혈관재생 관련 인자의 측분비 효과와 함께 종래의 줄기세포와 달리 혈관재생 관련 인자의 자가분비 효과도 가지므로, 종래의 줄기세포 치료제들보다 조직 내 생존 및 잔류율이 높고, 직접 혈관을 형성하는 혈관 재생용 줄기세포치료제로 활용할 수 있다.
도 1은 다양한 세포외기질에서 형성된 CD141+vMSC의 콜로니 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 CD141+vMSC의 마커 발현에 따른 세포 특성을 확인한 도이다.
도 3은 BM-MSC와 구별되는 CD141+vMSC 특이적인 신규 마커를 마커 스크리닝을 통해 발굴해낸 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 CD141+vMSC의 세포확장능력을 평가한 도이다
도 5는 CD141+vMSC의 줄기세포적 특성인 다분화능을 평가한 도이다.
도 6은 CD141+vMSC, BM-MSC 및 HUVEC의 배양 배지에 따른 혈관망 형성능을 확인한 도이다 (scale bar=200μm).
도 7은 CD141+vMSC의 자가분비 HGF 발현량 측정 및 c-MET 수용체를 통한 신호전달 활성을 분석한 도이다:
도 7a: CD141+vMSC를 EGM-2-FBS+2%hPL 배지로 배양했을 때 배양액 내 HGF 농도;
도 7b: BM-MSC를 StemMACS 배지로 배양했을 때 배양액 내 HGF 농도;
도 7c: 계대(Passage) 3의 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 혈관생성 성장인자가 부족한 배지 (MEM alpha +0.2% hPL)의 동일한 조건에서 배양했을 때 배양액 내 HGF 농도;
도 7d: CD141+vMSC 및 BM-MSC의 계대별 HGF 수용체 (c-Met)의 발현량 및 c-Met 활성 (인산화);
도 7e: C-Met의 발현량 정량화; 및
도 7f: C-Met의 활성 (인산화) 정량화.
도 8은 CD141+vMSC 스페로이드 및 BM-MSC 스페로이드에서 HGF에 의한 혈관 발아(sprouting) 능력을 분석한 도이다:
도 8a: CD141+vMSC; 및
도 8b: BM-MSC.
도 9는 BM-MSC가 분비하는 bFGF에 의한 CD141+vMSC 스페로이드의 혈관 발아 능력을 분석한 도이다.
도 10은 VEGF 또는 bFGF에 의한 CD141+vMSC 스페로이드의 혈관 발아 능력을 확인한 도이다:
도 10a 및 c: VEGF 또는 bFGF에 의한 vMSC 스페로이드의 혈관 발아능;
도 10b 및 d: VEGF 또는 bFGF에 의한 BM-MSC 스페로이드의 혈관 발아능; 및
도 10e: vMSC 및 BM-MSC에서의 VEGFR2의 mRNA 발현 (대조군: HUVECs).
도 11은 vMSC가 분비하는 HGF에의한 HUVEC 스페로이드의 혈관 발아능 촉진을 확인하는 도이다
도 12는 종래에 문헌에 보고된 EPC와 CD141+vMSC의 특성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 정상 환경에서 CD141+vMSC와 BM-MSC의 혈관망 형성능 비교 및 혈관 재생능을 극대화하기 위한 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 세포 구성비를 확인한 도이다 (scale bar=500μm).
도 14는 염증환경에서 CD141+vMSC의 혈관 재생능을 극대화하기 위한 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포 구성을 확인한 도이다 (scale bar=500μm).
도 15는 지방조직으로부터 CD141+vMSC를 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 16은 계대별 CD141+vMSC 및 AD-MSC의 세포 모양을 비교한 도이다.
도 17은 CD141+vMSC 및 AD-MSC의 누적 세포수를 비교한 도이다.
도 18은 CD141+vMSC 및 AD-MSC의 세포 표면 표지 마커를 비교한 도이다.
도 19는 CD141+vMSC 및 AD-MSC의 혈관 형성능을 비교한 도이다.
도 20은 중증하지허혈 동물 모델을 수립한 도이다.
도 21은 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 처리에 의한 중증하지허혈 모델에서의 족부 보존 효능을 평가한 도이다.
도 22는 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 처리에 의한 중증하지허혈 모델에서의 허혈 병변 괴사 등급을 평가한 도이다.
도 23은 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 처리에 의한 중증하지허혈 모델에서의 혈류량 변화를 분석한 도이다.
도 24는 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 줄기세포 치료제로서의 최소 유효 용량을 결정하기 위해 족부 보존 효능을 평가한 도이다.
도 25는 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 줄기세포 치료제로서의 최소 유효 용량을 결정하기 위해 허혈 병변 괴사 등급 및 혈류량을 평가한 도이다.
도 26은 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 각 세포의 단독투여 대비 효과를 족부 보존 효능으로 평가한 도이다.
도 27은 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 각 세포의 단독투여 대비 효과를 허혈 병변 괴사 등급으로 평가한 도이다.
도 28은 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 각 세포의 단독투여 대비 효과를 혈류량으로 평가한 도이다.
도 29는 중증하지허혈 모델에서 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 혈관 형성을 육안으로 확인한 도이다:
흰색 점선: 혈관이 제거된 부분; 및
노란색 화살표: 새롭게 형성된 혈관.
도 30은 중증하지허혈 모델에서 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 혈관 형성을 면역형광염색으로 확인한 도이다:
하얀색 박스(White Box): 혈관 제거 부위 (허혈 위치).
도 31은 중증하지허혈 모델에서 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 생체 내 혈관 형성을 조직면역염색으로 확인한 도이다:
도 31a: 혈관의 구조 및 각 마커; 및
도 31b: 조직면역염색 결과.
도 32는 중증하지허혈 모델에서 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 생체 내 혈관 형성을 혈관 직경에 따라 분류하여 분석한 도이다.
도 33은 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합한 복합줄기세포의 안전성을 확인한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD141(thrombomodulin TM) 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 세포 표면 항원 CD141을 발현하는 줄기세포는 혈관형성 다능성 줄기세포(Vasculogenic Multipotent Stem Cells, vMSCs)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포는 수탁번호 KCLRF-BP-00524로 기탁된 CD141+vMSCs(Vasculogenic Multipotent Stem Cells)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 제대혈 유래, 제대 유래, 지방 유래 또는 골수 유래일 수 있으며, 골수 또는 지방 유래인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 혈관 재생능 또는 혈관 형성능을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 다분화능을 가질 수 있으며, 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte) 또는 근세포(myocyte)로의 분화능을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 HGF(Hepatocyte growth factor) 및 이의 수용체를 다른 줄기세포에 비해 과발현할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포는 집단배가시간(population doubling time, PDT)이 0.5 내지 1.5일일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 생체 내에서 혈관내피로 분화될 수 있으며, 상기 혈관내피는 CD31 양성일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 HGF에 의해 신생 혈관 형성이 촉진될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 CD31, CD309, CD34, eNOS, VE-cadherin 또는 VEGF 수용체를 발현하지 않고, CD105, CD90, CD29, CD73 또는 CD44를 발현할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 vMSCs는 VEGF에 의해 신생혈관을 형성하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 줄기세포는 성체 줄기세포(adult stem cell)일 수 있으며, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)이거나 이의 특성을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, UCB-MSC), 제대 유래 중간엽 줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSC), 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, AD-MSC) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSC)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포(stem cell)"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 발명에서 사용된 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)"는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 다분화능(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포는, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사 활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 말하며, 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다. 특히, 줄기세포의 분화는 줄기세포가 특정 기능을 가지는 세포로 방향성을 가지고 발달하는 현상을 의미하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "발현"은 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사 후 및 해독 후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "과발현"은 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 상향조절(up-regulation)된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "발현하지 않는"은 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 "하향조절(down-regulation)"되어 발현량이 거의 없는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 발현은 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩 방법으로 유전자 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하여 확인할 수 있으며, 해당 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 이용하여 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이 방법으로 단백질의 발현 수준을 측정하여 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "혈관 재생"은 손상된 혈관의 손상을 복구하는 것으로, 본 발명의 조성물을 이용하여 혈관 신생, 즉 손상된 혈관의 재생을 촉진하고 이미 손상된 혈관이 지속적인 외력 등에 의해 추가로 손상되는 것을 방지하는 것을 의미한다. 상기 "혈관 신생" 또는 "혈관 형성"은 기관 또는 손상을 받은 조직에 혈액을 공급하기 위하여 새로운 혈관을 형성하는 자연치유 과정을 말하며, 혈관 신생은 많은 질환에서 병의 진행과 치료에 중요한 역할을 한다. 본 발명의 vMSC는 혈관생성 성장 인자가 결여된 배지에서도 혈관 형성능을 가지며, 세포 자신이 혈관 형성 성장 인자인 HGF를 고농도로 분비하고, 이의 수용체인 c-Met을 과발현하고 있어, HGF를 자가분비 인자로 이용하여 혈관 발아가 촉진된다. 또한 vMSC가 분비하는 HGF는 주변 혈관내피세포의 신생혈관 능력을 증가시키는 측분비 효과를 가진다. 또한, BM-MSC가 분비하는 bFGF에 의해 혈관 발아가 촉진되므로, 이에 의한 측분비 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 vMSC는 자가분비 효과 및 측분비 효과를 통해 혈관 재생, 혈관 신생 또는 혈관 형성 효과를 가진다.
본 발명에서 사용된 용어, "혈관 형성"은 vMSC의 자가분비 효과 및 측분비 효과에 의해 이루어질 수 있다. vMSC는 혈관생성 성장 인자가 결여된 배지에서도 혈관 형성능을 가지며, 세포 자신이 혈관 형성 성장 인자인 HGF를 고농도로 분비하고, 이의 수용체인 c-Met을 과발현하고 있어, HGF를 자가분비 인자로 이용하여 혈관 발아가 촉진된다. 또한 vMSC가 분비하는 HGF에 의해 성숙 혈관내피세포 (HUVEC)의 혈관 발아가 촉진되므로 이에 의한 측분비 효과를 가진다. 또한, BM-MSC가 분비하는 bFGF에 의해 혈관 발아가 촉진되므로, 이에 의한 측분비 효과를 가진다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포는 CD141 세포 표면 항원을 발현하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 줄기세포 (vMSC)와 상기 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 세포수 기준으로 1:10 내지 10:1의 비율로 포함할 수 있으며, 1:1 내지 10:1의 비율로 포함하는 것이 바람직하고, 1:1 내지 3:1의 비율로 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 2:1의 비율로 포함하는 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 조성물에 HGF 또는 bFGF를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 혈관 재생은 동맥 재생, 소동맥 재생, 정맥 재생, 모세혈관재생, 뇌혈관장벽 (BBB) 재생 또는 망막혈관 재생을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 줄기세포는 3D로 배양된 줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포 치료제 조성물은 냉동저장될 수 있으며, 혈관재생용으로 사용될 수 있다.
상기 세포 치료제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있으며, 비경구 또는 경구투여될 수 있고, 경구투여될 경우 세포를 이식재 등으로 내포하여 투여될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환 치료용 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 뇌신경계 질환은 퇴행성 뇌질환, 정신질환 또는 발달장애일 수 있다.
일 구현예에서, 퇴행성 뇌질환은 인지기능 장애, 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease), 루이체 치매(Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 파킨슨병(Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병(Huntington`s disase), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 길리안-바레 증후군(Gillain-Barre Syndrome; GBS)일 수 있다.
일 구현예에서, 정신 질환은 양극성 장애, 자폐증, 우울증, 과잉 행동, 주의력 결핍, 자폐증, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 불안 장애, 수면 장애, 공황 장애, 지능 장애, 기억력 저하, 약물 중독, 조현병, 강박증, 과대망상, 성격장애, 알코올중독 또는 조울증일 수 있다.
일 구현예에서, 발달장애는 뇌전증(epilepsy), 뇌성마비(cerebral palsy), 발달성 언어장애(developmental language disorder), 감각장애(disturbanee of sense), 학습장애(learning disorder), 주의력 결핍 과잉행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD), 자폐 범주성 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD), 지적 장애(Intellectual disability), 인지 장애(Cognitive impairment) 또는 충동조절 장애 (impulse control disorders)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "줄기세포 치료제"는, 세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologus), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic)의 줄기세포를 이용하여 체외에서 증식 및 선별하고 체내에 도입함으로써 조직의 재생 치료에 사용하는 치료제를 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포 또는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 혈관 재생용 이식재에 관한 것이다.
일 구현예에서, 이식재는 필름, 멤브레인, 시트, 막대, 나사, 앵커, 핀, 임플란트, 스텐트, 수술용 봉합사, 조직재생용 지지체, 바이오 나노 섬유, 하이드로젤, 바이오 스폰지, 본 플레이트(bone plate) 및 본그래프트(bone graft)와 같은 외과 이식물, 의료용품 또는 의료기기일 수 있다.
일 구현예에서, 이식재가 하이드로젤인 경우 경구 투여되어 내장 기관의 혈관 재생을 촉진시키는 용도로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이식재는 생분해성 고분자를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이식재는 조직공학용 복합 지지체일 수 있으며, 조직공학용 복합 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 본 발명의 줄기세포 또는 본 발명의 세포 치료제 조성물이 포함되어 있을 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이식재는 본 발명의 줄기세포 또는 세포 치료제가 조직공학용 복합 지지체에 접종된 이식재일 수 있다.
일 구현예에서, 이식재가 하이드로젤인 경우 하이드로젤을 형성하는 고분자는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리에틸렌옥사이드 (PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트 (PHEMA), 폴리아크릴산 (PAA), 폴리비닐알코올 (PVA), 폴리 (N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 젤라틴, 히알루론산, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드 또는 무수말레인산/비닐에테르일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생분해성 고분자"는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항(抗)석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 말한다. 이러한 생분해성 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으나, 대표적으로 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다. 상기 복합 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 생분해성 고분자를 성형하여 제조할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포 또는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 혈관 질환은 외상성 혈관 손상, 말초혈관 질환, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 또는 허혈성 질환일 수 있으며, 허혈성 질환은 허혈성 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 혈관질환, 허혈성 장염, 허혈성 안질환, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 망막증, 허혈성 뇌졸중 또는 허혈성 하지질환일 수 있다.
일 구현예에서, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애는 중증 사지 허혈, 당뇨성 혈관 신생 장애, 혈관성 치매, 당뇨병 수반 장기 손상, 동맥경화증, 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 동맥패쇄성 질환, 뇌졸중, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 당뇨성 궤양, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 허혈성 발작 또는 지주막하 출혈일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 혈관신생 또는 혈관형성 유도, 혈관 재생 또는 조직재생을 촉진하거나, 혈관 기능 개선, 조직 관류 및 새로운 혈관 형성을 증가시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포 또는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 뇌신경계 질환은 퇴행성 뇌질환, 정신질환 또는 발달장애일 수 있다.
일 구현예에서, 퇴행성 뇌질환은 인지기능 장애, 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease), 루이체 치매(Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 파킨슨병(Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병(Huntington`s disase), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 길리안-바레 증후군(Gillain-Barre Syndrome; GBS)일 수 있다.
일 구현예에서, 정신 질환은 양극성 장애, 자폐증, 우울증, 과잉 행동, 주의력 결핍, 자폐증, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 불안 장애, 수면 장애, 공황 장애, 지능 장애, 기억력 저하, 약물 중독, 조현병, 강박증, 과대망상, 성격장애, 알코올중독 또는 조울증일 수 있다.
일 구현예에서, 발달장애는 뇌전증(epilepsy), 뇌성마비(cerebral palsy), 발달성 언어장애(developmental language disorder), 감각장애(disturbanee of sense), 학습장애(learning disorder), 주의력 결핍 과잉행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD), 자폐 범주성 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD), 지적 장애(Intellectual disability), 인지 장애(Cognitive impairment) 또는 충동조절 장애 (impulse control disorders)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 건강상태, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 골수 유래 인간 골수 단핵세포(bone marrow mononuclear cells, cryopreserved, BM-MNCs) 또는 지방 유래 기질-혈관 분획(stroma vascular fraction, SVF)을 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate)을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 혈관 재생 또는 혈관 형성에 사용하기 위한, CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 뇌신경계 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 골수 유래 신규한 다분화능 줄기세포의 분리
1-1. vMSCs 최적 배양
냉동 보존된 인간 골수 단핵세포(bone marrow mononuclear cells, cryopreserved, BM-MNCs) (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada, LONZA, Basel, Switzerland)를 37 ℃에서 해동하거나, 또는 환자의 동의 하에 얻은 골수 흡인액을 Ficoll-paque (Cytiva, MA, USA)로 밀도 구배 원심 분리하여 BM-MNC를 얻는다. 이렇게 얻은 BM-MNC를 TC-treated(Tissue culture treated) 플라스크에 2% 인간 PL(human platelet lysate) (PL bioscience, GmbH, Germany) 및 2 unit/mL 헤파린(heparin) (Sigma-Aldrich, St. Louis)으로 보충된 FBS(Fetal bovine serum)-결핍된 EGM-2 bulletkit medium (Lonza; Basel, Switzerland) (EGM-2-FBS+2%hPL)을 이용하여 1.0 내지 2.0 × 105 cells/cm2의 밀도로 분주하고 7-12일 동안 초대 배양하였다. 초대 배양 기간 동안 배지 교체는 1-4일에 한번 수행하였다. 본 발명의 신규한 다분화능 줄기세포인 vMSCs(Vasculogenic Multipotent Stem Cells)의 콜로니는 배양 3 내지 5일부터 관찰되기 시작하며, 초대 배양시에 관찰되는 콜로니를 이루는 vMSCs 세포는 방추(spindle) 형태로 길이와 크기가 매우 다양하고 7일에서 10일 사이에 콜로니가 현저하게 확장되는 것으로 관찰되었다. vMSCs의 최초 계대배양 시기는 대다수의 콜로니가 80-90% 이상의 밀도를 보일 때 진행하며, 일반 부착세포를 계대배양하는 방법과 동일하게 트립신 또는 트립신 대체재를 이용하여 단일 세포로 분리 후에 새 플라스크로 1.0 내지 5.0 × 103 cells/cm2로 분주하고 70-90%의 밀도일 때 계대배양을 진행하며 5-7번 계대배양이 가능하다. 이와 같이, 본 발명의 vMSCs는 EGM-2 kit의 기본 구성성분 그대로 사용하여 FBS가 포함된 EGM-2로 배양하는 EPC(endothelial progenitor cell)와 달리, EGM-2에서 FBS를 배제하고 인간 PL(human platelet lysate)을 첨가하여 배양하는 것에 특징이 있다.
1-2. vMSCs의 세포외기질 부착 특성 확인
인간 섬유아세포(Human fibroblast) 유래 ECM 복합체인 HumaTein (100 μg/mL, ROKIT healthcare, Seoul, Republic of Korea), 인간 1형 콜라겐(human type I collagen) (0.2 μg/cm2)(Corning, NY, USA), 피브로넥틴(Fibronectin) (1 μg/cm2) (Sigma-Aldrich), 돼지 콜라겐 1-P형(Cellmatrix Type I-P) (Nitta Gelatin, Osaka, Japan), 래트 꼬리유래 1형 콜라겐(Collagen type I from rat tail) (50-825 μg/mL) (ThremoFisher, MA, USA) 및 콜라겐 1형 펩타이드(Corning) 등 다양한 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)로 코팅된 배양 플라스크에 vMSCs를 배양하여 확인한 결과, vMSC의 콜로니를 구성하는 세포는 모든 코팅 재료에서 방추 형태로 동일하게 나타났으며, 다양한 세포외기질에서 배양이 가능한 것으로 나타났다. 상기와 같은 ECM 코팅된 플라스크에서 배양하면 일반 TC-treated 플라스크에서 보다 더 많은 콜로니를 얻을 수 있었으나, 유의미한 차이는 없는 것으로 나타났다 (도 1). 즉, ECM 코팅 유무 및 종류에 따라 초대 배양 수득율은 다를 수 있으나, P1 이후 증식률에는 코팅 종류 및 유무에 따른 차이가 거의 없었다.
본 발명의 신규한 vMSCs는 인간 PL 대신에 기존 EGM-2 bullet kit의 FBS를 이용하여 배양하면 CD141+vMSC의 특성을 유지할 수 없으며, 인간 PL의 추가로 인해 CD141의 발현이 더욱 증가하므로, 이의 배양액은 EGM-2 bullet kit (Lonza)에 인간 PL을 추가하고, FBS를 배제하는 것을 필수로 하고, IGF 및 VEGF를 제거해도 성장에 문제가 없으므로, IGF 및 VEGF를 제외할 수 있다.
실시예 2. vMSCs의 마커 특성 분석
2-1. EPC 및 혈관내피세포 마커 발현 확인
본 발명의 vMSC에서의 종래의 EPC 및 혈관내피세포의 마커 발현 여부를 유세포 분석으로 확인하고, 성숙한혈관내피세포가 발현하는 eNOS 및 VE-cadherin의 발현을 면역형광염색 분석으로 확인하였으며, 이를 BM-MSC(bone marrow mononuclear cells) 및 HUVEC(Human umbilical cord endothelial cell)와 각각 비교하였다. 구체적으로, 유세포 분석을 위해, vMSC 및 BM-MSC를 2mM EDTA 및 0.5% BSA(Bovine serum albumin) (Sigma-Aldrich)를 포함하는 PEB 버퍼에 각각 재현탁한 후, human FcR blocking reagent (Miltynyi biotec)으로 4 ℃에서 10 분간 블라킹하였다. 그 후 Alexa flour 488 결합된 vWF 항체 (Abcam, 1:500), fluorescein으로 표지된 UEA-1 (Vectorlabs, 3:100), APC(allophycocyanin)-결합된 CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105 및 CD309 항체 (Miltenyl Biotec, 1:50)로 각각 염색하였다. 이 때, APC (Miltenyl Biotec. 1:50) 및 Alexa flour 488 (Abcam, 1:500)가 결합된 Isotype IgG를 대조 그룹으로 사용하였다. 항체 염색 후 세포를 PEB 버퍼로 세척하고 1,000 ×g 및 4 ℃에서 5분간 원심분리하였다. 최종적으로 세포를 PEB 버퍼로 재현탁하고 NovoCyte 3000 유세포분석기 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 및 NovoExpress 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 또한, 면역형광염색 분석을 위해, vMSC 및 HUVEC을 각각 커버 슬립 위에 배양하고 3.7% 포름알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 고정한 후 0.2% Triton X-100으로 세포막을 침투시켰다. 블라킹을 위해 20% NGS(normal goat serum)으로 1시간 동안 상온에서 반응시키고, 1차 항체로서 20% NGS에 희석한 e-NOS (Cell Signaling Technology, MA, USA, 1:400) 및 VE-cadherin (Cell Signaling Technology, 1:400)와 각각 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 20% NGS에 희석한 alexa fluor 488 결합한 항-래빗 2차 항체 (Invitrogen, MA, USA, 1:1000)와 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 샘플 관찰을 위해 DAPI가 포함된 마운팅 용액 (Vector Laboratories, CA, USA)로 마운팅한 후, 형광 현미경 (Leica)으로 이미지를 수득하였다.
유세포 분석 결과, 본 발명의 vMSC는 MSC 마커로 알려져 있는 CD105, CD90, CD29, CD73 및 CD44를 모두 발현하고 있으며, 기존에 보고된 EPC가 공통적으로 발현하는 CD31, CD309 및 CD34를 발현하지 않는 것으로 나타났다 (도 2a). 또한, 면역형광염색 분석 결과, 본 발명의 vMSC는 양성대조 그룹인 HUVEC과 달리 eNOS 및 VE-cadherin을 발현하지 않는 것으로 나타났다 (도 2c). 이를 통해, vMSC는 EPC보다 MSC와 더 많은 마커를 공유하는 것을 알 수 있다.
2-2. vMSCs 특이적 신규 마커 발굴
BM-MSC와 구별되는 본 발명의 vMSC 특이적 마커를 발굴하기 위하여 마커 스크리닝을 진행하였다. 이를 위해 378개의 표면항원마커를 유세포 분석기로 분석할 수 있는 MACS®Marker Screen, human, version 02 (Miltenyi Biotec)를 사용하였고, 제조사의 지침에 따라 실험을 수행하였다. 구체적으로, 동일한 공여자에서 유래한 Passage 3의 vMSC (5.7x107) 및 BM-MSC (5.7x107)를 PEB 버퍼로 재현탁한 후 human FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec)로 4℃에서 10분간 블라킹하였다. 그 후 6개의 Isotype control과 378개의 항체가 들어있는 96웰 플레이트 4개에 1.2x105/well로 각각 분주한 후 4℃에서 20-30분간 반응시켰다. PEB 버퍼로 세척 후 300 xg에서 5분간 원심분리한 후, PEB 버퍼를 이용하여 200 μl/well 농도로 재현탁하여 NovoSampler (Agilent Technologies)를 장착한 NovoCyte 3000 유세포분석기 (Agilent Technologies)와 NovoExpress 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
마커 스크리닝 결과, vMSC와 BM-MSC 간에 차이가 나는 약 21개의 마커를 선정하였고 (도 3a), 이의 검증을 위해, APC 결합된 CD141, CD282, PEAR1 (Miltenyi biotec. 1:50)을 사용하여 10명 이상의 도너에서 유래한 vMSC 및 BM-MSC에서 CD141, CD282 및 PEAR1(Platelet Endothelial Aggregation Receptor 1)에 대해 유세포분석을 수행하였다. 그 결과, CD141은 지속적으로 vMSC에서 70 내지 99% 발현하는 것으로 나타났으나, BM-MSC에서는 발현되지 않는 것으로 나타났다 (도 3b). 또한, CD282는 BM-MSC에서 발현되지 않고, vMSC에서 적게는 30%에서 많게는 90%까지 발현이 되어 공여자 간 편차가 큰 것으로 나타났다 (도 3c). 아울러, PEAR1은 vMSC에서 70~99% 발현되나, BM-MSC의 경우 적게는 20%에서 많게는 90%까지 발현되는 것으로 나타나, 공여자 간 편차가 매우 큰 것으로 나타났다 (도 3d). 이를 통해, 본 발명의 vMSC와 BM-MSC를 구분하는 명확한 마커는 CD141인 것으로 나타났다.
실시예 3. vMSCs의 세포확장능력 분석
CD141+vMSC의 세포확장능력을 BM-MSC와 비교 평가하기 위하여 상기 실시예 1에 기재된 방법으로 20명 이상의 공여자에서 CD141+vMSC를 계대 3까지 배양하고, CD141+vMSC 초대 배양과 동시에 BM-MNC를 StemMACS™expansion media, XF (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) (StemMACS) 배지에 4.0-7.0 x 104 cells/cm2로 분주 후 CD141+vMSC와 동일 기간 동안 초대 배양하고, 계대배양은 CD141+vMSC와 동일한 시기에 진행하였다. 이렇게 배양 후 상기 CD141+vMSC와 BM-MSC의 계대별 PDT(population doubling time) 및 초대 배양 MNC의 수를 1x107로 고정하고 계대 3까지의 누적 세포수를 측정하였다.
그 결과, P1에서 P3까지 평균 PDT가 CD141+vMSC의 경우 0.84일 (20시간)이고, BM-MSC의 경우 24일 (30시간)으로 나타나, CD141+vMSC가 약 1.5배 빠르게 분열하는 것으로 나타났다 (도 4a 및 b). 또한, 누적 세포수를 확인한 결과, CD141+vMSC의 경우 계대 3 (19~22일)안에 3.0 x1010 세포를 얻을 수 있었으며, BM-MSC의 경우 약 1.8x109 세포를 얻을 수 있는 것으로 나타났다 (도 4c 및 d). 즉, CD141+vMSC가 BM-MSC보다 16~17 배 높은 수의 세포를 얻을 수 있어 매우 세포 확장능이 매우 뛰어난 세포임을 알 수 있었다 (도 4e).
실시예 4. vMSCs의 다분화능 분석
4-1. 지방 분화 특성
CD141+vMSC의 다분화능을 확인하기 위하여 동일한 공여자에게서 유래한 계대 3의 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 지방분화 유도배지에서 배양하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 CD141+vMSC는 EGM-2-FBS+2%hPL 배지로, BM-MSC는 StemMACS 배지로 1.0x103/cm2로 분주하고 거의 100%의 밀도에 도달한 상태에서 지방 분화 유도 배지인 StemPro™Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco) 배지로 교체하고, 3-4일에 한번씩 새 배지로 교체해주며 14일간 배양하였다. 3.7% 포름알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 각 세포를 고정한 후, 세포를 60% 아이소프로판올(isopropanol) (Daejung, Sihueng si, Republic of Korea)에 상온에서 5분간 반응시킨 뒤, 60% 아이소프로판올이 포함된 0.3% Oil red O (Sigma-Aldrich) 용액을 이용하여 상온에서 20분간 염색하였다. 그 후 증류수를 이용하여 세척하고 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)으로 이미지를 얻었다. 그 결과, CD141+vMSC는 MSC처럼 지방으로 분화되는 것으로 나타났다 (도 5).
4-2. 골분화 특성
CD141+vMSC의 다분화능을 확인하기 위하여 동일한 공여자에게서 유래한 계대 3의 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 골분화 유도배지에서 배양하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 CD141+vMSC는 EGM-2-FBS+2%hPL 배지로, BM-MSC는 StemMACS 배지로 1.0x103/cm2로 분주하고 80-90%의 밀도에 도달한 상태에서 골분화 유도 배지인 StemPro™Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco) 배지로 교체하고, 3-4일에 한번씩 새 배지로 교체해주며 21일간 배양하였다. 3.7% 포름알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 각 세포를 고정한 후, 고정된 세포를 2% Alizarin red S (Sigma-Aldrich) 용액을 이용하여 상온에서 20분간 염색하였다. 그 뒤 증류수를 이용하여 세척하고 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)으로 이미지를 얻었다. 그 결과, CD141+vMSC는 MSC처럼 골분화가 일어나는 것으로 나타났다 (도 5).
4-3. 연골 분화 특성
CD141+vMSC의 다분화능을 확인하기 위하여 동일한 공여자에게서 유래한 계대 3의 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 연골분화 유도배지에서 배양하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 CD141+vMSC는 EGM-2-FBS+2%hPL 배지로, BM-MSC는 StemMACS 배지로 1.0x103/cm2로 분주하고 거의 100%의 밀도에 도달한 상태에서 연골 분화 유도 배지인 StemPro™Chobdrogenesis Differentiation Kit (Gibco) 교체하고, 3-4일에 한번씩 새 배지로 교체해주며 21일간 배양하였다. 3.7% 포름알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 각 세포를 고정한 후, 고정된 세포를 3% acetic acid (Sigma-aldrich)로 상온에서 3분간 반응시킨 후 1% alcian blue로 상온에서 30분간 염색하였다. 그 후 증류수를 이용하여 세척하고 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)으로 이미지를 얻었다. 그 결과, CD141+vMSC는 MSC처럼 연골로 분화되는 것으로 나타났다 (도 5).
이를 통해, 본 발명의 신규한 CD141+vMSC가 기존의 EPC에서는 보고된 바 없는 다분화능을 보유하여 MSC처럼 모두 지방, 뼈 및 연골로 분화가 되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. vMSCs의 혈관 재생능 분석
상기 실시예에서 제조한 CD141+vMSC의 혈관 재생능을 BM-MSC 및 성숙한 혈관내피세포인 HUVEC과 비교하기 위해, 마트리젤 혈관망 형성 분석(Matrigel tube formation assay)을 수행하였다. 구체적으로, 마트리젤 (Corning Inc, NY, USA)을 웰당 10μl로 μ-슬라이드(ibidi, Grafelfing, Germary)에 처리하고, CD141+vMSC, BM-MSC 및 HUVEC을 각각 성장인자가 결핍되고 0.2 % hPL가 함유된 α-MEM (GIBCO, NY, USA) 또는 VEGF, FGF 등 혈관생성(proangiogenic) 성장 인자가 함유된 EGM2 배지로 현탁하고 마트리젤에 6,000cells/well로 분주한 후 하룻밤 동안 (16시간 이상) 배양하였다. 이후 이미지는 현미경 (Leica, Wetzlar, Germany)으로 수득하였다.
그 결과, BM-MSC는 두 배지에서 모두 혈관망 구조를 형성하지 못하고, 혈관내피세포인 HUVEC의 경우 혈관생성 성장인자가 포함된 EGM2 배지에서는 혈관망 구조를 매우 잘 형성하지만, 혈관생성 성장인자의 첨가가 없는 MEMα+0.2% hPL 배지에서는 혈관망 구조를 유지하지 못하는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 CD141+vMSC의 경우 EGM2 배지에서는 매우 굵고 큰 혈관망 구조를 형성하였으며, MEMα+0.2% hPL 배지에서는 작고 많은 혈관망 구조를 형성하는 것으로 나타났다 (도 6). 즉, CD141+vMSC는 혈관생성 성장 인자가 결여된 배지에서도 혈관 형성능이 있는 것으로 나타났다.
실시예 6. vMSCs의 혈관 형성 성장 인자 분비능 분석
6-1. vMSCs의 HGF 분비능 분석
상처 치유뿐만 아니라 강력한 혈관 형성 성장 인자인 HGF(Hepatocyte growth factor)의 분비능을 확인하기 위해, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예에서와 같이 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 각각의 배양 배지 (EGM-2-FBS+2%hPL 및 StemMACS)를 이용하여 6웰 플레이트 9 x 104 cells/well 농도로 분주하고, 배지로 인한 차이를 배제하기 위해, 다음날 성장인자가 결여된 배지인 MEMα+0.2%hPL로 교체한 후, 48시간 동안 배양하고 그 배양액을 수집하여 Quantikine HGF ELISA (R&D systems, Minneapolis, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 흡광도를 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Device, SpectraMax ABS)를 이용하여 450nm에서 측정한 후, 세포수로 나누어 세포당 분비한 HGF 양을 분석하였다. 이와 같이 계대 4까지 배양하여 계대 배양 직전 배양액(culture supernatant)를 수집하고 HGF의 분비 정도를 분석하였다.
동일 계대의 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 비교한 결과, CD141+vMSC이 BM-MSC에 비해 HGF를 14 내지 130배 분비하는 것으로 나타났으며 (도 7a 및 b), 동일 조건일 때는 CD141+vMSC이 BM-MSC에 비해 HGF를 약 9배 높게 분비하는 것으로 나타났다 (도 7c).
6-2. vMSCs의 HGF 수용체 발현 분석
상기 실시예에서와 같이 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 배양하고 계대별로 얻은 세포를 2mM PMSF(phenylmethylsulphonyl fluoride, Sigma-Aldrich) 및 파쇄 버퍼(lysis buffer) (Cell signaling tech.)를 이용하여 용해하고, 14,000 xg로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액만 모아서 단백질 용해물을 수득하였다. BCA 분석 (Thermo Fisher Scientific)으로 동일한 농도로 맞춘 단백질 용해물을 SDS-PAGE로 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트렌스퍼하였다. 5% 스킴밀크가 포함된 TBS-T를 이용하여 1시간 동안 상온에서 블라킹한 뒤, C-Met(cell signaling tech, 1:1000), phosphor-c-Met (cell signaling, 1:1000) 및 α-tubulin (Sigma-Aldrichi, 1:4000)에 대한 항체를 각각 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, HRP 결합된 2차 항체와 1시간 동안 상온에서 반응시키고, 항체 반응이 완료된 멤브레인에 EZ-western Lumi pico (Dogen, Seoul, Korea)를 처리하여 발광시킨 후 Chemilluminator로 신호를 검출하고 Image J 소프트웨어로 정량화하여 HGF 수용체인 c-Met의 계대별 발현량 및 이의 활성화 (인산화)를 확인하였다.
그 결과, CD141+vMSC 세포 (CD141+vMSC)는 HGF 수용체 (c-Met)를 BM-MSC 세포보다 현저하게 많이 발현하는 것으로 나타났으며 (도 7d 및 e). 두 세포간의 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다 (도 7d 및 f). 따라서, CD141+vMSC은 HGF를 스스로 많이 분비할 뿐만 아니라 HGF 수용체 (c-Met) 또한 많이 발현하는 세포로써 HGF를 자가분비(autocrine) 인자로 이용할 수 있음을 확인하였다.
6-3. 혈관 신생 작용 기전 확인
6-3-1. 자가분비 인자에 의한 신생 혈관 형성능 확인
CD141+vMSC의 혈관 신생 작용 기전을 확인하기 위해, HGF에 의한 신생 혈관 형성능(Angiogenic Sprouting Capacity)을 BM-MSC와 비교 분석하였다. 이를 위해, CD141+vMSC 스페로이드 및 BM-MSC 스페로이드를 행잉 드롭(Hanging drop) 방법으로 각각 제작한 뒤, HGF 또는 HGF의 억제를 위한 HGF 중화 항체를 처리하여 In vitro 스페로이드 발아 분석(spheroid sprouting assay)을 수행하였다. 구체적으로, CD141+vMSC 및 BM-MSC 2x104 cells/mL를 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 1% P/S 및 0.2% 메틸셀룰로오스 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA)를 포함한 M199 배지에 현탁하고, 현탁한 세포를 30㎕의 용량으로 페트리 접시의 뚜껑에 방울 형태로 접종하였다. 접종한 페트리 접시의 뚜껑을 뒤집어서 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 스페로이드(spheroid)가 형성되도록 배양하였다. 배양 24시간 후에 형성된 CD141+vMSC 및 BM-MSC 스페로이드를 3mg/mL Collagen type Ⅰ-A (최종 농도 1.44mg/mL; Nitta Gelatin) 및 메틸셀룰로오스 (최종 농도 0.48%; Sigma-Aldrich) (Collagen gel mixture)에 혼합하여 24웰 플레이트에 0.7mL씩 각각 분주하였다. 스페로이드가 포함된 콜라겐 젤 혼합물을 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 30분간 중합하였다. 이 때, HGF 중화 항체 처리 그룹의 경우 HGF 중화 항체 (MAB294, R&D systems; Anti-HGF Ab) 500ng/mL를 각 스페로이드가 포함된 콜라겐 젤 혼합물과 혼합한 뒤 중합하였다 (HGF 처리 3시간 전). 중합 후, HGF (Peprotech, New Jersey, USA) 및/또는 HGF 중화 항체 (대조 그룹: 500ng/mL mouse IgG, IgG)를 M199 (Sigma-Aldrich) 배지에 희석하여 콜라겐 젤 혼합물 위에 100㎕씩 처리한 뒤, 48시간 동안 배양하고, 스페로이드의 발아 사진을 현미경 (Nikon)으로 촬영하여 얻었다. 스페로이드의 발아 수, 발아 평균 길이 및 발아 총 길이는 Image J software (NIH)로 측정하였다.
신생 혈관 형성능을 정량적으로 분석한 결과, 본 발명의 vMSC 스페로이드는 HGF 처리에 의해 혈관 발아가 현저하게 증가하고, HGF 및 HGF 중화 항체를 동시에 처리시 혈관 발아가 감소하는 것으로 나타났다 (도 8a). 반면, BM-MSC (MSCs) 스페로이드는 HGF 또는 이의 중화 항체 처리에 따른 혈관 발아에 변화가 없는 것으로 나타났다 (도 8b).
즉, HGF 비의존적인 발아 능력을 가진 BM-MSC와 달리 CD141+vMSC는 HGF 의존적인 발아 능력을 가지고 있으며, HGF를 스스로 많이 분비하고 c-Met을 많이 발현하므로 HGF를 자가분비 인자로 이용하여 발아할 수 있음을 알 수 있다.
6-3-2. BM-MSC 분비 bFGF에 의한 신생 혈관 형성능 비교
CD141+vMSC의 혈관 신생 작용 기전을 확인하기 위해, 상기 실시예 6-3-1에서와 같이, In vitro 스페로이드 발아 분석(spheroid sprouting assay)시 BM-MSC 및/또는 bFGF 수용체 억제제인 PD173074 (Tocris, Bristol, UK)를 M199 배지 (Sigma-Aldrich)에 희석하여 콜라겐 젤 혼합물 위에 100㎕씩 처리한 후, 48시간 배양한 뒤, CD141+vMSC의 스페로이드 발아에 미치는 BM-MSC가 분비하는 bFGF의 영향을 확인하였다.
그 결과, CD141+vMSC 스페로이드에 아무것도 처리하지 않은 그룹 (NT) 대비 CD141+vMSC 스페로이드를 BM-MSC와 함께 배양한 경우 CD141+vMSC의 혈관 발아 능력이 증가하는 것으로 나타났다 (도 9). bFGF 수용체 억제제인 PD173074 처리시, BM-MSC에 의해 증가한 CD141+vMSC의 혈관 발아 능력이 감소하는 것으로 나타났다 (도 9).
즉, bFGF 수용체 억제제 PD173074가 vMSC의 혈관 발아에 대한 BM-MSC의 측분비 효과(paracrine effect)를 억제하고, 본 발명의 CD141+vMSC와 HGF, bFGF 또는 BM-MSC를 조합하여 사용하는 경우 혈관 형성에 시너지적인 효과가 발생할 것으로 유추되었다.
6-3-3. VEGF에 의한 신생 혈관 형성능 확인
CD141+vMSC의 혈관 신생 작용 기전을 확인하기 위해, 중요한 혈관 형성 인자인 VEGF에 대해 CD141+vMSC 스페로이드 및 BM-MSC 스페로이드의 신생 혈관 형성능이 변화되는지를 상기와 같이 In vitro 스페로이드 발아 분석으로 확인하고, BM-MSC 및 vMSC에서 VEGFR2의 mRNA 발현을 EPC의 일종인 HUVEC 세포와 비교하였다.
그 결과, VEGF에 대해 CD141+vMSC 스페로이드 및 BM-MSC 스페로이드가 반응하지 않았으며 (도 10a 내지 d), 이는 BM-MSC 및 CD141+vMSC가 VEGF 수용체를 발현하지 않는 결과와 일치하였다 (도 10e). 또한, bFGF 처리에 의해 CD141+vMSC 스페로이드는 신생 혈관 형성능이 증가하였으나, BM-MSC 스페로이드는 신생 혈관 형성능이 증가하지 않는 것으로 나타났다 (도 10a 내지 d).
이를 통해, EPC 및 내피 세포(endothelial cell)는 VEGF에 의해 발아가 촉진되지만, CD141+vMSC는 VEGF에 의해 혈관 발아가 촉진되지 않으며, VEGFR2(VEGF 수용체 2)를 발현하지 않는 것을 알 수 있다. 또한, bFGF에 의한 발아 촉진이 BM-MSC와 다른 본 발명의 CD141+vMSC의 특성임을 알 수 있다.
6-3-4. vMSC 분비 HGF의 혈관신생 측분비 효과 확인
vMSC에 의한 혈관내피세포의 신생혈관 형성 촉진 측분비 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 6-3-1에서와 같이, 행잉 드롭(Hanging drop) 방법으로 HUVEC 세포를 스페로이드로 배양하고, vMSC와 비접촉 공동배양한 뒤, 스페로이드 발아 분석(Sprouting assay)을 수행하였다. 이 때, vMSC의 분비단백체들 중 HGF를 중화하기 위해, 500 ng/mL의 HGF 중화 항체 (MAB294, R&D systems; Anti-HGF Ab)를 M199 배지에 혼합하여 중합되어 HUVEC 스페로이드를 포함하는 콜라겐 젤 위에 100㎕씩 처리하고 24시간 동안 배양하였으며, 이의 대조군으로는 마우스 IgG (IgG) (500ng/mL)를 사용하였다. 스페로이드의 발아(sprouting) 이미지는 Image J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 발아 수, 누적 발아 길이(하나의 스페로이드에서 형성된 모든 sprout 길이의 총합) 및 발아 평균 길이(모든 스페로이드에서 형성된 모든 발아 길이의 평균값)을 정량 분석하였다.
그 결과, CD141+vMSC와 비 접촉 공동 배양 시 HUVEC 스페로이드에서 발아 촉진 효과가 있는 것으로 나타났으며, HGF 중화 항체 처리에 의해 HUVEC 발아 효과가 억제되는 것으로 나타났다 (도 11). 이를 통해, vMSC의 분비단백체 중의 HGF가 혈관내피세포 HUVEC의 세포 발아(cell sprouting) 효과를 나타내는, 즉, 신생혈관능을 촉진하는 물질임을 확인하였다.
따라서, 골수 유래 vMSC는 혈관 신생과 관련한 HGF를 과량으로 분비하고, 이는 HUVEC의 신생혈관 발아를 촉진하는 측분비 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 7. vMSCs 및 EPC의 비교
상기 결과들을 통해 확인한 본 발명의 골수 유래 CD141+vMSC와 말초혈 또는 제대혈 유래 EPC를 비교한 결과, 본 발명의 CD141+vMSC와 EPC는 기능적으로 유사한 특징을 가지지만, 배양 조건, 세포 형태(morphology) 및 세포 표면 마커의 발현이 전혀 상이하며, 특히, 모든 종류의 EPC에서 발현되는 CD309 및 CD31를 본 발명의 CD141+vMSC에서는 거의 발현되지 않았다. 또한, VEGF에 의해 발아가 촉진되는 EPC와 달리 본 발명의 CD141+vMSC는 VEGF에 의해 발아가 촉진되지 않으며, VEGF 수용체를 발현하지 않았다. 아울러, CD141+vMSC는 기존의 EPC에서는 보고된 바 없는 다분화능을 보유한다. 따라서, 본 발명의 CD141+vMSC 세포는 일반적으로 알려진 EPC와 기능적으로는 유사하지만 EPC와 전혀 상이한 종류의 세포인 것을 알 수 있다 (도 12).
상기 실시예들을 통해, 본 발명에서 동정한 신규한 줄기세포 CD141+vMSC가 EPC와 달리 CD31, CD309 및 CD34를 발현하지 않으며, 혈관내피세포와 달리 eNOS 및 VE-cadherin을 발현하지 않고, 중간엽 줄기세포와 달리 CD141을 발현하며, 중간엽 줄기세포에 비해 HGF 및 그 수용체 cMET를 과발현하고, 다분화능 및 신생혈관 촉진 효과를 가지므로, 이를 CD141+ Vasculogenic Mesenchymal Stem Cells로 명명하여 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁하고 KCLRFBP00524호 기탁번호를 부여받았다.
실시예 8. 골수 유래 vMSC 및 BM-MSC의 조합
8-1. 정상 환경에서 혈관 재생능 극대화 조합 탐색
CD141+vMSC의 혈관 재생능을 극대화하기 위해 BM-MSC를 첨가하면서, 두 종류 세포의 최적 혼합 비율을 확인하기 위해, 마트리젤 혈관망 형성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 마트리젤을 웰당 10μl로 μ-슬라이드에 분주하여 37℃에서 30분 동안 젤화하고, CD141+vMSC 및 BM-MSC를 0.2 % hPL가 함유된 α-MEM (MEMα+0.2%hPL)에 세포 갯수를 기준으로 1:0 (6,000개+0개), 9:1 (5,400개+600개), 2:1 (4,000개+2,000개), 1:1 (3,000개+3,000개), 1:2 (2,000개+4,000개), 1:9 (600개+5,400개) 및 0:1 (0개+6,000개)로 각각 혼합하여 마트리젤 위에 분주하고 16시간 동안 배양하였다. 각 그룹의 이미지는 현미경 (Nikon)으로 수득하고 Image J 소프트웨어의 Angiogenesis analyzer를 이용하여 전체 길이(Total length), 메쉬 수(number of meshes), 마스터 세그먼트 수(Number of Master segments), 총 마스터 세그먼트 길이(Total master segment length) 및 분리된 세그먼트 수(Number of isolated segment)를 평가 지표로 활용하였다.
현미경 관찰 결과, 세포의 조성비 별로 혈관망(Tube) 형성에 차이가 있는 것으로 나타났다. 구체적으로, BM-MSC는 단독으로 혈관망을 형성하지 못했으며 BM-MSC의 비율이 CD141+vMSC보다 높아질수록 뭉치는 경향이 나타났다 (도 13a). 또한, 정상 환경에서 CD141+vMSC 세포는 단독으로 in vitro에서 혈관망 형성(tube formation) 능력이 뛰어나지만 엉성한 구조가 관찰되었는데, 여기에 BM-MSC가 추가되면 더 타이트(tight)하고 성숙한 혈관망을 형성하는 것으로 나타났다 (도 13b). 평가 지표를 분석한 결과, 전체 길이, 메쉬 수, 마스터 세그먼트 수 및 총 마스터 세그먼트 길이에서는 유의미한 차이가 없었으나, 어디에도 연결되지 못한 세그먼트를 나타내 미성숙 혈관의 지표인 분리된 세그먼트 수는 나머지 지표에 차이가 없는 3가지 그룹 중 2:1에서 가장 낮게 나타났다 (도 13c).
즉, 정상 환경에서 CD141+vMSC가 단독으로도 in vitro 혈관 형성능력이 뛰어나지만, BM-MSC를 적절한 비율로 혼합하면 더욱 타이트하고 성숙한 혈관망을 형성할 수 있음을 확인하였다.
8-2. 염증 환경에서 혈관 재생능 극대화 조합 탐색
줄기세포치료제가 염증 환경에 투여될 것을 고려하여 염증 환경에서의 마트리젤 혈관망 형성 분석을 수행하였다. 염증 환경을 모사하기 위하여 TNF-α 500 pg/mL를 첨가한 배지를 이용하였다. CD141+vMSC 및 BM-MSC를 TNF-α 500 pg/mL가 첨가된 MEMα+0.2%hPL으로 1:0 (6,000개+0개), 9:1 (5,400개+600개), 2:1 (4,000개+2,000개), 1:1 (3,000개+3,000개), 1:2 (2,000개+4,000개), 1:9 (600개+5,400개) 및 0:1 (0개+6,000개)의 비율로 각각 혼합하여 현탁하고 분주하였다. 또한, 정상 환경과의 비교를 위하여 CD141+vMSC 및 BM-MSC 각각을 TNF-α 500 pg/mL가 없는 MEMα+0.2%hPL에 현탁한 그룹까지 추가하여 총 9가지 그룹을 비교하였다.
현미경 관찰 결과, 세포의 조성비 별로 혈관망 형성에 차이가 있는 것으로 나타났다. 구체적으로, CD141+vMSC은 정상 환경에서는 단독으로도 혈관망 형성을 잘 하였으나, 염증 환경에서는 혈관망 형성 능력이 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, BM-MSC를 추가해주면 혈관망 구조를 잘 만드는 것으로 나타났으며, 정상 환경에서와 마찬가지로 BM-MSC의 비율이 높아지면 뭉치는 현상이 관찰되었다 (도 14a). 또한, 염증 환경에서는 CD141+vMSC 세포가 단독으로 있을 경우 전체 길이가 줄어들고, 특히 성숙 혈관의 지표인 마스터 세그먼트 및 메쉬 생성이 가장 급격히 줄어들었으며, 미성숙 혈관 지표인 분리된 세그먼트의 수가 급격하게 증가하는 것으로 나타났다 (도 14b). 반면 CD141+vMSC 및 BM-MSC 세포가 2:1 비율로 혼합된 경우, 염증 환경임에도 혈관 자체의 길이나 메쉬 생성을 높은 수준으로 유지하였으며, 특히 마스터 세그먼트의 수 및 길이가 정상 환경의 CD141+vMSC 단독 그룹과 유사한 정도로 높은 수준을 유지하였고, 분리된 세그먼트 길이는 정상 환경의 CD141+vMSC 단독 그룹보다도 낮은 수준으로 관찰되었다 (도 14b).
즉, 염증 환경에서 타이트한 혈관 형성을 위해서는 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합하여 사용하는 것이 유리한 것으로 확인되었다.
실시예 9. 지방 유래 vMSCs
9-1. 지방 조직 유래 vMSCs 분리
지방 조직의 중배엽 조직의 줄기세포는 뼈, 연골, 근육, 지방 조직을 생성할 수 있고, 지방 조직 유래의 줄기세포, ASC(adipose-derived stem cells)는 골수 중간엽 줄기세포의 특성 (세포 모양, 발현 마커, 분비 사이토카인 등)을 가지고 있고, 초기 조직 수득량이 골수에 비해 많으며, 더 빠른 계대에 세포 이식이 가능한 장점때문에 골수 대체원으로 현재 이용되고 있으므로, 지방 유래 vMSC를 상기 실시예 1에서와 유사하게 분리하였다. 구체적으로, 환자로부터 지방 조직 (약 1.5g)을 얻고, 이를 가위로 Chopping한 뒤 콜라게네이즈(Collagenase) I을 이용해 단일 세포로 분리하고, 이를 원심분리하여 SVF(Stromal vascular fraction)를 얻었다. 이를 Humatein (Rokit healthcare)가 코팅된 배양 접시 FBS(Fetal bovine serum)-결핍된 EGM2 (LONZA) + 2% PL (Platelet lysate, BioScience GmbH) 배지로 배양하여 지방 유래 CD141+vMSC를 얻었다 (도 15). 이를 비교하기 위해, 지방으로부터 분리한 단일 세포를 HUMA 배지 (Rokit healthcare)에 배양하여 지방 유래 MSC(AD-MSC)도 얻었다.
9-2. 지방 유래 vMSC의 세포 형태 분석
상기 실시예 9-1에서 수득한 지방 유래 CD141+vMSC와 AD-MSC의 계대별 세포 모양을 관찰한 결과, 두 종의 세포 모두 일반적인 MSC의 세포 모양인 방추형 모양을 가지고 있었으나, CD141+vMSC가 더 끝이 길고 뾰족한 형태를 가지고 있는 것으로 나타났다 (도 16).
9-3. 지방 유래 vMSC의 세포확장능력 분석
지방 유래 CD141+vMSC와 AD-MSC를 각각 세포 초기의 일차(Primary)부터 계대 3까지 계대할 때 (두 세포 모두 2.16 x 106cells로 시작), 분주하여 얻을 수 있는 누적 세포수를 확인하였다. 그 결과, 계대 3에 109이상의 지방 유래 CD141+vMSC를 얻을 수 있었다 (도 17).
9-4. 지방 유래 vMSC의 세포 표면 표지 마커 분석
지방 유래 CD141+vMSC와 AD-MSC의 세포 표면 마커를 유세포 분석으로 분석한 결과, 두 종의 세포 모두 CD34-, CD45-, CD29+, CD44+, CD73+ 및 CD90+의 특성을 나타냈으며, CD141 및 PEAR1의 발현은 CD141+vMSC (EGM2-FBS+2%hPL)에서 높고, AD-MSC (HUMA)는 낮은 것으로 나타나 (도 18), 이 두 가지 마커를 지방 유래 CD141+vMSC와 AD-MSC를 구별하는 중요 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.
9-5. 지방 유래 vMSC의 혈관 형성능 분석
이식 후 환경 모사를 위해 염증 환경에서 지방 유래 CD141+vMSC의 혈관 형성능을 확인하기 위해, 지방 유래 CD141+vMSC 및 AD-MSC를 단일 (6,000 cells) 또는 2:1 비율 (vMSC 4,000 cells + AD-MSC 2,000 cells)로 혼합하여 마트리젤에 1% hPL + 500 pg/ml TNF-α와 함께 분주하고 24시간이 지난 뒤 나타나는 혈관 모양을 비교하였다. 그 결과, AD-MSC 단독의 경우 혈관 형성능이 낮아 세포가 뭉쳐버린 것으로 나타난 반해, 지방 유래 CD141+vMSC 단독, 또는 CD141+vMSC 및 AD-MSC를 2:1로 혼합한 경우 AD-MSC를 단독으로 배양한 것에 비해 혈관 형성능이 증가하였으며, 특히, CD141+vMSC 및 AD-MSC를 2:1로 혼합한 경우에 혈관 형성능이 가장 우수한 것으로 나타났다 (도 19).
실시예 10. 중증하지허혈 동물 모델 확립
골수 유래 CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합에 따른 복합 줄기세포 치료제로서의 중증하지허혈에서의 유효성을 확인하기 위해, 중증하지허혈 동물 모델을 제작하였다. 도 20의 Model 1은 총대퇴동맥 및 천대퇴동맥의 위쪽을 Silk를 이용하여 결찰시킨 모델로, 대부분의 마우스 개체에서 일정 시간 경과에 따라서 혈류량이 회복하는 것으로 나타나, 혈관 형성 관찰 및 유효성 평가 모델로는 부적합하다고 판단하여, 총대퇴동맥과 천대퇴동맥의 양쪽, 즉 3곳을 결찰시킨 후 천대퇴동맥을 제거한 Model 2 (critical limb ischemia, CLI)를 제작하였으며, 이는 대부분의 마우스 개체에서 심각한 괴사 및 조직 소실과 시간 경과에 따른 혈류량 감소의 증상을 나타냈다 (도 20).
실시예 11. 복합줄기세포의 중증하지허혈 동물 모델에 대한 효과 확인
11-1. 족부보존율 평가
상기 실시예 10에서 제작한 중증하지허혈 마우스 모델 (모델 2)에서 CD141+vMSC + BM-MSC의 복합 줄기세포 치료제로서의 유효성을 평가하고, 24주까지 그 효과를 관찰하였다. 투여 물질에 따라 대조 그룹 (G0) 및 CD141+vMSC + BM-MSC (세포수 2:1) 투여 그룹 (G1)으로 설정하고, 중증하지허혈 모델 제작 후 즉시 1.2x105 cells의 용량으로 허혈 발생 위치 (혈관 제거 위치)에 인슐린 시린지로 1회 근육 투여하였다.
그 결과, 모델 제작 후 24주에 최종 족부 상태를 관찰한 결과 대조 그룹에서 족부보존률이 0%이며, 대부분의 개체가 족부/하지 소실으로 나타났으나, G1 그룹에서는 족부 보존(Limb salvage)이 약 63% 이상으로 나타났다 (도 21).
11-2. 허혈 병변 괴사 등급 평가
중증하지허혈 마우스 모델에 상기 실시예 11-1에서와 같이 투여한 뒤, 허혈 발생 부위의 괴사(Ischemic necrosis) 중등도에 따라 7 단계로 나누어 등급화하여 평가하였다.
그 결과, 모델 제작 후, 투여 후 1일 및 2일차에서 G1 그룹에서 G0 그룹 대비 허혈 병변 괴사 정도에서 통계적으로 유의미한 차이가 나타났으며, 1주차에 현저한 차이가 나타나기 시작하여 24주까지 통계적으로 유의미한 차이가 지속되는 것을 확인하였다 (도 22) (1주, G0:4.3±0.8 VS G1:1.5±0.8, p<0.05; 및 24주, G0:4.9±0.4 VS G1:1.9±0.9, p<0.05).
11-3. 혈류량 변화 분석
중증하지허혈 마우스 모델에 상기 실시예 11-1에서와 같이 투여한 뒤, 허혈이 발생하지 않은 반대쪽 발(contralateral side)과 허혈이 발생한 발(Ischemic side)과의 혈류량을 비교하여 비율(%)로 나타낸 결과, 중증하지허혈 마우스 모델 제작 후 혈류량은 G0: 52.4±4.9 및 G1: 47.3±1.4으로 두 그룹 모두 급격한 혈류량 감소가 확인되었다. 그러나 3일차부터 G1 그룹에서 G0 그룹 대비 현저한 혈류량 개선이 나타나기 시작했으며, 이러한 통계적으로 유의한 현저한 개선은 24주까지 유지되는 것으로 나타났다 (도 23) (3일, G0: 37.2±4.9 VS G1: 70.8±14.3, p<0.05; 및 24주, G0: 11.9±6.3 VS G1: 69±15.9, p<0.01). 이를 통해, CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합은 중증하지허혈에서의 유효한 효과를 가지고 있으며, 3일~1주일차에 회복된 혈류가 24주까지 비슷한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.
11-4. 최소 유효 용량 결정
중증하지허혈에 대한 CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합에 따른 복합 줄기세포 치료제의 유효 용량을 설정하고, 최소 유효 용량(Minimal effective dose)를 결정하기 위해 대조 그룹 (G0), 고용량 그룹 (1.2x106 cells/50μL, 24,000/μL) (G1), 중간 용량 그룹 (1.2x105 cells/50μL, 2,400/μL) (G2) 및 저용량 그룹 (1.2x104 cells) (G3)으로 나누고, 각각 투여한 뒤 모델 제작 (D0) 후 4주차에 최종 족부 상태를 관찰한 결과 대조 그룹에서 족부보존률이 0%이며, 대부분의 족부/하지 소실이 관찰된 반면, G1 그룹 및 G2 그룹에서는 각각 42.9% 및 75%의 높은 족부 보존률이 나타났다 (도 24). 또한, G3 그룹에서는 족부보존률 14.3%로 나타났고, 지골소실은 28.6%로 상대적으로 양호하게 나타났다 (도 24). 또한, 유효성 평가 지표인 허혈성 괴사등급 평가 및 혈류량 측정결과, 고용량 그룹 및 중간 용량 그룹에서 대조 그룹 대비 통계적으로 현저한 효과를 나타냈다 (도 25). 이러한 유효한 효과는 용량 의존적으로(Dose dependent) 나타나지 않았으나, 고용량에서 충분한 효과를 나타냈으므로, 유효한 용량은 고용량 및 중간 용량으로 확인하여, 최소 유효 용량을 1.2x105 cells로 결정하였다.
실시예 12. 단독줄기세포의 투여 대비 복합줄기세포 투여 효과 비교
12-1. 족부보존률 평가
중증하지허혈 마우스 모델에서 CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합에 따른 복합 줄기세포의 투여가 각각의 CD141+vMSC 및 BM-MSC의 단독 줄기 세포 투여보다 우수한지 확인하기 위해, 대조 그룹 (G0), CD141+vMSC+BM-MSC 그룹 (G1), CD141+vMSC 단독 그룹 (G2) 및 BM-MSC 그룹 (G3)으로 설정하고 1.2x105 Cells의 용량으로 각각 투여하였다.
모델 제작 4주 후 (DAY28)에 최종 족부 상태를 관찰한 결과, 대조 그룹에서 족부보존률이 0%이며, 대부분의 개체가 족부/하지 소실로 나타난 반면, G1 그룹에서는 족부 보존(Limb salvage)이 약 87.5% 이상으로 나타났으며, G2 그룹에서는 족부보존률이 25% 및 지골소실이 25%로 상대적으로 양호하게 나타났으며, G3 그룹에서는 족부보존률이 0% 및 지골소실이 25%으로 나타났다 (도 26).
12-2. 허혈 병변 괴사 등급 평가
상기 실시예 12-1의 각 그룹에서 허혈 발생 부위의 괴사(Ischemic necrosis) 중등도에 따라 7 단계로 나누어 등급화하여 평가한 결과, 모델 제작 (time 0) 및 투여 후 1일 (time 1)에는 각 그룹간에 통계적 유의미한 차이는 나타나지 않았으나, 2일부터 G1 그룹에서 G0 그룹 대비 통계적으로 유의한 차이를 보이기 시작하였으며, 28일까지 현저한 차이가 유지되는 것을 확인하였다 (도 27) (투여 후 2일, G0:3.5±0.2 VS G1:1.0±0, P<0.001; 및 28일, G0: 4.8±0.3 VS G1: 0.4±0.4, P<0.001). 또한, 복합/단독투여 비교에서도, G1 그룹에서 3일부터 28일까지 G3 그룹 대비 통계적으로 유의한 결과를 나타냈으며 (3일, G1 VS G3: 2.9±0.4, P<0.001; 및 28일, G1 VS G3: 4.3±0.5, P<0.001), G2 그룹과 비교에서는 3일, 14일 및 28일에서 통계적 유의한 차이가 나타나는 것을 확인하였다 (도 27) (3일, G1 VS EPC G2: 2.2±0.3, P<0.001; 및 28일, G1 VS G2: 2.7±0.6, P<0.01).
12-3. 혈류량 변화 분석
상기 실시예 12-1의 각 그룹에서 허혈이 발생하지 않은 반대쪽 발(contralateral side)과 허혈이 발생한 발(Ischemic side)과의 혈류량을 비교하여 비율(%)로 나타낸 결과, CLI 모델 제작 후 혈류량이 급격하게 감소된 것을 확인하였다. 반면, 7일부터 G1 그룹에서 G0 그룹 대비 통계적 유의미있는 혈류량 개선이 나타나기 시작하였으며, 이러한 통계적 유의한 개선은 28일까지 유지되는 것을 확인하였다 (도 28) (7일, G1: 79.4±6.8 VS G0: 11.8±1.9, p<0.001; 및 28일, G1: 104.6±5.5 VS G0: 19.4±4.0, p<0.001). 또한, 복합/단독 투여 비교에서도 G1 그룹이 G3 그룹 대비 7일부터 28일까지 통계적으로 유의한 개선을 나타냈으며, G2 그룹과 비교에서는 28일에 통계적으로 유의한 차이가 나타나는 것을 확인하였다 (도 28) (7일, G1: 79.4±6.8 VS G3: 28.8±11.0, p<0.05; 28일, G1: 104.6±5.5 VS G3: 33.6±10.1, p<0.001, G2: 53.9±9.3, p<0.001).
이를 통해, CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합에 따른 복합 줄기세포의 투여가 각 세포의 단독 투여에 비해 중증하지허혈에서 치료 효과가 우수한 것을 확인하였다.
실시예 13. 복합줄기세포의 생체 내 혈관 형성 분석
13-1. 혈관 형성 확인 (육안)
중증하지허혈 마우스 모델의 허혈 위치인 혈관 제거 위치에 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합하여 (CD141+vMSC + BM-MSC) 투여 후 4주에 생체내에서의 혈관 형성 여부를 관찰하였다.
그 결과, 중증하지허혈을 유도하지 않은 정상 그룹 (Normal) 마우스의 경우 대퇴동맥이 선명하게 있으며, 근육 조직도 잘 보존이 되어 있고, 중증하지허혈을 유도한 대조 그룹 (Control) 마우스에서는 제거된 혈관 근처로 심각한 염증 및 주변부 조직 손상된 것을 관찰되었다. 반면, CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합하여 투여한 그룹 (CD141+vMSC+BM-MSC)의 경우 제거된 혈관 근처로 새롭게 혈관이 형성된 것으로 관찰되었으며 (노란 화살표), 주변 조직도 매우 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다 (도 29).
13-2. 혈관 형성 확인 (면역형광염색)
상기 실시예 13-1의 각 그룹의 마우스에서 3D 면역형광염색법을 이용하여 근육 전체의 CD31+ 혈관 염색을 수행하여 혈관 밀도를 관찰하였다.
그 결과, 정상 그룹 (Normal) 마우스의 경우 대퇴동맥 중심으로 소동맥들이 뻗어있고, 대조 그룹 (Control) 마우스에서는 동맥이 끊어진 모습 (* 표시)과 허혈 병변의 혈관 밀도가 매우 낮은 것으로 나타났다. 반면, CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합하여 투여한 그룹 (CD141+vMSC+BM-MSC)의 경우에는 소동맥들이 높은 밀도로 형성되어 있는 것을 확인하였다 (도 30). 혈관 염색 이미지를 확대하여 확인한 결과에서도, 정상 그룹 (Normal)에서 내경이 321.7±31.9 μM인 굵은 동맥(대퇴동맥)이 관찰되었고, CD141+vMSC+BM-MSC 그룹은 혈관 내경이 88.1±5.5 μM인 소동맥이 혈관 제거 위치로 뻗어져 나가는 것으로 나타난 반면, 대조 그룹의 경우에는 끊어진 혈관이 관찰되었으며 (*), 그 주변으로 혈관 밀도도 매우 낮았고, 일부 가는 혈관만이 관찰되었다 (도 30).
13-3. 혈관 형성 마커 확인
혈관의 구조는 혈관내피세포(Endothelial cell)과 혈관내피세포를 감싸고 있는 혈관주위세포(pericyte or smooth muscle cell)으로 구성되어 있으므로 (도 31a), CD141+vMSC + BM-MSC를 중증하지허혈 마우스 모델의 허혈 병변의 근육에 투여한 후 (2:1), 혈관 내피 세포의 마커인 CD31에 대한 항-인간-CD31 항체 및 혈관주위세포의 마커인 A-SMA(Alpha-smooth muscle actin)에 대한 항-인간-A-SMA 항체를 이용하여 면역형광염색 및 면역조직염색을 수행하였다.
그 결과, CD141+vMSC + BM-MSC의 투여 위치인 근육에서 Human-CD31 및 Human A-SMA이 혈관을 형성하는 것으로 나타났다 (도 31b). 따라서 CD141+vMSC + BM-MSC가 생체내에서 혈관을 형성할 수 있음을 확인하였다.
13-4. 혈관 직경에 따른 분류
CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합 투여에 따른 혈관 형성능을 확인하기 위해, 상기 실시예 13-3에서와 같이 CD141+vMSC 및 BM-MSC를 조합하여 중증하지허혈 마우스 모델의 허혈 병변의 근육에 투여한 후, 허혈 병변의 근육을 혈관을 구성하는 세포인 Smooth muscle cell의 마커인 TAGLN(Transgelin)에 대한 항체를 이용하여 면역형광염색방법으로 조직염색하고 TAGLN+ 혈관을 분석하였다.
그 결과, 허혈 병변 근육에서 CD141+vMSC + BM-MSC를 투여한 그룹이 대조 그룹 (Control) 대비 TAGLN+ 혈관수가 통계적으로 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (도 32) (Control:31.6±3.0 VS 복합줄기세포: 57±6.8, p<0.01). 또한, 혈관 내경 크기 측정 결과에서도 CD141+vMSC + BM-MSC 투여 그룹의 혈관 내경의 크기가 대조 그룹보다 현저히 큰 것으로 나타났다 (도 32) (Control:15.9±1.9μM VS 복합줄기세포: 36.8±8.4μm, p<0.5). 상기 결과를 바탕으로, 혈관을 내경(Vessel diameter)의 크기별로 분류하여 혈관 수를 측정한 결과, 직경이 20 μm이하 및 20 μm 내지 50μm이하인 경우에는 대조 그룹과 CD141+vMSC + BM-MSC 투여 그룹의 혈관 수가 통계적으로 유의하지 않았으나, CD141+vMSC + BM-MSC 투여 그룹에서 그 수가 많은 것으로 확인되었다. 아울러, 50 μm이상의 경우 CD141+vMSC + BM-MSC 투여 그룹의 혈관 수가 대조 그룹 대비 현저히 많은 것으로 나타났다 (도 32) (Control: 0 VS CD141+vMSC + BM-MSC:7±2, p<0.05).
결과적으로, CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합 투여는 혈관 수가 증가할 뿐만 아니라 50 μm 이상의 내경 사이즈가 큰 혈관이 형성됨으로써 허혈 부위의 혈류량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 14. 복합줄기세포의 생체내 안전성 확인
정상 BALB/c Nude 마우스에서 CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합/병용 투여 후 안전성을 확인하기 위해, 생체내 분포를 면역조직화학법(IHC)으로 CD31+ 혈관 및 Alpha-SMA+ 혈관의 형성을 확인하였다. 또한, 생착 양상을 확인하기 위해 1주, 4주, 13주 및 26주의 CD31+ 혈관과 Alpha-SMA+ 혈관 수를 확인하였다. 또한, 단회 투여 후 6시간, 1일, 1주, 4주, 13주 및 26주에 혈액 및 조직/장기에서 qPCR을 이용하여 체내 분포 시험을 수행하였다. 또한, 근육으로 1.2x105 cells, 6x105 cells 또는 1.2x106 cells 용량으로 단회 투여 후 26주 간 독성을 확인하였다. 아울러, 1x107 cells 용량으로 단회 피하투여 및 2.4x106 cells 용량으로 단회 근육투여 후 26주까지 종양 형성 및 가능성을 관찰하였다.
IHC 분석 결과, CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합/병용 투여에 의해 CD31+ 혈관 및 Alpha-SMA+ 혈관이 대조 그룹 (G0)에 비해 현저하게 많이 형성되는 것으로 나타났다 (도 33). 또한, 투여 후 시간에 따른 혈관수를 확인한 결과, 1주차가 가장 높게 나타났으며 4주차까지 감소한 후 26주까지는 비슷한 수준으로 유지되는 것으로 나타났다 (도 33의 총 혈관수). qPCR을 이용한 체내 분포 시험 결과, 모든 관찰 시점에서 투여 부위 근육에서만 복합줄기세포가 검출되었으며, 다른 장기 및 조직에서는 검출되지 않았고, 투여된 세포는 4주까지는 모든 개체에서 검출되었으나, 13주 및 26주차에도 대부분의 개체에서 검출되었다 (도 33의 Pg/100ng host DNA). 이를 통해, CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합/병용 투여는 투여 위치의 근육에서만 오랜 시간 동안 잔존 및 생착하며, 혈관 형태로 분화되어 중증하지허혈 치료 효과가 유지된 것을 알 수 있다. 또한, 모든 용량에서 26주 동안 독성 반응이 관찰되지 않아 (데이터 미도시), 무독성 용량은 약 1.2x106 cells으로 설정하였다. 아울러, 종양 형성 및 가능성을 관찰한 결과, 시험 물질과 관련된 종양은 형성되지 않아, 종양형성 및 가능성이 없는 것으로 확인되었다. 이를 통해, CD141+vMSC 및 BM-MSC의 조합/병용 투여에 의한 독성 및 종양 형성이 없는 것으로 확인되었으므로, 이를 중증하지허혈 치료제로서 사용시 안전성 측면에서 문제가 없음을 확인하였다.
Claims (30)
- CD141(thrombomodulin TM) 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포.
- 제 1항에 있어서, 혈관형성 다능성 줄기세포(Vasculogenic Multipotent Stem Cells, vMSCs)인, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, 수탁번호 KCLRF-BP-00524로 기탁된, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, 제대혈 유래(umbilical cord blood-derived), 제대 유래(umbilical cord-derived), 지방 유래(adipose-derived) 또는 골수 유래(bone marrow-derived)인, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, 혈관 재생능 또는 혈관 형성능을 가진, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, 다분화능을 가진, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, HGF(Hepatocyte growth factor) 및 이의 수용체를 다른 줄기세포에 비해 과발현하는, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, 집단배가시간(population doubling time, PDT)이 0.5 내지 3일인, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 HGF에 의해 신생 혈관 형성이 촉진되는, 줄기세포.
- 제 2항에 있어서, CD31, CD309, CD34, eNOS, VE-cadherin 또는 VEGF 수용체를 발현하지 않는, 줄기세포.
- 제 1항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물.
- 제 11항에 있어서, 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 추가로 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물.
- 제 12항에 있어서, 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포는 CD141 세포 표면 항원을 발현하지 않는, 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물.
- 제 12항에 있어서, 제 1항의 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 세포수 기준으로 1:10 내지 10:1의 비율로 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물.
- 제 11항에 있어서, HGF 또는 bFGF를 추가로 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성용 세포 치료제 조성물.
- 제 1항의 줄기세포 또는 제 11항의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 혈관 재생용 이식재.
- 제 1항의 줄기세포 또는 제 11항의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 17항에 있어서, 혈관 질환이 외상성 혈관 손상, 말초혈관 질환, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 또는 허혈성 질환인, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 18항에 있어서, 허혈성 질환은 허혈성 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 혈관질환, 허혈성 장염, 허혈성 안질환, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 망막증, 허혈성 뇌졸중 또는 허혈성 하지질환인, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 17항에 있어서, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애가 중증 사지 허혈, 당뇨성 혈관 신생 장애, 혈관성 치매, 당뇨병 수반 장기 손상, 동맥경화증, 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 동맥패쇄성 질환, 뇌졸중, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 당뇨성 궤양, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 허혈성 발작 또는 지주막하 출혈인, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항의 줄기세포 또는 제 11항의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 21항에 있어서, 뇌신경계 질환은 퇴행성 뇌질환, 정신질환 또는 발달장애인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 22항에 있어서, 퇴행성 뇌질환은 인지기능 장애, 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease), 루이체 치매(Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 파킨슨병(Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병(Huntington`s disase), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 길리안-바레 증후군(Gillain-Barre Syndrome; GBS)인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 22항에 있어서, 정신 질환은 양극성 장애, 자폐증, 우울증, 과잉 행동, 주의력 결핍, 자폐증, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 불안 장애, 수면 장애, 공황 장애, 지능 장애, 기억력 저하, 약물 중독, 조현병, 강박증, 과대망상, 성격장애, 알코올중독 또는 조울증인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 22항에 있어서, 발달장애는 뇌전증(epilepsy), 뇌성마비(cerebral palsy), 발달성 언어장애(developmental language disorder), 감각장애(disturbanee of sense), 학습장애(learning disorder), 주의력 결핍 과잉행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD), 자폐 범주성 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD), 지적 장애(Intellectual disability), 인지 장애(Cognitive impairment) 또는 충동조절 장애 (impulse control disorders)인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 골수 유래 인간 골수 단핵세포(bone marrow mononuclear cells, cryopreserved, BM-MNCs) 또는 지방 유래 기질-혈관 분획(stroma vascular fraction, SVF)을 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate)을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 제조방법.
- 혈관 재생 또는 혈관 형성에 사용하기 위한, CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포의 용도.
- CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 재생 또는 혈관 형성 방법.
- CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 치료 방법.
- CD141 세포 표면 항원을 발현하는 줄기세포를 뇌신경계 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환의 치료 방법.
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| KR20150009656A (ko) * | 2013-07-16 | 2015-01-27 | 학교법인 동아학숙 | 양막 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 |
| WO2015016785A1 (en) * | 2013-08-01 | 2015-02-05 | Agency For Science, Technology And Research | Method of identifying adipose stem cells |
| KR20170020273A (ko) * | 2015-08-12 | 2017-02-22 | (주)차바이오텍 | 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 제조방법 및 용도 |
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- 2023-10-05 WO PCT/KR2023/015279 patent/WO2024080661A1/ko unknown
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