CN101978045A - 来自人胎盘灌洗液的血管生成细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了来自胎盘灌洗液的血管发生或血管生成细胞的产生。本发明还提供了治疗患有心脏或血管机能不全、疾病、紊乱或病症的个体的方法，包括向所述个体给予胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、或者胎盘灌洗液或灌洗液细胞与胎盘或非胎盘造血干细胞或贴壁型胎盘干细胞的组合。

Description

来自人胎盘灌洗液的血管生成细胞

1.发明领域

本发明提供了分离的胎盘灌洗液，胎盘灌洗液细胞群，包含所述灌洗液或灌洗液细胞的组合物，以及利用胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞来产生血管生成细胞和血管生成细胞群、以及治疗患有心脏或血管疾病、紊乱或机能不全的个体的方法。

2.发明背景

人干细胞是能够生成多种成熟的人细胞世系的全能性或多能性前体细胞。存在证据证明，能够采用干细胞来增殖许多组织(如果不是所有的话)以及恢复生理和解剖功能。

已经表征过许多不同类型的哺乳动物干细胞。参见例如：Caplan等人，美国专利号5,486,359(人间充质干细胞)；Boyse等人，美国专利号5,004,681(胎儿和新生儿造血干细胞和前体细胞)；Boyse等人，美国专利号5,192,553(同上)；Beltrami等人，Cell 114(6)：763-766(2003)(心脏干细胞)；Forbes等人，J.Pathol.197(4)：510-518(2002)(肝脏干细胞)。脐带血和来源于脐带血的总有核细胞已被用于移植，从而在已进行消融疗法的患者体内部分地或完全地恢复造血功能。胎盘灌洗液包含通过使灌洗液流经胎盘脉管***所获得的胎盘细胞集合，和来自脉管***、来自胎盘母体表面的灌洗液的集合，或兼而有之。灌洗哺乳动物胎盘的方法描述在例如美国专利号7,045,146和美国专利号7,255,879中。通过灌洗获得的胎盘细胞群是异质的，其中包括CD34⁺细胞，有核细胞如粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，小比例(小于1％)的组织培养基质粘附型胎盘干细胞。迄今无人描述过胎盘灌洗液或来自灌洗液的胎盘细胞群在产生血管生成细胞方面的用途。

3.发明概述

本发明提供了由胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞，例如来自胎盘灌洗液的总有核细胞来产生血管生成或血管发生细胞的方法。

一方面，本发明提供了产生血管生成或血管发生细胞，例如具有脉管***形成能力的血管生成或血管发生细胞的方法，包括在多种所述细胞分化成血管或心脏***细胞(例如分化成血管细胞如内皮细胞，或分化成心脏细胞)的条件下培养胎盘灌洗液或灌洗液细胞。在具体实施方案中，所述胎盘灌洗液或所述胎盘灌洗液细胞包含造血胎盘干细胞，例如CD34⁺胎盘细胞。如本发明所用，术语“CD34⁺胎盘细胞”是指由胎盘而非胎盘血或脐带血获得的CD34⁺细胞，例如内皮前体细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞，例如所述CD34⁺胎盘干细胞，与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，以更高的水平产生大量的一种或多种血管生成相关标记。在具体实施方案中，所述标记包括CD31、VEGF-R和/或CXCR4。在具体实施方案中，所述胎盘CD34⁺细胞为CD45^-。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺、CD45w细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，以更高的水平产生大量的一种或多种血管生成相关标记。在具体实施方案中，所述标记包括CD31、VEGF-R和/或CXCR4。在另一具体实施方案中，所述培养包括使所述灌洗液细胞，例如所述CD34⁺胎盘细胞，与转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和一种或多种基质金属蛋白酶相接触。在更具体的实施方案中，所述培养持续18-24小时。在另一更具体的实施方案中，所述细胞在所述接触24小时之后形成可见的血管结构。在更具体的实施方案中，所述接触在如下条件下进行，其中所述细胞在24小时后产生可见血管结构，而来自脐带血的CD34⁺干细胞不形成可见的血管结构，或者与所述灌洗液细胞或CD34⁺胎盘细胞相比，形成可检测地更少的血管结构。在另一具体实施方案中，所述接触在体外进行。在另一具体实施方案中，所述接触在体内进行。在更具体的实施方案中，所述体内接触是在哺乳动物中进行。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物是人。在某些实施方案中，扩增本发明描述的任何CD34⁺细胞或CD34⁺细胞群。

在某些实施方案中，本发明提供了由胎盘灌洗液细胞群形成血管的方法，包括使所述细胞群接触促进形成血管的条件。在具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群是来自胎盘灌洗液的总有核细胞。在另一具体实施方案中，所述接触在体外进行。在另一具体实施方案中，所述接触在体内进行。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含由单个胎盘灌洗中分离的胎盘灌洗液细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞是CD34⁺细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是CD34⁺CD45^-细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞或CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR中的至少一种。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含并非从所述灌洗液中分离的分离的CD34⁺细胞(例如，从脐带血、胎盘血、外周血、骨髓等中分离的)。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从胎盘中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从脐带血、胎盘血、外周血或骨髓中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。在另一具体实施方案中，所述CD34⁺细胞是CD34⁺CD45^-细胞。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。

另一方面，本发明提供了治疗患有心脏或血管机能不全或缺陷的个体的方法，例如通过促进个体的血管发生或血管生成来治疗，该方法包括向个体给予足以使心脏或血管机能不全的一种或多种症状产生可检测的改善或减少其恶化的量的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞。在具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含在可植入或可注射的组合物之中。在另一具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含在如本发明所提供的组合物之中。在另一具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞添加有许多CD34⁺胎盘细胞、胎盘粘附型细胞或兼而有之。

在另一实施方案中，本发明提供了治疗患有心脏或血管疾病、紊乱、病症或机能不全的个体的方法，包括向所述个体给予足以治疗所述疾病、紊乱、病症或机能不全的量的人胎盘灌洗液细胞。在具体实施方案中，所述疾病、紊乱、病症或机能不全是外周血管疾病、急性或慢性心肌梗塞、心肌病、充血性或慢性心力衰竭、心血管缺血、高血压性肺部血管疾病、外周动脉疾病、或风湿性心脏疾病。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞是来自胎盘灌洗液的总有核细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含从单个胎盘灌洗中分离得到的胎盘灌洗液细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞是CD34⁺细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是CD34⁺CD45^-细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞或CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR中的至少一种。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含并非从所述灌洗液中分离的分离的CD34⁺细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从胎盘中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从脐带血、胎盘血、外周血或骨髓中分离的。在另一更具体的实施方案中，CD34⁺细胞为CD45^-。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞或所述CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞在支架或基质上给药。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液通过细胞静脉内给药。

在上述方法的某些实施方案中，CD34⁺胎盘细胞分离自胎盘灌洗液，例如分离自胎盘灌洗液细胞。在某些实施方案中，细胞为CD44^-。在某些实施方案中，细胞为CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺或CD166⁺。在某些实施方案中，细胞为CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺和CD166⁺。在某些实施方案中，细胞为CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺或CD200⁺。在某些实施方案中，细胞为CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺和CD200⁺。在某些实施方案中，所述CD34⁺细胞为CD34⁺CD45^-细胞。在某些其它实施方案中，所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。

在某些实施方案中，CD34⁺细胞与胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞组合。在更具体的实施方案中，CD34⁺细胞是胎盘细胞。在更具体的实施方案中，CD34⁺细胞是胎盘内皮前体细胞。在其它具体实施方案中，CD34⁺细胞是造血细胞，例如胎盘CD34⁺造血干细胞。在具体实施方案中，造血细胞与胎盘灌洗液细胞的比值为约100∶1、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45∶50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70、25∶75、20∶80、15∶85、10∶90、5∶95、100∶1、95∶1、90∶1、85∶1、80∶1、75∶1、70∶1、65∶1、60∶1、55∶1、50∶1、45∶1、40∶1、35∶1、30∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95、1∶100等。在某些其它实施方案中，来自胎盘以外来源(例如，来自脐带血、胎盘血、外周血、骨髓等)的CD34⁺细胞与CD34⁺胎盘细胞组合。在具体实施方案中，非胎盘CD34⁺细胞与CD34⁺胎盘细胞的比值为约100∶1、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45∶50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70、25∶75、20∶80、15∶85、10∶90、5∶95、100∶1、95∶1、90∶1、85∶1、80∶1、75∶1、70∶1、65∶1、60∶1、55∶1、50∶1、45∶1、40∶1、35∶1、30∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，1∶40、1∶45、1∶50、1∶55，1∶60，1∶65，1∶70，1∶75，1∶80，1∶85、1∶90、1∶95、1∶100等。

胎盘灌洗液在某些实施方案中包含组织培养塑料-粘附型胎盘干细胞。粘附型干细胞是美国专利号7,045,148、7,255,879、7,311,904和7,311,905以及美国申请公开号2007/0275362和2008/0032401中详细描述的细胞，其公开内容整体作为参考并入本发明中。粘附型胎盘干细胞呈现出干细胞的一种或多种特征(例如，呈现出与干细胞相关的标记，在培养中以未分化的状态复制至少10-20次，具有分化成代表三个胚层的成年细胞的能力等)，并且能够粘附于组织培养基质上(例如，组织培养塑料，例如组织培养皿或多孔板的表面)。

在一实施方案中，粘附型胎盘干细胞为CD200⁺或HLA-G⁺。在具体实施方案中，所述细胞为CD200⁺和HLA-G⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述干细胞促进从包含胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。

在另一实施方案中，粘附型胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述干细胞促进从包含胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。

在另一实施方案中，粘附型胎盘干细胞为CD200⁺和OCT-4⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述干细胞促进从包含胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。

在另一实施方案中，粘附型胎盘干细胞为CD73⁺和CD105⁺，并且当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，其促进包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。在具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为OCT4⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞为OCT4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。

在另一实施方案中，粘附型胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述干细胞促进从包含胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。

在另一实施方案中，粘附型胎盘干细胞为OCT-4⁺，并且当在允许形成胚样体的条件下培养时，其促进包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群形成一个或多个胚样体。在具体实施方案中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。

在另一实施方案中，灌洗液或灌洗液细胞包括本发明所述的分离的胎盘干细胞群，其产生方法包括灌洗已经排干脐带血并经灌洗除去了残留血液的哺乳动物胎盘；用灌洗溶液灌洗所述胎盘；和收集所述灌洗溶液，其中所述灌洗溶液在灌洗后含有包含胎盘干细胞的胎盘细胞群；和从所述细胞群中分离许多所述胎盘干细胞。在具体实施方案中，灌洗溶液流经脐静脉和脐动脉，并在流出胎盘时收集。在另一具体实施方案中，灌洗溶液流经脐静脉，并从脐动脉收集；或者流经脐动脉，并从脐静脉收集。

在更具体的实施方案中，粘附型胎盘干细胞与骨髓来源的间充质干细胞相比，以可检测地更高的水平表达一种或多种基因，其中所述一种或多种基因选自：ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC 12A8、TCF21、TGFB2、VTN和ZC3H12A，且其中所述骨髓来源的干细胞经历了与所述胎盘干细胞传代数目相同数目的培养传代。

本发明还提供了包含胎盘灌洗液或灌洗液细胞的组合物例如药物组合物的用途。在具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞添加有许多CD34⁺胎盘细胞和/或粘附型胎盘干细胞。在具体实施方案中，组合物包含胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞，以及一种或多种诱导从所述灌洗液或灌洗液细胞形成血管或血管样结构的试剂。在更具体的实施方案中，所述试剂包含TGF-β、FGF、纤溶酶原、tPA，和一种或多种基质金属蛋白酶。

在另一具体实施方案中，任何前述组合物包含基质。在更具体的实施方案中，所述基质是三维支架。在另一更具体的实施方案中，所述基质包含胶原、凝胶、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一更具体的实施方案中，所述基质是羊膜或羊膜来源的生物材料。在另一更具体的实施方案中，所述基质包含胞外膜蛋白。在另一更具体的实施方案中，所述基质包含合成化合物。在另一更具体的实施方案中，所述基质包含生物活性化合物。在另一更具体的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或小于5,000道尔顿的有机分子。在某些实施方案中，所述基质是合成的可降解聚合物，例如聚乳酸或聚乙醇酸。在某些实施方案中，所述基质是可植入的支架基质。在某些实施方案中，所述可植入的支架基质是胶原基质或透明质酸基质。在某些实施方案中，所述可植入的支架基质是胶原基质。

在另一方面，本发明提供了配制基质的方法，包括将胎盘灌洗液或灌洗液细胞与可植入的支架基质混合。在某些实施方案中，所述干细胞是非粘附型的。在某些实施方案中，所述干细胞为CD34⁺。在另一方面，本发明提供了配制可注射组合物的方法，包括将胎盘灌洗液或灌洗液细胞与可注射的透明质酸或胶原混合。在某些实施方案中，所述干细胞是非粘附型的。在某些实施方案中，所述干细胞为CD34⁺。

在某些实施方案中，胎盘灌洗液细胞或包含胎盘灌洗液细胞的组合物，例如药物组合物，包含在容器之中。所述容器在一实施方案中是适合于静脉递送液体的袋子。在某些实施方案中，所述容器包含至少、大约或至多1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹或1×10¹⁰细胞，例如胎盘灌洗液细胞，添加有许多CD34⁺胎盘细胞(例如，CD34⁺胎盘内皮前体细胞)的胎盘灌洗液细胞，或添加有粘附型胎盘干细胞的胎盘灌洗液细胞。在某些实施方案中，所述容器包含所述干细胞。在某些实施方案中，细胞已传代不超过5次、10次或20次。在某些实施方案中，细胞已在所述容器中扩增。在某些实施方案中，所述容器中的细胞包含在0.9％NaCl溶液之中。

另一方面，本发明提供了配制基质的方法，包括将包含干细胞的胎盘灌洗液或灌洗液细胞与可植入的支架基质混合。在某些其它实施方案中，本发明提供了配制可注射组合物的方法，包括将干细胞群与可注射的透明质酸或胶原混合，其中所述干细胞是CD34⁺胎盘细胞。在某些实施方案中，所述干细胞包含在胎盘灌洗液细胞之中。在某些实施方案中，所述组合物包含可注射的透明质酸。在某些实施方案中，所述组合物包含可注射的胶原。

本发明还提供了低温保存的胎盘灌洗液或灌洗液细胞在本发明提供的组合物和方法中的用途。

3.1定义

如本发明所用，术语“SH2指与标记CD105上的表位结合的抗体。因此，称作SH2⁺的细胞为CD105⁺。

如本发明所用，术语“SH3和“SH4指与标记CD73上的表位结合的抗体。因此，称作SH3⁺和/或SH4⁺的细胞为CD73⁺。

如本发明所用，术语“分离的干细胞”表示基本上与干细胞来源的组织(如胎盘)中的其它、非干细胞分离的干细胞。如果在例如干细胞的收集和/或培养过程中，从干细胞中去除了至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的与干细胞天然相伴的非干细胞，则所述干细胞是“分离的”。

如本发明所用，术语“分离的细胞群”表示基本上与细胞群来源的组织(如胎盘)中的其它细胞分离的细胞群。如果在例如干细胞的收集和/或培养过程中，从干细胞中去除了至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的与细胞群或者细胞群来自的细胞天然相伴的细胞，则所述干细胞是“分离的”。

如本发明所用，“胎盘灌洗液”表示已经流经胎盘(例如人胎盘)的至少一部分，例如流经胎盘血管组织的灌洗溶液，包括由灌洗溶液在流经胎盘期间所收集的许多细胞。

如本发明所用，“胎盘灌洗液细胞”表示由胎盘灌洗液分离的、或可由之分离的有核细胞，例如总有核细胞。

如本发明所用，术语“胎盘干细胞”指来源于哺乳动物胎盘的干细胞或前体细胞，而不考虑其形态学、细胞表面标记、或原代培养后的传代数。然而，如本发明所用的术语“胎盘干细胞”不表示滋养层。如果细胞保留了干细胞的至少一种属性，例如与一种或多种类型的干细胞相关的标记或基因表达谱、在培养中复制至少10-40次的能力、分化为三个胚层中的细胞的能力、缺乏成年(即分化的)细胞特征等等，则认为所述细胞是“干细胞”。术语“胎盘干细胞”和“胎盘来源的干细胞”可互换使用。

如本发明所用，当特定标记是可检测的时，则干细胞为该标记“阳性”。例如，由于CD73在胎盘干细胞上以可检测地高于背景(例如，与同型对照相比)的量可检测，因此胎盘干细胞为CD73阳性。当标记可用于将细胞与至少一种其它细胞类型区分开时，或当所述标记在细胞中存在或表达时能用于选择或分离所述细胞时，所述细胞也为所述标记阳性。

如本发明所用，“基质”是指三维物质，其特征在于散布在整个物质中的孔。孔适合于例如在基质中培养细胞，例如干细胞、PDAC、和/或生骨细胞。示例性的基质包括但不限于：β-磷酸三钙基质、β-磷酸三钙-胶原基质、胶原基质、磷酸钙基质、矿化的人胎盘胶原基质、透明质酸基质、和陶瓷基质。优选基质可通过存在于基质孔中的生骨细胞来矿化。

4.附图的简短说明

图1图示了脐带血(CB)或人胎盘灌洗液(HPP)中表达CD34和/或CD45的有核灌洗液细胞的百分数。

图2图示了脐带血(CB)或人胎盘灌洗液(HPP)中表达CD31、CXCR4和/或VEGFR的CD34⁺细胞的百分数。

图3图示了通过qRT-PCR进行的HPP CD34⁺CD45^-和CD34⁺CD45⁺细胞的基因表达分析。人胎盘灌洗液CD34⁺、CD45^-和CD34⁺、CD45⁺细胞中CD34和CD45的相对表达针对脐带血CD34⁺细胞中CD34和CD45的表达进行标准化。相对定量(RQ)(Y轴)表示为2^-ΔΔCt。

图4图示了用Gill改良的苏木精染料染色的CFU-Hill集落，放大倍数200×。集落是由在

培养基中培养2周的人胎盘灌洗液细胞培养物形成的。

图5图示了以10⁶细胞/孔在96孔板的ECMatrix上培养18-24小时的HPP细胞的血管形成。放大倍数：200×。

图6图示了HPP的体内骨形成活性。

图7A、7B：在植入(A)Vitoss和HPP细胞、(B)Vitoss无细胞后21天在支架中心获取的图像。由图6A可知，靠近血管可观察到许多CD34阳性细胞(箭头)。原始放大倍数200×，比例尺100μm；原始颜色：aSMA红色(AF594)、CD34绿色(荧光素)。

图8A、8B：在植入(A)Vitoss和HPP、(B)Vitoss无细胞后42天在支架中心获取的图像。由图7A可知，靠近血管观察不到CD34阳性细胞(箭头)。原始放大倍数200×，比例尺100μm，aSMA红色(AF594)。

图9：图像分析，显示了在21天时两只动物的HPP细胞组中，血管形成具有统计学意义的增强。Y轴--α平滑肌肌动蛋白的表达百分数。

5.发明详述

5.1应用胎盘灌洗液治疗的方法

本发明提供了由胎盘灌洗液产生血管发生或血管生成细胞的方法，此类细胞的用途，以及胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞(例如来自胎盘灌洗液的总有核细胞)单独或组合CD34⁺胎盘细胞(例如，CD34⁺胎盘内皮前体细胞)和/或粘附型胎盘干细胞(例如下文5.3节所述的粘附型胎盘干细胞)在治疗患有心脏或血管机能不全、疾病、紊乱或病症的个体中的用途。在更具体的实施方案中，所述疾病、紊乱或病症为外周血管疾病、急性或慢性心肌梗塞、心肌病、充血性或慢性心力衰竭、心血管缺血、高血压性肺部血管疾病、外周动脉疾病、或风湿性心脏疾病。

一方面，本发明提供了产生血管生成或血管发生细胞，例如具有形成脉管***的能力的血管生成或血管发生细胞的方法，该方法包括使胎盘灌洗液或灌洗液细胞与如下条件接触，其中多种所述细胞分化成血管或心脏***细胞(例如分化成血管细胞如内皮细胞，或分化成心脏细胞)。在具体实施方案中，所述接触在体内。在其它具体实施方案中，所述接触在体外，例如在所述细胞分化成血管或心脏***细胞、或展示此类细胞特征的条件下培养所述灌洗液或所述灌洗液细胞。在更具体的实施方案中，所述一种或多种特征包括形成血管或血管样结构。在另一具体实施方案中，所述培养包括使所述灌洗液细胞，例如所述CD34⁺胎盘细胞，与转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和一种或多种基质金属蛋白酶接触。在另一实施方案中，所述接触包括使所述灌洗液细胞与VEGF(50至200ng/mL)、TGF-β(1至5ng/mL)、FGF(10至50ng/mL)和一种或多种基质金属蛋白酶(各1至3个单位/mL)接触，例如其中所述VEGF、TGF-β、FGF和一种或多种基质金属蛋白酶包含在基质(例如Matrigel)中。所述基质金属蛋白酶可以是任何基质金属蛋白酶或基质金属蛋白酶的组合，例如，基质金属蛋白酶1、3和4的组合。在更具体的实施方案中，所述培养持续18-24小时。在另一更具体的实施方案中，所述细胞在所述接触24小时之后形成可见的血管结构。在更具体的实施方案中，所述接触处于所述细胞在24小时后产生可见血管结构的条件下，而来自脐带血的CD34⁺细胞不形成可见的血管结构，或者与所述灌洗液细胞或CD34⁺胎盘细胞相比形成可检测地更少的血管结构。在另一具体实施方案中，所述接触在体外进行。在另一具体实施方案中，所述接触在体内进行。在更具体的实施方案中，所述体内接触在哺乳动物中进行。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物是人。

在某些实施方案中，本发明提供了从胎盘灌洗液细胞群中形成血管的方法，包括使所述细胞群接触促进形成血管的条件。在具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群是来自胎盘灌洗液的总有核细胞。在另一具体实施方案中，所述接触在体外进行。在另一具体实施方案中，所述接触在体内进行。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含从单个胎盘灌洗中分离的胎盘灌洗液细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞是CD34⁺细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是CD34⁺CD45^-细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞或CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR中的至少一种。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含并非从所述灌洗液中分离的分离的CD34⁺细胞(例如，从脐带血、胎盘血、外周血、骨髓等中分离的)。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从胎盘中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从脐带血、胎盘血、外周血或骨髓中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。在另一具体实施方案中，所述CD34⁺细胞是CD34⁺、CD45^-细胞。

在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液或所述胎盘灌洗液细胞包含胎盘干细胞或胎盘前体细胞，例如CD34⁺胎盘细胞，例如CD34⁺胎盘内皮前体细胞。如本发明所用，术语“CD34⁺胎盘细胞”是指由胎盘而非胎盘血或脐带血获得的CD34⁺细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞，例如所述CD34⁺胎盘细胞，与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，以更高的水平产生大量的一种或多种血管生成相关标记。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞为CD45^-。在具体实施方案中，所述标记包括CD31、VEGF-R和/或CXCR4。在其它实施方案中，CD34⁺细胞为CD44^-。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺或CD166⁺。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺和CD166⁺。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺或CD200⁺。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺和CD200⁺。在某些实施方案中，所述CD34⁺细胞为CD34⁺CD45^-细胞。在某些其它实施方案中，所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。

在某些实施方案中，扩增本发明描述的任何CD34⁺细胞或CD34⁺细胞群。

另一方面，本发明提供了治疗患有心脏或血管机能不全或缺陷的个体的方法，例如通过促进个体的血管发生或血管生成来治疗，该方法包括向个体给予足以使心脏或血管机能不全的一种或多种症状产生可检测的改善或减少其恶化的量的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞。在具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含在可植入或可注射的组合物之中。在另一具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含在如本发明所提供的组合物之中。在另一具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞添加有许多CD34⁺胎盘细胞、胎盘粘附型细胞或兼而有之。

在另一实施方案中，本发明提供了治疗患有心脏或血管疾病、紊乱、病症或机能不全的个体的方法，包括向所述个体给予足以治疗所述疾病、紊乱、病症或机能不全的量的人胎盘灌洗液细胞。在具体实施方案中，所述疾病、紊乱、病症或机能不全是外周血管疾病、急性或慢性心肌梗塞、心肌病、充血性或慢性心力衰竭、心血管缺血、高血压性肺部血管疾病、外周动脉疾病、或风湿性心脏疾病。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞是来自胎盘灌洗液的总有核细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含从单个胎盘灌洗中分离的胎盘灌洗液细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞群包含并非从所述灌洗液中分离的分离的CD34⁺细胞。在更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从胎盘中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞是从脐带血、胎盘血、外周血或骨髓中分离的。在另一更具体的实施方案中，所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞在支架或基质上给药。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞在静脉内给药。

所述胎盘灌洗液、灌洗液细胞、灌洗液或灌洗液细胞与其它细胞的组合、以及包含它们的组合物(例如药物组合物)，在如下章节中详细描述。

5.2获得胎盘灌洗液和灌洗液细胞的方法

本发明提供了由哺乳动物胎盘获得胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞的方法。在本发明描述的所有实施方案中，优选的灌洗液是人胎盘灌洗液，而优选的灌洗液细胞是人胎盘灌洗液细胞。

5.2.1胎盘的收集和处理

一般，在胎盘排出后立即回收人胎盘。在优选的实施方案中，在知情同意、采集患者的完整医疗史并与胎盘关联起来后，从患者处回收胎盘。优选在分娩后继续记录医疗史。此类医疗史可用于协调胎盘或由之收获的干细胞的后续应用。例如，根据医疗史，人胎盘干细胞可用于与胎盘相关的婴儿、或用于所述婴儿的父母、兄弟姐妹或其它亲戚的个人化医疗。

在回收胎盘干细胞之前，去除了脐带血和胎盘血。在某些实施方案中，在分娩后回收胎盘中的脐带血。可以对胎盘实施常规的脐带血回收程序。在一实施方案中，例如，应用针头或套管，借助于重力对胎盘放血(参见例如：Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等，美国专利号5,415,665)。针头或套管通常置于脐静脉内，并且可轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。此类脐带血回收可以商业化进行，例如LifeBank USA、Cedar Knolls，N.J.，ViaCord，Cord Blood Registry和Cryocell。优选对胎盘通过重力来放血而不进行其它操作，从而使脐带血回收过程中的组织破坏最小化。

一般将胎盘从产房或出生室运输至另一地点如实验室，以进行脐带血回收和干细胞收集(例如，通过灌洗或组织解离收集)。胎盘优选在消毒保温的运输装置(维持胎盘温度在20-28℃)中运输，例如，将脐带近端夹紧的胎盘放置在消毒、拉拉链封闭的塑料袋中，然后将其放置在保温容器内。在另一实施方案中，胎盘在基本上如2005年9月19日递交的未决美国专利申请号11/230,760中描述的脐带血收集试剂盒中运输。优选在分娩后4至24小时将胎盘递送至实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收前，夹紧脐带近端，优选夹在距胎盘***处4-5cm(厘米)内的范围。在其它实施方案中，在脐带血回收后但是在胎盘的进一步处理前夹紧近端脐带。

在干细胞收集前，胎盘可储存在无菌条件下，要么在室温，要么在5至25℃(摄氏度)的温度下。胎盘可以储存超过48小时的时间，并优选在灌洗胎盘以去除任何残留的脐带血之前储存4至24小时的时间。胎盘优选在5至25℃(摄氏度)温度下储存在抗凝剂溶液中。适宜的抗凝剂溶液是本领域众所周知的。例如，可以使用肝素或华法令钠(warfarin sodium)溶液。在优选的实施方案中，抗凝剂溶液含有肝素溶液(例如，1％w/w的1∶1000溶液)。在收集胎盘干细胞前，放血的胎盘优选储存不超过36小时。

一旦哺乳动物胎盘或其部分如上所述进行了常规收集和制备，便可按照任何本领域已知的方法进行处理，例如，可进行灌洗或破坏，例如用一种或多种组织破坏酶来消化从而获得干细胞。

5.2.2胎盘灌洗

灌洗哺乳动物胎盘的方法公开在例如Hariri的美国申请公开号2002/0123141以及名为“用于收集和保存器官的改良组合物(ImprovedComposition for Collecting and Preserving Organs)”的美国申请号11/648,812中。

可通过使灌洗溶液(例如上文所述的盐溶液、培养基或细胞收集组合物)流经胎盘脉管***来收集灌洗液。在一实施方案中，通过使灌洗溶液流经脐动脉和脐静脉中任一或两者来灌洗哺乳动物胎盘。可以利用例如胎盘中的重力流来实现灌洗溶液在胎盘中的流动。优选利用泵(例如蠕动泵)来迫使灌洗溶液流经胎盘。例如，可用套管(如或塑料套管)对脐静脉进行插管，所述套管与无菌的连接装置(如无菌管)相连。无菌的连接装置与灌洗歧管相连。

为准备灌洗，胎盘优选按脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式取向(如，悬挂)。可以通过使灌洗溶液流经胎盘脉管***、或流经胎盘脉管***和周围组织来灌洗胎盘。在一实施方案中，脐动脉和脐静脉同时连接移液器，所述移液器通过柔性连接器与灌洗溶液的储器相连。灌洗溶液流入脐静脉和脐动脉。灌洗溶液渗出和/或流经血管壁进入胎盘的周围组织，并从在孕期附着于母亲子宫的胎盘表面的合适开放血管中收集。灌洗溶液还可以通过脐带开口导入，并允许从与母体子宫壁接触的胎盘壁中的开口流出或滤出。在另一实施方案中，灌洗液流经脐静脉并从脐动脉收集，或者流经脐动脉并从脐静脉收集，即仅流经胎盘脉管***(胎儿组织)。

在一实施方案中，例如，脐动脉和脐静脉同时连接于例如移液器，所述移液器通过柔性连接器与灌洗溶液的储器相连。灌洗溶液流入脐静脉和脐动脉。灌洗溶液渗出和/或流经血管壁进入胎盘的周围组织，并从在孕期附着于母亲子宫的胎盘表面的合适开放血管中收集。灌洗溶液还可以通过脐带开口导入，并允许从与母体子宫壁接触的胎盘壁中的开口流出或滤出。通过这种可称为“淘洗”法的方法收集的胎盘细胞，一般是胎儿和母体细胞的混合物。

在另一实施方案中，灌洗液流经脐静脉并从脐动脉收集，或者流经脐动脉并从脐静脉收集。通过这种可称为“闭路式”法的方法收集的胎盘细胞，一般几乎全是胎儿细胞。

在一实施方案中，闭路式灌洗法可以如下实施。产后胎盘在出生后48小时之内获得。夹紧脐带并在夹钳上方切开。脐带可以弃去，或者可以加工以回收例如脐带干细胞，和/或加工脐带膜用于生物材料的产生。羊膜在灌洗期间可以保留，或者可以与绒毛膜分离，例如用手指通过钝器解剖分离。如果羊膜在灌洗之前与绒毛膜分离，则可以例如弃去，或者加工，例如通过酶促消化以获得干细胞，或产生例如羊膜生物材料，例如美国申请公开号2004/0048796中所述的生物材料，其公开内容在此作为参考并入本发明中。在例如利用消毒纱布清洁掉胎盘上所有的可见血凝块和残留血液之后，可露出脐带血管，例如通过部分切开脐带膜而露出脐带横截面。辨认血管，并打开，例如通过沿着各血管切口端推进闭合的鳄鱼夹来打开。然后向各胎盘动脉中***仪器，例如与灌洗装置或蠕动泵相连的塑料管。所述泵可以是适合目的的任何泵，例如蠕动泵。然后向胎盘静脉中***与无菌收集储器，例如储血袋(如250mL收集袋)相连的塑料管。可选地，向胎盘静脉中***与泵相连的管，而向一根或两根胎盘动脉中均***与收集储器相连的管。然后用一定体积的灌洗溶液(例如大约750ml的灌洗溶液)灌洗胎盘。然后例如通过离心收集灌洗液中的细胞。

在一实施方案中，在灌洗期间夹紧脐带近端，更优选夹在距脐带胎盘***处4-5cm(厘米)内的范围。

在某些实施方案中，在灌洗之前从胎盘中除去脐带血(例如通过重力放血)，但是胎盘不用溶液冲洗(例如，灌洗)除去残留血液。在这样的实施方案中，从哺乳动物胎盘首先收集的灌洗液体通常都被脐带血和/或胎盘血残留的红细胞着色。随着灌洗继续和残留的脐带血细胞从胎盘中洗出，灌洗液变得越来越无色。一般30至100ml灌洗液体足以初步除去残留的脐带血。

在其它实施方案中，在灌洗之前从胎盘中除去脐带血(例如通过重力放血)，并且在灌洗回收胎盘干细胞或胎盘灌洗液细胞之前，胎盘用溶液冲洗(例如，灌洗)以除去残留血液。

用于灌洗胎盘的灌洗液体的体积可以根据待收集的胎盘细胞数、胎盘大小、对单个胎盘进行的收集次数等而变化。在多个实施方案中，灌洗液的体积可以是50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL，或750mL至2000mL。一般，在放血后用700-800mL灌洗液来灌洗胎盘。

胎盘可以在数小时或数天的时程内进行多次灌洗。当胎盘进行多次灌洗时，其可以置于容器或其它适宜的器皿中在无菌条件下维持或培养，并用细胞收集组合物或标准灌洗溶液(例如，普通的盐溶液，如磷酸缓冲盐溶液(“PBS”))来灌洗，该细胞收集组合物或标准灌洗溶液中含有或不含抗凝剂(如，肝素、华法令钠、香豆素、双羟香豆素)和/或含有或不含抗微生物剂(如，β-巯基乙醇(0.1mM)、抗生素如链霉素(如40-100μg/ml)、青霉素(如40U/ml)、两性霉素B(如0.5μg/ml)。在一实施方案中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌洗液，从而使胎盘在进行灌洗和收集灌洗液前维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时，或者2或3或更多天。灌洗的胎盘可以维持一个或多个额外的时间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用例如700-800mL灌洗液再灌洗一次。胎盘可以灌洗1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方案中，重复进行胎盘灌洗和灌洗溶液(如干细胞收集组合物)的收集，直至回收的有核细胞数低于100细胞/ml。不同时间点的灌洗液可以进一步单独处理以回收时间依赖性的细胞群，例如总有核细胞。不同时间点的灌洗液也可汇集在一起。

5.2.3胎盘细胞收集组合物

灌洗液可通过用任何生理学可接受的溶液(例如盐溶液、培养基或更为复杂的细胞收集组合物)来灌洗胎盘而从胎盘中收集。细胞收集组合物详细地在相关美国申请公开号2007/0190042中进行了描述，其整体作为参考并入本发明中。

细胞收集组合物可包括任何适合干细胞收集和/或培养的生理学可接受的溶液，例如，盐溶液(例如，磷酸缓冲盐溶液、Kreb氏液、改良的Kreb氏液、Eagle氏液、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM、H.DMEM等)，等等。

细胞收集组合物可包含一种或多种旨在保存胎盘细胞的组分，即，从收集时间到培养的时间内，保护胎盘细胞免于死亡，或延缓胎盘细胞的死亡，降低细胞群中胎盘细胞的死亡数等。此类组分可以是例如，凋亡抑制剂(例如：半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如：硫酸镁、抗高血压药物、心钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、皮质激素释放激素、亚硝基铁***、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如：2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐、或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如：全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。

细胞收集组合物可包含一种或多种组织降解酶，例如：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、RNA酶或DNA酶等。此类酶包括但不限于：胶原酶(例如胶原酶I、II、III或IV，来源于溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶等。

细胞收集组合物可包含杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性的实施方案中，抗生素是大环内酯(例如：妥布霉素)、头孢菌素(例如：头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉仙霉素、红霉素、青霉素(例如：青霉素V)或喹诺酮(例如：氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在特定实施方案中，抗生素具有抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌(例如绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等)的活性。

细胞收集组合物还可包含一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的高分子，在一实施方案中，以足够维持内皮完整性和细胞活力的量存在(例如：合成的或天然存在的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，以约25g/l至约100g/l、或约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如：叔丁对甲氧酚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM至约100μM存在)；还原剂(例如：N-乙酰半胱氨酸，以约0.1mM至约5mM存在)；防止钙进入细胞内的试剂(例如：维拉帕米，以约2μM至约25μM存在)；***油(例如：约0.05g/L至约0.2g/L)；抗凝剂，在一实施方案中，以足以帮助防止残留血液凝结的量存在(例如，肝素或水蛭素，以约1000单位/l至约100,000单位/l的浓度存在)；或含有阿米洛利的化合物(例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、环己基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，以约1.0μM至约5μM存在)。

5.2.4胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞

胎盘灌洗液包含异质的细胞收集物。通常，胎盘灌洗液在使用前清除红细胞。这样的清除可通过公知的从有核血细胞中分离红细胞的方法来进行。在某些实施方案中，灌洗液或灌洗液细胞低温保存。在某些其它实施方案中，胎盘灌洗液或者灌洗液细胞仅包含胎儿细胞，或者胎儿细胞与母体细胞的组合。

通常，来自单个胎盘灌洗的胎盘灌洗液包含约1亿至约5亿的有核细胞。在某些实施方案中，胎盘灌洗液或灌洗液细胞包含CD34⁺细胞，例如，造血干细胞或前体细胞或内皮前体细胞。在更具体的实施方案中，此类细胞可包含CD34⁺CD45^-干细胞或前体细胞、CD34⁺CD45⁺干细胞或前体细胞、骨髓前体细胞、淋巴前体细胞、和/或红细胞前体细胞。在其它实施方案中，胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞包含粘附型胎盘干细胞，例如CD34^-干细胞，例如上文5.1节所述的细胞。在其它实施方案中，胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞包含例如内皮前体细胞、骨前体细胞和天然杀伤细胞。在某些实施方案中，收集自胎盘并清除了红细胞的胎盘灌洗液或分离自此类灌洗液的灌洗液细胞包含：约6-7％的天然杀伤细胞(CD3^-、CD56⁺)、约21-22％的T细胞(CD3⁺)、约6-7％的B细胞(CD19⁺)、约1-2％的内皮前体细胞(CD34⁺、CD31⁺)、约2-3％的神经前体细胞(巢蛋白⁺)、约2-5％的造血前体细胞(CD34⁺)、和约0.5-1.5％的粘附型胎盘干细胞(例如，CD34^-、CD117^-、CD105⁺和CD44⁺)，如通过例如流式细胞仪例如FACS分析所确定的那样。

人胎盘灌洗液中的CD34⁺干细胞或前体细胞与相同数目的分离自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达可检测地更高水平的血管生成相关标记，例如CD31、VEGF-R和/或CXCR4。在某些实施方案中，来自单个灌洗、在具有VEGF的

培养基(用于培养CFU-Hill集落；StemCell Technologies，Inc.)中培养的人胎盘灌洗液单核细胞生成总计约20个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个CFU-Hill集落(内皮细胞前体)。液体培养物中CFU-Hill集落的形成可例如通过在例如

培养基中培养七天时测量获自人胎盘灌洗液的内皮前体细胞对二乙酰基化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)的摄取来证明和评估。

在其它实施方案中，CD34⁺细胞为CD44^-。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺或CD166⁺。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺和CD166⁺。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺或CD200⁺。在某些实施方案中，CD34⁺细胞为CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺和CD200⁺。

在一实施方案中，人胎盘灌洗液细胞在培养时产生血管或血管样结构。HPP细胞的血管形成可例如通过在TGF-β(转化生长因子β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和基质金属蛋白酶(MMP)的存在下，在基质(例如ECMATRIX^TM)上培养细胞(例如约5×10⁵细胞)来证明。血管或血管样结构在约18-24小时后形成。在相同条件下培养的脐带血单核细胞中未见到显著的血管形成。血管形成也可通过培养与VEGF(50至200ng/mL)、TGF-β(1至5ng/mL)、FGF(10至50ng/mL)和一种或多种基质金属蛋白酶(各1至3个单位/mL)接触的灌洗液细胞而观察到，例如其中所述VEGF、TGF-β、FGF和一种或多种基质金属蛋白酶包含在基质(例如Matrigel)中。

此外，来自人胎盘灌洗液的CD34⁺CD45^-细胞比CD34⁺CD45⁺细胞具有可检测地更高的血管生成相关标记CD31和/或VEGFR的表达。

通常，胎盘灌洗液和灌洗液细胞与脐带血细胞相比，具有低MHC I类表达，并且大部分为MHC II类标记阴性。

5.2.5胎盘细胞的分离、分选和表征

来自哺乳动物胎盘的细胞，例如灌洗液细胞或来自灌洗液的干细胞，可通过Ficoll(聚蔗糖)梯度离心从其它细胞中初步纯化(即分离)。此类离心可遵循任何标准离心方法的速度等。例如，在一实施方案中，从胎盘收集的细胞是通过在室温下5000×g离心15分钟从灌洗液中回收的，这使得细胞与例如污染的碎片和血小板分离。在另一实施方案中，胎盘灌洗液被浓缩至约200ml，轻轻地铺在Ficon上，在22℃以约1100×g离心20分钟，收集低密度的细胞中间层用于进一步处理。

细胞沉淀可重悬于新鲜的如上文所述的细胞收集组合物中，或适合干细胞维持的培养基中，例如含2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)。可以例如利用Lymphoprep(Nycomed Pharma，Oslo，挪威)，按照产生商的推荐方法来分离总单核细胞部分。

如本发明所用，“分离”的胎盘细胞，例如来自胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的干细胞或前体细胞，表示除去至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的在完整哺乳动物胎盘中通常与所述细胞相伴的细胞。当来自器官的细胞存在的细胞群中包含少于50％的在完整器官内通常与所述细胞相伴的细胞时，它就是“分离的”。

通过灌洗获得的胎盘细胞，例如如上文所述的粘附型胎盘干细胞，可以例如采用例如具有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma，St.Louis MO)通过差异胰酶消化来进一步或初步地分离。由于干细胞通常在约5分钟内从塑料表面剥离，而胎盘灌洗液中的其它粘附型细胞群通常要求20-30分钟以上的孵育，因此粘附型胎盘干细胞的差异胰酶消化是可行的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)的胰蛋白酶中和反应后，可以收获剥离的胎盘干细胞。在一分离粘附型细胞的实施方案中，将等份试样如5-10×10⁶个细胞置于若干T-75瓶(优选纤粘连蛋白包被的T75瓶)中的每一个。在这样的实施方案中，细胞可以用商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)并置于组织培养箱(37℃，5％CO₂)中来培养。在10-15天后，通过用PBS洗涤从瓶中去除非粘附型细胞。然后用MSCGM替代PBS。优选每天检查培养瓶中不同粘附细胞类型的存在，特别是鉴定和扩增成纤维细胞样细胞簇。

可以监测从哺乳动物胎盘收集的细胞数目和类型，例如通过利用标准的细胞检测技术，如流式细胞仪、细胞分选、免疫细胞化学(例如，用组织特异性或细胞标记特异性抗体染色)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)来测量形态学和细胞表面标记的改变；通过利用光学或共聚焦显微镜来研究细胞形态学；和/或通过利用本领域公知的技术，例如PCR和基因表达谱来测量基因表达的改变。这些技术也可用来鉴定对于一种或多种特定标记呈阳性的细胞。例如，利用CD34的抗体，利用上述技术，人们可以确定细胞是否含有可检测量的CD34；如果是，则细胞是CD34⁺。同样，如果细胞产生足够的RT-PCR可检测的OCT-4RNA，或产生比成体细胞显著更多的OCT-4RNA，则该细胞是OCT-4⁺。细胞表面标记(例如CD标记如CD34)的抗体，以及干细胞特异性基因(例如OCT-4)的序列，都是本领域熟知的。

胎盘细胞，特别是已经过Ficoll分离、差异粘附或两者的结合所分离的细胞可以利用荧光激活细胞分选仪(FACS)来分选。荧光激活细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光特性来分离颗粒(包括细胞)的公知方法(Kamarch，1987，Methods Enzymol，151：150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生微小的电荷，从而允许混合物中正电和负电颗粒的电磁分离。在一实施方案中，用不同的荧光标记来标记细胞表面标记特异性抗体或配体。细胞经过细胞分选仪处理，细胞分选仪允许基于其与所用抗体的结合能力来分离细胞。FACS分选的颗粒可以直接置入96孔或384孔板的单个孔中，从而便于分离和克隆。

在一个分选技术策略中，来自胎盘的干细胞基于标记CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达进行分选。这可以通过结合基于其在培养中的粘附特性来选择干细胞的方法来实现。例如，可以在基于标记表达的分选之前或之后实现干细胞的粘附选择。例如，在一实施方案中，细胞首先基于其CD34的表达进行分选；保留CD34^-细胞，并将CD200⁺HLA-G⁺的细胞与所有其它CD34^-细胞分离。在另一实施方案中，来自胎盘的细胞基于其CD200和/或HLA-G标记的表达进行分选；例如，分离展示任一这些标记的细胞以供进一步使用。在具体实施方案中，表达例如CD200和/或HLA-G的细胞可以基于其CD73和/或CD105的表达、或抗体SH2、SH3或SH4所识别的表位、或缺少CD34、CD38或CD45的表达而进行进一步的分选。例如，在一实施方案中，胎盘细胞通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或该表达的缺乏进行分选，并将CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的细胞与其它胎盘细胞分离，以供进一步使用。

在另一实施方案中，胎盘灌洗液细胞基于其CD34⁺的表达和一种或多种血管生成标记(例如CXCR4、VEGFR和/或CD31)的表达来进行分选。

在另一实施方案中，可使用磁珠来分离细胞。可以利用磁激活细胞分选(MACS)技术，一种基于颗粒结合磁珠(直径0.5-100μm)的能力进行分离的方法来分选细胞。可对磁微球体进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。磁珠随后与细胞混合，从而允许结合。然后使细胞通过磁场，以分离出具有特异性细胞表面标记的细胞。在一实施方案中，这些细胞可随后分离，并与偶联了抗其它细胞表面标记的抗体的磁珠再混合。细胞再次通过磁场，分离与两种抗体均结合的细胞。然后可将此类细胞稀释到不同的器皿中，例如微滴培养皿中以用于克隆分离。

胎盘细胞还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选。例如，胎盘细胞(例如粘附型胎盘干细胞)可以表征为在培养中具有成纤维细胞样外观，和/或基于在培养中的成纤维细胞样外观来选择。胎盘干细胞还可以表征为具有形成胚样体的能力，和/或基于其形成胚样体的能力来选择。在一实施方案中，例如，将形状为成纤维细胞样、表达CD73和CD105、并在培养中产生一个或多个胚样体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。在另一实施方案中，将培养中产生一个或多个胚样体的OCT-4⁺胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，胎盘干细胞(例如胎盘灌洗液或灌洗液细胞)可以通过集落形成单位试验来鉴定和表征。集落形成单位试验是本领域普遍公知的。

胎盘灌洗液或灌洗液细胞的活力、增殖潜力和寿命可采用本领域已知的标准技术，例如台盼蓝拒染测定、荧光素二乙酸酯摄取测定、碘化丙锭摄取测定(评估活力)；和胸苷摄取测定、MTT细胞增殖测定(评估增殖)来评估。寿命可以通过本领域公知的方法确定，例如通过确定延长培养中的最大群倍增数来确定。

胎盘干细胞可利用本领域已知的其它技术与其它胎盘细胞分离开，例如，期望细胞的选择性生长(阳性选择)、不需要细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于混合群中例如与大豆凝聚素一起的差异细胞凝集性而产生的分离；冻融方法；过滤；常规离心和区带离心；离心淘析(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳等等。

5.3粘附型胎盘干细胞

粘附型胎盘干细胞是可由胎盘或其部分获得的、粘附于组织培养基质、并具有分化成非胎盘细胞类型的能力的干细胞。粘附型胎盘干细胞以是胎儿或母体来源的(即，可以具有母亲或胎儿的基因型)。粘附型胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的细胞群，可包含在来源上仅为胎儿或母体的胎盘干细胞，或者可以兼而包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合群。胎盘干细胞和包含胎盘干细胞的细胞群可以通过下文讨论的形态学、标记和培养特征来鉴定和选择。可用于本发明所述组合物和方法的粘附型胎盘干细胞，以及获得和培养此类细胞的方法，在美国专利号7,045,148、7,255,879、7,311,904和7,311,905以及美国申请公开号2007/0275362和2008/0032401中详细描述，其公开内容整体作为参考并入本发明。

5.3.1物理和形态学特征

可用于本发明提供的组合物和方法的粘附型胎盘干细胞在原代培养或细胞培养中培养时粘附于组织培养基质，例如组织培养容器表面(如组织培养塑料)。培养中的粘附型胎盘干细胞通常呈现成纤维细胞样星形外观，从中央细胞体延伸出大量胞质突起。然而，粘附型胎盘干细胞与在相同条件下培养的成纤维细胞在形态学上不同，因为粘附型胎盘干细胞比成纤维细胞表现出更大量的此类突起。形态学上，粘附型胎盘干细胞也与造血干细胞是可区分的，后者在培养中通常呈现出更圆的或鹅卵石状的形态。

5.3.2细胞表面、分子和遗传标记

分离的粘附型胎盘干细胞和粘附型胎盘干细胞群表达许多可用于鉴定和/或分离所述干细胞或包含所述干细胞的细胞群的标记。粘附型胎盘干细胞和干细胞群(即，两种或多种胎盘干细胞)包括从胎盘或其任何部分(例如：羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶、脐带等)直接获得的干细胞和含干细胞的细胞群。

粘附型胎盘干细胞通常表达标记CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，而不表达CD34、CD38或CD45。胎盘干细胞还能够表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。

在一实施方案中，分离的粘附型胎盘干细胞为CD200⁺或HLA-G⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺和HLA-G⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，在允许形成胚样体的条件下，所述CD200⁺或HLA-G⁺干细胞促进在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成胚样体。

在另一实施方案中，分离的粘附型胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述干细为CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺，并且当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。

在另一实施方案中，分离的粘附型胎盘干细胞为CD200⁺和OCT-4⁺。在具体实施方案中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述干细胞促进包含所述干细胞的胎盘细胞群产生一个或多个胚样体。

在另一实施方案中，分离的粘附型胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为OCT-4⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方案中，当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，所述干细胞促进在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成胚样体。

在另一实施方案中，分离的粘附型胎盘干细胞为CD73⁺和CD105⁺，并且当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。在具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为OCT-4⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞为OCT-4⁺、CD34^-、CD38-和CD45^-。

在另一实施方案中，分离的粘附型胎盘干细胞为OCT-4⁺，并且当所述群在允许形成胚样体的条件下培养时，促进在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。在具体实施方案中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方案中，所述干细胞为CD200⁺。在更具体的实施方案中，所述干细胞为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。

粘附型胎盘干细胞可通过酶促消化或灌洗(例如通过如上所述灌洗哺乳动物胎盘)来获得。在具体实施方案中，灌洗溶液流经脐静脉，并从脐动脉收集；或者流经脐动脉，并从脐静脉收集。粘附型胎盘干细胞可基本上全是胎儿来源的；即群中多于90％、95％、99％或99.5％的胎盘干细胞是胎儿来源的。酶促消化胎盘组织以获得粘附型胎盘干细胞在美国专利申请公开号2007/0275362中描述，其公开内容在此整体作为参考并入本发明。

在其它实施方案中，粘附型胎盘干细胞与骨髓来源的间充质干细胞相比，以可检测地更高的水平表达一种或多种基因，其中所述一种或多种基因为：ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC 12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A，或任何前述的组合，其中所述细胞在相同条件下生长。在具体实施方案中，胎盘干细胞特异性或脐带血干细胞特异性基因为CD200。

5.4胎盘灌洗液细胞的培养

5.4.1培养基

分离的胎盘细胞(例如灌洗液细胞)，或由其获得的细胞(例如胎盘干细胞或胎盘干细胞群)，或长出胎盘干细胞的细胞或胎盘组织，可用于起始或接种细胞培养物。细胞通常转移到无菌的组织培养容器内，所述容器使用或未使用胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原(如：天然的或变性的)、明胶、纤粘连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白、和胞外膜蛋白(例如：MATRIGEL(BD DiscoveryLabware，Bedford，Mass.))来涂布。

可以在本领域公认为适合培养细胞(例如干细胞)的任何培养基和任何条件下培养胎盘细胞。优选培养基含有血清。胎盘灌洗液细胞或胎盘干细胞可以培养在例如以下培养基中：DMEM-LG(Dulbecco改良的必需培养基，低糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基础培养基)，其含有ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素；含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15％FBS的DMEM-HG；含有10％FBS、10％马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)；含有10％FBS、EGF和肝素的M199；含有10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素的α-MEM(最低必需培养基)；含有10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素的DMEM等。优选的培养基是含有2％FBS、ITS、LA+BSA、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。

可用于培养胎盘细胞的其它培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基础培养基、Ham氏F10培养基(F10)、Ham氏F-12培养基(F12)、Iscove改良的Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz氏L-15培养基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、改进的DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)和CELL-GRO FREE。

培养基可以添加一种或多种组分，包括例如：血清(如：胎牛血清(FBS)，优选约2-15％(v/v)、马血清(ES)、人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、***-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和***(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；一种或多种控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独或组合使用。

胎盘灌洗液或灌洗液细胞可以在标准组织培养条件下培养，例如在组织培养皿或多孔板中培养。胎盘灌洗液或灌洗液细胞还可以利用悬滴法培养。在此方法中，胎盘干细胞以大约1×10⁴细胞/mL悬浮于大约5mL培养基中，且将一滴或多滴培养基置于组织培养容器(如100mL皮氏培养皿)的盖子里面。悬滴可以是例如单个的悬滴，或者是来自例如多通道移液管的多个悬滴。将盖子小心地倒置在皿底之上，皿底上含有一定量的液体，例如足以维持皿中大气水分的无菌PBS，并培养干细胞。

5.4.2胎盘细胞的扩增和增殖

分离的胎盘细胞(例如灌洗液或灌洗液细胞或干细胞)、或分离的此类细胞群(例如，与至少约50％的在体内通常与干细胞或干细胞群相伴的胎盘细胞分离开的干细胞或干细胞群)可以在体外增殖或扩增。例如，可以在组织培养容器(例如皿、瓶、多孔板等)中培养胎盘细胞群，培养时间足以使细胞增殖至70-90％汇合度，即，直到细胞及其后代占据组织培养容器70-90％的培养表面区域。

胎盘干细胞可以允许细胞生长的密度接种在培养容器内。例如，细胞可以低密度(例如约1,000至约5,000细胞/cm²)至高密度(例如约50,000或更多细胞/cm²)来接种。在优选的实施方案中，在约0至约5％体积CO₂的空气中培养细胞。在一些优选的实施方案中，在约2至约25％O₂的空气中培养细胞，优选在约5至约20％O₂的空气中培养。细胞优选在约25℃至约40℃，优选37℃培养。细胞优选在培养箱中培养。培养基可以是静态的或搅动的，例如，利用生物反应器。胎盘干细胞优选生长在低氧化压力下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。

一旦获得70％-90％汇合度，细胞就可以传代。例如，细胞可以利用本领域公知的技术进行酶促处理，例如胰蛋白酶消化，从而将其与组织培养表面分离。在通过移液取出细胞并计数细胞后，将约20,000-100,000个干细胞，优选约50,000个干细胞传代到含有新鲜培养基的新培养容器内。一般地，新培养基与从中移取干细胞的培养基是相同类型的培养基。用于本发明提供的方法和组合物的粘附型胎盘干细胞可已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次。

5.4.3胎盘细胞群

胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可添加有粘附型胎盘干细胞、CD34⁺胎盘细胞(例如，CD34⁺胎盘内皮前体细胞)、来自胎盘以外来源(例如，脐带血、胎盘血、外周血、骨髓等)的CD34⁺细胞、并非干细胞的胎盘细胞、或并非胎盘细胞的细胞。

分离的胎盘细胞群(例如灌洗液或灌洗液细胞)可以与一个或多个非干细胞群或非胎盘细胞群组合。例如，分离的胎盘细胞群可与血液(例如盘血或脐带血)、血液来源的干细胞(例如来源于胎盘血或脐带血的干细胞)、血液来源的有核细胞群、骨髓来源的间充质干细胞、骨来源的干细胞群、原始骨髓、成年(体)干细胞、包含在组织内的干细胞群、培养的干细胞、完全分化的细胞群(例如软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌肉细胞、心脏细胞等)等相组合。相比各群中的总有核细胞数，分离的胎盘细胞群中的细胞可以如下比率与许多另一类型的细胞组合：约100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1,000、1∶2,000、1∶5,000、1∶10,000、1∶20,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶2,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶20,000,000、1∶50,000,000或约1∶100,000,000。在分离的胎盘细胞群中的细胞也可以与许多细胞类型的许多细胞组合。

在一实施方案中，分离的胎盘灌洗液或灌洗液细胞群与许多CD34+细胞组合。此类CD34⁺细胞可以是例如包含在未处理的胎盘血、脐带血或外周血中；在来自胎盘血、脐带血或外周血的总有核细胞中；在来自胎盘血、脐带血或外周血的分离的CD34⁺细胞群中；在未处理的骨髓中；在来自骨髓的总有核细胞中；在来自骨髓的分离的CD34⁺细胞群中；等等。在具体实施方案中，造血干细胞是CD34⁺胎盘内皮前体细胞。

5.5胎盘细胞库的产生

胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞可以贮存在细胞库中。在优选的实施方案中，胎盘灌洗液或灌洗液细胞是人灌洗液或灌洗液细胞。灌洗液或灌洗液细胞能够以单位进行贮存，例如从单个胎盘收集的总灌洗液或细胞，或单个胎盘的单次灌洗。来自多次灌洗或多个胎盘的灌洗液或灌洗液细胞可混合成单位。

来自产后胎盘的细胞(例如干细胞、胎盘灌洗液细胞或其组合)可以由多种不同的方法培养，以产生一系列批次的例如一系列独立给药剂量的胎盘干细胞。这样的批次可以例如由来自胎盘灌洗液的干细胞获得，或来自酶消化的胎盘组织。由大量胎盘获得的系列批次的胎盘细胞可以制备为胎盘细胞库例如进行长期储存。通常，由胎盘材料的初始培养物中获得粘附型干细胞从而形成种子培养物，其在可控的条件下扩增，以形成来自大致等同倍增次数的细胞群。所述批次优选来源于单个胎盘的组织，但是可以来源于多个胎盘的组织。

在一实施方案中，按如下获得胎盘细胞批次。胎盘灌洗液细胞通过灌洗一个或多个胎盘，优选仅流经胎盘脉管***来获得，优选来自已经排干脐带血并灌洗去除了残留血液的胎盘，通过离心收集所得灌洗液中的细胞，并除去红细胞。收集这些细胞并重悬于便利体积的培养基中，并定义为早期传代细胞。

早期传代细胞随之用于接种扩增培养物。扩增培养可以是任意排列的不同细胞培养装置，例如NUNC^TM的细胞工厂(Cell Factory)。早期传代培养物中的细胞可以细分至任何程度，从而用例如1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴或10×10⁴个干细胞来接种扩增培养物。优选用约2×10⁴至约3×10⁴个0代细胞接种各扩增培养物。扩增培养物的数量可取决于早期传代细胞的数量，并且取决于获得干细胞的特定胎盘该数量可以更大或更小。

扩增培养物可以生长直到培养物中的细胞密度达到一定的值，例如约1×10⁵细胞/cm²。在此时间点细胞可以进行收集或低温保存，或如上文所述传代为新的扩增培养物。细胞可以在使用前传代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。优选在扩增培养期间维持群倍增的累积数记录。来自早期传代培养物的细胞可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次倍增或多达60次倍增。不过，优选在将细胞群划分为独立剂量之前，群倍增数在约15至约30之间，优选约20次倍增。细胞可以在整个扩增过程中连续培养，或者可以在扩增期间的一个或多个时间点冷冻。

待用于独立剂量的细胞可以冷冻，例如低温保存以备后用。独立剂量可以包含例如每毫升约一百万至约一亿个细胞，并且可以包含总计约10⁶至约10⁹个细胞。

因此，在一实施方案中，可通过包括如下步骤的方法来制备胎盘干细胞库：扩增来自人产后胎盘的胎盘干细胞原代培养物，以进行第一多次群倍增；低温保存所述胎盘干细胞以形成主细胞库；扩增来自主细胞库的多种胎盘干细胞，以进行第二多次群倍增；低温保存所述胎盘干细胞以形成工作细胞库；扩增来自工作细胞库的多种胎盘干细胞，以进行第三多次群倍增；和以独立剂量低温保存所述胎盘干细胞，其中所述独立剂量共同地构成胎盘干细胞库。在一具体的实施方案中，所述独立剂量包含约10⁴至约10⁵个胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，所述独立剂量包含约10⁵至约10⁶个胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，所述独立剂量包含约10⁶至约10⁷个胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，所述独立剂量包含约10⁷至约10⁸个胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，所述独立剂量包含约10⁸至约10⁹个胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，所述独立剂量包含约10⁹至约10¹⁰个胎盘干细胞。

在优选的实施方案中，对获取胎盘的提供者(例如母亲)测试至少一种病原体。如果母亲测试为所测病原体阳性，则弃掉来自该胎盘的全部批次。这样的测试可以在胎盘干细胞批次产生期间的任何时间进行，包括在建立0代细胞之前或之后，或在扩增培养期间。测试其存在的病原体可以包括，但不限于：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(I型和II型)、巨细胞病毒、疱疹病毒等。

5.6胎盘细胞的保存

胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、以及胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞与粘附型胎盘干细胞和/或CD34⁺胎盘细胞的组合可以保存，即置于允许长期贮存的条件下，或置于抑制凋亡或坏死所致的细胞死亡的条件下。

可以利用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物来保存细胞，如题为“用于收集胎盘干细胞和保存器官的改良组合物(ImprovedComposition for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs)”的相关美国申请公开号2007/0190042中所述，其公开内容在此整体作为参考并入本发明。

在一实施方案中，胎盘细胞群可通过使所述细胞群与含有凋亡抑制剂和携氧全氟化碳(例如处于乳剂或分离相中)的细胞收集组合物接触来保存，其中与未接触凋亡抑制剂的细胞群相比，所述凋亡抑制剂以足以降低或防止干细胞群中的凋亡的量和时间存在。在多个实施方案中，所述凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂。在另一实施方案中，细胞收集组合物还包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方案中，在接触细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约0℃至约25℃之间。在另一更具体的实施方案中，在接触细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约2℃至约10℃之间，或约2℃至约5℃之间。在另一更具体的实施方案中，所述接触是在运输所述细胞群期间进行的。在另一更具体的实施方案中，所述接触是在冷冻和融化所述细胞群期间进行的。凋亡抑制剂可与器官保存化合物组合，例如羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖、UW溶液(描述于美国专利号4,798,824中；也称为ViaSpan；还参见Southard等，Transplantation 49(2)：251-257(1990))或是Stern等的美国专利号5,552,267中描述的溶液(其公开内容在此作为参考并入本发明)，或者它们的组合。

在所述方法的另一实施方案中，胎盘细胞在灌洗期间与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或其组合的细胞收集组合物相接触。在另一实施方案中，在组织破坏例如酶促消化期间接触所述细胞。在另一实施方案中，在通过灌洗收集后或在通过组织破坏例如酶促消化收集后，胎盘细胞与所述细胞收集化合物相接触

一般地，在胎盘细胞收集、富集和分离过程中，优选最小化或消除由于缺氧和机械应力导致的细胞胁迫。因此，在所述方法的另一实施方案中，胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、胎盘干细胞或干细胞群在收集、富集或分离过程中，在所述保存期间，与低氧条件接触少于6个小时，其中低氧条件是氧浓度低于正常的血氧浓度。在更具体的实施方案中，所述细胞群在所述保存期间与所述低氧条件接触少于2个小时。在另一更具体的实施方案中，所述细胞群在收集、富集或分离过程中与所述低氧条件接触少于1个小时、或少于30分钟、或不接触低氧条件。在另一具体实施方案中，所述细胞群在收集、富集或分离过程中不接触剪切应力。

胎盘灌洗液和灌洗液细胞可以低温保存，例如置于小容器如安瓿瓶中的低温保存培养基中。适宜的低温保存培养基包括但不限于：包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如可商购的细胞冷冻培养基，例如C2695、C2639或C6039(Sigma)在内的培养基。低温保存培养基优选包含DMSO(二甲亚砜)，其浓度为例如约10％(v/v)。低温保存培养基可以包含其它试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。在低温保存过程中，胎盘干细胞优选以约1℃/分钟冷却。优选的低温保存温度是约-80℃至约-180℃，优选约-125℃至约-140℃。在解冻使用前，低温保存的细胞可以转移到液氮中。在一些实施方案中，例如，一旦安瓿瓶达到约-90℃，就将其转移至液氮储存区域。低温保存的细胞优选在约25℃至约40℃的温度，优选在约37℃的温度解冻。

5.7胎盘细胞的用途

5.7.1胎盘细胞群

本发明提供了治疗患有心脏或血管疾病、紊乱或机能不全的个体的方法，包括向所述个体给予胎盘细胞群，包括胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞，例如来自胎盘灌洗液的总有核细胞，及它们与其它细胞(例如内皮前体细胞、造血干细胞或脐带血)的组合。如本发明所用，“治疗”包括治愈、矫正、改善心脏或血管疾病、紊乱、病症或机能不全或其任何参数或症状，减轻其严重程度，或缩短其病程。在多个实施方案中，所述疾病、紊乱、病症或机能不全是外周血管疾病、急性或慢性心肌梗塞、心肌病、充血性或慢性心力衰竭、心血管缺血、高血压性肺部血管疾病、外周动脉疾病、或风湿性心脏疾病。

胎盘灌洗液细胞和胎盘灌洗液细胞群或由之获得的干细胞，可离体或在体内诱导分化成特定的细胞类型，以制备成用于向需要干细胞或从干细胞分化的细胞的个体给药。例如，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可注射到损伤器官中，并用于器官再生和体内损伤修复。此类损伤可例如因动脉或静脉阻塞、梗塞、缺血等所致。

可以给予胎盘灌洗液和灌洗液细胞，而无需在引起干细胞分化的条件下培养。可选地，灌洗液或灌洗液细胞可在给药前在例如血管生成或血管发生培养基中培养例如约1-20天。在某些实施方案中，可分离胎盘灌洗液或灌洗液细胞，并接种在基质上，然后在血管生成或血管发生培养基中培养例如约1-20天。在另一实施方案中，胎盘灌洗液或灌洗液细胞可在例如血管生成或血管发生培养基中培养例如约1-20天，然后接种到基质上，然后如本发明所述在骨生成培养基中培养例如约1-20天。

胎盘灌洗液或灌洗液细胞，单独地或与干细胞或前体细胞群(例如胎盘干细胞)组合，可用来在体外或体内产生组织或器官。由胎盘获得的细胞，例如灌洗液、灌洗液细胞、胎盘干细胞或前体细胞，可用来接种基质，接着在引起或允许细胞分化和在基质上建殖的条件下进行培养。通过本发明提供的方法获得的组织和器官可用于多种目的，包括研究和治疗目的。

在另一实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞被用于自体和异源移植，包括匹配和不匹配的HLA型造血移植。在一胎盘灌洗液和/或灌洗液细胞作为异源造血移植的用途的实施方案中，治疗宿主以降低供体细胞的免疫排斥或建立免疫耐受(参见例如美国专利号5,800,539和5,806,529)。在另一实施方案中，宿主不进行降低免疫排斥或建立免疫耐受的治疗。

胎盘灌洗液或灌洗液细胞，单独地或与一种或多种其它干细胞群组合，能够用于治疗性移植方案，例如以补充或替换肝脏、胰脏、肾脏、肺脏、神经***、肌肉***、骨骼、骨髓、胸腺、脾脏、粘膜组织、性腺或毛发的干细胞或前体细胞。另外，胎盘灌洗液或灌洗液细胞在通常会应用前体细胞的治疗或研究方法中可以用来代替特定类型的前体细胞(例如，软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰腺实质细胞、成神经细胞、肌肉前体细胞等)。

胎盘灌洗液或灌洗液细胞可用来修复因例如创伤、代谢紊乱或疾病所致的组织和器官损伤。在这样的实施方案中，可对患者单独给予胎盘灌洗液或灌洗液细胞或与其它干细胞群或前体细胞群组合给药，从而再生或恢复已因为疾病而受损的组织或器官。

5.7.2包含胎盘灌洗液或灌洗液细胞的组合物

本发明提供了包含或衍生自胎盘灌洗液或灌洗液细胞、或源于其的生物分子的组合物。胎盘灌洗液或灌洗液细胞与任何生理学上可接受的或医学上可接受的化合物、组合物或装置相组合，以用于例如研究或治疗。

5.7.2.1低温保存的胎盘灌洗液或灌洗液细胞

本发明所述的胎盘灌洗液或灌洗液细胞可以保存，例如低温保存供随后使用。低温保存细胞如干细胞的方法是本领域公知的。胎盘干细胞群可以制备成易于向个体给药的形式。例如，本发明提供了包括在适合医学用途的容器内的胎盘干细胞群。此类容器可以是例如，无菌的塑料袋、瓶、罐，或其它可以方便的从中分配胎盘干细胞群的容器。例如，容器可以是适合将液体静脉给药至接受者的血袋或其它塑料的、医学上可接受的袋。容器优选是允许低温保存组合的干细胞群的容器。

低温保存的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可以包含来源于单个提供者或多个提供者的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞。胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可与目标接受者是完全地HLA匹配的，或者部分地HLA不匹配或完全地HLA不匹配的。

因而，在一实施方案中，本发明提供了处于容器中的包含胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的组合物。在具体实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞是低温保存的。在另一具体实施方案中，容器是袋、瓶或罐。在更具体的实施方案中，所述袋是无菌塑料袋。在更具体的实施方案中，所述袋适合、允许或有助于静脉给药所述胎盘干细胞群。所述袋可以包括相互连接的多个内腔或隔室，以允许在给药前或给药期间将胎盘干细胞与一种或多种其它溶液例如药物进行混合。在另一具体实施方案中，组合物包含一种或多种有助于低温保存胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的化合物。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含在生理学上可接受的水性溶液中。在更具体的实施方案中，所述生理学上可接受的水性溶液为0.9％NaCl溶液。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含与所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的接受者HLA匹配的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含与所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的接受者至少部分HLA不匹配的胎盘细胞。在另一具体实施方案中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞来源于多个提供者。

5.7.2.2药物组合物

胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可以配制成体内使用的药物组合物。此类药物组合物包含处于药学可接受的载体(例如用于体内给药的盐溶液或其它生理学上可接受的溶液)中的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞。本发明提供的药物组合物可以包含任何胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的实施方案。药物组合物可以包含胎儿、母体、或同时包括胎儿和母体的胎盘细胞。本发明提供的药物组合物还可以包含获自单个个体或单个胎盘或者获自多个个体或多个胎盘的胎盘细胞。

本发明提供的药物组合物可以包含任何数量的胎盘细胞。例如，在不同的实施方案中，单一单位剂量的胎盘细胞可以包含大约、至少、或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个胎盘干细胞。

细胞可以在例如生理学上可接受的溶液中给药，例如盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液，0.9％NaCl溶液等。

本发明提供的药物组合物可以包含含有50％或更多活细胞(即，群中至少约50％的细胞是功能性的或活的)的细胞群，例如胎盘灌洗液细胞。优选群中至少60％的细胞是活的。更优选药物组合物的群中至少约70％、80％、90％、95％或99％的细胞是活的。

本发明提供的药物组合物可以包含一种或多种例如有助于移植的化合物(例如抗T细胞受体、免疫抑制剂等等)；稳定剂如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉等等。

本发明提供的细胞群可以手术植入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或以其它方式直接或间接向个体给药，例如，在需要修复或补充的部位给药。本发明提供的细胞群或组合物(例如药物组合物)可以口服、经鼻、动脉内、胃肠外、静脉内、经眼、肌肉内、皮下、腹膜内、脑内、心室内、脑脏内、***内、脑池内、脊髓内和/或髓周给药。

5.7.2.3胎盘细胞条件培养基

胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、CD34⁺胎盘细胞或其组合(例如与粘附型胎盘干细胞的组合)，可用来产生条件培养基，即含有由灌洗液或细胞分泌或排出的一种或多种生物分子的培养基。在多个实施方案中，条件培养基包含在其中胎盘细胞已经生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其它实施方案中，条件培养基包含在其中胎盘细胞已经生长到至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合度，或高达100％汇合度的培养基。此类条件培养基可用于支持胎盘细胞或其它类型细胞如干细胞的独立群的培养。在另一实施方案中，条件培养基包含在其中的胎盘干细胞已经分化为成体细胞类型的培养基。在另一实施方案中，条件培养基包含在其中已经培养了胎盘灌洗液细胞和非胎盘干细胞的培养基。

5.7.2.4包含胎盘细胞的基质

本发明还提供了包含胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞的基质、水凝胶、支架等等。

胎盘细胞，例如灌洗液或灌洗液细胞，可以接种在天然基质上，例如胎盘生物材料，如羊膜材料。此类羊膜材料可以是例如直接从哺乳动物胎盘切割的羊膜、固定的或热处理的羊膜、基本干燥(即，＜20％H₂O)的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等等。优选可以接种胎盘细胞的胎盘生物材料描述在Hariri的美国申请公开号2004/0048796中。

胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可以悬浮在合适的例如注射的水凝胶溶液中。合适此类组合物的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一实施方案中，水凝胶溶液包含可以允许在例如模具中硬化的细胞，从而形成细胞分散其中的、用于移植的基质。也可以培养此类基质中的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞使得细胞在移植前进行有丝***扩增。水凝胶可以是例如通过共价键、离子键或氢键交联的有机聚合物(天然的或合成的)，从而产生三维开放的晶格结构，使水分子俘获于其中形成凝胶。水凝胶形成材料包括多糖，例如褐藻胶及其盐，肽、聚膦嗪和离子交联的聚丙烯酸脂，或嵌段聚合物，例如分别通过温度或pH交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在一些实施方案中，水凝胶或基质是可生物降解的。

在一些实施方案中，所述制剂包含原位的可聚合凝胶(参见例如美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等，J.Control Release，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003))。

在一些实施方案中，所述聚合物在水性溶液(例如水、缓冲盐溶液、或水性醇溶液)中至少是部分可溶的，所述聚合物具有带电的侧基，或其单价离子盐。具有酸性侧基、可以与阳离子反应的聚合物实例是聚(膦嗪)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，例如磺酸化聚苯乙烯。也可以使用通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应所形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卤代(优选氟代)醇基、酚羟基、和酸羟基。

胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可以接种在三维框架或支架上，并植入体内。此类框架可以与任何一种或多种生长因子、细胞、药物或其它刺激组织形成或以其它方式增强或提高本发明提供的方法实施的组分联合植入。

可以在本发明提供的方法中使用的支架的实例包括非织毡、多孔泡沫、或自组装肽。可以利用由合成的可吸收性乙醇酸和乳酸的共聚物(例如PGA/PLA)组成的纤维形成非织毡(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)。由例如聚(ε-己酸内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫也可作为支架使用，其通过例如冷冻干燥或冻干处理形成(参见例如：美国专利号6,355,699)。

胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞还可以接种在生理学上可接受的陶瓷材料上，或与其接触，所述陶瓷材料包括但不限于：磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙和磷酸四钙、羟磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸镁钙、生物学活性玻璃例如及其混合物。目前可商购的多孔生物相容性陶瓷材料包括

(CanMedica Corp.，加拿大)、

(Merck Biomaterial France，法国)、

(Mathys，AG，Bettlach，瑞士)，和矿化胶原骨骼移植产品，例如HEALOS^TM(DePuy，Inc.，Raynham，MA)和

RHAKOSS^TM和

(Orthovita，Malvern，Pa.)。框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物或复合物。

在另一实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可以接种在毡上，或与其接触，所述毡可以例如由生物可吸收性材料如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物或透明质酸制成的复丝组成。

在另一实施方案中，本发明的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可以接种在可以是复合结构的泡沫支架上。此类泡沫支架可以模制成有用的形状，例如需要修复、取代或补充的机体特定结构的一部分的形状。在一些实施方案中，在接种胎盘细胞(例如胎盘灌洗液细胞)前，用例如0.1M乙酸处理框架，接着将框架孵育在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中，从而增加细胞附着。可以修饰基质的外表面来改善细胞的附着或生长以及组织的分化，例如通过血浆包被基质，或添加一种或多种蛋白质(例如胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡胺聚糖(例如硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、细胞基质，和/或其它材料，例如但不限于明胶、褐藻胶、琼脂、琼脂糖和植物胶等。

在一些实施方案中，支架包含使其具有非血栓形成性的材料，或用所述材料处理。这些处理和材料还可以促进和维持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于：天然材料例如基膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料例如EPTFE，和片段化的聚氨酯脲硅树脂(segmented polyurethaneurea silicones)例如PURSPAN^TM(The PolymerTechnology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。支架还可以包含抗血栓形成剂例如肝素；支架还可以在接种胎盘灌洗液或灌洗液细胞之前进行处理，以改变表面电荷(例如用血浆包被)。

在一实施方案中，胎盘干细胞以约0.5×10⁶至约8×10⁶个细胞/mL接种在适宜的支架上，或与之接触。

5.7.3永生化胎盘细胞系

哺乳动物胎盘细胞可以通过用任何含有生长促进基因(即，在适宜条件下促进所转染的细胞生长的蛋白质的编码基因)的适宜载体转染而条件性永生化，从而所述生长促进蛋白质的产量和/或活性可通过外部因子调控。在优选的实施方案中，所述生长促进基因是癌基因，例如但不限于：v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒或人***瘤病毒的E7蛋白

生长促进蛋白质的外部调控可以通过将生长促进基因置于外部可调控启动子的控制之下实现，例如其活性能够通过例如改变所转染的细胞的温度或者与细胞接触的培养基的组成来控制的启动子。在一实施方案中，可采用四环素(tet)控制的基因表达***(参见Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci USA89：5547-5551，1992；Hoshimaru等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1518-1523，1996)。不存在tet时，此载体内tet控制的转录激活子(tTA)强有力地激活来自ph_CMV*-1的转录，其为与tet操纵子序列融合的来自人巨细胞病毒的最小启动子。tTA是大肠杆菌(Escherichia coli)转座子-10来源的tet抗性操纵子的阻遏蛋白(tetR)和单纯疱疹病毒VP 16酸性结构域的融合蛋白。无毒低浓度的tet(例如0.01-1.0μg/mL)几乎完全消除tTA的转录激活作用。

在一实施方案中，载体还含有编码可选择标记(例如赋予药物抗性的蛋白质)的基因。细菌新霉素抗性基因(neoR)是一种这样的可以在本发明方法中采用的标记。携带neoR的细胞可以通过本领域普通技术人员公知的方法来选择，例如向生长培养基中添加例如100-200μg/mL G418。

转染可以通过本领域普通技术人员公知的多种方法中的任何一种实现，包括但不限于逆转录病毒感染。一般而言，细胞培养物可以通过与从载体产生细胞系收集的条件培养基和含N2补充剂的DMEM/F12的混合物孵育来转染。例如，如上文所述制备的胎盘细胞培养物可以在例如5天后，通过在体外在一体积的条件培养基和两体积的含N2补充剂的DMEM/F12中孵育大约20小时进行感染。携带可选择标记的经转染的细胞可以随之如上文所述进行选择。

在转染之后，培养物在允许增殖的表面上传代，例如允许至少约30％的细胞在24小时的周期内倍增。优选基质是聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质(其由包被聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)的组织培养塑料组成)，聚赖氨酸/层粘连蛋白基质，或用纤粘连蛋白处理的表面。培养物随后每3-4天用生长培养基补料，培养基可以或可以不添加一种或多种增殖促进因子。当培养物不足50％汇合度时，可以向生长培养基中添加增殖促进因子。

条件性永生化的胎盘干细胞系可以利用标准技术传代，例如在80-95％汇合时通过胰酶消化。在一些实施方案中，到大约第二十几次传代时维持选择是有益的(通过例如对含新霉素抗性基因的细胞添加G418)。细胞还可以在液氮中冷冻进行长期储存。

可以从如上文所述制备的条件性永生化人胎盘干细胞系中分离克隆细胞系。一般而言，这样的克隆细胞系可以利用标准技术，如通过有限稀释或利用克隆环分离并扩增。克隆细胞系可以大体如上文所述进行补料和传代。

条件性永生化的人胎盘干细胞系可以是但不必须是克隆的，通常可以通过在有助于分化的培养条件下抑制生长促进蛋白质的产量和/或活性来诱导分化。例如，如果编码生长促进蛋白质的基因处于外部可调控启动子的控制之下，则可以改变条件例如温度或培养基的组成，以抑制生长促进基因的转录。对于如上文所讨论的四环素控制的基因表达***，可以通过添加四环素抑制生长促进基因的转录来实现分化。一般而言，1μg/mL四环素在4-5天足以起始分化。为促进进一步的分化，生长培养基中可以包括另外的试剂。

5.7.4测定

胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞可在测定中使用，以与不接触此类条件的胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞相比，来确定培养条件、环境因素、分子(例如生物分子、有机小分子等)等对干细胞增殖、扩增和/或分化的影响。

在优选的实施方案中，测定胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞与分子接触时在增殖、扩增或分化方面的变化。例如，骨生成分化可通过监测碱性磷酸酶活性和/或钙矿化来测定。

例如，在一实施方案中，本发明提供了鉴定调节胎盘灌洗液细胞的增殖的化合物的方法，包括使所述灌洗液细胞与所述化合物在允许增殖的条件下接触，其中与不接触所述化合物的大量所述细胞相比，如果所述化合物导致所述细胞增殖可检测地改变，则鉴定所述化合物为调节胎盘灌洗液细胞增殖的化合物。在具体实施方案中，鉴定所述化合物为增殖抑制剂。在另一具体实施方案中，鉴定所述化合物为增殖增强剂。

在另一实施方案中，本发明提供了鉴定调节大量胎盘细胞的扩增的化合物的方法，包括使胎盘灌洗液细胞与所述化合物在允许扩增的条件下接触，其中与不接触所述化合物的大量细胞相比，如果所述化合物导致所述细胞扩增可检测地改变，则鉴定所述化合物为调节胎盘细胞扩增的化合物。在具体实施方案中，鉴定所述化合物为扩增抑制剂。在另一具体实施方案中，鉴定所述化合物为扩增增强剂。

在另一实施方案中，本发明提供了鉴定调节胎盘细胞(例如胎盘灌洗液细胞)的分化的方法，包括使所述细胞与所述化合物在允许分化的条件下接触，其中与不接触所述化合物的细胞相比，如果所述化合物导致所述干细胞分化可检测地改变，则鉴定所述化合物为调节胎盘细胞增殖的化合物。在具体实施方案中，鉴定所述化合物为分化抑制剂。在另一具体实施方案中，鉴定所述化合物为分化增强剂。

6.实施例

如下实施例为举例说明目的而提供，故不应解释为以任何方式限制。本发明引述的所有参考文献，无论是专利文献、文献资料或是其它，在此用于所有目的作为参考并入本发明。

6.1实施例1：由胎盘灌洗液细胞生成血管生成细胞

如上文5.2节所述获得的胎盘灌洗液清除了红细胞，并对其分析以确定多种单核细胞类型的百分数。表1详述了所鉴定的细胞类型：

表1：来自单个胎盘的人胎盘灌洗液中的主要有核细胞群

在独立实验中，建立了来自人胎盘灌洗液的CD34⁺胎盘细胞，其包含CD34⁺CD45^-细胞亚群，其中与脐带血相比，对于给定数目的有核细胞而言，其以更高的百分数存在。参见图1。

在另一实施方案中，来自人胎盘灌洗液的CD34⁺细胞通过流式细胞仪分析，以确定表达血管生成相关标记CD31、CXCR4和VEGFR的细胞百分数。与来自脐带血的CD34⁺细胞相比，更高百分数的来自HPP的CD34⁺细胞表达这些标记。参见图2。

在另一实施方案中，应用定量实时PCR(qRT-PCR)来分析胎盘CD34⁺CD45^-细胞中的基因表达。CD34⁺CD45^-和CD34⁺CD45⁺细胞群通过FACS ARIA(BD Biosciences)分离自相同的人胎盘灌洗液(HPP)，并进行RNA制备，利用Applied Biosystems FAST 7900HT设备和引物/探针进行CD34、CD45、CD31和VEGFR表达的qRT-PCR分析。如图3所示，HPP CD34⁺CD45^-细胞中的CD31和VEGFR表达均高于CD34⁺CD45⁺细胞。这些数据表明HPPCD34⁺细胞是血管生成的，而且，另外，血管生成活性在CD34⁺CD45^-群中更为富集。

HPP细胞的血管生成活性利用CFU-HiIl集落测定法来确定，该方法鉴定内皮细胞的前体。根据上文实施例6.3收集的来自人胎盘灌洗液的单核细胞在

培养基(StemCell Technologies，Inc.)中培养约2周。细胞培养物随之用Gill改良的苏木精染料染色，以显示CFU-Hill集落。在测定中，从来自5个不同供体的每10⁶个灌洗液细胞中分别鉴定到0、19、7、11和6个CFU-Hill集落。参见图4。独立的测定证实了人胎盘灌洗液来源的内皮前体细胞在

培养基中培养7天时对Dil-acLDL(二乙酰基化低密度脂蛋白)的摄取。

人胎盘灌洗液细胞在培养中也显示出形成血管。根据上文实施例6.3获得的人胎盘灌洗液细胞利用体外血管生成测定试剂盒(Chemicon cat#ECM625)以约10⁶细胞/孔在96孔板的ECMATRIX^TM上培养18-24小时，其中细胞在TGF-β、FGF、纤溶酶原、tPA和基质金属蛋白酶的存在下培养。细胞在24小时后形成可见的血管结构。参见图5。在基本上相同条件下的脐带血细胞培养物中未观察到显著的微管形成。

6.2实施例2：应用胎盘灌洗液细胞的体内血管形成

该实施例证明了人胎盘灌洗液细胞在对啮齿类动物模型给药时，导致形成脉管***，如骨组织的形成所表明的那样。

血管生成/血管形成是骨愈合所必需的。参见例如Matsumoto等，Amer.J.Pathology 169：1440-1457(2006)(成人外周血来源的亚群具有血管生成和骨生成活性(adult human peripheral blood-derived CD34⁺subpopulation has bothangiogenic and osteogenic activity))和Matsumoto等，Bone 2008第1-6页。现有的实验描述了人胎盘灌洗液(HPP)细胞的体内骨形成活性和血管生成作用。

骨形成活性：在6周龄无胸腺大鼠颅盖的每一侧创建头盖骨缺陷(3mm×5mm)。各左侧缺陷仅用Healos(DePuy Orthopaedics Inc.，Warsaw，IN)载体处理，而各右侧缺陷用阳性对照(Healos+骨形态发生蛋白2(BMP-2))、阴性对照(空白缺陷)或用HPP+Healos处理。各治疗组分配8只动物。大鼠在移植后4周处死。处理颅盖进行组织学分析，且组织切片用苏木精和曙红(H&E染料)根据表2的方法染色。

表2.H&E染色方法

溶液	时间
		二甲苯取代物	5分钟
二甲苯取代物	5分钟
		100％乙醇	30秒
95％乙醇	30秒
		80％乙醇	30秒
70％乙醇	30秒
		纳米纯水	20秒
苏木精	10秒
		自来水	2分钟
蓝色漂白剂	15-30秒
		70％乙醇	15-30秒
曙红Y	2分钟
		80％乙醇	30秒
95％乙醇	30秒
		95％乙醇	30秒

100％乙醇	30秒
		100％乙醇	30秒-1分钟
二甲苯取代物	5分钟

骨向内生长至缺陷中的量通过0至4的评分***来评估，其中4分为最大量(与单独的Healos(空白缺陷)相比，^*p＜0.05)(参见图6)。

血管生成：与仅植入支架的动物组相比，在皮下植入接种了HPP的支架的动物组的外植体中证明了血管发生。

材料和方法

皮下支架植入：支架植入6周龄(在研究开始时)雄性Hsd:RH-Foxnl^rnu无胸腺大鼠中。实验组大鼠植入被动吸收5×10⁶细胞/mL HPP的环形直径5mm的支架(Vitoss Bone Graft Substitute，Orthovita)。对照组仅植入Vitoss。麻醉大鼠，根据组别将植入物皮下置于背部、腹部或股部。在术后第21天和第42天，选择的大鼠通过CO₂窒息进行安乐死。收集植入物并置于10％常规缓冲的***中。石蜡包埋后，加工5μm的切片进行免疫荧光染色。

免疫荧光染色：为检测大鼠组织中移植的人细胞，用人特异性CD34内皮细胞标记小鼠单克隆抗体(clone QBEnd/10)IgG1(Novocastra cat#NCL-L-END)以1∶50的稀释进行免疫组织化学分析(n＝2)。利用1∶30稀释的来自Dako cat#M0851的α平滑肌肌动蛋白(aSMA)小鼠单克隆抗体来检测人和大鼠平滑肌细胞。二抗如下：对于CD34为Vector M.O.M.免疫检测试剂盒荧光素cat#FMK-2201，而对于aSMA为Alexa Flour 594缀合的山羊抗小鼠(MolecularProbes A21 135)。阳性对照由具有34种不同人组织的人组织微阵列(Pantomics，Inc cat#MNO 341)组成，而阴性对照未Max阵列小鼠组织微阵列载片(Zymedlab cat#75-2013)。

简言之，载片在56℃烘烤30分钟(min)，用二甲苯脱石蜡(3次改变，各5分钟)，再水合(100％至70％的乙醇流经)并在0.5％过氧化氢的甲醇溶液中于-20℃封闭内源过氧化物酶。在pH 6.0的、经微波处理的0.01M柠檬酸盐缓冲液中进行抗原恢复(两个循环，各10分钟)。抗生物素蛋白和生物素封闭进行15分钟。CD34染色根据产生商的方案应用Mouse-on-Mouse(M.O.M.)试剂盒(Vector Laboratories)来进行。第二种一抗(aSMA)在4℃孵育过夜，而相应的二抗(AF594)在室温孵育20分钟。在所有步骤之间，载片用PBS洗涤3次，每次5分钟。施加4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液5分钟，进行核染色。载片利用水性封固剂盖上盖片。

图像分析：载片利用配备有适当落射荧光滤光片组的Nikon Eclipse E800和成像软件(Nis Elements Basic Research)来观察。为评价血管生成，各载片以20×的放大倍数在5个不同的视野中评价，而aSMA表达通过Nis Elements软件测量视野中的表达百分数来测定。

结果

接受HPP的动物体内固有血管生成的增强：通过aSMA阳性免疫染色和内皮细胞中CD34的缺乏，证实了因移植细胞对接受体的旁分泌效应所致的血管生成的增强。在较早的时间点(21天)(n＝2)，观察到比对照组更多的新血管形成，并且这些新血管中没有特异性人内皮细胞标记的迹象，仅仅是靠近血管的一些细胞呈CD34染色(图7)。在较晚的时间点(42天)，观察到增强的血管生成，但是相对于21天的时间点程度更低，且HPP组中未观察到阳性CD34细胞(图8)。

图像分析显示了在21天时HPP组与对照组(仅Vitoss)相比具有统计学意义的更高的血管生成(p＜0.01)，在42天时未观察到组间统计学显著的差异(图9)。

本发明不应局限于本发明描述的具体实施方案的范围。实际上，根据前述说明书，除了本发明描述的那些之外的本发明的各种改变对本领域技术人员都将是显而易见的。此类改变都旨在落入所附权利要求的范围内。

所有本发明引述的参考文献整体作为参考并入本发明并用于所有目的，就如同专门单独地指出每一篇单独的出版物、专利或专利申请整体用于所有目作为参考并入本发明一样。对任何出版物的引述是出于其公开内容早于本申请日，其不应理解为承认本发明没有资格因在先发明而早于这些出版物。

Claims (27)

1.从胎盘灌洗液细胞群形成血管的方法，包括使所述细胞群接触促进形成血管的条件。

2.权利要求1的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞群是来自胎盘灌洗液的总有核细胞。

3.权利要求1的方法，其中所述接触包括使所述细胞与VEGF(50至200ng/mL)、TGF-β(1至5ng/mL)、FGF(10至50ng/mL)和一种或多种基质金属蛋白酶(各1至3个单位/mL)接触。

4.权利要求1的方法，其中所述接触在体外进行。

5.权利要求1的方法，其中所述接触在体内进行。

6.权利要求1的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞群包含从单个胎盘的灌洗中分离的胎盘灌洗液细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞是CD34⁺细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述CD34⁺细胞是CD34⁺CD45^-细胞。

9.权利要求6或7的方法，其中所述CD34⁺细胞或CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR中的至少一种。

10.权利要求1的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞群包含并非从所述灌洗液中分离的分离的CD34⁺细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述CD34⁺细胞是从胎盘中分离的。

12.权利要求10的方法，其中所述CD34⁺细胞是从脐带血、胎盘血、外周血或骨髓中分离的。

13.权利要求10的方法，其中所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。

14.权利要求10的方法，其中所述CD34⁺细胞是CD34⁺、CD45^-细胞。

15.治疗患有心脏或血管疾病、紊乱、病症或机能不全的个体的方法，包括向所述个体给予足以治疗所述疾病、紊乱、病症或机能不全的量的人胎盘灌洗液或人胎盘灌洗液细胞。

16.权利要求15的方法，其中所述疾病、紊乱、病症或机能不全是外周血管疾病、急性或慢性心肌梗塞、心肌病、充血性或慢性心力衰竭、心血管缺血、高血压性肺部血管疾病、外周动脉疾病、或风湿性心脏疾病。

17.权利要求15的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞是来自胎盘灌洗液的总有核细胞。

18.权利要求15的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞群包含从单个胎盘的灌洗中分离的胎盘灌洗液细胞。

19.权利要求18的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞是CD34⁺细胞。

20.权利要求19的方法，其中所述CD34⁺细胞是CD34⁺CD45^-细胞。

21.权利要求19或20的方法，其中所述CD34⁺细胞或CD34⁺CD45^-细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR中的至少一种。

22.权利要求15的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞群包含并非从所述灌洗液中分离的分离的CD34⁺细胞。

23.权利要求22的方法，其中所述CD34⁺细胞是从胎盘中分离的。

24.权利要求22的方法，其中所述CD34⁺细胞是从脐带血、胎盘血、外周血或骨髓中分离的。

25.权利要求22的方法，其中所述CD34⁺细胞与相同数目的来自脐带血的CD34⁺细胞相比，表达更高水平的CD31、CXCR4或VEGFR。

26.权利要求15的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞是在支架或基质上给药。

27.权利要求15的方法，其中所述胎盘灌洗液细胞是静脉内给药。

Images