CN108137676A - gp120中和抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合gp120并中和HIV‑1的抗体及抗原结合片段。还提供了编码这些抗体的核酸、载体和宿主细胞。本发明公开了使用这些抗体来检测HIV‑1的方法。此外，公开了这些抗体、抗原结合片段、核酸及载体在预防和/或治疗HIV‑1感染中的用途。

Description

gp120中和抗体及其用途
相关申请
本申请要求于2015年3月20日提交的美国临时申请第62/136,228号和于2015年11月3日提交的美国临时申请第62/250,378号的优先权，每个临时专利申请通过引用全部并入本说明书中。
技术领域
本发明涉及特异性结合gp120的单克隆抗体和抗原结合片段，及其在例如治疗患有HIV-1感染对象的方法中的用途。
背景技术
尽管大力研发抗HIV-1治疗剂，但1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染及由此产生的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)仍威胁着全球公共健康。
有包膜病毒HIV-1躲避各种保护机制后的体液识别。主要的HIV-1包膜蛋白(HIV-1Env)为大约160kD的糖蛋白(gp160)。感染期间，宿主细胞的蛋白酶将gp160切割为gp120和gp41。gp41是完整的膜蛋白，而gp120则从成熟病毒中突出。gp120和gp41一起组成作为中和抗体的靶的HIV-1包膜刺突。已经鉴定了与HIV-1Env结合的广谱中和抗体，其包括与gp120的CD-4结合位点特异性结合并可中和高百分比HIV-1毒株的VRC01抗体。然而，仍需要研发额外的可商业化生产的针对具有不同识别和中和谱的HIV-1中和抗体。
发明内容
本文提供了与gp120上的CD4结合位点特异性结合并中和HIV-1的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。如本文所公开的，一种新型的名为“N6”的抗体中和了代表多种HIV-1毒株的181假病毒组中98％的假病毒，IC50<50μg/ml，以及中和96％的假病毒IC50<1μg/ml。中和病毒的中值IC50为0.038μg/ml，是目前为止最有效的。进一步地，N6成功地中和了检测组中对于被VRC01(典型的广谱中和CD4结合位点抗体)中和有抗性的20个假病毒中的16个。因此，本公开的实施方案包括具有N6抗体特异性结合性的抗体和抗原结合片段及其变体。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，重链可变区包含如SEQ ID NO:1(N6VH)所示的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含如SEQ ID NO:2(N6VL)所示的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和/或VL，VH包含如SEQ ID NO:3(N17VH)所示的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL包含如SEQ ID NO:4(N17VL)所示的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在进一步的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和/或VL，VH包含如SEQ ID NO:5(F8VH)所示的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL包含如SEQ ID NO:6(F8VH)所示的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。所公开的抗体和抗原结合片段能特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列的VH和VL。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:3和4所示的氨基酸序列的VH和VL。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ IDNO:5和6所示的氨基酸序列的VH和VL。
还公开了包括所述抗体和抗原结合片段、编码所述抗体和抗原结合片段的核酸，包含所述核酸的表达载体以及包含所述核酸的分离的宿主细胞的组合物。在若干实施方案中，编码所公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子可以是编码所述抗体或抗原结合片段的cDNA分子。在另外的实施方案中，核酸分子可以是编码所述抗体或抗原结合片段的VH和VL的双顺反子表达构建体。
所公开的抗体和抗原结合片段有效地中和了可接受的体外HIV-1感染模型中的HIV-1。因此，公开了一种用于治疗或抑制对象中HIV-1感染的方法。该方法包括向对象(如处于HIV-1感染风险中或有HIV-1感染的对象)施用治疗有效量的所公开的抗体、抗原结合片段、核酸分子、载体或组合物的一种或多种。
本文所公开的抗体、抗原结合片段、核酸分子、载体和组合物可用于各种额外用途，如用于检测对象中的HIV-1感染或诊断对象中的HIV-1感染，或检测样品中的HIV-1。
从参考附图对若干实施方案进行的以下详细描述可知，本发明的上述及其他特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1A-1F显示了一组说明N6抗体及其若干变体的序列和中和活性的表和序列比对。(图1A)用涵盖10种不同表位特异性的中和指纹来询问HIV-1感染患者Z258的血清特异性。将从中分离VRC01和VRC01样抗体的患者45和127/C的血清用作对照。数值预测了血清中和分数，其可被归因于每个抗体特异性。在血清中观察到强VRC01样信号(数值>0.3)。在中和分析中使用21个HIV-1毒株检测组并用于计算血清宽度。(图1B)N6、其变体N17和F8以及相关抗体VRC01和VRC27的可变区的氨基酸序列。粗体显示的残基代表种系序列的取代。使用Kabat编号来鉴定N6重链和轻链中的特异残基。显示的序列包括IGHV1-2*02(SEQ ID NO:77)、N6 VH(SEQ ID NO:1)、N17 VH(SEQ ID NO:3)、F8VH(SEQ ID NO:5)、VRC01VH(SEQ IDNO:73)、VRC27VH(SEQ ID NO:75)、IGHV1-2*02(SEQ ID NO:78)、N6 VL(SEQ ID NO:2)、N17VL(SEQ ID NO:4)、F8VL(SEQ ID NO:6)、VRC01 VL(SEQ ID NO:74)以及VRC27 VL(SEQ ID NO:76)。(图1C)N6重链可变区和轻链可变区的种系基因。(图1D)抗体对181-分离的Env假病毒组的中和效价和宽度。数据显示了被测病毒的数目、被中和病毒的百分比、IC50<50μg/ml中和病毒的几何平均和中值IC50。(图1E)抗体中和181-假病毒组的宽度-效价曲线。实线表示包括那些IC50>50μg/ml的所有病毒的中值IC50，取值为50。虚线仅表示敏感性病毒的中值IC50。点图顶部的数字代表对中和有抗性的病毒的百分比。(图1F)N6抗体以及若干N6变体对20个HIV-1假病毒组(代表了多种对VRC01有抗性的HIV-1毒株)的中和特性。变体包括变体1(N6 VH+F8 VL)、变体2(N6 VH+N17 VL)、变体3(N17 VH+F8 VL)、变体4(N17 VH+N6 VL)、变体5(F8 VH+N6 VL)以及变体6((F8 VH+N17 VL)。
图2是显示N6、VRC01、3BNC117和VRC07-523-LS对20个抗VRC01假病毒的中和谱的表。数值以μg/ml表示。
图3A-3C是一组显示N6自身反应性特性的图和表。(图3A)N6与HEP-2上皮细胞的反应性。将VRC07-G54W、VRC07-523-LS和4E10用作阳性对照。将VRC01-LS用作阴性对照。抗体浓度为25μg/ml。所有图片以400X放大显示。(图3B)N6与心磷脂的ELISA结合。对照如图3A所示。(图3C)通过Luminex测定来检测N6与自身抗原的反应性。将4E10用作阳性对照。将抗RSV单克隆抗体Synagis用作阴性对照。SSA，干燥综合征A抗原；SSB，干燥综合征B抗原；Sm，史密斯抗原；RNP，核糖核蛋白；Scl 70，硬皮病70；Jo1,抗原；CentrB，着丝粒B。
图4A-4E是一组表明N6对gp120的结合特异性的图和表。(图4A)与CD4Ig-生物素、VRC01-生物素和VRC-PG04-生物素竞争的N6与gp120YU2的ELISA结合。将B12、VRC01和CD4-Ig用作阳性对照，将2G12用作阴性对照。(图4B)N6与gp120BaL、RSC3及其CD4结合位点敲除突变体gp120BaLD368R和RSC3 Δ371I P363N的ELISA结合。(图4C)N6及N6变体-1结合gp140折叠子(foldon)(一种与折叠子结构域连接的可溶三聚体gp140)和gp120，但不结合gp41或MPER肽。(图4D)利用ELISA在单体gp120JRCSF存在的情况下N6与丙氨酸扫描突变体的结合。突变体的氨基酸编号基于HIV-1 HXB2序列。对捕获的gp120的结合亲和力的测定基于半最大结合时的抗体浓度。将2G12用作对照来测定捕获的gp120的量以标准化每个突变对抗体结合的作用。(图4E)中和一组gp120JRCSF丙氨酸突变体假病毒。根据JRCSF突变体的IC50/JRCSF WT的IC50来计算中和倍数变化。
图5A-5E是一组提供表明N6中和机制的结果的表。(图5A)N6抗性病毒和Z258自体病毒中和谱。显示了N6敏感性病毒和VRC01敏感性病毒HXB2、JRCSF和93TH057、若干N6敏感性但VRC01抗性病毒、以及N6和VRC01抗性病毒的环D、CD4 BLP和β23-V5区的氨基酸序列。以粗体列出了与参考序列对比的由N6抗性病毒和Z258自体病毒显示的gp120的序列变化。序列编号基于HXB2。(图5B-5C)N6中和N6抗性病毒和Z258自体病毒及其在环D、CD4 BLP和β23-V5区内具有回复突变的突变体。将CD4Ig和CD4结合位点抗体、VRC01、3BNC117、VRC-PG04、12A21以及VRC27用作阳性对照，将2G12用作阴性对照。显示了与参考序列对比的由N6抗性病毒和Z258自体病毒显示的gp120的序列变化。(图5D-5E)N6中和在环D中具有回复突变的N6抗性病毒和Z258自体病毒。以粗体和下划线突出在环D内的回复突变。
图6A-6F是一组显示来自针对6种VRC01敏感性病毒的丙氨酸扫描变体N6(图6A-6B)、VRC27(图6C-6D)和VRC01(图6E-6F)的假病毒中和测定的IC50与IC80值的表。以μg/ml表示中和值。倍数变化定义为抗体突变体的IC50/抗体WT的IC50。
图7是显示来自采用针对6种VRC01抗性病毒和2种VRC01敏感性病毒的N6丙氨酸变体的假病毒中和测定的IC50的表。以μg/ml表示中和值。根据VRC01抗性病毒计算中值IC50。以μg/ml表示中和值。倍数变化定义为抗体突变体的IC50/抗体WT的IC50。
图8A-8C是一组说明HIV-1被N6抗体及其变体中和以及结合的表。(图8A)包括N6、VRC01、VRC27和12A21抗体的重链和轻链的交叉互补抗体的中和。根据原始抗体的IC50/抗体组合的IC50计算中和倍数变化。中值IC50基于包括那些抗性病毒的所有测试的病毒，其值为50。(图8B-8C)被具有N6的不同接触残基用VRC01、VRC27或N6变体N17的残基取代的抗体突变体中和。将N6和VRC01用作对照。基于所有VRC01抗性病毒计算中值IC50。对于IC50>50的情况，取值50。根据抗体突变体的IC50/抗体WT的IC50计算中和倍数变化。
图9显示了一组表明与gp120复合的N6抗体的三维结构的图，并且显示了N6是具有与HIV-1 gp120上的CD4结合环相互作用的CDR H2和5-氨基酸标签LCDR3的VRC01类抗体。
图10和11显示了当叠加在HIV-1 gp120上时，相对于其他VRC01类抗体的轻链，N6的轻链呈现不同定向，这种定向使得N6轻链避免了与HIV-1 gp120 V5和环D发生潜在的冲突。
图11显示了像其他VRC01类抗体一样，N6在LCDR1中也采用柔性GxG基序以避免与环D发生冲突。
图12A和12B是一组表明N6 HCDR2和LCDR3有助于观察到的N6对gp120 V5处变化的耐受性的图。
图13显示了N6 LCDR3 Gln96间接接合Loop V5以适应V5中的变化，并且显示了VRC01 LCDR3 Gln96通过氢键接合Loop V5并对V5中的庞大侧链敏感。
图14、15A和15B是一组表明N6在供体Z258中VRC27谱系内发展的图和表。(图14)来自于2012、2014及2015年供体Z258样品的重链和轻链相同性-差异性图。将序列绘制为N6(顶部)和VRC27(底部)的序列相同性与重链IGHV1-2*02(左)或轻链IGKV1-33*01(右)种系V基因的序列差异性的函数。(图15A)成对的N6谱系***发生树。重链的***发生树基于CDRH3与N6、VRC27 F8或N17的序列相同性。轻链的***发生树基于衍生自IGKV1-33*01的读段和VRC01类抗体的5氨基酸-CDRL3标签。(图15B)与N6相比，由NGS推测中间体的可变区的氨基酸序列。浅灰色的残基代表重链和轻链的I1序列的取代。用Kabat编号来鉴定N6重链和轻链中的特异残基。显示的序列包括IGHV1-2*02(SEQ ID NO:77),I1 VH(SEQ ID NO:79)、I2VH(SEQ ID NO:80)、I3 VH(SEQ ID NO:81)、I4 VH(SEQ ID NO:82)、N6 VH(SEQ ID NO:1)、I5VH(SEQ ID NO:83)、VRC27 VH(SEQ ID NO:75)、IGHV1-2*02(SEQ ID NO:78)、I1 VL(SEQ IDNO:84)、I2 VL(SEQ ID NO:85)、I3 VL(SEQ ID NO:86)、I4 VL(SEQ ID NO:87)、I5 VL(SEQID NO:88)、I6 VL(SEQ ID NO:89)、N6 VL(SEQ ID NO:2)、I7 VL(SEQ ID NO:90)、I8 VL(SEQID NO:91)、I9 VL(SEQ ID NO:92)、I10 VL(SEQ ID NO:93)以及VRC27 VL(SEQ ID NO:76)。
图16和17是VRC01抗性假病毒的被各种从2014到2015时间点的NGS测序衍生的N6样重链和轻链的组合(图16，图18所示的变体序列)或N6的估算前体(图17，图15B所示的变体序列)中和的表。
图18显示了变体N6重链和轻链序列的比对。
序列
通过采用按照37C.F.R.1.822定义的核苷酸碱基标准字母缩写以及使用氨基酸的3字母编码来显示在所附的序列表中列出的核酸及氨基酸序列。每个核酸序列仅显示了一条链，但应理解对显示的链的任何引用也包含了互补链。序列表以文件名为“Sequence.txt”(～100kb)形式的ASCII文本文件提交，该文本文件于2016年3月17日创建并通过引用并入本文。随附的序列表如下：
SEQ ID NO:1是N6mAb的VH的氨基酸序列。
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA
SEQ ID NO:2是N6mAb的VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK
SEQ ID NO:3是N17mAb的VH的氨基酸序列。
RAHLVQSGTAVKRPGASVRVSCETSGYTFTAHILYWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRGRVTLTRDIYRDTAYMDISGLRFDDTAVYYCARDRSYDDSSWALDAWGQGTTVVVSA
SEQ ID NO:4是N17mAb的VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSAGDRVTINCQTSQGVGRDLHWYQHKPGRAPKLLIRHASSVEDGVPSRFSGTGFHTSFNLTINDLQSDDIATYYCQVLESFGRGSRLDFK
SEQ ID NO:5是F8mAb的VH的氨基酸序列。
QVQLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDIYREIAYMDIRGLKLDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVASA
SEQ ID NO:6是F8mAb的VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHASSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTINDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK
SEQ ID NO:7-18是N6、N17和F8抗体的kabat CDR的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9-24是N6、N17和F8抗体的kabat CDR的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO:25-34是关于嵌合抗原受体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是来自HIV-1的HXB2毒株的HIV-1Env的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是编码N6mAb的VH的示例性核酸序列。
CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGACCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTGGGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACGTATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCG
SEQ ID NO:37是编码N6mAb的VL的示例性核酸序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTTGATCCACCATACCTCTTCTGTGGAAGACGGTGTCCCCTCAAGATTCAGCGGCTCTGGATTTCACACATCTTTTAATCTGACCATCAGCGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAAGTTTTACAATTTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA
SEQ ID NO:38是编码N17mAb的VH的示例性核酸序列。
CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGGTGAAGAGACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCGAGACTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATACTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTTGAGTGGGTGGGGTGGATCAAGCCACAATACGGTGCCGTGAACTTTGGGGGTGGTTTTCGGGGCAGGGTCACATTGACGCGAGACATATATAGAGATACTGCATATATGGACATCAGTGGCCTGAGATTTGACGACACGGCCGTCTACTATTGTGCGAGAGACCGTTCTTATGACGACTCTTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGCCAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCG
SEQ ID NO:39是编码N17mAb的VL的示例性核酸序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTGCTGGGGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCCGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCCTGATCCGCCACGCCTCTTCTGTGGAGGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCACTGGATTTCACACATCTTTTAATTTGACCATCAACGACCTGCAGTCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTGTTAGAATCTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTGGATTTTAAA
SEQ ID NO:40是编码F8mAb的VH的示例性核酸序列。
CAGGTGCAGCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCCAGACTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTTGAGTGGGTGGGATGGATCAAGCCACAATACGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCATACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGCCTCCGCG
SEQ ID NO:41是编码F8mAb的VL的示例性核酸序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTTGATCCACCATGCCTCTTCTGTGGAGGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCTCTGGATTTCACACATCTTTTAATCTGACCATCAACGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTTTTACAATTTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA
SEQ ID NO:42-64是修饰抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65-71是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:72是肽序列。
SEQ ID NO:73是VRC01VH。
QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSS
SEQ ID NO:74是VRC01VL。
EIVLTQSPGTLSLSPGETAIISCRTSQYGSLAWYQQRPGQAPRLVIYSGSTRAAGIPDRFSGSRWGPDYNLTISNLESGDFGVYYCQQYEFFGQGTKVQVDIKR
SEQ ID NO:75是VRC27VH。
QRLVQSGPQVRKPGSSVRISCETSGYTFNAYILHWFRQAPGRSFEWMGWIKPKFGAVNYAHSFQGRITLTRDIYRETAFLDLTGLRFDDTAVYYCARDRLYDGSSWRLDPWGQGTRVVVSS
SEQ ID NO:76是VRC27VL。
FALMTQSPATLAVSVGDRVTITCRASQGIGSDLHWYQQKPGRPPKILIHHASAREEGVPSRFGGSGSHTSFIFTINDLQLDDVATYYCQVLESFGQGTRLDIN
SEQ ID NO:77是IGHV1-2*02序列。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARAYCGGDCYNWFDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:78是IGKV1-33*01序列。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:79-93是N6VH和VL变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:94是包括N6VH的示例性重链序列。
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:95是编码包括N6VH的重链的示例性核酸序列。
CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGACCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTGGGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACGTATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCGGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:96是包括N6VL的示例性轻链序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:97是编码包括N6VH的轻链的示例性核酸序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTTGATCCACCATACCTCTTCTGTGGAAGACGGTGTCCCCTCAAGATTCAGCGGCTCTGGATTTCACACATCTTTTAATCTGACCATCAGCGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAAGTTTTACAATTTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGAAACAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAGGATTCCAAGGATTCCACATACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACACACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTCAACAGAGGAGAATGC
SEQ ID NO:98是包括分离于人供体的N6VH的重链序列，其与SEQ ID NO:94相比包括多态性。
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGEEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:99是编码分离于人供体的N6VH的核酸分子的序列。
CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGACCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTGGGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACGTATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCGAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTTGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:100是编码N6I1VH中间体的示例性核苷酸序列。
CGAGGGCACTTGGTGCAGTCAGGGACTGAGGTGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTGAGAGTCTCCTGCGAGACTTCTGGATACACCTTCACCGCCTACATTTTACATTGGTTCCGACAGGCCCCCGGACGAGGGCTTGAGTGGATGGGGTGGATCAAGCCAAAATATGGAGCCGTCAATTATGCTCATGCATTTCAGGGCAGGGTCACCCTGACCAGAGACATATATAGAGACACTGCATACATGGACTTGAGTGGCCTAAGATTCGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGATCGCGTTTATGACGATTCGTCTTGGCAATTGGATCCCTGGGGCCAGGGAACTTCGGTCATCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:101是编码N6I2VH中间体的示例性核苷酸序列。
CGAGGGCACTTGGTGCAGTCAGGGACTGAGGTGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTGAGAGTCTCCTGCGAGACTTCTGGATACACCTTCACCGCCCACATTTTACATTGGTTCCGACAGGCCCCCGGACGAGGGCTTGAGTGGATGGGGTGGATCAAGCCAAAATATGGAGCCGTCAATTATGCTCATGCATTTCAGGGCAGGGTCACCCTGACCAGAGACATATATAGAGACACTGCATACATGGACTTGAGTGGCCTAAGATTCGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGATCGCGTTTATGACGATTCGTCTTGGCAATTGGATCCCTGGGGCCAGGGAACTTCGGTCATCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:102是编码N6I3VH中间体的示例性核苷酸序列。
CGAGCGCACTTGGTGCAGTCAGGGACTGCGGTGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTGAGAGTCTCCTGCGAGACTTCTGGATACACCTTCACCGCCCACATTTTATATTGGTTCCGACAGGCCCCCGGACGAGGGCTTGAGTGGGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGGCAGGGTCACCCTGACCAGAGACATATATAGAGACACTGCATACATGGACATCAGTGGCCTAAGATTCGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGATCGCTCCTATGACGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCG
SEQ ID NO:103是编码N6I4VH中间体的示例性核苷酸序列。
CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGACCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTGGGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCG
SEQ ID NO:104是1_2015_00106641_L VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRDPKLLIRHTTSVEDGVPSRVSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK
SEQ ID NO:105是编码1_2015_00106641_L VL的示例性DNA序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGACCCTAAACTCTTGATCCGCCATACCACTTCTGTGGAAGACGGTGTCCCCTCAAGAGTCAGCGGCTCTGGATTTCACACATCTTTTAATCTGACCATCAGCGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAAGTTTTACAATTTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA
SEQ ID NO:106是1_2015_00065970_L VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHASSVDDGVPSRFSGSGFHTSFNLTINDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK
SEQ ID NO:107是编码1_2015_00065970_L VL的示例性DNA序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGGGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAGCCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTTGATTCATCATGCCTCTTCTGTGGACGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCTCTGGATTTCACACATCTTTTAATCTGACCATCAACGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTTTTACAATTTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA
SEQ ID NO:108是1_2014_00019094_L VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHASSVEDGVPSRFSGTGFHTSFNLTINDLQADDIGTYYCQVLQSFGRGSRLDTK
SEQ ID NO:109是编码1_2014_00019094_L VL的示例性DNA序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATAGGGGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCCTGATCCACCATGCCTCTTCTGTGGAGGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCACTGGATTTCACACATCTTTTAATTTGACCATCAACGACCTGCAGGCTGACGACATTGGCACTTATTACTGTCAGGTGTTACAATCTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTGGATACTAAA
SEQ ID NO:110是1_2015_00217585_L VL的氨基酸序列。
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGFGRDLHWYQHKPGRAPKLLIHHAPYVDDGVPSRFSGSGFHTSFNLTINDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK
SEQ ID NO:111是编码1_2015_00217585_L VL的示例性DNA序列。
TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGGGTCACCATCAATTGCCAGACGAGTCAGGGTTTTGGCAGGGACCTACATTGGTATCAACACAAGCCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTTGATTCATCATGCCCCTTATGTGGACGACGGTGTCCCTTCAAGATTCAGTGGCTCTGGATTTCACACATCTTTTAATCTGACCATCAACGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTTTTACAATTTTTCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA
SEQ ID NO:112是2_2014_00173626_H VH的氨基酸序列。
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDIYREIAYMDIRGLKLDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVS
SEQ ID NO:113是编码2_2014_00173626_H VH的示例性DNA序列。CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCCAGACTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTGGAGTGGGTGGGATGGATCAAGCCACAATACGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCATACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCC
SEQ ID NO:114是2_2014_00173626_Hmut VH的氨基酸序列。
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDIYREIAYMDIRGLKLDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA
SEQ ID NO:115是编码2_2014_00173626_Hmut VH的示例性DNA序列。CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCCAGACTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTGGAGTGGGTGGGATGGATCAAGCCACAATACGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTGACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCATACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGACGGTCGTCGTCTCCGCG
发明详述
I.术语总结
除非另有说明，按照常规用法使用技术术语。分子生物学中的常见术语的定义可在以下文献及其他相似参考文献中找到：Benjamin Lewin,Genes X,由Jones&BartlettPublishers出版,2009；Meyers等.(编),The Encyclopedia of Cell Biology andMolecular Medicine,由Wiley-VCH出版,卷16,2008。
如本文所用，除非上下文有明确指出，否则单数形式“一个/一种”和“所述”既是指单数又是指复数。例如，术语“抗原”包括单个或多个抗原并且可以认为等价于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含”意指“包括”。还应理解的是，除非另有说明，核酸或多肽的任意及所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值都是近似的，且都是出于描述性目的而提供的。尽管可以使用多种与本文所述相似或等价的方法和材料，但是本文描述的都是特别合适的方法和材料。如果有冲突，将以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，所述材料、方法和示例都仅仅是说明性的而不是限制性的。为了便于评述各个实施方案，下面提供了术语的释义：
施用：通过选择的途径将组合物引入到对象中。施用可以是局部的或全身的。例如，如果选择的途径是静脉内途径，组合物通过将其引入到对象的静脉中来施用。施用的示例性途径包括但不限于口服、注射(如皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、经皮(例如表面)、鼻内、***以及吸入途径。
氨基酸取代：用不同的氨基酸替换蛋白中的一个氨基酸。
抗逆转录病毒剂：一种特异性抑制逆转录病毒复制或感染细胞的物质。抗逆转录病毒药物的非限制性示例包括进入抑制剂(例如恩夫韦肽)、CCR5受体拮抗剂(例如aplaviroc、vicriviroc、马拉韦罗)、逆转录酶抑制剂(例如拉米夫定、齐多夫定、阿巴卡韦、替诺福韦、恩曲他滨、依法韦仑)、蛋白酶抑制剂(例如lopivar、利托那韦、雷特格韦、地瑞那韦、阿扎那韦)、成熟抑制剂(例如α干扰素、贝韦立马和vivecon)。
抗逆转录病毒治疗(ART)：用于HIV-1感染的治疗处理，涉及向HIV-1感染个体施用至少一种抗逆转录病毒剂(例如1、2、3或4种抗逆转录病毒剂)。ART方案的一个示例包括使用替诺福韦、恩曲他滨和依法韦仑的组合的治疗。在一些示例中，ART包括高效抗逆转录病毒疗法(HAART)。HAART方案的一个示例包括使用替诺福韦、恩曲他滨和依法韦仑的组合的治疗。
抗体：一种免疫球蛋白、抗原结合片段或其衍生物，其特异性结合并识别分析物(抗原)如HIV-1gp120。本文采用最广泛意义上的术语“抗体”，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们体现出所需的抗原结合活性即可。
抗体的非限制性示例包括例如完整的免疫球蛋白及其本领域已知的保留抗原结合亲和力的变体和片段。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰完整抗体生成的抗原结合片段或者采用重组DNA方法(参见Kontermannand Dubel(编),Antibody Engineering,Vols.1-2,2nd Ed.,Springer Press,2010)重新合成的那些。
单链抗体(scFv)是基因工程分子，其含有被作为基因融合单链分子的由合适的多肽接头连接的一个或多个抗体的VH和VL结构域(参见例如Bird等,Science,242:423-426,1988；Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5879-5883,1988；Ahmad等,Clin.Dev.Immunol.,2012,doi:10.1155/2012/980250；Marbry,IDrugs,13:543-549,2010)。scFv中的VH结构域和VL结构域的分子内定向对scFv来说通常不是决定性的。因此，可使用具有两种可能排列(VH结构域-接头结构域-VL结构域、VL结构域-接头结构域-VH结构域)的scFv。
在dsFv中，VH和VL已被突变以引入二硫键来稳定链的结合。还包括双抗体，其是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，但是使用很短的以致于不能使同一链上的两个结构域配对的接头，从而迫使结构域与另一链的互补结构域配对并生成两个抗原结合位点(参见例如Holliger等,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:6444-6448,1993；Poljak等,Structure,2:1121-1123,1994)。
抗体还包括基因工程形式如嵌合抗体(如人源化鼠抗体)和异源缀合抗体(如双特异性抗体)。同样参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中能阻断参考抗体与其抗原结合50％或以上的抗体，反之，在竞争测定中参考抗体也能阻断该抗体与其抗原结合50％或以上。抗体竞争测定是已知的，本文提供了示例性竞争测定。
抗体可具有一个或多个结合位点。如果有多于一个的结合位点，那么该结合位点可与另一结合位点相同或不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体具有两个不同的结合位点。
通常，免疫球蛋白具有由二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变结构域基因。有两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。有五个主要重链类别(或同种型)，其决定了抗体分子IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的功能活性。
每个重链和轻链都含有恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域；参见例如Kindt等.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007))。在若干实施方案中，VH和VL组合以特异性结合抗原。在另外的实施方案中，只需要VH。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在无轻链存在时有功能性且稳定(参见例如Hamers-Casterman等,Nature,363:446-448,1993；Sheriff等,Nat.Struct.Biol.,3:733-736,1996)。所公开的任何抗体都可包括异源恒定结构域。例如，抗体可包括与天然恒定结构域不同的恒定结构域，如包括一种或多种修饰(如“LS”突变)以增加半衰期的恒定结构域。
提及“VH”或“VH”是指抗体重链包括抗原结合片段如Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指抗体轻链包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
VH和VL含有被3个高变区、也称为“互补决定区”或“CDR”间断的“框架”区(参见例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department ofHealth and Human Services,1991)。在物种内，不同轻链或重链的框架区的序列是相对保守的。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合框架区用于定位和比对三维空间内的CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。采用任何诸多众所周知的方案，包括由Kabat等(“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991；“Kabat”numberingscheme),Al-Lazikani等,(JMB 273,927-948,1997；“Chothia”numbering scheme)和Lefranc等(“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains,”Dev.Comp.Immunol.,27:55-77,2003；“IMGT”numbering scheme)描述的方案，可以容易地确定出给定CDR的氨基酸序列边界。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端到C端)，并且通常通过特定CDR所在的链来鉴定。因此，VH CDR3是来自其被发现的抗体的VH的CDR3，而VL CDR1是来自其被发现的抗体的VL的CDR1。轻链CDR有时也称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR有时也称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
“单克隆抗体”是得自基本均质抗体群的抗体，也就是说，除了例如含有天然存在的突变或单克隆抗体制剂的生产过程中产生的可能的变体抗体(这些变体一般以较少数量存在)之外，包含于该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示得自基本均质抗体群的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法来生成抗体。例如，单克隆抗体可由多种技术制得，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了这些方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法。在一些示例中，单克隆抗体分离于对象。单克隆抗体可具有对抗原结合或其它免疫球蛋白功能基本无作用的保守氨基酸取代。(参见例如Harlow&Lane,Antibodies,A LaboratoryManual,2nd ed.Cold Spring Harbor Publications,New York(2013))。
“人源化”抗体或抗原结合片段包括人框架区和来自非人(如小鼠、大鼠或合成的)抗体或抗原结合片段的一个或多个CDR。提供CDR的非人抗体或抗原结合片段称为“供体”，提供框架的人抗体或抗原结合片段称为“受体”。在一个实施方案中，所有的CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。不需要存在恒定区，但如果存在恒定区，则它们与人免疫球蛋白恒定区基本相同，如有至少大约85-90％，如大约95％或以上的相同。因此，除了可能的CDR，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分与天然人抗体序列的相应部分基本上相同。
“嵌合抗体”是一种包括衍生自通常属于不同物种的两个不同抗体的序列的抗体。在一些示例中，嵌合抗体包括来自一个人抗体的一个或多个CDR和/或框架区以及来自另一人抗体的CDR和/或框架区。
“完全人抗体”或“人抗体”是一种包括来自(或衍生自)人基因组的序列但不包括另外物种的序列的抗体。在一些实施方案中，人抗体包括来自(或衍生自)人基因组的CDR、框架区和Fc区(如果存在)。基于衍生自人基因组的序列，采用制造抗体的技术，例如通过噬菌体展示或用转基因动物来鉴定和分离人抗体(参见例如Barbas等Phage display:ALaboratory Manuel.1st Ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2004.Print.；Lonberg,Nat.Biotech.,23:1117-1125,2005；Lonenberg,Curr.Opin.Immunol.,20:450-459,2008)。
中和HIV-1的抗体或抗原结合片段：抗体或抗原结合片段与HIV-1Env特异性结合(例如结合gp120)以抑制HIV-1Env相关的生物学功能(如与其靶受体结合)。在若干实施方案中，中和HIV-1的抗体或抗原结合片段降低了HIV-1的感染效价。
HIV-1的广谱中和抗体与其他HIV-1的抗体的区别在于它们在循环中可中和高百分比的多种类型的HIV-1。在一些实施方案中，HIV-1的广谱中和抗体与其他HIV-1的抗体的区别在于它们在循环中可中和高百分比(如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，至少99％)的多种类型的HIV-1。HIV-1广谱中和抗体的非限制性示例包括N6、2G12、PGT122、VRC01和35O22。
抗体自反应性或自身反应性：一种抗体的特性，其中抗体与自身表位反应，所述自身表位是由对象产生的蛋白和/或脂质的表位。不具有自反应性的抗体基本上不与来自对象的细胞膜上存在的表位或脂质结合。确定抗体是否与自身表位反应的方法对本领域技术人员来说是已知的。在一个实例中，用HEp-2细胞染色、心磷脂结合测定或抗核抗原(ANA)测定来评估抗体自反应性。例如，抗ANA测定可包括例如抗ANA测定或ANA细胞染色测定。在若干实施方案中，所公开的抗体是非自反应性的(或自身反应性)的，或者是最低限度自反应性的。在一个非限制性实例中，所公开的抗体不具有背景水平之上的自反应性，例如，如用抗ANA测定或ANA细胞染色法测定测量的。
生物样品：一种得自对象的样品。生物样品包括所有用于检测对象疾病或感染(例如HIV-1感染)的临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液(如血液、血液的衍生物和成分(如血清)、脑脊液)；以及活组织检查或手术摘除的组织，例如未固定、冷冻或固定于***或石蜡中的组织。在一个具体的实例中，生物样品得自患有或疑似有HIV-1感染的对象。
双特异性抗体：一种由两个不同的抗原结合结构域构成从而与两个不同的抗原表位结合的重组分子。双特异性抗体包括两个抗原结合结构域的化学上或遗传学上连接的分子。可用接头连接抗原结合结构域。抗原结合结构域可以是单克隆抗体、抗原结合片段(例如Fab、scFv)或其组合。双特异性抗体可包括一个或多个恒定结构域，但并不必须包括恒定结构域。
CD3(分化簇3T细胞共受体)：一种特定的蛋白复合物，包括至少四个与T细胞表面上的T细胞受体非供价结合的多肽链。这四个多肽链包括两个CD3-ε链、一个CD3-δ链和一个CD3-γ链。CD3既存在于辅助性T细胞上又存在于细胞毒性T细胞上。
CD4：分化簇因子4多肽；介导与MHC II类分子的相互作用的T细胞表面蛋白。CD4还可作为HIV-1感染期间HIV-1在T细胞上的主要受***点。已知CD4与HIV-1的gp120结合。CD4前体的已知序列具有疏水性信号肽、大约370个氨基酸的胞外区、与MHC II类beta链的跨膜结构域有显著相同性的高度疏水性延伸、以及40个残基的高电荷胞内序列(Maddon,Cell42:93,1985)。
嵌合抗原受体(CAR)：一种具有与T细胞受体的一个或多个胞内信号转导结构域联接的胞外抗体衍生靶向结构域(如scFv)的改造T细胞受体。“嵌合抗原受体T细胞”是一种表达CAR的T细胞，并且具有由CAR的抗体衍生靶向结构域决定的抗原特异性。制备CAR的方法是可获得的(参见例如Park等,Trends Biotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等,N Engl JMed.,368:1509-1518,2013；Han等,J.Hematol Oncol.,6:47,2013；PCT Pubs.WO2012/079000,WO2013/059593；和U.S.Pub.2012/0213783，其中每篇文献皆以其全文并入本文作参考)。
足以形成免疫复合物的条件：允许抗体或抗原结合片段与其同源表位结合在可检测地程度上比与基本上所有其它表位结合更大，和/或基本上不与基本所有其它表位结合的条件。足以形成免疫复合物的条件取决于结合反应的形式并且通常是在免疫测定方案采用的或体内遇到的条件。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,2nded.Cold Spring Harbor Publications,New York(2013)就免疫测定形式和条件的描述。所述方法中采用的条件是“生理条件”，其包括参考在活的哺乳动物或哺乳动物细胞内的典型条件(例如温度、渗透性、pH)。虽然应认识到某些器官经受极端条件，但是生物体内及胞内环境一般接近pH7(例如从pH6.0到pH8.0，更典型pH6.5-7.5)，含有水作为主要溶剂，并存在于0℃以上且50℃以下的温度。渗透性在可支持细胞存活和增殖的范围内。
通过本领域技术人员已知的常规方法，例如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹法(例如Western印迹)、磁共振成像、CT扫描、X射线以及亲和色谱法，来检测免疫复合物的形成。所选择抗体的免疫学结合特性可采用本领域已知的方法来定量。
缀合物：连接在一起的两个分子的复合物，例如通过共价键连接在一起。在一个实施方案中，抗体与效应分子连接；例如，与HIV-1Env特异性结合的抗体与效应分子共价连接。该连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，该连接是化学连接，其中抗体部分与效应分子之间的反应产生了在两分子间形成的共价键以形成一个分子。抗体和效应分子之间可任选地包括肽接头(短肽序列)。由于缀合物可由两个具有不同功能性的分子(如抗体和效应分子)制得，所以其有时也称为“嵌合分子”。
保守变体：“保守”氨基酸取代是基本上不影响或不降低蛋白功能(如蛋白与靶蛋白相互作用的能力)的那些取代。例如，在一些实施方案中，HIV特异性抗体与参考抗体序列相比，可包括最多1、2、3、4、5、6、7、8、9个或者最多10个保守取代并且保留了对HIV-1抗原的特异性结合活性和/或HIV-1中和活性。术语保守变化也包括用取代的氨基酸替换未取代的亲本氨基酸。
此外，普通技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸(例如小于5％，在一些实施方案中小于1％)的个别取代、缺失或添加都是保守性变化，其中变化导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。
提供功能性相似氨基酸的保守氨基酸取代对本领域普通技术人员来说是已知的。以下6组为被认为是彼此保守取代的氨基酸的示例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
非保守取代是降低HIV特异性抗体的活性或功能(如特异性结合gp120的能力)的那些。例如，如果氨基酸残基对蛋白的功能是必需的，那么即使是另外的保守取代也可能破坏此活性。因此，保守取代并不会改变目的蛋白的基本功能。
接触：直接物理关联的放置；既包括以固体形式也包括以液体形式，可发生在体内或体外。接触包括一个分子与另一个分子之间的接触，例如，一个多肽(如抗原)的表面上的氨基酸接触另一个多肽(如抗体)。接触还可包括接触细胞，例如通过将抗体置于与细胞的直接物理关联。
对照：参照标准。在一些实施方案中，对照是阴性对照，如得自未感染HIV-1的健康患者的样品。在另一些实施方案中，对照是阳性对照，如得自诊断有HIV-1感染的患者的组织样品。在再另一些实施方案中，对照是历史对照或参照标准值或值的范围(如先前测试过的对照样品，如一组具有已知预后或后果的HIV-1患者、或一组代表基线值或正常值的样品)。
测试样品与对照之间的差异可增加，或反之可减少。该差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学显著差异。在一些实例中，相对于对照，差异是增加或减少至少大约5％，如至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约100％、至少大约150％、至少大约200％、至少大约250％、至少大约300％、至少大约350％、至少大约400％、或至少大约500％。
简并变体：在本发明的上下文中，“简并变体”是指编码蛋白(例如特异性结合gp120的抗体或其可变区)的多核苷酸，其包括由于遗传密码而简并的序列。存在20个天然氨基酸，其中大部分由多于一个的密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的结合gp120的抗体的氨基酸序列未发生变化，就包括所有简并的核苷酸序列。
可检测标记：可检测分子(也称为标记物)，其直接或间接地与第二分子如抗体缀合以便于检测所述第二分子。例如，可检测标记能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(如CT扫描、MRI、超声、光纤维检查以及腹腔镜检查)检测。可检测标记的具体的非限制性示例包括荧光团、化学发光物质、酶连接、放射性同位素以及重金属或化合物(例如经MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。在一个实例中，“标记的抗体”是指在抗体中掺入另一分子。例如，标记物是可检测标记，如掺入放射性标记的氨基酸或附着于可被标记的抗生物素蛋白检测的生物素基部分的多肽(例如含有荧光标记或具有酶活性的可通过光学方法或比色法检测的链霉抗生物素蛋白)。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域是已知的并且可以使用。针对多肽的标记物的示例包括但不限于如下：放射性同位素或放射性核素(如35S或131I)、荧光标记物(如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记物(如辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基团、由次级报道分子(如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定的多肽表位、或磁性物质如钆螯合物。在一些实施方案中，标记物由各种长度的间隔臂附着以减少潜在的空间位阻。例如，在Sambrook等(MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012)和Ausubel等(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,throughsupplement 104,2013)中讨论了使用可检测标记和指导如何选择适用于各种用途的可检测标记的方法。
检测：鉴定某物的存在、出现或事实。本领域技术人员了解检测的一般方法，并以本文所公开的方案和试剂作为补充。例如，本文包括检测对象中表达gp120的细胞的方法。
效应分子：旨在具有或产生期望效应的分子；例如，对效应分子所靶向的细胞的期望效应。效应分子可包括例如多肽和小分子。在一个非限制性实例中，效应分子是毒素。技术人员将理解的是，一些效应分子可具有或产生多于一种的期望效应。
表位：抗原决定簇。这些是抗原性(即诱发特异性免疫应答)分子上的特殊化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原性表位。在一些实例中，所公开的抗体特异性结合gp120上的表位。
表达：核酸序列的转录或翻译。例如，编码核酸序列(如基因)可在其DNA转录为RNA或RNA片段时表达，在一些实施例中，RNA或RNA片段被加工为mRNA。编码核酸序列(如基因)也可在其mRNA翻译为氨基酸序列如蛋白或蛋白片段时表达。在特定实例中，异源基因在其转录为RNA时表达。在另一实例中，异源基因在其RNA翻译为氨基酸序列时表达。表达的调控可包括对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子如mRNA的降解的控制，或在特异性蛋白分子生成之后通过激活、失活、区室化或降解。
表达控制序列：调控其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调控核酸序列的转录和(合适时)翻译时，表达控制序列可操作地与核酸序列连接。因此，表达控制序列可包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子(ATG)、用于内含子的剪接信号、保持基因的正确阅读框以允许mRNA的适当翻译、以及终止密码子。术语“控制序列”旨在最低限度地包括其存在可影响表达的成分，还可包括其存在是有利的额外成分，例如，前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。
启动子是足以指导转录的最小序列。还包括足以使启动子依赖型基因表达对于特异细胞类型、特异组织可控的或被外部信号或物质可诱导的那些启动子元件；此种元件可位于基因的5’或3’区。包括组成型和诱导型启动子(参见例如Bitter等,Methods inEnzymology 153:516-544,1987)。例如，在细菌***进行克隆时，可使用诱导型启动子如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂种启动子)等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞***中进行克隆时，可使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。也可采用由重组DNA或合成技术生产的启动子以提供核酸序列的转录。
多核苷酸可***到表达载体中，该表达载体含有促进宿主中***的遗传序列有效转录的启动子序列。表达载体通常含有复制起点、启动子以及允许对转化的细胞进行表型选择的特异性核酸序列。
表达载体：包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达***中提供。表达载体包括所有本领域已知的载体，如粘粒、质粒(例如裸露的或脂质体中包含的)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
Fc多肽：包括抗体的恒定区但不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。Fc区一般是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。Fc区还可包括这些结构域N末端的部分或全部的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc区可包括或可不包括尾端(tailpiece)以及可被或可不被J链结合。对于IgG，Fc区包括免疫球蛋白结构域Cgamma2与Cgamma3(Cγ2和Cγ3)和Cgamma1(Cγ1)与Cγ2之间的铰链的下部。尽管Fc区的边界可变化，但人IgG重链Fc区通常限定为包括位于残基C226或P230至其羧基末端，其中按照Kabat中的EU索引进行编号。对于IgA，Fc区包括免疫球蛋白结构域Calpha2与Calpha3(Cα2和Cα3)和Calpha1(Cα1)与Cα2之间的铰链的下部。
HIV-1包膜蛋白(Env)：HIV-1包膜蛋白初始被合成为大小为845-870个氨基酸的前体蛋白，称为gp160。单个gp160多肽形成同源三聚体，并在高尔基体内进行糖基化及加工以去除信号肽，并在大约位置511/512之间被细胞蛋白酶切割以生成分开的gp120和gp41多肽链，所述多肽链仍结合作为gp120/gp41原聚体存在于同源三聚体内。HIV-1Env三聚体的胞外结构域(即细胞外部分)经过若干结构重排，从躲避抗体识别的融合前成熟(切割)封闭构象，经由结合受体CD4和共受体(CCR5或CXCR4)的中间构象，到融合后构象。
所公开的HIV-1Env蛋白及其片段中使用的编号是相对于全文并入本文参考的Numbering Positions in HIV Relative to HXB2CG Bette Korber等,HumanRetroviruses and AIDS 1998:A Compilation and Analysis of Nucleic Acid andAmino Acid Sequences.Korber等,Eds和Theoretical Biology and Biophysics Group,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM中显示的HXB2编号方案而言的。
HIV-1gp120：一种多肽，其是HIV-1Env蛋白的一部分。成熟的gp120包括大约HIV-1Env残基31-511，含有大部分的HIV-1Env三聚体的外部的表面暴露的结构域，并且它是既结合细胞CD4受体又结合细胞趋化因子受体(如CCR5)的gp120。成熟gp120多肽是胞外多肽，其与gp41胞外结构域相互作用形成HIV-1Env原聚体，所述HIV-1Env原聚体三聚体化形成HIV-1Env三聚体。
HIV-1gp140：一种重组HIV-1Env多肽，包括gp120和gp41胞外结构域，但不包括gp41跨膜或胞质结构域。HIV-1gp140多肽可三聚化形成可溶的HIV-1Env胞外结构域三聚体。
HIV-1gp41：一种多肽，其是HIV-1Env蛋白的一部分。成熟gp41包括大约HIV-1Env残基512-860，并且包括胞质结构域、跨膜结构域以及胞外结构域。gp41胞外域(包括大约HIV-1Env残基512-644)可与gp120相互作用形成HIV-1Env原聚体，该HIV-1Env原聚体三聚化形成HIV-1Env三聚体。
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)：一种逆转录病毒，其可在人中产生免疫抑制(HIV-1病)，从而导致已知为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的疾病综合征。“HIV-1病”是指感染HIV-1病毒的人中充分认识的征候和症状的群集(包括机会性感染的发展)，由抗体或Western印迹研究确定。与该疾病相关的实验室发现包括T细胞进行性衰退。用作动物模型的相关病毒包括猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。使用HAART治疗HIV-1已有效地减少了受感染个体中的病毒负荷并改善了HIV-1感染的影响。
HXB2编号***：一种用于HIV-1蛋白和核酸序列的参考编号***，其将HIV-1HXB2毒株序列作为所有其它HIV-1毒株序列的参考。本领普通技术人员熟悉HXB2编号***，并且在如下文献中描述了该***：“Numbering Positions in HIV Relative to HXB2CG,”Bette Korber et al.,Human Retroviruses and AIDS 1998:A Compilation andAnalysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences.Korber B,Kuiken CL,Foley B,Hahn B,McCutchan F,Mellors JW,and Sodroski J,Eds.Theoretical Biology andBiophysics Group,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM，其全文并入本文参考。HXB2也称为：HXBc2，表示HXB克隆2；HXB2R，在Los Alamos HIV数据库，其中R表示修订，因为它相对于原始HXB2序列略有修订；以及GENBANKTM中的HXB2XCG，表示HXB2完整基因组。在本文所公开的gp120多肽中使用的编号是相对HXB2编号方案而言的。为参考，下面列出了HXB2的HIV-1Env的氨基酸序列：
MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGACRAIRHIPRRIRQGLERILL(SEQ ID NO:35；登记号K03455，以2015年3月15日在数据库中存在的形式并入本文参考)。
IgA：一种多肽，属于基本上被已确认的免疫球蛋白α基因编码的抗体类别。在人类中，该类别或同种型包括IgA1和IgA2。IgA抗体可以作为单体、以二聚体形式为主的多聚体(称为pIgA)和分泌型IgA存在。野生型IgA的恒定链在其称为尾端(tp)的C末端含有18个氨基酸延伸。多聚IgA由浆细胞分泌，浆细胞具有被称为J链的15-kDa肽，J链通过尾端内的保守半胱氨酸残基将IgA的两个单体连接。
IgG:一种多肽，属于基本上可被已确认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别或同种型。在人类中，该类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在鼠类中，该类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。
免疫复合物：抗体或抗原结合片段(如scFv)与可溶抗原结合形成免疫复合物。免疫复合物的形成可通过本领域技术人员已知的常规方法例如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如Western印迹)、磁共振成像、CT扫描、X射线以及亲和层析检测。所选择的抗体的免疫学结合特性可采用本领域公知的方法来定量。
分离的：一种生物组分(如核酸、肽、蛋白质或蛋白复合物，例如抗体)，该生物组分与在所述组分天然存在的生物体细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上已分开、分离产生或纯化。因此，分离的核酸、肽和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包含通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。分离的核酸、肽或蛋白质，例如抗体，可是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯。
接头：一种双功能分子，其可用于将两个分子连接为一个连续分子，例如用于将效应分子与抗体连接。在一些实施方案中，所提供的缀合物包括效应分子或可检测标记与抗体之间的接头。在某些情况下，接头是抗原结合片段(如Fv片段)内起到将VH和VL间接键合的肽。肽接头的非限制性实例包括甘氨酸接头和甘氨酸-丝氨酸接头。
术语“缀合”、“联接”、“键合”或“连接”可指使两个分子成为一个连续分子；例如，将两个多肽连接为一个连续多肽，或将一个效应分子或可检测标记放射性核素或其他分子共价附着到多肽如scFv上。在特定的上下文中，该术语包括提及将配体(如抗体部分)联接到效应分子上。连接可以通过化学手段或重组手段进行。“化学手段”是指抗体部分与效应分子之间的反应，使得两分子之间形成共价键以形成一个分子。
核酸：一种由核苷酸单位(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)通过磷酸二酯键连接组成的多聚体、相关天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。因此，该术语包括核苷酸多聚体，其中核苷酸和它们之间的键包括非天然存在的合成类似物(例如但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这种多核苷酸可以采用例如自动化DNA合成仪来合成。术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸，一般不超过大约50个核苷酸。应理解的是，当由DNA序列表示核苷酸序列时(即A、T、G、C)，这也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”替换“T”。
在本文中使用常规表示法来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手端是5’端；双链核苷酸序列的左手方向称为5’方向。向新生RNA转录物的5’到3’添加核苷酸的方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上、具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列且位于RNA转录物的5’端的5’的序列被称为“上游序列”；DNA链上、具有与RNA相同的序列且位于编码RNA转录物的3’端的3’的序列被称为“下游序列”。
“cDNA”是指单链或双链形式的与mRNA互补或相同的DNA。
“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列的固有特性，其用作生物过程中其它多聚体和大分子合成的模板，其它多聚体和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA,tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果由基因产生的mRNA转录和翻译在细胞或其他生物***中产生蛋白质，那么该基因就编码蛋白质。两条编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同且一般提供在序列列表中，而且用作转录模板的基因或cDNA的非编码链都可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或者其他产物。除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或修饰形式的任何核苷酸。该术语包括DNA的单链形式或双链形式。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作地连接。例如，如果启动子如CMV启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列是可操作地连接。一般地，可操作连接的DNA序列是连续的，并且必要时，将两个蛋白质编码区联接在同一阅读框中。
药学上可接受的载体：所用的药学上可接受的载体是常规的。Remington'sPharmaceutical Science,22th ed.,Pharmaceutical Press,London,UK(2012)描述了适用于所公开物质的药物递送的组合物和制剂。
一般地，载体的性质将取决于采用的特定施用方式。例如，胃肠外制剂通常包括可注射液体，所述可注射液体包括作为运载体的药学上和生理学上可接受的液体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体可包括例如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性载体之外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅料，如润湿剂或乳化剂、添加的防腐剂(如非天然防腐剂)、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨醇单月桂酸酯。在特定实例中，药学上可接受的载体是无菌的并且适用于对对象进行胃肠外施用，例如通过注射。在一些实施方案中，以单位剂型如丸剂或者以小瓶以选定的量来提供活性剂和药学上可接受的载体。单位剂型可包括一剂量或多剂量(例如以小瓶，其中可选择性地分配计量的物质剂量)。
多肽：一种多聚体，其中单体是通过酰胺键联接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为α氨基酸时，可以使用L光学异构体或D光学异构体，优选L异构体。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖任何氨基酸序列并且包括修饰的序列如糖蛋白。多肽既包括天然存在的蛋白质也包括重组或合成生成的蛋白质。多肽具有氨基末端(N-末端)和羧基末端。在一些实施方案中，多肽为所公开的抗体或其片段。
多肽修饰：多肽可通过各种化学技术来修饰以生成具有与未修饰的肽基本上相同活性和构像并且任选地具有其他所需特性的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团，无论是羧基末端还是侧链，都可以药学上可接受的阳离子盐的形式提供，或被酯化形成C1-C16酯，或转化为化学式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C16烷基，或组合形成杂环，如5元环或6元环。肽的氨基，无论是氨基末端还是侧链，都可以是药学上可接受的酸加成盐形式，如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其他有机盐，或可被修饰为C1-C16烷基或二烷基氨基，或被进一步转化为酰胺。
采用公知技术可将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽侧链的苯环和苯酚环可被一个或多个卤素原子如F、Cl、Br或I或被C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯、或此类羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可延伸至同源的C2-C4亚烷基。硫醇可用许多公知的保护基团任一如乙酰胺基来保护。
重组：重组核酸是具有非天然存在的序列或具有由人工组合两个另外的分离的序列区段制得的序列的核酸。该人工组合可通过化学合成或更通常地通过对分离的核酸区段的人工操作例如通过基因工程技术来完成。重组蛋白是具有非天然存在的序列或具有由人工组合两个另外的分离的序列区段制得的序列的蛋白质。在若干实施方案中，重组蛋白由已被引入到诸如细菌或真核细胞的宿主细胞中的异源(例如重组)核酸编码。核酸可被引入到例如具有能够表达由所引入的核酸编码的蛋白质的信号的表达载体上，或核酸可整合到宿主细胞染色体中。
序列相同性：根据序列之间的相似性来表示氨基酸序列之间的相似性，序列之间的相似性也称为序列相同性。序列相同性通常根据相同性(或相似性或同源性)百分比来度量。百分比越高，两序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽的同源物或变体具有相对高程度的序列相同性。
用于比较的序列比对方法在本领域是公知的。在下列文献中描述了各种程序和比对算法：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet等,Nucleic Acids Research 16:10881,1988；以及Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988.Altschul等,Nature Genet.6:119,1994提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI局部序列比对检索基本工具(BLAST)(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990)可从数个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网，其用于与序列分子程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。关于如何使用该程序确定序列相同性的描述可在互联网的NCBI网站上获得。
特异性结合多肽的抗体的VL或VH的同源物和变体特征通常在于经与目的氨基酸序列的全长比对计算，具有至少大约75％，例如至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。当用该方法进行评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质体现出增加的百分比相同性，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性。当小于整个序列进行序列相同性比较时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短视窗上具有至少80％的序列相同性，并可依据其与参考序列的相似性具有至少85％或至少90％或95％的序列相同性。在互联网的NCBI网站上可获得通过这种短视窗确定序列相同性的方法。本领域技术人员将意识到提供这些序列相同性范围仅仅是用于指导；完全有可能获得落在超出所提供的范围外的显著同源物。
用于描述两个或多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“选自”、“对比窗”、“相同”、“序列相同性百分比”、“基本上相同”、“互补”以及“基本上互补”。
对于核酸序列的序列对比，通常，与测试序列对比，一个序列充当参考序列。当采用序列对比算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。采用默认程序参数。用于对比的序列比对方法在本领域是已知的。例如，可以通过Smith and Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482,1981)、通过Needleman and Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443,1970)，通过Pearson andLipman,Proc.的搜索相似性方法(Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988)，通过这些算法的计算机化执行(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过人工比对和目测(参见例如Sambrook等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold SpringHarbor,New York,2012)和Ausubel等(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013)来进行用于对比的最佳序列比对。有用算法的一个示例是PILEUP。PILEUP采用Feng and Doolittle的渐进比对法(J.Mol.Evol.35:351-360,1987)的简化方法。采用的方法与Higgins and Sharp描述的方法(CABIOS 5:151-153,1989)相似。采用PILEUP，将参考序列与其他测试序列比较以确定序列相同性百分比关系，采用的参数如下：默认缺口权数(3.00)、默认缺口长度权数(0.10)以及加权的末端缺口。PILEUP可由例如7.0版本的GCG序列分析软件包(Devereaux等,Nuc.Acids Res.12:387-395,1984)获得。
适用于确定序列相同性百分比和序列相似性的算法的另一个示例是BLAST和BLAST 2.0算法，这两种算法在Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1977中描述。通过美国国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)可公开获得执行BLAST分析的软件。(用于核苷酸序列的)BLASTN程序默认采用11的字长(W)、50的比对(B)、10的预期(E)、M＝5、N＝-4和双链比较。(用于氨基酸序列的)BLASTP程序默认采用3的字长(W)和10的预期(E)以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)。寡核苷酸是长度为最多大约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。
特异性结合：当指抗体或抗原结合片段时，是指在蛋白质和其他生物质的异质群体存在的条件下，确定目标蛋白质、肽或多糖的存在的结合反应。因此，在指定条件下，抗体优先结合特定的目的蛋白质、肽或多糖(如病原体的表面存在的抗原，例如HIV-1Env)并且不以显著量结合样品或对象中存在的其他蛋白质或多糖。可以通过本领域已知的方法来确定特异性结合。对于抗体-抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合具有小于约10-7M、如小于约10-8M、10-9或甚至小于约10-10M的Kd。
Kd是指给定的相互作用如多肽配体相互作用或抗体抗原相互作用的解离常数。例如，对于抗体或抗原结合片段与抗原的双分子相互作用，它是双分子相互作用的个体组分的浓度除以复合物的浓度。
本文公开的抗体与确定的靶(或多个靶，在双特异性抗体存在的情况下)特异性结合。因此，特异性结合gp120上的表位的抗体是基本上结合gp120(包括表达gp120的细胞或组织、gp120附着其上的基材或生物样本中的gp120)的抗体。当然，应认识到抗体或包括抗体的缀合物(如特异性结合gp120的抗体或包括此抗体的缀合物)与非靶(如不表达gp120的细胞)之间也可发生一定程度的非特异性相互作用。通常，特异性结合导致抗体与携带抗原的蛋白质或细胞之间的结合大大强于抗体与缺少所述抗原的蛋白质或细胞之间的结合。特异性结合通常会导致抗体与包括表位的蛋白质或表达靶表位的细胞或组织结合的量比缺少该表位的蛋白或细胞或组织结合的量增加2倍，如大于5倍、大于10倍或大于100倍(每单位时间)。在此条件下与蛋白质的特异性结合需要针对其与特定蛋白质的特异性而选择的抗体。各种免疫测定方式适用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，通常采用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质特异性免疫反应的单克隆抗体。对可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述参见Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Publications,New York(2013)。
对象：活的多细胞脊椎动物生物体，一种包括人类和非人类哺乳动物的类别。在一个实例中，对象是人。在特定实例中，对象是新生儿。在额外的实例中，选择需要抑制HIV-1感染的对象。例如，对象是未感染的及处于HIV-1感染风险中，或被感染需要治疗。
治疗有效量：足以防止、治疗(包括预防)、减少和/或改善失调或疾病如HIV-1感染的症状或潜在原因的物质(如公开的gp120特异性抗体或抗原结合片段)的量。在一些实施方案中，治疗有效量足以减少或消除HIV-1感染如AIDS的症状。例如，它可以是抑制或防止HIV-1复制或可测量地改变HIV-1感染的外部症状所必需的量。理想地，治疗有效量提供治疗效果，但不在对象中引起实质细胞毒性作用。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，结合gp120的治疗有效量的所公开的抗体或抗原结合片段的施用可减少或抑制HIV-1感染(例如通过感染的细胞、或通过被HIV-1感染的对象的数量或百分比、或通过被感染对象的存活时间的增加来度量)所希望的量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％(消除或防止可检测的HIV-1感染)。
以治疗有效量施用本文所公开的若干制剂。向对象施用的特异性结合gp120的抗体或抗原结合片段的治疗有效量依据与该对象相关联的多个因素如对象的总体健康和/或体重而变化。通过改变剂量以及测量由此产生的治疗反应如病毒滴度的降低来确定治疗有效量。也可通过各种体内、体外或原位免疫测定法来确定治疗有效量。
治疗有效量涵盖分次剂量，所述分次剂量与之前或之后的施用结合来促成达到治疗反应。例如，以单剂或多剂(例如持续几天或几周的疗程期间的每日)来施用治疗有效量的药剂。然而，治疗有效量取决于正在治疗的对象、正在治疗的状况的严重性和类型以及施用方式。治疗量的或数倍治疗量的药剂可包装成单位剂型，例如在小瓶(例如带有可刺穿的盖)或含有无菌组分的注射器中。
转化：转化细胞是通过分子生物学技术将核酸分子引入其内的细胞。如本文所用，术语转化涵盖所有可将核酸分子引入到此细胞中的技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速将DNA引入。
治疗或预防疾病：抑制例如处于HIV-1感染风险或已被HIV-1感染的对象的疾病或状况的全面发展。“治疗”是指改善已开始发展的疾病或病理状况的征候或症状的治疗性干预。针对疾病或病理状况，术语“改善”是指任何可观察的有益治疗效果。例如，通过易感对象中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或所有临床症状的严重性的降低、疾病的减慢进展、病毒负荷减少、对象全身健康的改善或完全好转，或者通过本领域已知的针对具体疾病的其他参数来证实有益效果。“预防”治疗是向未表现出疾病迹象的对象施用的治疗，以降低病理发展的风险。
载体：重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可包括被允许在宿主细胞内复制的核酸序列，如复制起点。载体还可包括一个或多个可选择的标记基因和其他本领域已知的遗传元件。病毒载体是具有衍生自一个或多个病毒的至少一些核酸序列的重组核酸载体。在一些实施方案中，提供了包括编码特异性结合HIV-1gp120并中和HIV-1的公开的抗体或抗原结合片段的一个或多个核酸分子的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺伴随病毒(AAV)载体。复制缺陷型病毒载体是一种由于至少一个复制必需基因功能缺陷而要求对复制所需的病毒基因组的一个或多个区进行互补的载体。例如，病毒载体在典型宿主细胞，特别是在治疗方法的过程中可被病毒载体感染的人类患者的细胞中不复制。
VRC01类抗体、重链或轻链：一类结合gp120上的CD4结合位点并可中和HIV-1的抗体及其重链和轻链。VRC01类抗体的原型成员VRC01可中和超过90％的流行HIV-1分离株，平均50％抑制浓度(IC50)为0.3μg/ml。尽管VRC01类抗体之间存在全序列差异，但是抗体-gp120共晶结构揭示了gp120的VRC01类识别在整个类别中是一致的。的确，在具有来自多个供体的不同VRC01类抗体的复合物中源自不同HIV-1进化枝的HIV-1gp120的三维结构分析表明VRC01类抗体的物理结构具有惊人的相似性，并揭示了有助于gp120结合和HIV-1中和的若干抗体特征。VRC01类抗体的主要结构和个体发生特征允许通过抗体序列的询问来对该类别的成员进行识别。
例如，VRC01类抗体的VH具有VH1-2种系来源，其中VRC01类VH编码序列20％到35％(如25-30％)不同于相应种系基因序列。VRC01类VH包括kabat位置50处的色氨酸残基(VHTrp50)、kabat位置58处的天冬酰胺残基(VH Asn58)以及kabat位置71处的精氨酸残基(VHArg71)。这些残基与gp120上的氨基酸形成特异性相互作用，有助于VRC01类特异性和中和特性。当VRC01类抗体与gp120结合时，VH Trp50与gp120Asn280形成氢键，VH Asn58与gp120Arg456形成氢键，VH Arg71与gp120Asp58形成盐桥，并且VH Trp 100B与gp120Asn279形成氢键。
进一步地，VRC01类抗体的VL具有IGKV1-33、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGLV2-14种系来源，其中VRC01类VL编码序列15％到35％(如25-30％)不同于相应种系基因序列。VRC01类VL包括具有2-6氨基酸缺失的LCDR1(kabat定位)或者在kabat位置28和30处具有甘氨酸残基的LCDR1。甘氨酸残基的缺失或存在提供了使LCDR1在抗体与CD4结合位点结合时避免与gp120的D环发生结构冲突的柔性。进一步地，VRC01类VL包括(根据kabat定位)长度为5个氨基酸的LCDR3并且包括kabat位置91处的疏水性残基(如亮氨酸或酪氨酸)、kabat位置92-95的缺失以及kabat位置96处的谷氨酸或谷氨酰胺残基。位置91处的疏水性残基针对gp120 D环的主链填充，kabat位置96处的谷氨酸或谷氨酰胺残基在gp120V5结构域的基础上与保守的正电性区相互作用。
属于VRC01类的抗体的非限制性示例包括VRC01、VRC03、VRC07、VRC07-523、VRC13、3BCN117、12A12、12A21、VRC-PG04、NIH45-46、VRC23、VRC-CH30、VRC-CH31和VRC-PG20抗体。本领技术人员可获取并熟悉这些抗体以及VRC01类抗体的描述、特征和生成(参见例如Diskin等.,Science,334(6060):1289-93,2011；Kwong and Mascola,Immunity,37,412-425,2012；Li等,J.Virol.,85,8954-8967,2011；Rudicell等,J.Virol.,88,12669-12682,2012；Scheid等,Science,333(6049):1633-1637,2011；West等,PNAS,109:E2083-2090,2012；Wu等,Science,329(5993):856-861,2010；Wu等.,Science,333(6049):1593-1602,2011；Zhou等,Immunity,39:245-258,2013；Georgiev等,Science,340:751-756,2013；Zhu等,PNAS,110,E4088-E4097,2013；以及WIPO Pub.Nos.WO 2012/158948、WO2011038290、WO2012154312、WO2013142324和WO2013016468，每篇文献都全文并入本文参考)。
II.若干实施方案的描述
提供了特异性结合gp120上表位的分离的单克隆抗体和抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可完全是人的。在若干实施方案中，可使用抗体和抗原结合片段来中和HIV-1。本文还公开了包括抗体和抗原结合片段和药学上可接受的载体的组合物。也提供了编码抗体或抗原结合片段的核酸和包括这些核酸的表达载体(如腺伴随病毒(AAV)病毒载体)。
抗体、抗原结合片段、核酸分子、宿主细胞和组合物可用于研究、诊断和治疗目的。例如，可使用单克隆抗体和抗原结合片段来诊断或治疗具有HIV-1感染的对象，或可预防性地施用以预防对象中的HIV-1感染。在一些实施方案中，可使用抗体来确定对象中的HIV-1滴度。
A.抗体和抗原结合片段
本公开提供了新型N6、N17或F8抗体及其变体(包括抗原结合片段)。表位作图和竞争结合研究表明所公开的抗体和抗原结合片段在与gp120上的CD4结合位点重叠的的表位处特异性结合HIV-1Env。
所公开的抗体和抗原结合片段对HIV-1的中和有惊人的有效性。例如，如实施例1中所讨论的，N6抗体在标准中和测定中中和98％的HIV-1假病毒IC50小于50μg/ml以及96％的HIV-1假病毒IC50小于1μg/ml。进一步地，N6抗体中和了大量的对VRC01抗体有抗性的HIV-1病毒株。
在一些实施方案中，抗体和抗原结合片段包括VH和VL，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。在若干实施方案中，抗体和抗原结合片段包括包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的VH和包括轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含一个或多个(例如一个、两个或全部三个)来自N6、N17或F8抗体任一的HCDR的VH。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含一个或多个(例如一个、两个或全部三个)来自N6、N17或F8抗体任一的LCDR的VL。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括分别包括N6、N17或F8抗体之一的HCDR1、HCDR 2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。
下面关于单克隆抗体的讨论是指参考Kabat编号方案(除非上下文另有所指)包括包含CDR的VH和VL的单克隆抗体。本领域技术人员将理解的是可使用各种CDR编号方案(如Kabat、Chthia或IMGT编号方案)来确定CDR位置。表1显示了根据Kabat编号方案的N6、N17或F8抗体的重链和轻链的氨基酸序列和CDR位置。
表1N6和变体抗体的Kabat CDR序列
N6
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以基于或衍生自N6抗体，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。例如，抗体或抗原结合片段可包括N6抗体的分别包含HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL(例如根据IMGT或kabat)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如表1中所述的N6VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如表1中所述的N6VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括分别包含如表1所示的N6VH和VL的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括至少一个CDR(如HCDR3)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述CDR具有与表1所示的N6VH或VL的重链或轻链CDR的任何一个有至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％)序列相同性的序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:1的31-35位、50-66位和99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:2的24-34位、50-56位和89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ IDNO:1的31-35位、50-66位和99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:2的24-34位、50-56位和89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述VH和VL各自独立地包含分别与SEQ ID NO:1和2所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VH，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述VH和VL包含分别如SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列。
N17
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可基于或衍生自N17抗体，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。例如，抗体或抗原结合片段可包括分别包含N17抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL(例如根据IMGT或kabat)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如表1所述的N17VH的HCDR1、HCDR 2和HCDR3的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如表1所述的N17VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括分别包含如表1所示的N17VH和VL的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括至少一个CDR(如HCDR3)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述CDR具有与表1所示的N17VH或VL的重链或轻链CDR的任何一个有至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％)序列相同性的序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ IDNO:3的31-35位、50-66位和99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:4的24-34位、50-56位和89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:3的31-35位、50-66位和99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:4的24-34位、50-56位和89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括含有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括独立地包含分别与SEQ ID NO:3和4所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO:3和4所示氨基酸序列的VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
F8
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可基于或衍生自F8抗体，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。例如，抗体或抗原结合片段可包含F8抗体的分别包含HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL(例如根据IMGT或kabat)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含表1所述的F8VH的HCDR1、HCDR 2和HCDR3的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含表1所述的F8VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含表1所示的F8 VH和VL的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括至少一个CDR(如HCDR3)并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述CDR具有与表1所示的F8VH或VL的重链或轻链CDR的任何一个有至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％)序列相同性的序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:5的31-35位、50-66位和99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:6的24-34位、50-56位和89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:5的31-35位、50-66位和99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:6的24-34位、50-56位和89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在另外实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1，所述VH和VL独立地包含分别与SEQ ID NO:5和6所示氨基酸序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的VH，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO:5和6所示氨基酸序列的VH和VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
额外的N6变体
N6VH和VL的额外的变体通过下一代测序研究来鉴定。这些变体序列的重链和轻链序列在图18中显示并且包括2_2014_00173626_H和2_2014_00173626_Hmut VH序列，以及1_2015_00106641_L、1_2015_00065970_L、1_2014_00019094_L和1_2015_00217585_L VL序列。在若干实施方案中，这些抗体的VH和VL序列或CDR序列可“混合和匹配”以形成特异性结合gp120并中和HIV的抗体。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH和如图18所示的1_2015_00106641_L(SEQ ID NO:104)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH和如图18所示的1_2015_00065970_L(SEQ ID NO:106)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH和如图18所示的1_2014_00019094_L(SEQID NO:108)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH和如图18所示的1_2015_00217585_L(SEQ ID NO:110)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH和如图18所示的1_2015_00106641_L(SEQ ID NO:104)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH和如图18所示的1_2015_00065970_L(SEQ ID NO:106)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH和如图18所示的1_2014_00019094_L(SEQ ID NO:108)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH和如图18所示的1_2015_00217585_L(SEQ ID NO:110)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与如图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与如图18所示的1_2015_00106641_L(SEQID NO:104)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2015_00065970_L(SEQ ID NO:106)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2014_00019094_L(SEQ IDNO:108)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_H(SEQ ID NO:112)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2015_00217585_L(SEQ ID NO:110)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH，和如图18所示的1_2015_00106641_L(SEQ ID NO:104)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH，和图18所示的1_2015_00065970_L(SEQ ID NO:106)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ IDNO:114)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH，和图18所示的1_2014_00019094_L(SEQ ID NO:108)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含如图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH的HCDR1、HCDR2与HCDR3的VH，和如图18所示的1_2015_00217585_L(SEQ ID NO:110)VL的LCDR1、LCDR2与LCDR3，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH和如图18所示的1_2015_00106641_L(SEQ ID NO:104)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH和如图18所示的1_2015_00065970_L(SEQ IDNO:106)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH和如图18所示的和如图18所示的1_2014_00019094_L(SEQ ID NO:108)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括如图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQID NO:114)VH和如图18所示的1_2015_00217585_L(SEQ ID NO:110)VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2015_00065970_L(SEQID NO:104)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2015_00065970_L(SEQ ID NO:106)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ ID NO:114)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2014_00019094_L(SEQ ID NO:108)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包括包含与图18所示的2_2014_00173626_Hmut(SEQ IDNO:114)VH的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VH和包含与图18所示的1_2015_00217585_L(SEQ ID NO:110)VL的序列至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的VL，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
1.抗体和抗原结合片段的额外描述
N6、N17或F8抗体是彼此的克隆变体，包括衍生自相同的重链和轻链种系基因的相似的重链和轻链CDR。因而，可使用这些抗体的CDR序列来生成特异性结合gp120并中和HIV-1的抗体和抗原结合片段的属的共有CDR序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH，所述VH包括分别包括SEQ ID NO:19(AHILX1，其中X1是F或Y)、SEQ ID NO:20(WIKPQYGAVNFGGGFRX1，其中X1是D或G)和/或SEQ ID NO:21(ARDRSYX1DSSWALDAW，其中X1是G或D)的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VL，所述VL包括分别包括SEQ ID NO:22(QTSQGVGX1DLH，其中X1是G或S)、SEQ ID NO:23(HX1SSVED，其中X1是A或T)和/或SEQ ID NO:24(QVLX1X2F，其中X1是E或Q，且X2是S或F)的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH，所述VH包括分别包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，抗体或抗原结合片段还包括VL，所述VL包括分别包括SEQ ID NO:22,SEQID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。
在一些实施方案中，所公开的抗体的VH和VL区段可“混合和匹配”，其中不同对的VH和VL区段组合并筛选与gp120的结合从而选择目的VL/VH对组合。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:7、13或19之一的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:8、14或20之一的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ IDNO:9、15或21之一的氨基酸序列的HCDR3。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:10、16或22之一的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:11、17或23之一的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12、18或24之一的氨基酸序列的LCDR3。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:7、13或19之一的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:8、14或20之一的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:9、15或21之一的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:10、16或22之一的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:11、17或23之一的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12、18或23之一的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括至少一个CDR，所述CDR具有与SEQID NO:7-18任一个有至少95％序列相同性的序列，其中抗体特异性结合gp120并中和HIV-1感染。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH，所述VH包括包含分别与SEQ IDNO:1、3或5之一的31-35位、50-66位和/或99-111位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VL，所述VL包括包含分别与SEQ ID NO:2、4或6之一的24-34位、50-56位和/或89-93位氨基酸至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本文提供的结构研究表明N6抗体与gp120相互作用的若干特征，包括(1)N6VH的kabat位置54处的酪氨酸残基(位于HCDR2内)，(2)N6VH的kabat位置61-63处的3个甘氨酸残基(也位于HCDR2内)，(3)N6VL的kabat位置28处的甘氨酸残基(位于LCDR1内)，(4)N6VL的kabat位置28-30处的GXG基序(也位于LCDR1内)和(5)5残基LCDR3。如图1所示，这些特征在跨N6、N17或F8抗体中是保守的。在一些实施方案中，所公开的包括N6、N17或F8抗体的CDR的抗体(或其变体)可进一步包括在上文中列出的特征(1)-(5)中的一个或多个(如特征(1)和(2)；(1)和(3)；(1)和(4)；(1)和(5)；(2)和(3)；(2)和(4)；(2)和(5)；(3)和(4)；(3)和(5)；(4)和(5)；(1)、(2)和(3)；(1)、(2)和(4)；(1)、(2)和(5)；(1)、(3)和(4)；(1)、(3)和(5)；(1)、(4)和(5)；(2)、(3)和(4)；(2)、(3)和(5)；(2)、(4)和(5)；(3)、(4)和(5)；(1)、(2)、(3)和(4)；(1)、(2)、(3)和(5)；(1)、(3)、(4)、(5)；(2)、(3)、(4)和(5)；或(1)、(2)、(3)、(4)和(5))，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。
进一步地，由于N6、N17或F8抗体与某些已知VRC01类抗体的相似性，所以VRC01类抗体包括所指明的上述特征(1)-(5)(如特征(1)和(2)；(1)和(3)；(1)和(4)；(1)和(5)；(2)和(3)；(2)和(4)；(2)和(5)；(3)和(4)；(3)和(5)；(4)和(5)；(1)、(2)和(3)；(1)、(2)和(4)；(1)、(2)和(5)；(1)、(3)和(4)；(1)、(3)和(5)；(1)、(4)和(5)；(2)、(3)和(4)；(2)、(3)和(5)；(2)、(4)和(5)；(3)、(4)和(5)；(1)、(2)、(3)和(4)；(1)、(2)、(3)和(5)；(1)、(3)、(4)和(5)；(2)、(3)、(4)和(5)；或(1)、(2)、(3)、(4)和(5))以增加这些抗体特异性结合gp120并中和HIV-1的宽度和效价。可被修饰为包括特征(1)-(5)中的一个或多个的VRC01类抗体的非限制性示例包括VRC01、VRC03、VRC07、VRC07-523、3BCN117、12A12、12A21、VRC-PG04、NIH45-46、VRC18、VRC23、VRC27、VRC-CH30、VRC-CH31、VRC-PG04和VRC-PG20抗体。
抗体或抗原结合片段可以是人抗体或其片段。也提供了嵌合抗体。抗体或抗原结合片段可包括任何合适的框架区，如(但不限于)人框架区。人框架区和在人抗体框架区可以进行的突变在本领域是已知的(参见例如第5,585,089号美国专利，其通过引用并入本文)。或者，异源框架区，如例如但不限于鼠或猴框架区，也可包括在抗体的重链或轻链中(参见例如Jones等,Nature 321:522,1986；Riechmann等,Nature 332:323,1988；Verhoeyen等,Science 239:1534,1988；Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285,1992；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437,1992；和Singer等,J.Immunol.150:2844,1993.)
抗体可以是任何同种型。抗体可以是例如IgM或IgG抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。特异性结合gp120的抗体的类别可与另一种类别转换。在一方面，采用本领域周知的方法分离编码VL或VH的核酸分子，以使其不包括任何分别编码轻链或重链的恒定区的核酸序列。然后，编码VL或VH的核酸分子可操作地连接编码来自不同类的免疫球蛋白分子的CL或CH的核酸序列。这可通过采用本领域已知的包括CL或CH链的载体或核酸分子来实现。例如，特异性结合gp120的初始为IgG的抗体可类别转换为IgM。类别转换可用于将一个IgG子类转换为另一个，如从IgG1转换为IgG2、IgG3或IgG4。
在一些示例中，所公开的抗体为抗体的寡聚体，如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚物等。
(a)结合亲和力
在若干实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合gp120，亲和力(例如由Kd度量)不大于1.0x 10-8M、不大于5.0x 10-8M、不大于1.0x 10-9M、不大于5.0x 10-9M、不大于1.0x 10-10M、不大于5.0x 10-10M或不大于1.0x 10-11M。Kd可通过例如利用已知的方法、采用目的抗体的Fab及其抗原进行的放射标记抗原结合测定(RIA)来测量。在一个测定中，针对抗原的Fab的溶液结合亲和力通过在一系列滴定的未标记的抗原的存在下用最小浓度的125I标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原来测量(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为创建测定条件，用溶于50mM碳酸钠(pH9.6)的5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被多孔板(Thermo Scientific)过夜，随后在室温(大约23℃)用于PBS的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭2到5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，100μM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab(例如与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)混合。然后，过夜孵育目的Fab；然而，孵育可持续更长时间(例如大约65小时)以确保达到平衡。此后，在室温将混合物转移到用于孵育的捕获板中(例如1小时)。之后，去除溶液，并用溶于PBS的0.1％聚山梨醇酯20洗涤板八次。当板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并在TOPCOUNTTMgamma计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择每个Fab的可给予小于或等于20％最大结合的浓度以用于竞争性结合测定。
在另一测定中，在25℃，应用含有～10个回应单位(RU)的固定抗原CM5芯片的或(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)、采用表面等离子体共振测定法来测量Kd。简单地说，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)来激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,Inc.)。在以5l/分钟的流速进行注射前，用10mM、pH4.8的乙酸钠将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，以达到大约10个回应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25l/分钟的流速，将Fab的两倍连续稀释(0.78nM至500nM)注射于含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。通过同时拟合结合和解离传感图，采用简单1:1langmuir结合模型(Evaluation Software version 3.2)来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。按照koff/kon比值来计算平衡解离常数(Kd)。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可采用荧光淬灭技术来确定，在光谱仪如stop-flow装配的光谱仪(Aviv Instruments)或具有搅拌反应杯的8000系列SLM-AMINCOTM光谱仪中测量出的在增加浓度的抗原存在下，所述荧光淬灭技术可测量出pH7.2的PBS中20nM的抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通)的增加或降低。
(b)中和
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段也可由中和宽度来区分。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可中和包含在HIV-1假病毒(包括例如来自进化枝A分离株KER2018、RWO20.2、Q168.a2、Q769.d22和Q769.h5、进化枝B分离株JRFL.JB、BaL.01、YU2.DG、PVO.04、TRO.11、CAAN.A2、TRJO.58、THRO.18、BG1168.1和6101.1以及进化枝C分离株ZA012.29、DU156.12、DU422.01、ZM106.9和ZM55.28a的gp120)标准化组中的至少70％(如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)的HIV-1分离株(IC50小于50μg/ml)。示例性的假病毒中和测定法和HIV-1假病毒组在例如Li等,J Virol 79,10108-10125,2005中有描述，该文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合gp120的CD4结合位点并可中和图2B中列出的至少50％的HIV-1分离株(即6540.v4.c1、620345.c1、T278-50、6322.V4.C1、DU422.01、X2088.c9、6545.V4.C1、242-14、T250-4、7165.18、BL01.DG、HO86.8、6471.V1.C16、6631.V3.C10、TVI.29、TZA125.17、CAP210.E8、DU172.17)(抑制浓度(IC50)小于50μg/ml)。本领域的普通技术人员熟悉测量中和宽度和效价的方法，例如这些方法包括TZM-bl细胞的单轮HIV-1Env假病毒感染(参见例如Li等,J Virol 79,10108-10125,2005,通过引用并入本文；还参见PCT No.WO2011/038290，通过引用并入本文)。
测定中和活性的额外方法包括如Martin等(2003)Nature Biotechnology 21:71-76中描述的单循环感染测定。在该测定中，病毒活性水平经由可选择的标记来测定，所述可选择的标记的活性是样品中活病毒的量的反映，并确定了IC50。在其他测定中，在PM1细胞系或在原代细胞(正常PBMC)中监控急性感染。在该测定中，通过用ELISA确定p24浓度来监测病毒活性水平。参见例如Martin等(2003)Nature Biotechnology 21:71-76。
(c)多特异性抗体
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括在多特异性抗体如双特异性抗体中。此种多特异性抗体可由已知方法生产，如将两个或多个抗体、相同类型或不同类型的抗原结合片段(如scFv)交联。制备多特异性抗体的示例性方法包括PCT公开号WO2013/163427中描述的那些方法，该文献通过引用全文并入本文。合适的交联剂包括具有两个明显的被适当间隔物(如m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)隔开的反应基团的异型双功能交联剂或者同型双功能交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。可从Pierce ChemicalCompany,Rockford,Ill获得此种交联剂。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括在特异性结合gp120且进一步特异性结合CD3的双特异性抗体中。可以包括在双特异性抗体或抗原结合片段中的CD3结合结构域的示例是已知的并且包括PCT公开号WO2013/163427(该文献通过引全文并入本文)中所公开的那些。
各种类型的多特异性抗体是已知的。双特异性单链抗体可由单核酸分子编码。双特异性单链抗体的示例以及构建此种抗体的方法在本领已知(参见例如美国专利号8,076,459、8,017,748、8,007,796、7,919,089、7,820,166、7,635,472、7,575,923、7,435,549、7,332,168、7,323,440、7,235,641、7,229,760、7,112,324、6,723,538，通过引用并入本文)。双特异性单链抗体的额外示例可见于PCT申请WO 99/54440；Mack,J.Immunol.,158:3965-3970,1997；Mack,PNAS,92:7021-7025,1995；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,45:193-197,1997；Loffler,Blood,95:2098-2103,2000；和Bruhl,J.Immunol.,166:2420-2426,2001。例如，在Schoonjans et al.(J.Immunol.165:7050-57,2000)和Willems等(JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786:161-76,2003)中描述了双特异性Fab-scFv(“双抗体”)分子的产生。对于双抗体，scFv分子可融合至VL-CL(L)或VH-CH1链之一，例如一个scFv融合至Fab链的C末端产生双抗体。
(d)片段
本公开涵盖抗原结合片段，如Fab、F(ab’)2和包括重链和VL并特异性结合gp120的Fv。这些抗体片段保留了选择性结合抗原的能力并且为“抗原结合”片段。此种片段的非限制性示例包括：
(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以获得完整轻链和一条重链的一部分来生产；
(2)Fab’，抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体、然后还原以产生完整轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab’片段。
(3)(Fab')2，抗体的片段，其可通过用胃蛋白酶处理整个抗体来获得，不需要之后的还原；(Fab')2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，基因工程片段，含有表达为两条链的VH和VL；以及
(5)单链抗体(如scFv)，定义为基因工程分子，含有被作为基因融合单链分子的合适多肽接头连接的VH和VL(参见例如Ahmad等,Clin.Dev.Immunol.,2012,doi:10.1155/2012/980250；Marbry,IDrugs,13:543-549,2010)。VH-结构域和VL-结构域在scFv中的分子内定向对提供的抗体(例如对于提供的多特异性抗体)来说并不是决定性的。因此，可使用具有两种可能排列(VH-结构域-接头结构域-VL-结构域；VL-结构域-接头结构域-VH-结构域)的scFv。
(6)单链抗体的二聚体(scFV2)，定义为scFV的二聚体。这也已经被称为“微型抗体”。
制备这些片段的方法在本领域是已知的(参见例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,2nd,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,2013)。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以是Fv抗体，其通常为大约25kDa并含有全部的抗原结合位点，每条重链和每条轻链中有3个CDR。为生产Fv抗体，VH和VL可从宿主细胞中的两个单个的核酸构建体表达。如果VH和VL非连续地表达，那么Fv抗体的链通常由非共价相互作用连接在一起。然而，这些链一旦稀释就倾向解离，所以研发了通过戊二醛、分子间二硫化物或肽接头使链交联的方法。因此，在一个实例中，Fv可以是二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其中VH和VL通过二硫键化学连接。在额外实例中，Fv片段包括由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)可通过构建编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的核酸分子来制备。核酸分子***表达载体中，之后表达载体再引入到宿主细胞如哺乳动物细胞中。重组宿主细胞合成单个多肽链，其中接头肽桥连两个V结构域。生产scFv的方法在本领域已知(参见例如Methods:a Companion to Methods in Enzymology,Vol.2,page 97,1991；Bird等,Science 242:423,1988；U.S.Patent No.4,946,778；Pack等,Bio/Technology 11:1271,1993；Ahmad等,Clin.Dev.Immunol.,2012,doi:10.1155/2012/980250；Marbry,IDrugs,13:543-549,2010)。也可以考虑单链抗体的二聚体(scFV2)。
抗原结合片段可通过抗体的蛋白酶水解或通过在编码该片段的DNA在宿主细胞(如大肠杆菌细胞)中表达来制备。抗原结合片段也可通过常规方法对整个抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。例如，可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶解来产生抗原结合片段以提供表示为F(ab’)2的5S片段。用硫醇还原剂，以及任选地用对于由二硫键裂解导致的巯基的封闭基团进一步裂解该片段以产生3.5S Fab’单价片段。或者，用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段(参见美国专利号4,036,945和美国专利号4,331,647以及其中参考文献；Nisonhoff等,Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960；Porter,Biochem.J.73:119,1959；Edelman等,Methods in Enzymology,Vol.1,page 422,AcademicPress,1967；以及Coligan等章节2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4)。
也可采用其他切割抗体的方法，如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或者也可以使用其他酶学、化学或基因技术，只要片段结合被完整抗体识别的抗原即可。
抗原结合单VH结构域，称为结构域抗体(dAb)，也已经从由免疫小鼠的基因组DNA扩增的鼠VH基因文库中鉴定(Ward等Nature 341:544-546,1989)。已经描述了能够以高亲和力结合抗原的人单免疫球蛋白可变结构域多肽(参见例如PCT公开号WO 2005/035572和WO 2003/002609)。本文公开的CDR也可包括在dAb中。
在一些实施方案中，一个或多个来自所公开抗体(如N6、N17或F8抗体)的重和/或轻链互补决定区(CDR)表达在另一蛋白质如支架蛋白的表面。抗体的结构域在支架蛋白表面的表达在本领域是已知的(参见例如Liu等,J.Virology 85(17):8467-8476,2011)。此种表达生成了保留对gp120的结合的嵌合蛋白。在一些特异实施方案中，将重链CDR的一个或多个接枝到支架蛋白上，如重链CDR1、CDR2和/或CDR3的一个或多个。一个或多个CDR也可包括在双抗体或另一种类型的单链抗体分子中。
(e)结合gp120上的N6、N17或F8表位的额外抗体
还包括结合与gp120上N6、N17或F8抗体结合的表位相同的表位的抗体。与此表位结合的抗体可基于其在gp120结合测定中与本文提供的N6、N17或F8抗体(如实施例中描述的那些)交叉竞争的能力(例如以统计学上有显著的方式竞争性抑制结合)来鉴定。当N6、N17或F8抗体与gp120的结合被竞争抗体抑制超过50％时，在高于106x Kd竞争抗体浓度存在时，抗体“竞争”结合。在某个实施方案中，与gp120上N6、N17或F8抗体结合的表位相同的表位结合的抗体是人单克隆抗体。可制备和分离此种人单克隆抗体，如本文所述。
与gp120上N6、N17或F8抗体结合的表位相同的表位结合的人抗体可采用本领域已知的各种技术生成。一般地，人抗体在van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。此种抗体可通过例如将免疫原施用于已经修饰的转基因动物来制备应答抗原攻击的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此种动物通常含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座，其代替内源性免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在此种转基因鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于从转基因动物中获得人抗体的方法的评述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，描述了XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429描述了技术；美国专利号7,041,870描述了K-M技术和美国专利申请公开号US 2007/0061900，描述了技术。例如通过与不同的人恒定区组合，进一步修饰来自由此种动物产生的完整抗体的人可变区。
与gp120上N6、N17或F8抗体结合的表位相同的表位结合的人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和鼠-人异种骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)。)在Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中还公开了经由人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。额外方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的方法。在Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中也描述了人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)。也可通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体。然后，此种可变结构域序列可与所需的人恒定结构域组合。
也可通过筛选具有所需结合特征的抗体的组合文库来分离与N6、N17或F8特异性结合gp120上相同表位的抗体和抗原结合片段。例如，本领域已知用于生成噬菌体展示文库并筛选此种具有所需结合特征的抗体的文库的各种方法。此种方法在下面文献中有评述，例如在Hoogenboom等in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)，并进一步在下面文献中描述，例如在theMcCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,in Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的库集(repertoires)通过聚合酶链反应(PCR)单独地克隆并在噬菌体文库中随机重组，然后筛选如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述的抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示出作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段的抗体片段。免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体而不需要构建杂交瘤。或者，首次用于实验的库集(例如人的)可被克隆以将单一来源的抗体提供给大范围的非自体抗原和自体抗原而不需要任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，首次用于实验的文库也可通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段和用含有随机序列的PCR引物编码高变CDR3区并完成体外重排来合成制得，如Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
(f)抗体变体的另外描述
在一些实施方案中，预期本文所提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将合适的修饰引入到编码抗体的核苷酸序列或者通过肽合成来制备。此种修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或***和/或取代。可进行缺失、***和取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目的位点包括CDR和框架区。可将氨基酸取代引入到目的抗体和针对所需活性(例如保留的/改善的抗原结合、增加的HIV-1中和宽度或效价、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选的产物。
变体通常保留了正确折叠及VH和VL区之间稳定所需的氨基酸残基并保留了所述残基的电荷特征以保存分子的低pI和低毒性。在一些实施方案中，可在VH和VL区进行氨基酸取代以增加产量。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、3或5之一所示VH氨基酸序列相比，抗体的VH可包括最多10个(如最多1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个或最多9个)氨基酸取代(如保守性氨基酸取代)，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2、4或6之一所示VL氨基酸序列相比，抗体的VL可包括最多10个(如最多1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个或最多9个)氨基酸取代(如保守性氨基酸取代)，并且特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，与已知框架区相比或与N6、N17或F8抗体的框架区相比，抗体或抗原结合片段在抗体的VH的框架区或抗体的VL框架区内可包括最多10个(如最多1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个或最多9个)氨基酸取代(如保守性氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，与N6、N17或F8抗体(例如表1中所示)之一的相应天然CDR序列相比，抗体或抗原结合片段在HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3内可包括最多10个氨基酸取代(如保守性氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。
在一些实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:1和2所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，总体来说，抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列可共同包括最多10个氨基酸取代(如最多8个、最多6个、最多5个、最多4个或最多2个氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些这种实施方案呢中，与包括分别如SEQ ID NO:1和2所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，抗体或抗原结合片段在每个CDR内可包括不超过一个的氨基酸取代，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和104所示的VH和VL的抗体的相应CDR序列相比，总体来说，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列可共同包括最多10个氨基酸取代(如最多8个、最多6个、最多5个、最多4个或最多2个氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些这种实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和104所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，所述抗体或抗原结合片段在每个CDR内可包括不超过一个的氨基酸取代，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和106所示的VH和VL的抗体的相应CDR序列相比，总体来说，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列可共同包括最多10个氨基酸取代(如最多8个、最多6个、最多5个、最多4个或最多2个氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些这种实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和106所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，所述抗体或抗原结合片段在每个CDR内可包括不超过一个的氨基酸取代，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和106所示的VH和VL的抗体的相应CDR序列相比，总体来说，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列可共同包括最多10个氨基酸取代(如最多8个、最多6个、最多5个、最多4个或最多2个氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些这种实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和108所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，所述抗体或抗原结合片段在每个CDR内可包括不超过一个的氨基酸取代，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和106所示的VH和VL的抗体的相应CDR序列相比，总体来说，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列可共同包括最多10个氨基酸取代(如最多8个、最多6个、最多5个、最多4个或最多2个氨基酸取代)，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些这种实施方案中，与包括分别如SEQ ID NO:114和110所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，所述抗体或抗原结合片段在每个CDR内可包括不超过一个的氨基酸取代，并且可特异性结合gp120并中和HIV-1。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代。
在某些实施方案中，在一个或多个CDR内可发生取代、***或缺失，只要这种改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在CDR内进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。在上述提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR不被改变，或含有不超过1个、2个或3个的氨基酸取代。
为增加抗体的结合亲和力，VL和VH区段可被随机突变，例如在HCDR3区或LCDR3区内，在类似于天然免疫应答期间负责抗体亲和力成熟的体内体细胞突变过程中。因此，可通过利用分别与HCDR3或LCDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区来完成体外亲和力成熟。在这个过程中，引物已经在某些位置被4个核苷酸碱基的随机混合物“spiked”以使生成的PCR产物编码VH和VL区段，其中随机突变已经导入到VH和/或VL CDR3区内。可测试这些随机突变的VH和VL区段以确定对gp120的结合亲和力。在特定示例中，VH氨基酸序列是SEQ ID NO：1、3或5之一。在其他示例中，VL氨基酸序列是SEQ ID NO：2、4或6之一。用于体外亲和力成熟的方法是已知的(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)),and Hoogenboom等.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等,Human Press,Totowa,N.J.,(2001))。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段被改变以增加或降低该抗体或抗原结合片段糖基化的程度。通过改变氨基酸序列来方便地完成糖基化位点的添加或缺失，从而生成或移除一个或多个糖基化位点。
在抗体包括Fc区时，可改变附着其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包括支链的二天线型的寡糖，该寡糖一般通过N-键附着到Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及附着在二天线型寡糖结构的“主干”内的GlcNAc上的海藻糖。在一些实施方案中，可对抗体中的寡糖修饰以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有缺少(直接或间接)附着在Fc区的海藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此种抗体中海藻糖的量可从1％至80％、从1％至65％、从5％至65％或从20％至40％。相对于用例如WO 2008/077546中描述的MALDI-TOF质谱分析法测得的附着于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂种和高甘露糖结构)的总和，通过计算Asn297处糖链内的海藻糖的平均量来确定海藻糖的量。Asn297是指位于Fc区内大约位置297处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体内的微小序列变化，Asn297也可位于位置297的大约±3个氨基酸上游或下游，即在位置294与300之间。此种岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利申请US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化的”或“海藻糖缺乏的”抗体变体有关的公开示例包括US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的示例包括Lec13CHO蛋白质岩藻糖基化缺陷细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等，特别是实施例11)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
抗体变体进一步地具有平分的寡糖，例如其中附着于抗体的Fc区的二天线型寡糖被GlcNAc平分。此种抗体变体可具有降低的岩藻糖基化作用和/或改善的ADCC功能。例如，在WO 2003/011878(Jean-Mairet等)、美国专利号6,602,684(Umana等)和US 2005/0123546(Umana等)中描述了此种抗体变体的示例。还提供了在附着于Fc区的寡糖内具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此种抗体变体可具有改善的CDC功能。例如，在WO 1997/30087(Patel等)、WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述了此种抗体变体。
在若干实施方案中，抗体的恒定区包括一个或多个氨基酸取代以优化抗体的体内半衰期。由新生儿Fc受体(FcRn)调节IgG Ab的血清半衰期。因此，在若干实施方案中，抗体包括增加与FcRn结合的氨基酸取代。若干此种取代对本领域的普通技术人员来说是已知的，如在IgG恒定区的取代T250Q和M428L(参见例如Hinton等,J Immunol.,176:346-356,2006)、M428L和N434S(“LS”突变,参见例如Zalevsky等.,Nature Biotechnology,28:157-159,2010)、N434A(参见例如Petkova等,Int.Immunol.,18:1759-1769,2006)、T307A、E380A和N434A(参见例如Petkova等,Int.Immunol.,18:1759-1769,2006)以及M252Y、S254T和T256E(参见例如Dall’Acqua等,J.Biol.Chem.,281:23514-23524,2006)。所公开的抗体和抗原结合片段可与包括上述列出的取代任一的Fc多肽连接，例如所述Fc多肽可包括M428L和N434S取代。
在一些实施方案中，抗体的恒定区包括一个或多个氨基酸取代以优化抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC主要由一组密切相关的Fcγ受体来介导。在一些实施方案中，抗体包括增加与FcγRIIIa的结合的一个或多个氨基酸取代。若干此种取代对本领域的普通技术人员来说是已知的，如在IgG恒定区的取代S239D和I332E(参见例如Lazar等.,Proc.Natl.,Acad.Sci.U.S.A.,103:4005-4010,2006))以及S239D、A330L和I332E(参见例如Lazar等.,Proc.Natl.,Acad.Sci.U.S.A.,103:4005-4010,2006)。
还包括上述取代的组合以产生与FcRn和FcγRIIIa的结合增加的IgG恒定区。这些组合增加了抗体半衰期和ADCC。例如，此种组合包括在Fc区内具有以下氨基酸取代的抗体：(1)S239D/I332E和T250Q/M428L；(2)S239D/I332E和M428L/N434S；(3)S239D/I332E和N434A；(4)S239D/I332E和T307A/E380A/N434A；(5)S239D/I332E和M252Y/S254T/T256E；(6)S239D/A330L/I332E和250Q/M428L；(7)S239D/A330L/I332E和M428L/N434S；(8)S239D/A330L/I332E和N434A；(9)S239D/A330L/I332E和T307A/E380A/N434A；或(10)S239D/A330L/I332E和M252Y/S254T/T256E。在一些实例中，修饰抗体或其抗原结合片段以使其对感染的细胞有直接的细胞毒性，或者使用天然防御如补体、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或巨噬细胞的吞噬作用。
在某些实施方案中，本文提供的抗体可被进一步修饰以含有本领域已知且易获得的额外的非蛋白部分。适用于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性多聚体。水溶性多聚体的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造方面有优势。聚合物可具有任意分子量，并且可以是支链的或非支链的。附着于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果多于一个的聚合物附着，则它们可以是相同或不同的分子。一般，用于衍生的聚合物的数目和/或类型可以根据某些考虑来确定，包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否会在限定条件的情况下用于治疗等。
抗体或抗原结合片段可被衍生化或连接另一分子(如另一肽或蛋白质)。一般地，抗体或抗原结合片段被衍生以使与gp120的结合不会受到衍生或标记的不利影响。例如，抗体或抗原结合片段可功能化地(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它)与一个或多个其他分子实体连接，如另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、可检测标记、效应分子或能介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)的结合的蛋白或肽。
·B缀合物
采用本领域技术人员已知的任何数目的方式，特异性结合gp120上的表位的抗体和抗原结合片段可与物质如效应分子或可检测标记缀合。可以使用共价和非共价附着方式。本领域的技术人员将认识到可以使用各种效应分子和可检测标记，包括(但不限于)毒素和放射性物质如125I、32P、14C、3H和35S以及其它标记物、靶部分和配体等。特定的效应分子或可检测标记的选择取决于特定的靶分子或细胞以及所需的生物学效应。
特定的效应分子或可检测标记的选择取决于特定的靶分子或细胞以及所需的生物学效应。因此，例如，效应分子可以是用于使特定靶细胞(如HIV-1感染细胞)死亡的细胞毒素。在其他实施方案中，效应分子可以是细胞因子，如IL-15；例如可用包括细胞因子的缀合物来局部刺激免疫细胞。
将效应分子或可检测标记附着于抗体或抗原结合片段的过程根据效应分子的化学结构而变化。多肽通常包含多种官能团，如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)，它们可用于与多肽上合适的官能团反应以使效应分子或可检测标记结合。或者，抗体或抗原结合片段被衍生以暴露或附着另外的反应性官能团。衍生可包括附着许多已知接头分子如从Pierce Chemical Company,Rockford,IL中获得的那些。接头可以是用于将抗体或抗原结合片段与效应分子或可检测标记连接的任意分子。接头能够与抗体或抗原结合片段以及与效益分子或可检测标记形成共价键。合适的接头对本领域的技术人员来说是已知的并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。如果抗体或抗原结合片段以及效应分子或可检测标记为多肽，接头则可通过其侧基连接组成氨基酸(如通过二硫键连接至半胱氨酸)或与末端氨基酸的α碳氨基或羧基连接。
鉴于已经报道的用于将各种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标志物(如酶或荧光分子)、毒素以其他物质附着于抗体的众多方法，本领域技术人员能够确定用于将给定物质附着于抗体或抗原结合片段或其他多肽的合适方法。例如，抗体或抗原结合片段可与效应分子缀合，如小分子量药物，如Monomethyl Auristatin E(MMAE)、MonomethylAuristatin F(MMAF)、美坦辛、美坦辛衍生物，包括称为DM1的美坦辛的衍生物(也称为mertansine)，或其他形成抗体药物缀合物(ADC)的物质。在若干实施方案中，提供了抗体或抗原结合片段与一个或多个小分子毒素如卡奇霉素、maytansinoids、多拉司他汀、auristatins、单端孢霉烯类和CC1065的缀合物以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
抗体或抗原结合片段可与可检测标记缀合；例如，能够被ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜检查或诊断成像技术(如计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层成像(CAT)扫描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像(NMRI)、磁共振断层成像(MTR)、超声、光纤检查和腹腔镜检查)检测的可检测标记。可检测标记的具体非限制性示例包括荧光团、化学发光剂、酶连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素、荧光素异氰酸酯、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。可也使用生物发光标记，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可与用于检测的酶缀合，如辣根过氧化酶、β-半乳糖甘酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测酶缀合时，其可通过添加另外的试剂来检测，酶使用该试剂产生可被识别的反应产物。例如，当存在辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺会导致视觉上可检测的有色反应产物生成。抗体或抗原结合片段也可与生物素缀合，并通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量来检测。应注意的是抗生物素本身可与酶或荧光标记缀合。
抗体或抗原结合片段可与顺磁物质如钆缀合。顺磁物质如超顺磁氧化铁可用作标志物。抗体也可与镧系元素(如铕和镝)和锰缀合。抗体或抗原结合片段也可用由次级报道分子(如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定多肽表位标记。
抗体或抗原结合片段也可与放射性标记的氨基酸缀合。放射性标记物可用于诊断和治疗目的。例如，可用放射性标记物通过x射线、放射光谱或其他诊断技术来检测gp120和表达gp120的细胞。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下放射性同位素或发射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
检测此种可检测标记的方式对本领域技术人员来说是已知的。因此，例如，可用摄影胶片或闪烁记数器来检测放射性标记，可用光电探测器来检测荧光标记以检测发射的光照。酶标记通常通过向酶提供底物并检测酶在底物上作用产生的反应产物来检测，而比色标记则通过简单地目测有色标记来检测。
缀合物中每抗体或抗原结合片段的效应分子或可检测标记部分的平均数目的范围例如是每抗体或抗原结合片段1至20个部分。在某些实施方案中，每抗体或抗原结合片段的效应分子或可检测标记部分的平均数目的范围是大约1至大约2、大约1至大约3、大约1至大约8；大约2至大约6；大约3至大约5；或大约3至大约4。缀合物的荷载(例如效应分子/抗体比)可以用不同的方式控制，例如通过(i)限制效应分子-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修饰的还原条件，(iv)用重组技术改造抗体的氨基酸序列从而修饰半胱氨酸残基的数目和位置以控制接头-效应分子附着的数目或位置。
·C嵌合抗原受体(CAR)
本文还公开了嵌合抗原受体(CAR)，其是人工构建的嵌合蛋白，包括特异性结合gp120、与跨膜结构域连接、与一个或多个胞内T细胞信号转导结构域连接的胞外抗原结合结构域(例如单链可变片段(scFv))。所公开的CAR的特征包括其以非MHC限制方式向gp120表达细胞重定向T细胞特异性和反应性的能力。非MHC限制gp120识别赋予表达所公开的CAR的T细胞不依赖于抗原加工来识别抗原的能力。
胞内T细胞信号转导结构域可包括例如T细胞受体信号转导结构域、T细胞共刺激信号转导结构域，或者两者。T细胞受体信号转导结构域是指包含T细胞受体的胞内结构域的CAR的一部分，如CD3ζ蛋白的胞内部分。共刺激信号转导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分，所述共刺激分子是细胞表面分子，不是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的抗原受体或其配体。
1.胞外区
若干实施方案提供了包括如本文所公开的特异性结合gp120的抗原结合结构域的CAR(参见例如II.A部分)。例如，抗原结合结构域可以是包括II.A部分中公开的抗体或其抗原结合片段的任一的VH和VL的scFv。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可包括VH和VL，所述VH和VL分别包括N6、N17或F8抗体之一的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如如表1所示)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括VH和VL，所述VH和VL包括分别如SEQ IDNO：1和2、分别如SEQ ID NO：3和4、或分别如SEQ ID NO：5和6所示的氨基酸序列。在若干实施方案中，抗原结合结构域可以是scFv。在一些实施方案中，scFv包括由肽接头联接的VH和VL，如包括GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:25)所示的氨基酸序列的接头。
CAR可包括信号肽序列，例如抗原结合结构域的N末端。信号肽序列可包括任何合适的信号肽序列。在一个实施方案中，信号肽序列是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体序列，如包括或由LLVTSLLLCELPHPAFLLIPDT SEQ ID NO:26组成的氨基酸序列。虽然信号肽序列可促进CAR在细胞表面的表达，但表达的CAR中信号肽序列的存在对CAR功能的发挥不是必需的。一旦CAR在细胞表面表达，信号肽序列可从CAR中切掉。因此，在一些实施方案中，CAR缺少信号肽序列。
在CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，存在间隔区结构域，其包括多肽序列。间隔区结构域可包括最多300个氨基酸，优选10-100个氨基酸以及最优选25-50个氨基酸。在一些实施方案中，间隔区结构域可包括免疫球蛋白结构域，如人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白CH2和CH3免疫球蛋白G(IgG1)结构域序列(CH2CH3)。在这方面，间隔区结构域可包括包含或由SEQ ID NO:27:EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK所示的氨基酸序列组成的免疫球蛋白结构域。不受特定理论的束缚，认为CH2CH3结构域使CAR的抗原结合结构域远离CAR表达细胞的膜延伸并可更准确地模拟天然TCR的大小和结构域结构。
2.跨膜结构域
关于跨膜结构域，将CAR设计为包含与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR的结构域之一自然结合的跨膜结构域。
跨膜结构域可以衍生自天然或衍生自合成来源。如果来源是天然的，那么结构域可衍生自任意膜结合蛋白或跨膜蛋白。用于所公开的CAR中的示例性跨膜结构域可至少包括T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD154的跨膜区。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种状况下，它主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在若干实施方案中，在合成的跨膜结构域的每个末端都会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，优选长度在2-10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头，可在CAR的跨膜结构域与胞内T细胞信号转导结构域和/或T细胞共刺激结构域之间形成连接。示例性的接头序列包括一个或多个甘氨酸-丝氨酸双联体。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含T细胞受体的跨膜结构域，如CD8跨膜结构域。因此，CAR可包括包含或由SEQ ID NO:28:
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC组成的CD8跨膜结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含T细胞共刺激分子如CD137或CD28的跨膜结构域。因此，CAR可包括包含或由SEQ ID NO:29:
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR组成的CD28跨膜结构域。
3.胞内区
CAR的胞内区包括负责激活T细胞正常效应功能中至少一个功能的一个或多个胞内T细胞信号转导结构域，其中CAR表达在或位于T细胞内。本文提供了示例性T细胞信号转导结构域，并且其对本领域技术人员来说是已知的。
虽然在CAR中可以使用整个胞内T细胞信号转导结构域，但是在许多情况下，没有必要使用整个链。在某种程度上可使用胞内T细胞信号转导结构域的截短部分。可以使用此截短部分来替代完整链，只要其能转导相关的T细胞效应功能信号即可。
用于CAR中的胞内T细胞信号转导结构域的示例包括T细胞受体(TCR)的胞质序列和在抗原受体参与之后协同起作用以发起信号转导的共刺激分子以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性的任何合成序列。
T细胞信号转导结构域以刺激方式或抑制方式调控T细胞受体复合物的主要激活作用。所公开的CAR可包括以刺激方式起作用的主要胞质信号转导序列，所述信号转导序列可含有称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号转导基序。含有可包括在所公开的CAR中的主要胞质信号转导序列的ITAM的示例包括来自CD3包、FcR包、FcR包、CD3包、CD3包、CD3包、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d蛋白的那些。在若干实施方案中，CAR中的胞质信号转导分子包括来自CD3号的胞内T细胞信号转导结构域。
CAR的胞内区可包括ITAM，所述ITAM自身含有主要胞质信号转导结构域(如CD3-转)或与在CAR背景下使用的任何其他所需的胞质结构域组合。例如，CAR的胞质结构域可包括CD3可链部分和胞内共刺激信号转导结构域。共刺激信号转导结构域是指CAR的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是细胞表面分子，不是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的抗原受体或其配体。此种分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3。可包括在所公开的CAR中的信号转导结构域的另外示例为肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18；也称为糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白，GITR)信号转导结构域。
在一些实施方案中，CAR可包括CD3ζ信号转导结构域、CD8信号转导结构域、CD28信号转导结构域、CD137信号转导结构域或其两个或多个的组合。在一个实施方案中，胞质结构域包括CD3-ζ的信号转导结构域和CD28的信号转导结构域。在另一个实施方案中，胞质结构域包括CD3-ζ的信号转导结构域和CD137的信号转导结构域。在另一个实施方案中，胞质结构域包括CD3-ζ的信号转导结构域和CD28与CD137的信号转导结构域。可根据本领域技术人员的需求来改变CAR上的一个或多个T细胞信号转导结构域的顺序。
提供了此种T细胞信号转导结构域的示例氨基酸序列。例如，CD3-ζ信号转导结构域可包括或由SEQ ID NO:30(RVKFSRSADAPAYQQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)所示的氨基酸序列组成，CD8信号转导结构域可包括或由SEQ ID NO:31(FV PVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR)所示的氨基酸序列组成，CD28信号转导结构域可包括或由SEQ ID NO:32(FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR)所示的氨基酸序列组成，CD137信号转导结构域可包括或由SEQ ID NO:33(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEE EEGGCEL)或SEQ ID NO:34(RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)所示的氨基酸序列组成。
本发明CAR的胞质信号转导部分内的胞质信号转导序列可以随机或指定顺序彼此连接。任选地，优选长度在2-10个氨基酸之间的短多肽接头可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。进一步地，在CAR的信号转导结构域与跨膜结构域之间，存在间隔区结构域，其包括多肽序列。间隔区结构域可包含最多300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，最优选25-50个氨基酸。
4.CAR的额外描述
还提供了本文描述的CAR的功能部分。当提及CAR时使用的术语“功能部分”是指CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留了CAR(亲本CAR)(所述功能部分是其的一部分)的生物学活性。功能部分涵盖例如保留了在与亲本CAR相似、相同或更高程度上识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的CAR的那些部分。参考亲本CAR，所述功能部分可包含例如大约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的亲本CAR。
CAR或其功能部分在氨基末端或羧基末端或二者末端可包括额外氨基酸，其中额外氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中未发现。需要的是，额外氨基酸不干扰CAR或功能部分的生物学功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更需要的是，与亲本CAR的生物学活性相比，额外氨基酸增强了生物学活性。
本文还提供了本文所述CAR的功能变体，其与亲本CAR有实质或显著的序列相同性或相似性，该功能变体保留了CAR(所述功能变体是其变体)的生物学活性。功能变体涵盖例如本文所述CAR(亲本CAR)的保留了在与亲本CAR相似、相同或更高程度上识别靶细胞的能力的那些变体。参考亲本CAR，功能变体可例如与亲本CAR的氨基酸序列有至少大约30％、大约50％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或更多的相同性。
功能变体可以例如包含具有至少一个保守行氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。可替换地或额外地，功能变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守性氨基酸取代不干扰或不抑制功能变体的生物学活性。与亲本CAR相比，非保守性氨基酸取代可增强功能变体的生物学活性以使功能变体的生物学活性增加。
CAR(包括功能部分和功能变体)可以是任何长度，即可包含任何数目的氨基酸，只要CAR(或其功能部分或功能变体)仍保留了它们的生物学活性，例如特异性结合抗原、检测哺乳动物中的病变细胞、或治疗或预防哺乳动物中的疾病的能力等。例如，CAR的长度可以是大约50至大约5000个氨基酸长，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多氨基酸。
CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸以替代一个或多个天然存在的氨基酸。此种合成氨基酸在本领是已知的且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α氨基酸n-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基丙氨酸、α氨萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸，N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α基氨基环戊烷羧酸、α烷氨基环己烷羧酸、oc-氨基环庚烷羧酸、-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、γ酸二氨基丁酸、α氨基丁二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α氨叔丁甘氨酸。
CAR(包括功能部分和功能变体)可被糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过例如二硫键的环化、或被转化为酸加成盐和/或任选地被二聚化或多聚化，或被缀合。
生成嵌合抗原受体、包括该受体的T细胞的方法及其用途(例如癌症治疗)在本领域是已知的且进一步地在本文描述(参见例如Brentjens等,2010,Molecular Therapy,18:4,666-668；Morgan等,2010,Molecular Therapy,published online February 23,2010,pages 1-9；Till等,2008,Blood,1 12:2261-2271；Park等,Trends Biotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Han等,J.Hematol Oncol.,6:47,2013；PCT公开WO2012/079000,WO2013/126726；和美国公开2012/0213783，每篇文献通过引用全文并入本文)。例如，编码所公开的嵌合抗原结合受体的核酸分子可包括在用于在宿主细胞如T细胞中进行表达的表达载体(如慢病毒载体)内，以制得所公开的CAR。在一些实施方案中，使用嵌合抗原受体的方法包括将T细胞自对象分离，用编码嵌合抗原受体的表达载体(如慢病毒载体)转化T细胞并向对象施用表达嵌合抗原受体的工程化T细胞用于治疗，例如治疗对象中的肿瘤。
D.多核苷酸和表达
提供了编码特异性结合gp120的抗体、抗原结合片段、CAR和缀合物的氨基酸序列的核酸分子(例如cDNA分子)。本领域的技术人员采用本文提供的氨基酸序列(如CDR序列和VH和VL序列)、本领可得的序列(如框架区或恒定区序列)和遗传密码可容易地生产编码这些分子的核酸。在若干实施方案中，核酸分子可编码所公开的抗体或抗原结合片段的VH、VL、或VH和VL二者(例如在双顺反子表达载体中)。在若干实施方案中，核酸分子可在宿主细胞(如哺乳动物细胞)中表达以产生所公开的抗体或抗原结合片段。
本领域技术人员可容易地使用遗传密码来构建各种功能上等效的核酸，如序列不同但可编码相同抗体序列或编码包括VL和/或VH核酸序列的缀合物或融合蛋白的核酸。
在非限制性示例中，分离的核酸分子编码所公开的抗体或抗原结合片段的VH并且包括SEQ ID NO:36、38或40任一所示核酸序列。在非限制性示例中，分离的核酸分子编码所公开的抗体或抗原结合片段的VL并且包括SEQ ID NO:37、39或41任一所示核酸序列。在非限制性示例中，分离的核酸分子编码所公开的抗体或抗原结合片段的VH和VL并且包括分别如SEQ ID NO:36和37、分别如SEQ ID NO：38和39、或分别如SEQ ID NO：40和41任一所示核酸序列。在非限制性示例中，分离的核酸分子编码所公开的抗体或抗原结合片段的VH和VL并且包括分别如SEQ ID NO:113和105、分别如SEQ ID NO：113和107、分别如SEQ ID NO：113和109、分别如SEQ ID NO：113和111、分别如SEQ ID NO：114和105、分别如SEQ ID NO：114和107、分别如SEQ ID NO：114和109、分别如SEQ ID NO：114和111任一所示核酸序列。
编码特异性结合gp120的抗体、抗原结合片段、CAR和缀合物的核酸序列可通过任何合适方法制得，包括例如克隆适当的序列或通过以下方法进行直接化学合成，如Narang等,Meth.Enzymol.68:90-99,1979的磷酸三酯法；Brown等.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979的磷酸二酯法；Beaucage等.,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981的二乙基亚磷酰胺法；Beaucage&Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用例如Needham-VanDevanter等.,Nucl.Acids Res.12:6159-6168,1984中描述的自动化合成仪；和美国专利号4,458,066的固体载体法。化学合成产生单链寡核苷酸。单链寡核苷酸可通过与互补序列的杂交或通过以单链为模板用DNA聚合酶聚合转化为双链DNA。
示例性的核酸可通过克隆技术制得。适当的克隆和测序技术的示例以及通过许多克隆练习充分指导技术人员的说明书是已知的(参见例如Sambrook等(MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012)和Ausubel等(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,throughsupplement 104,2013)。来自生物试剂和实验设备的生产商的产品信息还提供了有用信息。这些生产商包括SIGMA Chemical Company(Saint Louis,MO)、R&D Systems(Minneapolis,MN)、Pharmacia Amersham(Piscataway,NJ)、CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI)、GlenResearch,Inc.、GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD)、FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen(Carlsbad,CA)和Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及技术人员已知的许多其他商业化来源。
核酸还可通过扩增方法来制得。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增***(TAS)、自我持续序列复制***(3SR)。多种克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法对技术人员来说是熟知的。
在一些实施方案中，核酸分子编码如本文提供的用于在T细胞中进行表达的CAR以产生嵌合抗原受体T细胞。编码嵌合抗原结合受体的核酸分子可包括在用于在宿主细胞如T细胞中进行表达的载体(如慢病毒载体)内。示例性的细胞包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。生成编码嵌合抗原受体的核酸分子和包括此种受体的T细胞的方法在本领域是已知的(参见例如Brentjens等,2010,Molecular Therapy,18:4,666-668；Morgan等,2010,Molecular Therapy,published online February 23,2010,pages 1-9；Till等,2008,Blood,1 12:2261-2271；Park等,Trends Biotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Han等,J.Hematol Oncol.,6:47,2013；PCT公开WO2012/079000,WO2013/126726和美国公开2012/0213783，每篇文献通过引用全文并入本文)。
核酸分子可表达在重组工程化细胞内，如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。抗体、抗原结合片段和缀合物可表达为单个VH和/或VL链(根据需要与效应分子或可检测标记连接)，或可表达为融合蛋白。表达和纯化抗体和抗原结合片段的方法是已知的并且进一步在本文中描述(参见例如Al-Rubeai(ed),Antibody Expression and Production,Springer Press,2011)。免疫粘附素也可被表达。因此，在一些示例中，提供了编码VH和VL的核酸和免疫粘附素。核酸序列可任选地编码前导序列。
为生成scFv，编码VH和VL的DNA片段可与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段可操作地连接，以使VH和VL序列可表达为连续单链蛋白，具有通过柔性接头联接的VL和VH结构域(参见例如Bird等,Science 242:423-426,1988；Huston等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988；McCafferty等,Nature 348:552-554,1990；Kontermann and Dubel(Ed),Antibody Engineering,Vols.1-2,2nd Ed.,SpringerPress,2010；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,2nd,Cold SpringHarbor Laboratory,New York,2013)。任选地，切割位点，如弗林蛋白酶切割位点，可包括在接头中。
编码VH和/或VL的核酸任选地可编码Fc结构域(免疫粘附素)。Fc结构域可以是IgA、IgM或IgG Fc结构域。Fc结构域可以是如公开的美国专利申请号2010/093979(通过引用并入本文)中描述的优化的Fc结构域。在一个示例中，免疫粘附素为IgG1 Fc。
如果只使用单一VH和VL，则单链抗体可以是单价的，如果使用两个VH和VL，则是二价的，或如果使用两个以上的VH和VL，则是多价的。可生成特异性结合gp120和另一抗原(例如但不限于CD3)的双特异性或多价抗体。编码的VH和VL在VH和VL结构域之间任选地可包括弗林蛋白酶切割位点。
本领技术人员熟知许多可用于蛋白表达的表达***，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。
可通过DNA转移至合适宿主细胞对编码抗体、抗原结合片段、CAR或缀合物的一个或多个DNA序列进行体外表达。所述细胞可以是原核或真核的。该术语还包括对象宿主细胞的任何后代。应理解的是由于复制期间会可能发生突变，所以并不是所有后代都与亲本细胞相同。稳定转移即将外源DNA连续保持在宿主中的方法在本领域是已知的。本发明还涵盖了表达目的抗体的杂交瘤。
可通过可操作地将DNA或cDNA与启动子(其是组成型或可诱导型的)连接，然后掺入表达盒中来实现对编码本文所述的抗体和抗原结合片段的核酸的表达。启动子可以是任意目的启动子，包括巨细胞病毒启动子和人T细胞亲淋巴病毒启动子(HTLV)-1。任选地，增强子如巨细胞病毒增强子包括在构建体内。表达盒适用于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达盒包含用于调节编码蛋白的DNA的表达的特异序列。例如，表达盒可包括合适的启动子、增强子、转录和翻译终止子、起始序列、蛋白编码基因前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持基因的正确读框以允许mRNA正确翻译的序列和终止密码子。载体可编码可选择标记，如编码药物抗性(例如氨苄青霉素或四环素抗性)的标记。
为获得高水平表达的克隆基因，需要构建表达盒，所述表达盒最低限度包含指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点(内部核糖体结合序列)和转录/翻译终止子。对于大肠杆菌，其可包括启动子如T7、trp、lac或λ启动子，核糖体结合位点以及优选地包含转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可包括衍生自例如免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒的启动子和/或增强子以及聚腺苷酸化序列，并且可进一步包括剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。通过众所周知的方法如大肠杆菌转化或电穿孔和磷酸钙处理、哺乳动物细胞电穿孔或脂质转染可将表达盒转移至选择的宿主细胞中。根据由表达盒内包含的基因如amp、gpt、neo和hyp基因所赋予的抗生素抗性来选择被表达盒转化的细胞。
当宿主为真核细胞时，可以使用DNA转染方法，如磷酸钙共沉淀、传统的机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包裹的质粒的***、或病毒载体。也可以用编码抗体、标记抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列和编码可选择表型如单纯性疱疹胸苷激酶基因的第二外源DNA分子共转化真核细胞。另一方法是使用真核病毒载体，如猴病毒40(SV40)或牛***瘤病毒，瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白(参见例如Viral Expression Vectors,Springer press,Muzyczka ed.,2011)。本领域技术人员可容易地使用表达***，如在包括高等真核细胞如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系的细胞内蛋白生产中使用的质粒和载体。
为生产重组CAR，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单个核细胞(PBMC)，或T细胞。T细胞可以是任意T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat,SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果是从哺乳动物获得的，T细胞可从包括但不限于血液、骨髓、***、胸腺，或其他组织或体液的多种来源获得。T细胞可富集或纯化。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以是处于任何发育阶段的，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞，例如Th1和Th2细胞，CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
还提供了细胞群，包含至少一种本文所述的宿主细胞。细胞群可以是异质群，除至少一种其他细胞(例如不含有所述重组表达载体任何一种的宿主细胞(例如T细胞)或者除不是T细胞的细胞例如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等)之外，包括包含任意所述重组表达载体的宿主细胞。或者，细胞群可以是基本上同质群，其中所述群主要包括(例如基本上组成为)含有所述重组表达载体的宿主细胞。细胞群还可以是克隆细胞群，其中群的所有细胞都是含有重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，从而群的所有细胞都包括所述重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群为包括含有本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群。
可对编码本文所述多肽的核酸进行修饰，但不降低其生物学活性。可进行一些修饰以便于克隆、表达或将靶分子掺入融合蛋白。此种修饰对本领域技术人员来说是已知的并且包括例如终止密码子、添加于氨基末端以提供起始位点的甲硫氨酸、位于任一末端以产生位置便利的限制位点的额外氨基酸或辅助纯化步骤的额外氨基酸(如聚组氨酸)。除重组方法之外，还可采用本领域众所周知的标准肽合成法完整或部分构建本发明的免疫缀合物、效应部分和抗体。
一旦表达，就可根据包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等本领域标准程序来纯化抗体、抗原结合片段和缀合物(参见，一般地，Simpson ed.,Basic methods in ProteinPurification and Analysis:A laboratory Manual,Cold Harbor Press,2008)。抗体、抗原结合片段和缀合物不需要是100％纯。一旦纯化，部分或纯化至均质是所需的，如果用于治疗，多肽应基本上无内毒素。
已经描述了从哺乳动物细胞和细菌如大肠杆菌表达抗体、抗原结合片段、和缀合物、和/或再折叠至适当活性形式的方法，所述方法是已知的且适用于本文所公开的抗体。参见例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,2nd,Cold Spring HarborLaboratory,New York,2013,Simpson ed.,Basic methods in Protein Purificationand Analysis:A laboratory Manual,Cold Harbor Press,2008,和Ward等.,Nature 341:544,1989。
除重组方法之外，还可采用标准肽合成法完整或部分地构建抗体、抗原结合片段和/或缀合物。可通过将序列的C末端氨基酸附着于不溶支持物、随后在序列中顺序添加剩余的氨基酸来完成多肽的固相合成。固相合成技术由以下文献描述：Barany&Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2:Special Methods in PeptideSynthesis,Part A.pp.3-284；Merrifield等,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156,1963,andStewart等.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.,1984。通过将较短片段的氨基和羧基末端缩合来合成较长的蛋白。通过激活羧基末端(如通过采用偶联剂N,N’-二环己基碳二亚胺)来形成肽键的方法在本领域是已知的。
E.方法和组成
1.治疗方法
本文公开了预防或治疗HIV-1感染的方法。预防可包括抑制HIV-1感染。所述方法包括将细胞与治疗有效量的所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR或表达特异性结合gp120的CAR的T细胞或编码这种抗体、抗原结合片段、缀合物或CAR的核酸接触。所述方法还可包括向对象施用治疗有效量的所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR或表达特异性结合gp120的CAR的T细胞或编码这种抗体、抗原结合片段、缀合物或CAR的核酸。在一些实例中，在暴露前可使用所述抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或核酸分子(例如以预防或抑制HIV-1感染)。在一些实例中，可在暴露后预防中使用所述抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或核酸分子。在一些实例中，可使用所述抗体、抗原结合片段、缀合物或核酸分子以清除或减少对象中HIV-1病毒储主(viral reservoir)。例如，可向患有HIV-1的对象如采用抗病毒疗法进行治疗的对象施用治疗有效量的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或核酸分子。在一些示例中，修饰所述抗体、抗原结合片段、缀合物或核酸分子以使对感染的细胞直接产生细胞毒性(例如通过缀合至毒素)，或采用自然防御，如补体、抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或巨噬细胞的吞噬作用。
有效方法不需要完全清除HIV-1感染。例如，与未经治疗的HIV-1感染相比，一种方法可使HIV-1感染降低期望的量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％(清除可检测的HIV-1感染细胞)。在一些实施方案中，细胞还可与治疗有效量的额外物质如抗病毒剂接触。细胞可以是体内的或体外的。该方法可包括施用本领域已知的一种或多种额外物质。在额外实施方案中，通过相似方法减少或抑制HIV-1复制。有效方法不需要完全清除HIV-1复制。例如，与未经治疗的HIV-1复制相比，一种方法可使HIV-1复制降低所需的量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％(清除可检测的HIV-1)。
在一个实施方案中，所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或核酸分子的施用导致减少HIV-1感染和/或减缓对象中随后的HIV-1疾病发展。HIV-1感染的减少和/或对象中随后的HIV-1疾病发展的减缓包含任何统计学上HIV-1活性的显著降低。在一些实施方案中，描述了用于治疗患有HIV-1感染的对象的方法。这些方法包括向对象施用治疗有效量的所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或核酸分子，从而预防或治疗HIV-1感染。
研究已显示在向妊娠和分娩期间的HIV-1感染的女性和出生后的后代施用齐多夫定时，HIV-1母婴传播率显著降低(Connor等,1994Pediatr Infect Dis J 14:536-541)。HIV-1母婴传播的若干研究表明分娩时母体病毒载量与HIV-1传播至孩子的风险之间的关联。本发明提供了用于降低HIV母婴传播的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞和核酸分子。因此，在一些实例中，施用治疗有效量的gp120特异性抗体或其抗原结合片段或编码此抗体或抗体抗原结合片段的核酸以预防HIV-1母婴传播或降低HIV-1母婴传播的风险。在一些实例中，向母亲和/或刚出生的孩子施用治疗有效量的所述抗体或抗原结合片段或编码此抗体或抗原结合片段的核酸。在其他实例中，在母乳喂养前，向母亲和/或婴儿施用治疗有效量的所述抗体、抗原结合片段或编码所述抗体或抗原结合片段的核酸以防止病毒传播至婴儿或降低病毒传播至婴儿的风险。在一些实施方案中，向母亲和/或婴儿施用治疗有效量的所述抗体、抗原结合片段或编码所述抗体或抗原结合片段的核酸和治疗有效量的另一药物如齐多夫定。
对于任何应用，所述抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或核酸分子可与抗逆转录病毒疗法组合。抗逆转录病毒药物根据所述药物抑制的逆转录病毒生命周期的阶段而广谱分类。所公开的抗体可与核苷类似物逆转录酶抑制剂(如齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦和阿普瑞西他滨)、核苷酸逆转酶抑制剂(如替诺福韦和阿德福韦)、非核苷逆转录酶抑制剂(如依法韦伦、奈韦拉平、地拉韦定、依曲韦林和利匹韦林)、蛋白酶抑制剂(如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、氨普那韦、洛匹那韦、膦沙那韦、阿扎那韦、替拉那韦和地瑞那韦)、进入或融合抑制剂(如马拉维若和恩夫韦肽)、成熟抑制剂(如bevirimat和vivecon)、或广谱抑制剂如天然抗病毒药联合施用。在一些实例中，公开的抗体或其活性片段或编码其的核酸与IL-15联合或与IL-15缀合施用。
研究已表明靶向gp120不同表位的HIV-1中和抗体的混合物可治疗长期感染SHIV的猕猴(Shingai et al.,Nature,503,277-280,2013；和Barouch等,Nature,503,224-228,2013)。因此，在一些实例中，向对象进一步施用结合HIV-1Env(例如结合gp120或gp41)并可以中和HIV-1的一种或多种额外抗体。可在施用本文公开的新型抗体(例如N6、N17或F8抗体)之前、期间或之后施用额外抗体。在一些实施方案中，额外抗体可以是特异性结合如下上的表位的抗体：HIV-1Env上的，如CD4结合位点(例如b12、3BNC117、VRC01或VRC07)、近膜端外区(例如10E8抗体)、V1/V2结构域(例如PG9抗体、CAP256-VRC26)或V3环(例如10-1074、PGT 121或PGT128抗体)、或结合gp120和gp41亚基二者的抗体(例如35O22、PGT151或8ANC195)。特异性结合这些区域并中和HIV-1感染的抗体对本领域普通技术人员来说是已知的。非限制性示例可见于例如PCT公开WO 2011/038290、WO/2013/086533、WO/2013/090644、WO/2012/158948中找到，这些文献通过引用全文并入本文。
在一些示例中，向对象施用编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA以提供体内抗体生成，例如采用对象的细胞机制。核酸构建体的免疫在本领域是众所周知的并且在例如美国专利5,643,578、美国专利5,593,972和美国专利5,817,637中教导了。美国专利5,880,103描述了几种输送编码核酸至生物体的方法。一种施用核酸的方法是直接施用质粒DNA，如用哺乳动物表达载体。编码所公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列可置于启动子的控制下以提高表达。该方法包括核酸的脂质体递送。此种方法可应用于由本领域普通技术人员进行的抗体或其抗原结合片段的生产。在一些实施方案中，采用pVRC8400载体在对象中表达公开的抗体或抗原结合片段(描述于Barouch等,J.Virol,79,8828-8834,2005，其通过引用并入本文)。
编码所公开的抗体(如N6抗体)或抗原结合片段的核酸分子可包括在病毒载体中，例如用于在宿主细胞或对象(如感染HIV-1或处于感染HIV-1风险的对象)中表达所述抗体或抗原结合片段。已经构建了许多用于表达所公开的抗体或抗原结合片段的病毒载体，如逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒(AAV)载体。在若干实施例中，病毒载体是可复制的。例如，病毒载体在病毒基因组中可具有突变以致在宿主细胞中不抑制病毒复制。病毒载体还可以具有条件复制能力。在其他实例中，病毒载体在宿主细胞中是复制缺陷型的。
在若干实施方案中，向对象(如患有HIV-1感染或处于HIV-1感染风险中的人对象)施用治疗有效量的包括编码公开的抗体或抗原结合片段(如N6抗体)的一种或多种核酸分子的腺伴随病毒(AAV)病毒载体。AAV病毒载体是针对表达编码公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子而设计的，向对象施用治疗有效量的AAV病毒载体导致在对象中表达治疗有效量的抗体或抗原结合片段。用于在对象中表达公开的抗体或抗原结合片段的AAV病毒载体的非限制性示例包括以下文献提供的那些：Johnson等(“Vector-mediated gene transferengenders long-lived neutralizing activity and protection against SIVinfection in monkeys,”Nat.Med.,15(8):901-906,2009)和Gardner等(“AAV-expressedeCD4-Ig provides durable protection from multiple SHIV challenges,”Nature,519(7541):87-91,2015)，每篇文献通过引用全文并入本文。
在一个实施方案中，将编码公开的抗体或其抗原结合片段的核酸直接引入细胞中。例如，核酸通过标准方法加载至金微球上并通过如Bio-Rad’s HELIOSTM Gene Gun的设备引入皮肤。核酸可以是“裸”的，并由在强启动子控制下的质粒组成。
通常，将DNA注射入肌肉中，尽管它也可直接注射入其他部位。注射的剂量一般为大约0.5μg/kg至大约50mg/kg，并且通常为大约0.005mg/kg至大约5mg/kg(参见例如美国专利5,589,466)。
2.剂量
gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子的治疗有效量将取决于疾病和/或感染的严重程度和患者健康的总体状态。治疗有效量是提供主观上症状减轻或如临床医生或其他有资质观察者注意到的客观上可鉴定的改善的量。gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子可与另一治疗剂联合施用，同时或依次施用。
依据患者所需的和所耐受的剂量和频率来单次或多次施用包括公开的gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子的组合物。包括gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子的组合物应提供足量的gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子中的至少一种以有效治疗患者。剂量可以是施用一次，但也可周期性地施用直到达到疗效或直到副作用使得治疗终止。在一个实例中，每隔一天灌注一剂抗体或抗原结合片段三十分钟。在该实例中，可施用大约1至大约10剂，如每隔一天施用3或6剂。在进一步的实例中，连续灌注大约5天至大约10天。对象可每隔一定时间如每月进行治疗，直到达到所需疗效。通常，剂量足以治疗或改善疾病症状或征候，但不产生对患者不可接受的毒性。
可使用得自细胞培养测定和动物研究的数据来制定用于人类的剂量范围。剂量通常处于包括ED50的几乎无毒性或最小毒性的循环浓度的范围内。剂量可依据采用的剂型和利用的施用途径在该范围内变化。由细胞培养测定和动物研究来确定治疗有效剂量。
在某些实施方案中，以从大约5或10nmol/kg至大约300nmol/kg或从大约20nmol/kg至大约200nm/kg的范围内的剂量，或大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量，或以大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg/kg的剂量，或大约1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg的剂量，或治疗医生认为合适的其他剂量来施用特异性结合gp120的抗体或抗原结合片段或其缀合物或编码这种分子的核酸分子或载体或包括这些分子的组合物。在一些实施方案中，可以大约0.5至大约40mg/kg，如大约1至大约30、大约1至大约20、大约1至大约15、大约1至大约10、大约1至大约5、大约1至大约3，大约0.5至大约40mg/kg，如大约0.5至大约30、大约0.5至大约20、大约0.5至大约15、大约0.5至大约10、大约0.5至5、大约0.5至3、大约3至大约7、大约8至大约12、大约15至大约25、大约18至大约22、大约28至大约32、大约10至大约20、大约5至大约15，或大约20至大约40mg/kg的剂量向对象施用抗体或抗原结合片段。可以根据本文所述的给药频率/施用频率包括来施用本文所述的剂量，包括但不限于每天、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月、每隔一月等。
在一些实施方案中，在一段时间内可通过静脉注射、皮下或另外方式每天或每周多次施用公开的治疗剂，之后是不治疗阶段，然后重复此循环。在一些实施方案中，治疗的初始阶段(例如每日或每周多次施用治疗剂)为3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在有关实施方案中，不治疗阶段持续3天、1周、2周、3周或4周。在某些实施方案中，治疗剂的给药方案是每天给药持续3天，接下来3天不给药；或每天给药或每周多次给药，持续1周，接下来3天或1周不给药；或每天给药或每周多次给药，持续2周，接下来1或2周不给药；或每天给药或每周多次给药，持续3周，接下来1、2或3周不给药；或每天给药或每周多次给药，持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接下来1、2、3或4周不给药。
3.施用模式
可以以多种方式向对象施用gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子或包括这些分子的组合物以及额外的物质，包括局部和全身施用，例如通过皮下注射、静脉注射、动脉注射、腹腔内注射、肌肉注射、皮内注射或鞘内注射。在一个实施方案中，治疗剂通过每天一次单一皮下、静脉、动脉、腹腔内、肌肉、皮内或鞘内注射施用。治疗剂也可通过直接注射在病灶处或病灶附近施用。
gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、或编码这些分子的核酸分子或包括这些分子的组合物也可以以微球、微囊、脂质体(不带电或带电(例如阳离子))、聚合微粒(例如聚酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液等的形式口服施用。
另一施用方法是通过渗透泵(如Alzet泵)或迷你泵(如Alzet迷你渗透泵)，该方法允许治疗剂或药物组合物在预定时间段内可控连续和/或缓释递送。渗透泵或迷你泵可皮下植入或在靶点附近植入。
对本领域技术人员来说明显的是，gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、或编码这些分子的核酸分子或包括这些分子的组合物也可通过其他模式施用。决定最有效的施用模式在本领域技术人员技术能力内。gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、或编码这些分子的核酸分子或包括这些分子的组合物可作为适合例如口服(包括口腔和舌下)、直肠、鼻、表面、肺、***或肠胃外(包括肌肉、动脉、鞘内、皮下和静脉)施用的药物制剂来施用，或以适合通过吸入或吹入施用的形式施用。根据施用的目标模式，药物制剂可以是固体、半固体或液体剂型形式，如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉剂、液体、悬浮剂、乳剂、膏剂、软膏剂、洗剂等。制剂可以适于单次施用精确剂量的单位剂型提供。制剂包括有效量的治疗剂，和一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂以及任选地包括一种或多种其他生物学活性剂。
4.组合物
提供了于载体中包括本文公开的gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子中的一种或多种的组合物。组合物用于例如治疗或检测HIV-1感染。组合物可以单位剂型制备以向对象施用。施用的量和时间以治疗医生的判断为准从而达到期望的目的。可配制gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子以用于全身或局部施用。在一个实例中，配制gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子以用于肠胃外施用，如静脉内施用。
在一些实施方案中，组合物包括抗体、抗原结合片段或其缀合物，纯度为至少70％(如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。在某些实施方案中，组合物含有少于10％(如少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％，或甚至更少)的大分子杂质，如其他哺乳动物(例如人)蛋白。
用于施用的组合物可包括溶解在药学上可接受的载体如水性载体中的gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子的溶液。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的且一般不含不需要的物质。这些组合物可通过常规熟知灭菌技术进行灭菌。组合物可含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钙等。这些制剂中的抗体浓度可广泛变化，并且根据选择的施用具体模式和对象的需求主要基于液体体积、粘度、体重等选择。
静脉内施用的典型组合物包括每对象每天大约0.01至大约30mg/kg的抗体或抗原结合片段或缀合物(或包括抗体或抗原结合片段的缀合物的相应剂量)。制备可施用组合物的实际方法对本领域技术人员来说是已知和明显的并且在出版物如Remington'sPharmaceutical Science,22th ed.,Pharmaceutical Press,London,UK(2012)中详细描述。在一些实施方案中，组合物可以是包括一种或多种抗体、抗原结合片段(如特异性结合gp120的抗体或抗原结合片段)的液体制剂，浓度范围为从大约0.1mg/ml至大约20mg/ml，或从大约0.5mg/ml至大约20mg/ml、或从大约1mg/ml至大约20mg/ml，或从0.1mg/ml至大约10mg/ml，或从大约0.5mg/ml至10mg/ml，或从大约1mg/ml至大约10mg/ml。
抗体或其抗原结合片段或缀合物或编码这些分子的核酸可以以冻干形式提供并且在施用前用无菌水再水化，尽管它们也可以以已知浓度的无菌溶液形式提供。抗体溶液或抗原结合片段或编码这些抗体或抗原结合片段的核酸可添加到含有0.9％氯化钠(USP)的输液袋中，并且通常以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。自1997年获得批准以来已经在美国销售的抗体药物的施用的重要经验可在本领域中获得。抗体、抗原结合片段、缀合物或编码这些分子的核酸可通过缓慢灌注而非静脉推注或丸剂来施用。在一个实例中，施用较高负荷剂量，随后再施用较低水平的维持剂量。例如，在90分钟的时间内输入4mg/kg的初始负荷剂量，如果可很好地耐受之前的剂量，那么之后在30分钟时间内灌注2mg/kg的周维持剂量，持续4-8周。
控释肠胃外制剂可制成植入物、含油注射液或制成颗粒体系。对于蛋白递送***的概要，参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)。颗粒体系包括微球、微粒、微囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微囊含有作为中心核的治疗蛋白如细胞毒素或药物。在微球中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于1μm的颗粒、微球和微囊一般分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管具有约5μm的直径，使得只有纳米颗粒可以静脉内施用。微粒直径通常是大约100μm，可以皮下或肌肉施用。参见例如Kreuter,J.,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342(1994)；和Tice&Tabibi,Treatise on Controlled DrugDelivery,A.Kydonieus,ed.,Marcel Dekker,Inc.New York,NY,pp.315-339,(1992)。
聚合物可用于本文公开的抗体组合物的离子控释。用于受控药物递送的多种可降解和不可降解聚合基质在本领域是已知的(Langer,Accounts Chem.Res.26:537-542,1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温以粘稠但流动液体形式存在，但在体温形成为半固体凝胶。已表明其是重组白介素-2和脲酶配制和缓释的有效载体(Johnston等,Pharm.Res.9:425-434,1992；和Pec等,J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65,1990)。或者，羟磷灰石已经用作蛋白控释的微载体(Ijntema等.,Int.J.Pharm.112:215-224,1994)。在另一个方面，脂质体用于脂质微囊包裹的药物的控释及药物靶向(Betageri等.,LiposomeDrug Delivery Systems,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。用于治疗蛋白的受控递送的许多额外体系是已知的(参见美国专利5,055,303；美国专利5,188,837；美国专利4,235,871；美国专利4,501,728；美国专利4,837,028；美国专利4,957,735；美国专利5,019,369；美国专利5,055,303；美国专利5,514,670；美国专利5,413,797；美国专利5,268,164；美国专利5,004,697；美国专利4,902,505；美国专利5,506,206；美国专利5,271,961；美国专利5,254,342和美国专利5,534,496)。
5.检测和诊断方法
还提供了用于体内或体外检测gp120表达的方法。在一个实例中，在生物样品中检测gp120的表达，并且因为样品中存在HIV-1，所以gp120的表达可用于检测HIV-1感染。所述样品可以是任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸体解剖和病理样本。生物样品还包括组织切片，例如用于组织学目的的冷冻切片。生物样品进一步包括体液，如血液、血清、血浆、唾液、脊髓液或尿液。检测方法可包括接触细胞或样品，或在足以形成免疫复合物的情况下向对象施用特异性结合gp120的抗体或抗原结合片段或其缀合物(例如包括可检测标记的缀合物)，并检测免疫复合物(例如通过检测与所述抗体或抗原结合片段缀合的可检测标记)。
在若干实施方案中，提供了用于检测对象中的AIDS和/或HIV-1感染的方法。本公开提供了检测生物样品中HIV-1的方法，其中所述方法包括在足以形成免疫复合物的情况下将来自对象的生物样品与公开的抗体或抗原结合片段接触，并检测免疫复合物以检测生物样品中的gp120。在一个实例中，在样品中检测gp120证实了对对象中AIDS和/或HIV-1感染的诊断。
在一些实施方案中，使用所公开的抗体或其抗原结合片段来测试疫苗。例如，测试包括gp120的疫苗组合物是否具有包括N6、N17或F8表位的构象。因此，本文提供了一种测试疫苗的方法，其中所述方法包括在足以形成免疫复合物的情况下将含有所述疫苗如gp120免疫原的样品与公开的抗体或抗原结合片段接触，并检测所述免疫复合物以检测样品中具有包括N6、N17或F8表位的HIV-1免疫原的疫苗。在一个实例中，样品中免疫复合物的检测表明疫苗组分如HIV-1Env免疫原具有能够结合所述抗体或抗原结合片段的构象。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段直接用可检测标记标记。在另一个实施方案中，结合HIV-1Env的抗体(第一抗体)未被标记并且利用可结合第一抗体的第二抗体或可结合该抗体的其他分子来进行检测。如本领域技术人员所熟知，选择第二抗体能够特异性结合第一抗体的特异种和类别。例如，如果第一抗体是人IgG，那么第二抗体可以是抗人IgG。其他可与抗体结合的分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，二者都是商业上可获得的。
用于抗体、抗原结合片段或二级抗体的合适标记如上所述，并且包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。合适的酶的非限制性示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性示例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的非限制性示例包括伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制的示例性发光材料为鲁米诺；非限制的示例性磁性剂为钆，和非限制的示例性放射性标记包括125I、131I、35S或3H。
F.试剂盒
还提供了试剂盒。例如，治疗患有HIV-1感染的对象的试剂盒、或检测样品或对象中gp120的试剂盒。试剂盒通常包括公开的gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子或包括这些分子的组合物。试剂盒中可包括多于一种的所公开的gp120特异性抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、表达CAR的T细胞或编码这些分子的核酸分子或包括这些分子的组合物。
在一个实施方案中，试剂盒是诊断试剂盒并且包括免疫测定。尽管免疫测定的细节可随着采用的具体形式而变化，但是检测生物样品中gp120的方法一般包括以下步骤：在足以形成免疫复合物的情况下将生物样品和与gp120特异性反应的抗体接触。允许所述抗体在免疫反应性条件下特异性结合以形成免疫复合物，并且直接或间接地检测免疫复合物(结合的抗体)的存在。
试剂盒可包括容器和所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料形成。容器通常容纳包括公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子或组合物中的一种或多种的成分。在若干实施方案中，容器可具有无菌接入口(例如容器可以是静脉内溶液包或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页表明组合物用于治疗特定状况。
标签或包装插页通常进一步包括用于包含在试剂盒中的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子或组合物的说明书。包装插页通常包括说明书，所述说明书习惯上包括在治疗性产品的商业包装中，包含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或关于使用此治疗性产品的警示的信息。说明材料可以以电子形式(如电脑磁盘或光盘)书写或可以是可视化的(如视频文档)。试剂盒还可包括额外成分以方便试剂盒设计的特定应用。因此，例如，试剂盒可另外包含检测标记物的工具(如用于酶标记的酶底物、检测荧光标记的滤光片组、适当的第二标记物如二级抗体等)。试剂盒可另外包括常规用于实践特定方法的缓冲剂和其他试剂。此种试剂盒和适当的内容物对本领域技术人员来说是熟知的。
III.实施例
提供了以下实施例以显示某些实施方案的具体特征，但是权利要求书的范围不应限制于那些示例的特征。
实施例1
通过结合CD4结合位点的人抗体广谱和有效的HIV-1中和
本实施例显示了N6抗体及其若干变体的分离和表征。N6抗体是广谱和极其有效的gp120特异性单克隆抗体，其结合gp120上的HIV-1Env的CD4结合位点。N6以IC50<50μg/ml中和了代表多种HIV-1毒株的181假病毒组中98％的假病毒。被中和病毒的中值IC50为0.038μg/ml，其是目前为止最有效的。进一步地，N6成功地中和组盘中20个对VRC01中和具有抗性的假病毒中的16个，所述VRC01为典型的广谱中和CD4结合位点抗体。
引言
HIV-1中和抗体之中最广谱的是一组结合CD4结合位点的成员。若干此种抗体已自患者分离，其中大部分根据结构和功能已被广泛鉴定。这些抗体中的大部分在VH使用和结合模式方面具有显著的相似特征，并基于此原因，被命名为“VRC01类”。尽管这些抗体是最广谱的，但是一些针对Env其他区域的广谱较低的抗体有效性增加10至20倍，如靶向N332聚糖或V1V2的抗体。此外，大约12％的分离株对VRC01-类抗体具有抗性。
本实施例提供了新的称为N6的可达到高效和显著宽度的单克隆CD4结合位点抗体。N6是VRC01类中的一员但可非常有效地中和大量VRC01抗性分离株。提供了中和、结构和诱变数据以表明这些活性是通过N6的多个结构域与HIV-1Env之间的新的相互作用来介导的。该机制涉及避免空间冲突，空间冲突是对VRC01类抗体抗性的主要机制。此外，它涉及N6的CDRH3与HIV-1Env的环D的高保守区段之间的独特且关键的相互作用。N6的效价和宽度及其自身反应性的缺乏使得其成为用于预防或治疗的高度期望的抗体。
结果
N6分离和中和特性
进行测定以理解成为中和患者Z258的血清广谱有效基础的特异性。来自该患者的血清对20个HIV-1Env假病毒的中和是广谱有效的(图1A)。中和的效价、宽度和模式与患者45的相似，来自患者45的熟知的CD4结合位点抗体VRC01被克隆。此外，根据中和指纹(Georgiev等,Science,340,751-756,2013)(图1A)，该患者的血清提示CD4结合位点抗体是有显性特异性。为确定介导该患者中HIV特异性中和的特异性，采用了在无先前靶特异性知识的情况下自外周血B细胞分离目的单克隆抗体的技术(Huang等,Nat.Protoc.,8,1907-1915,2013)。将Z258的外周血IgM-、IgA-和IgD-记忆B细胞分类并扩增。然后，对B细胞微量培养的上清液筛选中和活性，并克隆和再表达来自具有中和活性孔的IgG基因。发现了具有中和活性的抗体的3个克隆家族变体，其中名为N6的抗体(分离为IgG1mAb)是最有效和广谱的(图1B)。鉴定的抗体和相应序列标识符如下：
与许多其他HIV特异性广谱中和单克隆抗体一致，N6在重链(31％)和轻链(25％)中是高度体细胞突变的。N6抗体序列也具有与VRC01类抗体一致的特征(Zhou等,Science,329,811-817,2010)，如衍生自VH1-2*02种系基因的重链和由5个氨基酸组成的轻链CDR3(LCDR3)(图1B和图1C)。尽管它们衍生自相同的祖先B细胞，但是N6与VRC27明显不同，且在重链的氨基酸水平上有38％的差异。
为将N6的中和宽度和效价与其他广谱中和抗HIV-1抗体比较，将N6与VRC01、3BNC117、VRC27、FG9、PGDM1400、PGT121、10-1074、10E8、4E10和35O22针对181-假病毒组进行平行测试。如图1D和1E所示，N6以IC50<50μg/ml中和了181个假病毒中的98％。尽管许多抗体的宽度急剧降低至小于1μg/ml，但是在该水平，N6仍中和了96％的测试分离株。中值IC50为0.038μg/ml，是到目前为止最有效的。
另外，生成了包括N6、F8抗体的重链和轻链的交叉互补抗体并测试HIV-1中和(图1F)。嵌合抗体包括变体1(N6VH+F8VL)、变体2(N6VH+N17VL)、变体3(N17VH+F8VL)、变体4(N17VH+N6VL)、变体5(F8VH+N6VL)和变体6(F8VH+N17VL)。如图1F所示，所有测试的嵌合抗体都在假病毒测定中中和HIV-1。
惊人的结果是N6中和了许多对VRC01具有高度抗性的分离株。当检查针对VRC01抗性分离株组成的20-病毒组的活性并与VRC01-类的其他成员(VRC01、VRC07-523-LS和3BNC117)的活性比较，N6中了20个分离株中的16个(图2)。或许更加值得注意的是它非常有效地中和了这些分离株。这提示N6可能具有跨不同Env操作的新型识别模式，使其避免了通常对于VRC01-类抗体的其他成员的抗性。
自身反应性或多反应性是若干HIV特异性抗体的特性，这能限制它们在治疗或预防中的应用。然而，N6不结合Hep-2上皮细胞(图3A)，也不结合心磷脂(图3B)或自身抗原组(图3C)，提示自身反应性可能不限制N6在HIV-1预防、治疗和阻止中的潜在用途。
为理解N6的结合特异性，通过ELSA检查其与其他抗体竞争或结合gp120突变体的能力。与VRC01-类抗体一致，N6与生物素化的CD4Ig和CD4结合位点抗体竞争结合gp120(图4A)。对于竞争性结合测定，像b12、VRC01和CD-Ig(已知其结合gp120上的CD4结合位点)一样，N6和变体1(N6重链组合F8κ链)竞争结合gp120(图4A)。如图4B所示，N6和变体1(N6重链组合F8κ链)抗体与BaL gp120、RSC3和RSC3Δ371I P363N的结合与CD4结合位点抗体VRC01和b12相似。然而，与VRC01和b12不同，N6和变体1(N6重链组合F8κ链)维持了与BaL gp120D368R的结合。值得注意的是在基于探针的分选策略中，使用D368R突变体来选出(gateout)非CD4结合位点抗体。因而，在先前努力恢复CD4结合位点抗体中，N6很有可能排除在分析之外。为进一步证实N6和变体1(N6重链组合F8κ链)抗体结合CD4结合位点，通过ELSA测定N6与gp120的结合(图4C)。如图4C所示，N6和N6变体1特异性结合三聚体gp140(gp140折叠子)和单体gp120，但不结合gp120V3结构域、gp41或MPER肽。
N6结合特异性
为更精确对N6在HIV-1 gp120上的表位作图，在单体gp120JRCSF的背景下，通过ELISA测试了N6与丙氨酸扫描突变体的结合。基于之前的结构分析和病毒诱变，已知VRC01抗体类的成员在3个主要区域内接触gp120：环D、CD4结合环(CD4 BLP)和β23-V5区。与其他CD4结合位点抗体一致，在JRCSF的环D、CD4 BLP或β23-V5区内残基的突变导致N6介导的gp120结合降低(图4D)。总之，在该背景下未观察到N6结合与其他VRC01类抗体之间的差异。然而，ELSA中测试的单体gp120的构象并不能准确地反映出N6与完整功能三聚体之间的相互作用。为更好的评估该相互作用，使用JRCSF Env假病毒丙氨酸扫描突变体组来检查N6的中和效价，与其他CD4结合位点抗体和2G12(作为阴性对照)相比。如图4E所示，与之前结果一致，JRCSF的环D中的单一突变，如D279A或K282A，导致对大多数CD4结合位点单克隆抗体中和的抗性(Li等.,J.Virol.,85,8954-8967,2011；Lynch等,J.Virol.,89,4201-4213,2015)。反之，JRCSF的环D、CD4 BLP或β23-V5区中的单一突变显示不对N6中和有抗性。除与上文所述的RSC突变体结合(图4B)之外，这些结果提示N6可能通过新的识别模式结合CD4结合位点。
N6表位
在之前工作中，对VRC01类抗体的抗性通常是通过在gp120的环D、CD4 BLP或β23-V5中的已知接触区域中的突变来介导的(Lynch等.,J Virol 89,4201-4213,2015)。在181个测试病毒中，只有4个对N6具有高抗性(IC50>50μg/ml)，2个对N6具有较低敏感性(IC50>5μg/ml)(图5A)。相对于参考病毒序列HXB2、JFCSF和93TH057，每个抗性病毒在环D(残基276-283)、CD4 BLP(残基362-374)或β23-V5区(残基458-469)有突变。然而，在20个VRC01抗性病毒组内的N6敏感性病毒和抗性病毒的序列没有清晰模式(图5A)。此外，我们制备了来自患者Z258的血浆病毒的Env的全长克隆，其中N6分离自该患者。在之前工作中，已观察到自体病毒通常对同代血清学应答有抗性，并且可提供关于抗性46,50-55机制的信息。与这些之前观察一致，表达这些自体Env的11个假病毒也对N6介导的中和有抗性(图5A)。自体Env序列的分析揭示了相对于参考病毒序列，它们的序列在环D、CD4 BLP和β23-V5区内也有突变(图5A)。为确定这些突变对N6抗性的相对贡献，T278-50、BL01和TV1.29的环D、CD4 BLP和β23-V5区回复突变，且自体病毒Z258.2012.SGA5假病毒回复突变为敏感性病毒序列HIVJRCSF(图5B-5C)。用来自HIVJRCSF的序列替换β23-V5使在2个假病毒(T278-50和TV1.29)但不在BL01和Z258.2012.SGA5中对N6的敏感性增加了3-5倍。用来自HIVJRCSF的序列替换CD4 BLP没有增加N6敏感性。只有在将来自HIVJRCSF的序列引入到环D时，所有假病毒才能变为对N6中和高度敏感。与N6相反，CD4结合位点抗体、VRC01、3BNC117、VRC-PG04、12A12和VRC27的全敏感性要求在环D、CD4 BLP和β23-V5区的回复突变。N6与T278-50、BL01、TV1.29的回复突变体和自体病毒Z258.2012.SGA5的结合也通过ELSA来测试。相似地，在环D残基处的回复突变导致强N6介导的gp120结合，而在环D、CD4 BLP和β23-V5区内的回复突变是CD4结合位点抗体的结合所需的。为确认在环D内的突变对N6抗性是必需的，将JRCSF的环D、CD4 BLP或β23-V5区的序列***自体病毒Z258.2012.SGA5序列中。JRCSF环D序列被Z258.2012.SGA5的环D取代使N6中和敏感性显著降低11倍，而CD4 BLP和β23-V5交换分别显示出3倍差异或无显著差异。为探究环D内哪些残基在N6逃逸中发挥重要作用，我们用来自HIVJRCSF的相应残基替换抗性病毒中不同的每个残基。位置281、382和283处的回复突变显示N6敏感性几乎没有或没有增加。只有在将来自HIVJRCSF的保守残基Asp引入位置279处时，大部分的假病毒才会变成对N6中和敏感(图5D-5E)。可能是通过引起与N6的CDRH3直接冲突的TV1.29、BL01和Z258自体病毒中位置279处的残基的庞大侧链来介导这些病毒对N6的抗性。这些结果提示对N6中和的抗性需要环D中的突变。然而，与其他CD4结合位点抗体不同，N6耐受CD4 BLP和β23-V5区内的逃逸突变，包括可引起与其他VRC01类抗体的CDRH2和CDRL3空间冲突的那些。
N6互补位
为理解N6的互补位，生成N6丙氨酸扫描突变体组以检查N6对6个VRC01敏感性病毒的中和效价。也将VRC01和VRC27以及它们的丙氨酸扫描突变体用作对照。若干变化使得对VRC01和VRC27的平均中和效价降低5倍多(图6C-6F)。由于与Asp279gp120的相互作用的破坏，推测CDRH3内的Trp100bVRC01和Trp100cVRC27丙氨酸突变有较大影响。此外，VRC27重链的Trp47、Trp50、Asn58和Arg71与VRC27轻链的Gly28和Ile91中的若干残基也有较大影响(图6C-6F)。值得注意的是在N6的丙氨酸点突变中未观察到此影响(图6A-6B)。因此，推测N6在重链和轻链的长度上可耐受单一突变，因为有充足的能量遍布其余位置的接触来介导结合。
还检查了N6丙氨酸扫描突变体对6个VRC01抗性病毒的中和效价，所述突变体包含环D、CD4 BLP和V5环内的突变。N6重链的Ile33、Trp47、Trp50、Arg71和Trp 100c与N6轻链的Ile91中的残基对中和效价降低也有较大影响(图7)。由于上述残基也出现在VRC27抗体中，所以这不足以解释为什么N6具有比VRC27更优异的中和活性。
其次，询问了N6重链或轻链的在其中和宽度和效价方面发挥重要作用的区域。首先，将N6的重链和轻链与其他CD4结合位点中和抗体VRC01、VRC27和12A21交换，然后测定它们对6个抗VRC01抗性和2个VRC01敏感性假病毒的中和活性。如图8A所示，分别相对于VRC01、VRC27或12A21，N6重链与VRC01、VRC27或12A21轻链的组合增加了抗体中和效价和宽度。然而，N6轻链与VRC01、VRC27或12A21重链的组合显示在宽度上无变化。这个结果可能与提示N6结合VRC01抗性病毒的能力(尽管通过轻链定向介导)主要通过重链采用的构象来介导的结构数据一致。
在N6中，基于晶体结构分析，CDRH2内的Tyr54HC和GlyGlyGly60-62HC和CDRH3是与gp120相互作用的关键区域。然而，将这些残基取代为VRC01的相应区域不会增加其宽度或效价(图8B)。也将N6CDRH3取代为VRC01-类抗体如VRC07和VRC08并观察到无宽度或效价上的增加(图8B)。这提示这些特征并不能单独地赋予VRC01类其他成员针对抗性病毒的提高的活性。
接下来检查是否可通过将N6的FR和CDR突变为VRC01类其他成员的来削弱N6对抗性病毒的活性(图8B和8C)。用Gly54VRC01取代Tyr54N6和用CDRH2中的AlaArgPro60-62VRC01的相应残基取代GlyGlyGly60-62N6，各自使得中和降低32倍和14倍。然而，针对这些病毒的活性的最大降低是通过将N6CDRH1、CDRH2和CDRH3及框架区(FR)FRH3取代为VRC01的相应部分引起的，该取代使得中和活性分别降低2857、2857、304倍。N6 CDRH3也被VRC01样抗体如VRC07和VRC08的那些区置换。观察到中和活性分别降低2757和2857倍。此外，这些抗体丧失了对大部分VRC01抗性病毒的中和活性。考虑到对敏感性分离株的中和未变化，所以这并不是由于取代引起的大量功能破坏导致的。用VRC01的相应区取代N6轻链CDRL1和FRL3也使得抗体中和活性显著降低2857倍。CDRL3和FRL1取代有较温和的影响。
为进一步理解N6负责其宽度和效价的结构域，N6的每个区都被来自基因上和结构上相似但广谱和效价较差的来自相同VRC01类的抗体的区取代。VRC27是分离自相同供体的克隆相关物，CDRH3中仅具有5个与N6不同的残基。然而，VRC27的中和活性低于VRC01(中值IC50为0.217μg/ml和78％宽度)，并且其中和VRC01抗性病毒。将N6CDRH3用VRC27的取代(N6VRC27 CDRH3)使得对VRC01抗性病毒的中和降低10倍(图8)。鉴于这两种抗体的CDRH3十分相似，这是可以预期的。然而，将N6的CDRH2和CDRH1用VRC27的取代导致中和降低78倍和10倍。用CDRH2中的GlnGly64-65VRC27的相应残基取代ArgAsp64-65N6使得中和降低108倍。有些出乎意料地，对FRH1、2和3的取代使得中和降低21、11和30倍(图8)。
N17是与N6密切相关但对VRC01抗性病毒活性较低的另一克隆变体。N17重链具有与N6相同的CDRH1、CDRH2、CDRH3和FRH2，但在FRH1和FRH3内的若干残基处有差异。它的轻链在每个FR和CDR方面也与N6不同。如图8所示，用来自N17的相应残基取代N6的FRH1和FRH3使得效价降低5倍和7倍。在所有FRL和CDRL中的取代观察到效价没有变化。这些结果表明除了N6CDRH1、CDRH2和CDRH3之外，FRH1和FRH3也对N6对VRC01抗性病毒的效价有贡献。
综上所述，重链和轻链交换、结构分析和诱变表明被N6结合是通过遍布重链CDR和FR上的多个接触介导的。N6通过与重链和轻链的相互作用维持了环D内的最关键接触。然而，N6能够耐受CD4BLP和β23-V5区内突变，所述突变引入了具有与其他VRC01-类抗体有空间冲突的庞大侧链的残基。该特性通过由重链的整体构象支配的轻链独特定向而赋予。正是该特性才导致N6避免了对VRC01类抗体抗性的主要机制的显著能力。
上文公开的修饰抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列如下：
VRC01G54YHC
QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRYGAVNYARPLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSS(SEQ ID NO:42)
VRC01ARP60-62GGGHC
QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYGGGLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSS(SEQ ID NO:43)
VRC01N6CDRH3
QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCARDRSYGDSSWALDAWGRGTPVIVSS(SEQ ID NO:44)
VRC07N6CDRH3
QVRLSQSGGQMKKPGDSMRISCRASGYEFINCPINWIRLAPGKRPEWMGWMKPRHGAVSYARQLQGRVTMTRDMYSETAFLELRSLTSDDTAVYFCARDRSYGDSSWALDAWGQGTPVTVSS(SEQ ID NO:45)
VRC08 N6CDRH3
QVQLVQSGTQMKEPGASVTISCVTSGYEFVEILINWVRQVPGRGLEWMGWMNPRGGGVNYARQFQGKVTMTRDVYRDTAYLTLSGLTSGDTAKYFCARDRSYGDSSWALDAWGQGTLVIVSP(SEQ ID NO:46)
N6 Y54GHC
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQGGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:47)
N6 GGG60-62ARPHC
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFARPFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:48)
N6 VRC07CDRH3
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARGKYCTARDYYNWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:49)
N6 VRC08CDRH3
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARGRSCCGGRRHCNGADCFNWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:50)
N6 VRC27CDRH2
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPKFGAVNYAHSFQGRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:51)
N6 VRC27CDRH3
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRLYDGSSWRLDPWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:52)
N6 VRC27FRH1
SQRLVQSGPQVRKPGSSVRISCETSGYTFNAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:53)
N6 VRC27FRH2
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRSFEWMGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:54)
N6 VRC27FRH3
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRITLTRDIYRETAFLDLTGLRFDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:55)
N6 N17FRH1
RAHLVQSGTAVKRPGASVRVSCETSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:56)
N6 N17FRH3
RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTLTRDIYRDTAYMDISGLRFDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVVVSA(SEQ ID NO:57)
N6 N17FRL1
YIHVTQSPSSLSVSAGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK(SEQ ID NO:58)
N6 N17FRL2
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIRHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK(SEQ ID NO:59)
N6 N17FRL3
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGTGFHTSFNLTINDLQSDDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK(SEQ ID NO:60)
N6 N17FRL4
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLDFK(SEQ ID NO:61)
N6N17CDRL1
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGRDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK(SEQ ID NO:62)
N6N17CDRL2
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHASSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK(SEQ ID NO:63)
N6N17CDRL3
YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIHHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTSFNLTISDLQADDIATYYCQVLESFGRGSRLHIK(SEQ ID NO:64)
与gp120复合的N6的晶体结构
为定义通过N6可介导此种效价和宽度的结构机制，对与来自对VRC01类抗体有不同敏感性的毒株的HIV gp120蛋白复合的N6的抗原结合片段(Fab)进行了结构分析(参见图9-13)。这些包括进化枝AE 93TH057，对大部分VRC01类抗体敏感的毒株；DU172，对VRC01有抗性但对其他若干VRC01抗体包括N6敏感的毒株；和X2088，仅对N6敏感的毒株。
结构分析揭示了N6与VRC01类抗体的其他成员共同具有若干特征。这些包括CDRH3与环D之间的接触，尽管这些接触比VRC01的更广泛。N6还在CDRH2与CD4 BLP之间具有接触，在Arg71HC与Asp368gp120有盐桥。N6还具有口袋填充Tyr54HC，其模拟Phe43CD4与gp120的相互作用，此特征在一些VRC01类抗体中也被发现，如VRC27(分离自患者Z258)、VRC-PG20和12A21，其含有Phe54，或者具有Typ54的VRC03。轻链衍生自IGKV1-33，与某些其它抗体如12A21相似。与其他某些VRC01类抗体相同，N6也在CDRL1内包含柔性GlyXGly基序(aa 28-30)，使其避免与环B的空间冲突。尽管N6CDRH3具有与VRC01不同的构象，但是CDR H3Trp100c(Kabat参考编号)具有与VRC01 Trp100b相似的位置，VRC01 Trp100b与Asp279gp120相互作用。
发现N6还具有若干与其他VRC01类抗体不同的结构特征。例如，N6重链包含在任何其他分离的CD4结合位点抗体中未发现的聚甘氨酸60-62。N6轻链也具有使其转动的独特定向，从而使CDRL3比VRC01更加远离β23-V5。将具有大的侧链的残基添加到该结构域中是之前描述的VRC01类抗体抗性的机制。CDRL3与该区域之间的较大距离使得N6比其它VRC01类抗体能更好地耐受V5中的这种变化。与该解释一致，N6-X2088.c9gp120的共结晶结构揭示了N6轻链的转动容纳了在该Env的沿轻链方向突出的并且可能与该类型其他抗体冲突的α2螺旋和CD4BLP之间的额外残基。重要的是要注意到N6轻链的独特定向并不是由于轻链的特殊特征或重链和轻链界面形成的，鉴于这些与VRC27那些重叠。然而，还可能是N6重链的结合模式或定向允许轻链的这种转动。总之，与其他VRC01类抗体相比，N6具有独特的轻链定向，因此其允许轻链避免与β23-V5和环D发生潜在的冲突。
N6发展途径
为理解与其他VRC01抗体相比，N6是如何发展此种突出的效价和宽度的，对来自供体Z258的外周血记忆B细胞在3个时间点(2012、2014和2015)进行下一代测序(NGS)以鉴定额外的谱系成员。简单的说，从每个时间点制备B细胞受体cDNA，再用Illumina MiSeq测序，平均测序深度为～40x。基于CDRH3中与N6、VRC27、F8或N17的序列相同性来鉴定谱系相关的重链转录物。相关轻链转录物鉴定为衍生自IGKV1-33的读段并用VRC01类的5个氨基酸CDRL3特征(Zhou等Immunity 39,245-258,2013)。在除去重复和包含终止密码子或框外连接的转录物后，将剩余读段聚集一起来解释测序错误。最后，人工校正聚集的序列以产生最终的每个时间点处的重链和轻链谱系成员组。
重链和轻链的校正转录物显示了高水平的体细胞超变(大约20％)，与N6相比有更多的转录物与VRC27高度相似(图14)。尽管如此，在2012和2014时间点观察到了显示比N6或VRC27低的体细胞突变(～23％)的重链转录物。相似地，与N6和VRC27轻链的～25％相比，也观察到了一些具有～20％体细胞超变的轻链转录物。从2012时间点观察到了比2014或2015更多的谱系相关转录物，这有可能是由于更多的B细胞用于NGS实验。在所有3个时间点都观察到了N6样轻链转录物(图14)，但在2012或2015数据中没有观察到与N6有高度相似性的重链转录物。虽然***发生树中大量的校正重链序列与VRC27密切相关(图15)，但这可能并不能反映出VRC27进化枝相对于N6进化枝的生物扩展。相反地，可通过正反向MiSeq读段之间重叠部分的低序列质量而人工产生这种多样性。
为探究谱系的***发生结构，为重链和轻链构建了最大似然树(图15)。***发生树一致地显示N6和VRC27形成2个高度趋异的组。尽管如此，除使用相同基因元件外，这两个组都具有相似的重链和轻链结合部以及在重链和轻链中分别共享15和14个突变，证实它们代表单一克隆谱系的两个进化枝。
***发生树进一步显示这两个进化枝早在谱系发展时就发生趋异。尽管从2014时间点的3个转录物落在N6和VRC27分支之间(图15)，但是分析并没有检索到足够数量的早期谱系-成员序列来确定这两个进化枝发生趋异的点。似乎重链GlyGlyGly60-62N6基序和RD63-64N6基序分别在2个和3个进化枝后出现。在轻链中，CDRL1中的GlyXGly基序在两个进化枝发生趋异前出现，而CDRL3中的Gln96在N6进化枝发展后期出现。
我们配对了N6谱系的***发生树并克隆了与N6有关的Z258重链和轻链转录物。两个重链衍生自2015，4个轻链衍生自2014和2015。我们发现8个配对的抗体中的三个具有与N6相似的效价(图16)。有趣的是，所有三个抗体能中和N6抗性病毒TV1.29，表明亲本Z258在该时间段内是具有较大宽度的发展中的抗体。
讨论
这些结果在努力刺激广谱中和抗体应答和在预防或治疗中利用bNAb方面具有若干重要意义。在那些为临床发展而考虑的抗体中有总趋势，即它们是十分广谱的(如10E8或VRC01)或者是十分有效但广谱性较低的(PGT121、PGDM1400)。然而，N6抗体的发现说明该新的VRC01类抗体可介导惊人的宽度和效价，甚至抗传统上对这类抗体有抗性的分离株。对抗性分离株的序列分析、诱变和结构数据每一项都能证实N6具有许多特征和接触是VRC01类的特征。然而，通过具有重链和轻链的多个结构域中的变化的复杂组合，能够达到其它VRC01-类抗体之上的宽度和效价。
与其他VRC01类抗体相比，效价的增加很大程度上是通过重链与gp120之间的一系列接触介导的。N6的重链和轻链与其他VRC01-类抗体的重链和轻链的交换表明N6的活性很大程度上是通过重链相互作用介导的。这主要发生在CDRH2、CDRH3和Tyr54N6Heavy处的接触。尽管将这些序列的任一取代为其他VRC01-类抗体不会增加活性，但这些中的每一个的突变降低了N6的活性。然而，这些相互作用中最主要的相互作用发生在N6的CDR H3与环D之间。鉴于发现之前描述的利用VH1-2*02的VRC01-类抗体在很大程度上是依赖CDR H2相互作用的，那么这种程度的对CDRH3-环D相互作用的依赖性是令人惊讶的。可能与其他VRC01类的抗体相比，该与CDRH2和Y54N6的相互作用一起的相互作用组合赋予N6额外的效价。
特别有趣地应注意的是通过体内自然选择，N6具有已改造为其他抗体以增加效价或宽度或降低抗体逃逸的可能性的特征。尽管到目前为止描述的天然存在的VH1-2*02衍生的VCR01-类抗体模拟了CD4与gp120的相互作用，但是大多数并没有填满gp120上通常被Phe43CD4填充的疏水性口袋。抗体NIH45-4658和VRC0759中Gly54疏水性残基的取代已导致效价的巨大增加和宽度的一些增加。通过体内自然选择，N6抗体具有在该疏水性口袋中结合并对N6效价有贡献的Tyr54N6。此外，VRC07和NIH 45-46的轻链已被改造以避免与β-23V5环49,59,60的空间冲突。通过轻链定向中的变化由N6抗体来避免这些相同的空间冲突，所述其耐受β-23V5结构域内的庞大侧链。然而，VRC01类抗体中的这些能改善效价和宽度的改造变化中的许多却是以牺牲自反应性的增加(59以及在61中概述)为代价的。尽管天然自身反应性抗体可特别地存在于bNab62中，但令人吃惊的是，并未观察到N6抗体的自身反应性。有可能对表达具有强自身反应性的N6克隆亲缘B细胞的扩增是在体内进行了选择。这些数据表明抗体如N6中的宽度和效价的发展并不一定要通过自身反应性来完成。
N6抗体具有若干使其成为预防和治疗中使用的所期望的候选物的特征。自身反应性的缺乏表明与其他在此测定中有反应性的抗体相比，N6具有更长的体内半衰期。N6的效价可进一步增加在被动施用情况下对预防性或治疗性有益效果的持久性，因为要求更少的抗体持续介导效应。可通过将能够扩展其体内半衰期的突变引入到N6中来进一步扩展该效应。除其效价外，当用于治疗设置中逃逸突变的预防或选择时，使用具有该宽度的抗体还可显著地限制传播的可能性。
鲜有发生的N6抗性突变可表明发生此种突变需要高适应度代价，代表对选择抗性突变体的障碍。Z258自体病毒在环D序列的位置279gp120和281gp120处中很少有变化。对N6的抗性似乎要求突变环D的这些位置。响应于VRC01-类抗体选择50、60，已在患者或人源化小鼠中观察到这些位置处的变化。患者45的自体病毒(从中克隆VRC01和NIH45-46)包含Asp279Glugp120和Ala281Hisgp120突变。在这种情况下，Ala281Hisgp120恢复了包含Asp279Glugp120的分离株中的病毒适应度。在近期努力将VRC01样抗体改造为限制病毒逃逸中，将改造的NIH45-46抗体作为疗法给予HIVYU-2感染的人源化小鼠。针对导致病毒适应度降低的Ala281Thrgp120突变体选择的该疗法通过生成Asn-X-Thr/Ser糖基化序列子(sequon)潜在地通过将聚糖引入Asn279gp120。各个突变对Z258自体病毒的构象和复制适应度的影响仍待确定。然而，这些变化只发生在大型数据库(www.hiv.lanl.gov)中5132种病毒的<0.01％中，表明了此种突变可能强烈不受欢迎。因此，除了其效价和宽度，N6抗体由于与生成N6抗性有关的病毒适应度代价而可对治疗用途特别有效。
实验程序
研究患者。从登记在国立卫生研究院的HIV-1感染患者中根据经InvestigationalReview Board in the National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID-IRB)核准的临床方案选择血浆和外周血单个核细胞(PBMC)。所有参与者都签署了经NIAID-IRB核准的知情同意书。登记标准如下：具有可检测的病毒载量、400细胞/μl以上的稳定CD4 T细胞计数、诊断患有HIV-1感染至少4年，以及未进行逆转录病毒治疗至少5年。因为其血清中和活性在同期群中最有效且广谱，选择供体Z258用于B细胞分选和抗体生成。在进行白细胞去除术时，他已经感染HIV-1 21年，CD4 T细胞计数为733细胞/μl，血浆HIV-1RNA值为996拷贝/μl，并且未接受逆转录病毒治疗。
记忆B细胞染色、分选及抗体克隆详细的方案于近期发表后(Huang等,Nat.Protoc.,8,1907-1915,2013)，对记忆B细胞进行染色和单细胞分选。简单地说，对全部75000个CD19+IgA-IgD-IgM-记忆B细胞进行分选并于具有IL-2、IL-21和辐射的3T3-msCD40L饲养细胞的培养基中重悬，并以每孔4个细胞的密度种植于384-孔微滴定板中。孵育13天后，用针对HIV-1MN.3和HIV-1Bal.26的高通量微中和测定法对中和活性筛选每孔的上清。从在HIV-1MN.3和HIV-1Bal.26中和测定中都评分为阳性的孔中可知，免疫球蛋白基因的重链和轻链的可变区通过RT-PCR扩增并如之前所述再表达(Tiller等,J.Immunol.Methods,329,112-124,2008；Georgiev et al.,Science,340:751-756,2013)。用重组蛋白-A柱(GRHealthcare)纯化全长IgG。
假病毒的产生通过以2:1的比例用Env缺陷骨架(pSG3ΔEnv)与表达HIV-1Env的第二质粒共转染293T细胞来生成HIV-1Env假病毒。转染后72小时，收集含有假病毒的上清并在-80℃冷冻直到进一步使用。JRCSF突变体根据生产商的方案(Agilent)用QuikChangeLightning定点诱变试剂盒改变JRCSF Env质粒来生产JRCSF突变体。
中和测定用如之前描述的TZM-bl细胞的一轮HIV-1Env假病毒感染来测定单克隆抗体或血清的中和活性(Li等,J.Virol.,79,10108-10125,2005)。用Dulbecco改良的Eagle培养基10％FCS(Gibco)连续5倍稀释热灭活的患者血清或单克隆抗体(mAb)，并且将10μl血清或mAb与40μl假病毒于37℃在96孔板中孵育30分钟。然后，添加TZM-bl细胞，孵育孔板48小时。然后，用荧光素酶测定***(Promega,FinnbodaSweden)进行测定，在光度计(Perkin Elmer)上读取相对光单位(RLU)。
结合测定HIVBAL26gp120单体、gp120Resurfaced Stabilized Cores(RSC3)及其2μg/ml的CD4敲除突变体gp120D368R和RSC3Δ371I P363N于4℃涂覆在96孔板上，过夜。室温下板用BLOTTO缓冲液(PBS、1％FBS、5％脱脂奶)封闭1小时，之后用在裂解缓冲液(PBS、5％FBS、2％BSA、1％Tween-20)连续稀释的抗体室温下孵育1小时。室温下加入以1：10,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG抗体1小时。每个步骤之间用0.2％Tween-20PBS洗涤板。用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma-Aldrich)显色板，并在450nm读数。
交叉竞争ELISA根据之前公布的方法(Wu等,Science,329,856-861,2010)进行交叉竞争ELISA。4℃将2μg/ml的HIVYU2 gp120涂覆在96孔板上，过夜。37℃，用B3T缓冲液(PBS，3.3％FBS、2％BSA、0.07％Tween-20、0.02％硫柳汞、150mM NaCl、50mM Tris-HCl和1mMEDTA)封闭板1小时。向板中加入50μl连续稀释的非生物素化的竞争抗体，之后加入50μl生物素化的抗体或CD4-Ig，固定浓度为：250ng/ml的VRC01-生物素、5μg/ml的VRC23-生物素、1μg/ml的VRC-PG04-生物素或150ng/ml的CD4-Ig-生物素。37℃孵育板1小时。加入以1：200稀释的HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(BD)并在室温孵育30分钟。每个步骤之间用0.2％Tween-20 PBS洗涤板。用TMB显色板，并在450nm读数。
病毒捕获ELISA通过如之前描述的gp120捕获酶联免疫吸附测定法(ELSA)确定单体gp120和N6的相对结合能力(Moore等,J.Virol.,69,101-109,1995)。4℃将于PBS的1μg/ml的100μl抗gp120D7324(Aalto Bioreagent,Dublin,Ireland)涂覆在96孔板上，过夜。加入用Triton X-100(0.5％)处理的JRCSF假病毒原种并于37℃孵育2小时。37℃用B3T缓冲液封闭板1小时，之后37℃用在B3T缓冲液中连续稀释的抗体孵育1小时。37℃加入以1：10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories)1小时。每个步骤之间用0.2％Tween-20PBS洗涤板，用TMB显色并在450nm读数。
自身反应性测定通过使用伊文思蓝作为复染剂并采用FITC缀合的山羊抗人IgG(Zeus Scientific)对切片进行间接免疫荧光检验来确定对HIV-1阴性人上皮(HEp-2)细胞的反应性(Haynes等,Science,308,1906-1908,2005)。在Nikon Optiphot荧光显微镜上对切片拍照。在10秒曝光时获取与HEp-2细胞结合的每个单克隆抗体的柯达彩色胶片，将该胶片扫描为数字格式。Luminex AtheNA Multi-Lyte ANA试验(Wampole Laboratories)用来测试单克隆抗体对SSA/Ro、SS-B/La、Sm、核糖核蛋白(RNP)、Jo-1、双链DNA、着丝粒B和组蛋白的反应性，并且按照生产商的说明书和按照之前描述(Haynes等,Science,308,1906-1908,2005)进行。测定的单克隆抗体浓度为50μg/ml。用luminex荧光珠孵育10μl每个浓度并按照生产商的说明书进行试验。
病毒RNA提取和cDNA合成按照之前所述的进行病毒RNA提取和cDNA合成(Wu等,J.Virol.,86,5844-5856,2012)。简单的说，用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)于两个不同的时间点从280μl患者Z258的血清样品提取病毒RNA并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。采用SuperScript III反转录酶(Invitrogen Life Technologies)进行第一链cDNA合成。最终100ul反应体积是由50μl病毒RNA、5μl脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合物(每个10mM)、1.25μl 20μM反义引物envB3out(5′-TTGCTACTTGTGATTGCTC CATGT-3′,SEQ ID NO:65)、20μl 5×第一链缓冲液、5μl 100mM二硫苏糖醇、5μl的RNaseOUT和5μl的SuperScript III逆转录酶组成。RNA、引物和dNTP在65℃加热5分钟并在冰上冷却1分钟，然后全部反应混合物在50℃孵育60分钟，之后55℃再孵育60分钟。最后，在70℃对反应热灭活15分钟，然后在37℃用1μl RNase H处理20分钟。由此得到的cDNA立即用于PCR或在80℃冷冻以等待进一步分析。
SGA HIV-1env SGA的嵌套PCR如之前所述(Wu等,J.Virol.,86,5844-5856,2012)。简单的说，cDNA被连续稀释并分散于ThermoGrid 96孔板(Denville Scientific)中重复12个PCR反应中以鉴定稀释度，其中PCR阳性孔组成了总反应数的大约30％。在该稀释度下，大部分孔含有衍生自单cDNA分子的扩增子。在全96孔板中采用该稀释度进行另外的PCR扩增。采用铂Taq高保真PCR***(Invitrogen Life Technologies)进行PCR扩增。最终20μl反应体积由2μl 10×缓冲液、0.82μl的MgSO4、0.4μl的dNTP混合物(每个10mM)、0.2μl 20μM每个引物、0.1μl铂Taq高保真聚合酶和1μl模板DNA组成。用于第一轮PCR的引物为envB5out(5′-TAGAGCCCT GGAAGCATCCAGGAAG-3′,SEQ ID NO:66)和envB3out(5′-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3′,SEQ ID NO:67)。用于第二轮PCR的引物为envB5in(5′-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3′,SEQ ID NO:68)和envB3in(5′-GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC-3′,SEQ ID NO:69)。循环仪参数：94℃2分钟，之后35次循环94℃15秒，55℃30秒及68℃4分钟，再之后68℃最终延伸10分钟。随后，将第一轮PCR的产物(1μl)用作在相同条件下但要进行共45次循环的第二轮PCR的模板。在预制的1％琼脂糖凝胶(Embi Tec)检查扩增子。采用程序化的针对样本污染的安全措施在指定的洁净的PCR罩中进行所有PCR过程。
DNA测序由ACGT,Inc.采用BigDye Terminator chemistry直接测序扩增子。用部分重叠片段来测序DNA双链。组装每个扩增子的各个序列片段并用Sequencher 5.0(GeneCodes，Ann Arbor,MI)编辑。检查所有混合碱基位点的色谱图(双峰)，其是从多于1个的模板中引发或在初期循环中引入PCR错误的证据。具有双峰证据的任何序列在进一步分析时排除。
供体Z258信息选择供体Z258用于B细胞分选和抗体生成，因为其血清中和活性在同期群中是最有效和广谱的。在进行白细胞去除术时，他已经感染HIV-121年，CD4 T细胞计数为733细胞/μl，血浆HIV-1RNA值为996拷贝/μl，并且未接受抗逆转录病毒治疗。
供体Z258HIV-1env基因的克隆选择来自供体Z258的代表性env序列进行克隆。用Herculase II Fusion DNA聚合酶(Agilent Technologies)、引物HIV RevS(CACCATGGCAGGAAGAAG,SEQ ID NO:70)和envB3in(5′-GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC-3′,SEQID NO:71)用与上述第二轮PCR相同条件对含有全长rev和env基因的第二轮env PCR产物进行扩增。PCR扩增子是凝胶纯化的并在T7启动子的控制下连接表达载体pcDNA3.1D(Invitrogen Life Technologies)中。转染至TOP10化学感受态大肠杆菌(InvitrogenLife Technologies)中后，每个rev和env表达质粒都是maxiprepped(Qiagen)，并验证其序列。从供体Z258克隆的共7个env序列中，7个(100％)都具有介导病毒进入功能。
统计分析由Spearman检验来评估N6与VRC01、10E8、PGT121或PG9抗体之间对181个假病毒的中和效价的相关性。
PBMC记忆B细胞的下一代测序(NGS)
NGS数据处理用USEARCH75将2x300原始读段组装为单端转录物。排除含有用Usearc估计的多于10个测序错误的转录物。然后，用我们内部实施的生物信息学管道处理转录物。简单的说，去除短于300个核苷酸的转录物。BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)用来将种系V、D和J基因分配给每个具有定制参数的转录物。去除转录物的除V(D)J区的序列并排除含有移码或终止密码子的转录物。用ClustalO77计算每个转录物对种系V基因、N6、F8、N17和VRC27的序列相同性，并显示在用R中的ggplot2绘制的2D热图中。
从NGS对N6谱系相关转录物的鉴定为发现谱系相关重链转录物，我们使用ClustalO77来计算每个数据集中每个转录物的CDR3与N6、F8、N17或VRC27的序列相同性。筛选具有分配给IGHV1-2的种系V基因的转录物、CDR3对N6、F8、N17和VRC27的大于60％的序列相同性以及CDR3在10-20个氨基酸范围内的长度以供进一步分析。为去除含有测序错误的PCR复制物和转录物，用USEARCH进行两步聚类。首先，对呈现100％序列相同性的转录物聚类并通过测序覆盖对转录物排序。然后，高覆盖的转录物用作呈现97％序列相同性时进行第二步聚类的种子或中心。从含有多于1个转录物的每个群集中选择一个代表性序列，然后，每一时间点处生成校对的独特数据集。然后，我们从校对的数据集中手动去除非相关转录物。
为发现谱系相关轻链转录物，首先我们鉴定了含有VRC01类57的CDR3标记(X-X-[AFILMYWV,SEQ ID NO:72]-[EQ]-X)的转录物。然后进行两步聚类以去除含有测序错误(参见重链数据处理)的PCR复制物和转录物。最后，每一时间点处生成校对的独特轻链数据集并手动去除非相关转录物。
中间体的***发生分析和推理用Muscle对重链和轻链的谱系相关转录物进行单独比对并手动调节。用MEGA678构建重链和轻链的最大似然***发生树。用MEGA6选择为匹配序列数据集78的最佳总体模型的GTR+G+Ι取代模型用于估计遗传距离。在用Γ分布建模异质率时，使用5个类别。分别用IGHV1-2*02和IGKV1-33*01使重链和轻链的***发生树生根。将生根的***发生树和比对的序列输入MEGA6以用最大似然法78推断出中间物。J.Virol.,86,5844-5856,2012
实施例2
使用gp120特异性抗体检测样品或对象中的HIV-1
本实施例描述了使用gp120特异性HIV-1单克隆中和抗体检测样品或对象中的HIV-1。本实施例进一步描述了使用这些抗体证实对象中HIV-1感染的诊断。
从诊断有、筛查出有或疑似有HIV-1感染的患者获得生物样品如血液样品。用从未被感染的患者提取的血液样品作为对照，尽管也可用标准结果作为对照。进行ELISA来检测血液样品中gp120的存在。根据本领已知方法(参见例如Robinson等,Lancet 362:1612-1616,2003，其通过引用并入本文)将血液样品(患者样品和对照样品)中存在的蛋白固定化在固体支持物如96孔板上。固定化后，将用荧光标记直接标记的gp120特异性HIV-1单克隆中和抗体应用于蛋白固定化板。所述板用适当缓冲液如PBS洗涤以去除任何未结合的抗体以最小化抗体的非特异性结合。根据标准方法采用荧光板读取仪检测荧光。患者样品相对于对照样品的荧光强度的增加表明来自血液样品的gp120抗体特异性结合的蛋白，从而检测样品中存在gp120蛋白。患者样品中检测gp120蛋白表明所述患者具有HIV-1感染，或证实对象中HIV-1感染的诊断。
实施例3
用gp120特异性单克隆抗体治疗HIV-1
本实施例描述了一种可用于通过施用一种或多种gp120特异性人中和单克隆抗体来治疗人类对象中HIV-1感染的特定方法。尽管提供了特定施用方法、剂量和模式，但是本领域技术人员将理解的是上实质性不影响治疗的情况下作改变。
基于本文公开的教导，可通过施用治疗有效量的本文所述的一种或多种中和单克隆抗体来治疗HIV-1感染，从而降低或消除HIV-1感染。
筛选对象
在特定实施例中，首先筛选对象来确定他们是否有HIV-1感染。用于筛查HIV-1感染的方法的实例包括将对象的CD4+T细胞计数与HIV-1病毒在血液血清中的水平的测定的组合。采用本文所述的gp120特异性单克隆抗体的额外方法也可用于筛查HIV-1感染。
在一些实例中，HIV-1测试包括用酶联免疫测定(ELISA)进行初始筛选以检测针对HIV-1的抗体。除非有新暴露于感染的伙伴或未知HIV-1状态的伙伴的情况发生，否则将具有来自初始ELISA的未反应结果的样本视为HIV-1阴性。对具有反应性ELSA结果的样本重复再测试。如任一重复测试的结果是有反应性的，那么报告样本是反复反应性的并用更特异的补充试验(例如Western印迹或免疫荧光测定(IFA))进行证实测试。经ELSA测定是反复反应性的且经IFA测定是阳性的或者经Western印迹测定是反应性的样本被视为HIV-1阳性并标明有HIV-1感染。反复ELSA反应性的样本有时也提供了中间Western印迹结果，该结果可以是应答受感染人中的HIV-1的不完全抗体，或为受感染人中的非特异性反应。IFA可用于证实这些模棱两可的情况中是否存在感染。在一些情况中，一个多月之后收集第二样本并针对具有含糊Western印迹结果的对象再测试。在另外的实例中，核酸测试(例如病毒RNA或前病毒DNA扩增法)在某些情形下也有助于诊断。
在对象血液中检测HIV-1表明对象受HIV-1感染，是接受本文公开的治疗组合物的候选。此外，每毫升CD4+T细胞计数低于350如每毫升200细胞也可表明对象可能有HIV-1感染。
在施用本文公开的治疗组合物之前不要求预筛选。
对象的预治疗
在特定实例中，在施用包括本领域技术人员已知的一种或多种抗逆转录病毒疗法的治疗剂之前先对对象进行治疗。然而，并不总是要求进行此种预治疗，并可经熟练的临床医生决定。
治疗组合物的施用
筛选对象之后，将本文描述的治疗有效剂量的gp120特异性中和单克隆抗体(如N6抗体)施用于对象(如处于感染HIV-1风险或已知感染HIV-1的成年人或新生婴儿)。可将另外药物如抗病毒剂在施用所公开的药剂同时、之前或之后施用于对象。通过本领域已知的任何方法如口服施用、吸入、静脉、肌肉、腹膜内或皮下来实现施用。
为预防、降低、抑制和/或治疗HIV-1或与此有关的状况而施用的组合物的量取决于正在治疗的对象、病症的严重程度和治疗组合物的施用方式。理想地，药剂的治疗有效量是足以预防、降低、和/或抑制、和/或治疗对象的状况(例如HIV-1)而不引起对象中实质性细胞毒性效应的量。有效量可容易地由本领域技术人员例如用建立剂量应答曲线的常规试验来确定。同样地，这些组合物可用惰性稀释剂或药学上可接受的载体配制。
在一个具体实例中，根据HIV-1的特定阶段，每两周以5mg每kg或每两周10mg每kg施用抗体。在一实例中，连续施用抗体。在另一实例中，以50μg每kg施用抗体或抗体片段，每周两次，持续2-3周。
治疗组合物可长期施用(例如持续几个月或几年时间)。
评价
施用一种或多种疗法之后，监控具有HIV-1的对象HIV-1水平的降低、对象CD4+T细胞计数的增加，或与HIV-1疾病相关的一种或多种临床症状的减少。在特定实例中，治疗7天后开始，对对象进行一次或多次分析。采用本领域已知的任何方法监控对象。例如，可获得来自对象的生物样品包括血液，并对HIV-1或CD4+T细胞水平的变化进行评估。
额外治疗
在特定实例中，如果对象稳定或对治疗有少量的、混合的或部分的应答，可在用他们之前接受了期望时间的相同方案和物质制剂进行再评价包括对象寿命之后，对他们再进行治疗。部分应答是在HIV-1感染、HIV-1复制或其组合上有降低，如降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少70％。部分应答也可以是在CD4+T细胞计数上有增加，如至少350个T细胞每微升。
明显的是，在不脱离描述的实施方案的精神的条件下，可改变或修改所述方法或组合物的细节。我们请求保护落入以下权利要求书的范围和精神内的所有这种修改和变化。
序列表
<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
<120> gp120中和抗体及其用途
<130> 4239-94622-03
<150> US 62/136,228
<151> 2015-03-20
<150> US 62/250,378
<151> 2015-11-03
<160> 115
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
115 120
<210> 2
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
100
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Asp Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Arg Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Arg His Ala Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Asn Asp Leu Gln Ser
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu Asp Phe Lys
100
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
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Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Ala Ser Ala
115 120
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Ala Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Asn Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
100
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<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 7
Ala His Ile Leu Phe
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe Arg
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Asp
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<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 9
Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala
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<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu His
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<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
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His Thr Ser Ser Val Glu Asp
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Gln Val Leu Gln Phe
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<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Ala His Ile Leu Tyr
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe Arg
1 5 10 15
Gly
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<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Asp Arg Ser Tyr Asp Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala
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<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Arg Asp Leu His
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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His Ala Ser Ser Val Glu Asp
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Gln Val Leu Glu Ser
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Xaa
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<223> X is G or D
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Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Xaa Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
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His Xaa Ser Ser Val Glu Asp
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<221> MISC_FEATURE
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Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe
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Leu Leu Ile Pro Asp Thr
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys
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Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
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50 55 60
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65
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Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
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65
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
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20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
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Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
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<211> 42
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<400> 33
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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20 25 30
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35 40
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<220>
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<400> 34
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210> 35
<211> 856
<212> PRT
<213> human immunodeficiency virus
<400> 35
Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg
1 5 10 15
Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu
20 25 30
Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala
35 40 45
Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu
50 55 60
Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn
65 70 75 80
Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp
85 90 95
Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp
100 105 110
Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser
115 120 125
Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser
130 135 140
Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn
145 150 155 160
Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe
165 170 175
Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys
180 185 190
Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val
195 200 205
Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala
210 215 220
Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr
225 230 235 240
Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser
245 250 255
Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile
260 265 270
Arg Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu
275 280 285
Asn Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg
290 295 300
Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile
305 310 315 320
Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala
325 330 335
Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln
340 345 350
Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp
355 360 365
Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr
370 375 380
Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp
385 390 395 400
Ser Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu
405 410 415
Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys
420 425 430
Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn
435 440 445
Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu
450 455 460
Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg
465 470 475 480
Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val
485 490 495
Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala
500 505 510
Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser
515 520 525
Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu
530 535 540
Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu
545 550 555 560
Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu
565 570 575
Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu
580 585 590
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val
595 600 605
Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn
610 615 620
His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser
625 630 635 640
Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn
645 650 655
Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp
660 665 670
Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met Ile
675 680 685
Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser Ile
690 695 700
Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr His
705 710 715 720
Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu
725 730 735
Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly Ser
740 745 750
Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser Tyr
755 760 765
His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu Leu
770 775 780
Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu Leu
785 790 795 800
Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn
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Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val
820 825 830
Val Gln Gly Ala Cys Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile Arg
835 840 845
Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu
850 855
<210> 36
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 36
cgagcgcacc tggtacaatc agggactgcg atgaagaaac cgggggcctc agtaagagtc 60
tcctgccaga cctctggata cacctttacc gcccacatat tattttggtt ccgacaggcc 120
cccgggcgag gacttgagtg ggtggggtgg atcaagccac aatatggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcgggacag ggtcacattg actcgagacg tatatagaga gattgcgtac 240
atggacatca gaggccttaa acctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaccgt 300
tcctatggcg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tccgcg 366
<210> 37
<211> 309
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 37
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<210> 71
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<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 71
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<213> artificial sequence
<220>
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1 5
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gln Met Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Met Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ile Asp Cys
20 25 30
Thr Leu Asn Trp Ile Arg Leu Ala Pro Gly Lys Arg Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Leu Lys Pro Arg Gly Gly Ala Val Asn Tyr Ala Arg Pro Leu
50 55 60
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Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Thr Arg Gly Lys Asn Cys Asp Tyr Asn Trp Asp Phe Glu His Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Pro Val Ile Val Ser Ser
115 120
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<211> 104
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ala Ile Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Tyr Gly Ser Leu Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val Ile Tyr Ser
35 40 45
Gly Ser Thr Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg
50 55 60
Trp Gly Pro Asp Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser Gly Asp
65 70 75 80
Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Phe Phe Gly Gln Gly Thr
85 90 95
Lys Val Gln Val Asp Ile Lys Arg
100
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<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 75
Gln Arg Leu Val Gln Ser Gly Pro Gln Val Arg Lys Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Val Arg Ile Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ala Tyr Ile
20 25 30
Leu His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Ser Phe Glu Trp Met Gly
35 40 45
Trp Ile Lys Pro Lys Phe Gly Ala Val Asn Tyr Ala His Ser Phe Gln
50 55 60
Gly Arg Ile Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Glu Thr Ala Phe Leu
65 70 75 80
Asp Leu Thr Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Arg Leu Tyr Asp Gly Ser Ser Trp Arg Leu Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Arg Val Val Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 76
Phe Ala Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Pro Pro Lys Ile Leu Ile
35 40 45
His His Ala Ser Ala Arg Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Ser His Thr Ser Phe Ile Phe Thr Ile Asn Asp Leu Gln Leu
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Gln
85 90 95
Gly Thr Arg Leu Asp Ile Asn
100
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<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Asn Trp Phe Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 79
Arg Gly His Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Ile Leu His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Lys Tyr Gly Ala Val Asn Tyr Ala His Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Val Tyr Asp Asp Ser Ser Trp Gln Leu Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Arg Gly His Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Lys Tyr Gly Ala Val Asn Tyr Ala His Ala Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Val Tyr Asp Asp Ser Ser Trp Gln Leu Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser
115 120
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<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 81
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
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Ile Leu Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Asp Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
115 120
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<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 82
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
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Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
115 120
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<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 83
Ser Gln Arg Leu Val Gln Ser Gly Pro Gln Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Ile Leu His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Lys Phe Gly Ala Val Asn Tyr Ala His Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Glu Ile Ala Phe
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Leu Asp Leu Thr Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Leu Tyr Asp Gly Ser Ser Trp Arg Leu Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Arg Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 102
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 84
Tyr Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Val Gly Asn Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Thr Phe Thr Ile Asn Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Gln
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Gly Thr Arg Leu Glu Ile
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 85
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Val Gly Asn Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Phe His Thr Ser Phe Thr Phe Thr Ile Asn Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Gln
85 90 95
Gly Thr Arg Leu Glu Ile
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<213> homo sapiens
<400> 86
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Ala Ser Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Gln
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Gly Thr Arg Leu Glu Ile
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<213> homo sapiens
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Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
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Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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His His Ala Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Arg
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Gly Ser Arg Leu Asp Ile
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<213> homo sapiens
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Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
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Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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His His Ala Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Ser Phe Gly Arg
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Gly Ser Arg Leu Asp Ile
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<213> homo sapiens
<400> 89
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
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Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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His His Ala Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Asn Asp Leu Gln Ala
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Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
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Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Leu His Trp Tyr Gln His Lys Arg Gly Arg Pro Pro Lys Ile Leu Ile
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<213> homo sapiens
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
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His His Ala Ser Ala Arg Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Glu Ser Phe Gly Gln
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Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
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Leu His Trp Tyr Gln His Lys Arg Gly Arg Pro Pro Lys Ile Leu Ile
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His His Ala Ser Ala Arg Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Thr Phe Thr Ile Asn Asp Leu Gln Pro
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<213> homo sapiens
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Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Asp
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Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
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Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
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Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 95
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> antibody heavy chain
<400> 95
cgagcgcacc tggtacaatc agggactgcg atgaagaaac cgggggcctc agtaagagtc 60
tcctgccaga cctctggata cacctttacc gcccacatat tattttggtt ccgacaggcc 120
cccgggcgag gacttgagtg ggtggggtgg atcaagccac aatatggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcgggacag ggtcacattg actcgagacg tatatagaga gattgcgtac 240
atggacatca gaggccttaa acctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaccgt 300
tcctatggcg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tccgcggcgt cgaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 96
<211> 210
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 96
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
100 105 110
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
115 120 125
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
130 135 140
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
145 150 155 160
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
165 170 175
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
180 185 190
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
195 200 205
Glu Cys
210
<210> 97
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<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 97
tacatccacg tgacccagtc tccgtcctcc ctgtctgtgt ctattggaga cagagtcacc 60
atcaattgcc agacgagtca gggtgttggc agtgacctac attggtatca acacaaaccg 120
gggagagccc ctaaactctt gatccaccat acctcttctg tggaagacgg tgtcccctca 180
agattcagcg gctctggatt tcacacatct tttaatctga ccatcagcga cctacaggct 240
gacgacattg ccacatatta ctgtcaagtt ttacaatttt tcggccgagg gagtcgactc 300
catattaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360
ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctaccc cagagaagcc 420
aaagtgcagt ggaaggtgga caacgccctg cagagcggaa acagccagga aagcgtgaca 480
gagcaggatt ccaaggattc cacatacagc ctgagcagca cactgacact gtccaaggcc 540
gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc gaagtgacac accagggact gtcctcccct 600
gtgacaaaga gcttcaacag aggagaatgc 630
<210> 98
<211> 452
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 98
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Glu Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 99
<211> 1356
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 99
cgagcgcacc tggtacaatc agggactgcg atgaagaaac cgggggcctc agtaagagtc 60
tcctgccaga cctctggata cacctttacc gcccacatat tattttggtt ccgacaggcc 120
cccgggcgag gacttgagtg ggtggggtgg atcaagccac aatatggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcgggacag ggtcacattg actcgagacg tatatagaga gattgcgtac 240
atggacatca gaggccttaa acctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaccgt 300
tcctatggcg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tccgcggcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcgaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgccttg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 100
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 100
cgagggcact tggtgcagtc agggactgag gtgaagaaac cgggggcctc agtgagagtc 60
tcctgcgaga cttctggata caccttcacc gcctacattt tacattggtt ccgacaggcc 120
cccggacgag ggcttgagtg gatggggtgg atcaagccaa aatatggagc cgtcaattat 180
gctcatgcat ttcagggcag ggtcaccctg accagagaca tatatagaga cactgcatac 240
atggacttga gtggcctaag attcgacgac acggccgtct attactgtgc gagagatcgc 300
gtttatgacg attcgtcttg gcaattggat ccctggggcc agggaacttc ggtcatcgtc 360
tcctca 366
<210> 101
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 101
cgagggcact tggtgcagtc agggactgag gtgaagaaac cgggggcctc agtgagagtc 60
tcctgcgaga cttctggata caccttcacc gcccacattt tacattggtt ccgacaggcc 120
cccggacgag ggcttgagtg gatggggtgg atcaagccaa aatatggagc cgtcaattat 180
gctcatgcat ttcagggcag ggtcaccctg accagagaca tatatagaga cactgcatac 240
atggacttga gtggcctaag attcgacgac acggccgtct attactgtgc gagagatcgc 300
gtttatgacg attcgtcttg gcaattggat ccctggggcc agggaacttc ggtcatcgtc 360
tcctca 366
<210> 102
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 102
cgagcgcact tggtgcagtc agggactgcg gtgaagaaac cgggggcctc agtgagagtc 60
tcctgcgaga cttctggata caccttcacc gcccacattt tatattggtt ccgacaggcc 120
cccggacgag ggcttgagtg ggtggggtgg atcaagccac aatatggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcggggcag ggtcaccctg accagagaca tatatagaga cactgcatac 240
atggacatca gtggcctaag attcgacgac acggccgtct attactgtgc gagagatcgc 300
tcctatgacg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tccgcg 366
<210> 103
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 103
cgagcgcacc tggtacaatc agggactgcg atgaagaaac cgggggcctc agtaagagtc 60
tcctgccaga cctctggata cacctttacc gcccacatat tattttggtt ccgacaggcc 120
cccgggcgag gacttgagtg ggtggggtgg atcaagccac aatatggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcgggacag ggtcacattg actcgagaca tatatagaga gattgcgtac 240
atggacatca gaggccttaa acttgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaccgt 300
tcctatggcg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tccgcg 366
<210> 104
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 104
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Asp Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Arg His Thr Thr Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Val Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
100
<210> 105
<211> 309
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 105
tacatccacg tgacccagtc tccgtcctcc ctgtctgtgt ctattggaga cagagtcacc 60
atcaattgcc agacgagtca gggtgttggc agtgacctac attggtatca acacaaaccg 120
gggagagacc ctaaactctt gatccgccat accacttctg tggaagacgg tgtcccctca 180
agagtcagcg gctctggatt tcacacatct tttaatctga ccatcagcga cctacaggct 240
gacgacattg ccacatatta ctgtcaagtt ttacaatttt tcggccgagg gagtcgactc 300
catattaaa 309
<210> 106
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 106
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Ala Ser Ser Val Asp Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Asn Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
100
<210> 107
<211> 309
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 107
tacatccacg tgacccagtc tccgtcctcc ctgtctgtgt ctattggaga cagggtcacc 60
atcaattgcc agacgagtca gggtgttggc agtgacctac attggtatca acacaagccg 120
gggagagccc ctaaactctt gattcatcat gcctcttctg tggacgacgg tgtcccgtca 180
agattcagtg gctctggatt tcacacatct tttaatctga ccatcaacga cctacaggct 240
gacgacattg ccacatatta ctgtcaggtt ttacaatttt tcggccgagg gagtcgactc 300
catattaaa 309
<210> 108
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 108
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Ala Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Asn Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Ser Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu Asp Thr Lys
100
<210> 109
<211> 309
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 109
tacatccacg tgacccagtc tccgtcctcc ctgtctgtgt ctatagggga cagagtcacc 60
atcaattgcc agacgagtca gggtgttggc agtgacctac attggtatca acacaaaccg 120
gggagagccc ctaaactcct gatccaccat gcctcttctg tggaggacgg tgtcccgtca 180
agattcagtg gcactggatt tcacacatct tttaatttga ccatcaacga cctgcaggct 240
gacgacattg gcacttatta ctgtcaggtg ttacaatctt tcggccgagg gagtcgactg 300
gatactaaa 309
<210> 110
<211> 103
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 110
Tyr Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Phe Gly Arg Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His His Ala Pro Tyr Val Asp Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Asn Asp Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Leu His Ile Lys
100
<210> 111
<211> 309
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 111
tacatccacg tgacccagtc tccgtcctcc ctgtctgtgt ctattggaga cagggtcacc 60
atcaattgcc agacgagtca gggttttggc agggacctac attggtatca acacaagccg 120
gggagagccc ctaaactctt gattcatcat gccccttatg tggacgacgg tgtcccttca 180
agattcagtg gctctggatt tcacacatct tttaatctga ccatcaacga cctacaggct 240
gacgacattg ccacatatta ctgtcaggtt ttacaatttt tcggccgagg gagtcgactc 300
catattaaa 309
<210> 112
<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 112
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser
115 120
<210> 113
<211> 363
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 113
cgagcgcacc tggtacaatc agggactgcg atgaagaaac cgggggcctc agtaagggtc 60
tcctgccaga cttctggata cacctttacc gcccacatat tattttggtt ccgacaggcc 120
cccgggcgag ggctggagtg ggtgggatgg atcaagccac aatacggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcgggacag ggtcacattg actcgagaca tatatagaga gattgcatac 240
atggacatca gaggccttaa acttgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaccgt 300
tcctatggcg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tcc 363
<210> 114
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 114
Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val Asn Phe Gly Gly Gly Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser Trp Ala Leu Asp Ala Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
115 120
<210> 115
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 115
cgagcgcacc tggtacaatc agggactgcg atgaagaaac cgggggcctc agtaagggtc 60
tcctgccaga cttctggata cacctttacc gcccacatat tattttggtt ccgacaggcc 120
cccgggcgag ggctggagtg ggtgggatgg atcaagccac aatacggggc cgtgaatttt 180
ggtggtggtt ttcgggacag ggtcacattg actcgagaca tatatagaga gattgcatac 240
atggacatca gaggccttaa acttgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaccgt 300
tcctatggcg actcctcttg ggccttagat gcctggggac agggaacgac ggtcgtcgtc 360
tccgcg 366

Claims (50)

1.一种分离的单克隆抗体，包括：
(a)包含SEQ ID NO:1(N6 VH)、SEQ ID NO:3(N17 VH)或SEQ ID NO:5(F8 VH)所示的VH的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，或者包含与SEQ ID NO:1、3或5之一至少90％相同的氨基酸序列的VH；
(b)包含SEQ ID NO:2(N6 VL)、SEQ ID NO:4(N17 VL)或SEQ ID NO:6(F8 VL)所示的VL的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区(VL)，或者包含与SEQ ID NO:2、4或6之一至少90％相同的氨基酸序列的VL；或
(c)(a)与(b)的组合；以及
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合HIV-1 gp120并中和HIV-1感染。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中与包含分别由SEQ ID NO:1和2所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，总体上所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列共包含最多10个氨基酸取代。
3.权利要求2的分离的单克隆抗体，其中与包含分别由SEQ ID NO:1和2所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，总体上所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列共包含最多5个氨基酸取代。
4.权利要求2的分离的单克隆抗体，与包含分别由SEQ ID NO:1和2所示的VH和VL的N6抗体的相应CDR序列相比，在每个CDR中包含不超过1个氨基酸取代。
5.权利要求2-4任一项的分离的单克隆抗体，其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
6.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含由SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24所示的共有氨基酸序列。
7.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中：
所述HCDR1包含SEQ ID NO：7或13所示的氨基酸序列；
所述HCDR2包含SEQ ID NO：8或14所示的氨基酸序列；
所述HCDR3包含SEQ ID NO：9或15所示的氨基酸序列；
所述LCDR1包含SEQ ID NO：10或16所示的氨基酸序列；
所述LCDR2包含SEQ ID NO：11或17所示的氨基酸序列；以及
所述LCDR3包含SEQ ID NO：12或18所示的氨基酸序列。
8.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含由SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18或分别由SEQID NO:7、8、9、10、17和18所示的氨基酸序列。
9.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含由SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列(N6CDR)。
10.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，其中
所述VH包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列；
所述VL包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列；或
所述VH和VL分别包含与SEQ ID NO：1和2至少90％相同的氨基酸序列。
11.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，其中
所述VH包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
所述VL包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或
所述VH和VL分别包含由SEQ ID NO：1和2所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-9任一项的分离的单克隆抗体，其中：
所述VH包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至少90％相同的氨基酸序列；
所述VL包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少90％相同的氨基酸序列；或
所述VH和VL分别包含与SEQ ID NO：3和4至少90％相同的氨基酸序列或分别包含与SEQID NO：5和6至少90％相同的氨基酸序列。
13.权利要求1-9任一项的分离的单克隆抗体，其中：
所述VH包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
所述VL包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或
所述VH和VL分别包含由SEQ ID NO：3和4或分别包含由SEQ ID NO：5和6所示的氨基酸序列。
14.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，其中
(a)所述VH在kabat位置50处包含色氨酸残基；
(b)所述VH在kabat位置54处包含酪氨酸残基；
(c)所述VH在kabat位置58处包含天冬酰胺残基；
(d)所述VH在kabat位置60-62处包含甘氨酸残基；
(e)所述VH在kabat位置71处包含精氨酸残基；
(f)所述VL在kabat位置28和30处包含甘氨酸残基；
(g)所述VL在kabat位置91处包含疏水性残基；
(h)所述VL在kabat位置96处包含谷氨酸或谷酰胺残基；
(i)所述VL包含LCDR3，根据kabat定位，所述LCDR3的长度为5个氨基酸；或
(j)(a)-(i)中两个或更多个的组合。
15.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，其中
所述VH包含VH1-2种系来源，其与种系基因有20-35％的趋异性；
所述VL包含IGKV3-11、IGKV3-20、IGKV1-33或IGLV2种系来源，其与相应的种系基因有15-35％的趋异性。
16.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，包括人框架区。
17.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是IgG、IgM或IgA，特别地其中所述抗体是IgG并且包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列。
18.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体，包括重组恒定结构域，所述重组恒定结构域包含增加与新生儿Fc受体结合的修饰。
19.权利要求18的分离的单克隆抗体，其中所述重组恒定结构域是包含M428L和N434S突变的IgG1恒定结构域。
20.权利要求1-15任一项的分离的单克隆抗体的抗原结合片段。
21.权利要求20的抗原结合片段，包括所述分离的单克隆抗体的VH和VL。
22.权利要求20或权利要求21的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是FV、Fab、F(ab’)2、scFV或scFV2片段。
23.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合gp120上的CD4结合位点。
24.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以<50μg/ml的抑制浓度(IC50)中和至少50％的图2B中列出的HIV-1分离株(6540.v4.c1、620345.c1、T278-50、6322.V4.C1、DU422.01、X2088.c9、6545.V4.C1、242-14、T250-4、7165.18、BL01.DG、HO86.8、6471.V1.C16、6631.V3.C10、TVI.29、TZA125.17、CAP210.E8、DU172.17)。
25.一种分离的双特异性抗体，包括前述权利要求任一项的分离的人单克隆抗体或抗原结合片段。
26.权利要求25的分离的双特异性抗体，其中所述抗体特异性结合gp120和CD3。
27.前述权利要求任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其与效应分子或可检测标记连接。
28.权利要求27的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述可检测标记为荧光标记、酶标记或放射性标记。
29.一种编码权利要求1-28任一项的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
30.一种编码权利要求1-28任一项的抗体或抗原结合片段的VH和/或VL的分离的核酸分子。
31.权利要求29或权利要求30的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为重组核酸分子。
32.权利要求29-31任一项的分离的核酸分子，包括编码所述抗体或所述抗原结合片段的cDNA分子。
33.权利要求29-32任一项的分离的核酸分子，其中所述抗体或抗原结合片段的VH和/或VL分别由如下所示的核酸序列编码：
(a)SEQ ID NO:36和37，或其简并变体；
(b)SEQ ID NO:38和39，或其简并变体；或
(c)SEQ ID NO:40和41，或其简并变体。
34.权利要求29-33任一项的分离的核酸分子，其进一步编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含胞外结构域，其中所述胞外结构域包含由所述核酸分子编码的抗原结合片段。
35.权利要求29-34任一项的分离的核酸分子，其可操作地连接启动子。
36.一种表达载体，包含权利要求29-35任一项的核酸分子。
37.权利要求36的表达载体，其中所述表达载体为病毒载体，特别地其中所述病毒载体为腺伴随病毒载体。
38.一种分离的宿主细胞，其用权利要求29-37任一项的核酸分子或表达载体转化。
39.一种用于治疗HIV-1感染的药物组合物，包含：
治疗有效量的权利要求1-38任一项的抗体、抗原结合片段、核酸分子、表达载体或宿主细胞；以及
药学上可接受的载体。
40.权利要求39的药物组合物，其中所述组合物是无菌的和/或为单位剂型或其多剂量形式。
41.一种生产特异性结合HIV-1 gp120的抗体的方法，包括:
在宿主细胞中表达包含权利要求29-35任一项的核酸分子的异源核酸分子以生产所述抗体或抗原结合片段。
42.权利要求41的方法，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
43.权利要求41或权利要求42的方法，进一步包括纯化所述特异性结合HIV-1 gp120的抗体。
44.一种检测对象中HIV-1感染的方法，包括：
在足以形成免疫复合物的条件下将来自对象的生物样品与权利要求1-28任一项的抗体或抗原结合片段接触；以及
检测所述样品中是否存在所述免疫复合物，其中所述样品中存在所述免疫复合物表明所述对象有HIV-1感染。
45.一种预防或治疗对象中HIV-1感染的方法，包括
向所述对象施用治疗有效量的权利要求1-40任一项的抗体、抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物，从而预防或治疗HIV-1感染。
46.权利要求45的方法，其中所述对象处于HIV-1感染的风险中或有HIV-1感染。
47.权利要求46的方法，其中所述对象患有AIDS。
48.权利要求45-47任一项的方法，进一步包括向所述对象施用额外的抗体、抗原结合片段或编码所述额外的抗体或抗原结合片段的核酸，其中所述额外的抗体或抗原结合片段特异性结合HIV-1 Env并中和HIV-1感染。
49.一种试剂盒，包括包含权利要求1-40任一项的抗体、抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物的容器和使用所述试剂盒的说明书。
50.权利要求1-40任一项的抗体、抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物在抑制或治疗对象HIV-1感染中的用途。
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