CN108135961A

CN108135961A - 调控免疫反应的方法及多肽

Info

Publication number: CN108135961A
Application number: CN201680034380.8A
Authority: CN
Inventors: 吕衍达; 张家鸣; 魏采音
Original assignee: MacKay Memorial Hospital
Current assignee: MacKay Memorial Hospital
Priority date: 2015-06-12
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2018-06-08
Also published as: CA2988623A1; KR20180017152A; EP3307297A1; US20180362651A1; KR20180012856A; CA2988623C; KR20220005627A; RU2018100549A; KR102661066B1; HK1254289A1; CA2988641A1; AU2016276509B2; EP3307782A1; JP2018524300A; RU2018100545A3; AU2016276509A1; KR20230091184A; RU2734169C2; AU2016274175B2; US11685785B2

Abstract

本发明发现TLT‑1直接结合至免疫细胞并触发细胞从而表现免疫抑制表型；即，下调HLA‑DR并上调PD‑L1。通过TLT‑1或TLT‑1衍生的多肽诱导PD‑L1并降低HLA‑DR可因此用于治疗与免疫高反应性相关的疾病，例如自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥及移植物抗宿主病症。

Description

调控免疫反应的方法及多肽

技术领域

本发明涉及免疫反应的调控。特定地，本发明涉及通过使TLT-1直接结合至免疫细胞且触发细胞表达免疫抑制表型来调控免疫反应的方法及多肽。

背景技术

血小板是重要的止血介体。最新进展表明，血小板可影响先天性及适应性免疫反应二者。经活化血小板可释放可溶性介体(例如可溶性CD40L)，这些介体与白血球相互作用以调控发炎过程且可促使患有败血症的患者的免疫失调。TREM样转录物-1(TLT-1)仅在静息血小板巨核细胞的α颗粒中及经活化血小板的表面上观察到。TLT-1是TREM家族的成员，所述TREM家族由单一V-set免疫球蛋白(Ig)结构域、短胞质尾区及跨膜结构域中的带电残基组成。使用针对TLT-1的抗体的最新研究揭示蛋白质在凝血酶诱导的血小板凝集中的作用(Giomarelli B、Washington VA、Chisholm MM、Quigley L、McMahon JB等人，(2007)Inhibition of thrombin-induced platelet aggregation using human single-chainFv antibodies specific for TREM-like transcript-1.Thromb Haemost 97:955-963)。US7553936 B2涉及调控血小板活性的方法及组合物及用于治疗个体的与血小板活性相关的疾病或病症的方法及组合物，其包括以有效调控血小板活性的量投与单链抗TREM样转录物-1(TLT-1)抗体或其功能性片段或变体。

在正常人类血清中观察到TLT-1细胞外结构域的小的可溶性片段(12及14kDa)，但在血浆中未观察到。研究已显示TLT-1可通过与纤维蛋白原连接以促进血小板凝聚用作止血的调节剂，且亦展示高含量的可溶性TLT-1(sTLT-1)与散播性血管内凝血评分间的显著相关性。US 20040180409 A1提供TLT-1核酸及蛋白分子，其可在各种细胞过程(例如，血液凝固及免疫反应)的调节中用作调控剂。血浆中的经延长sTLT-1表达与患有败血性休克的患者的缩短存活期相关(Washington A V、Gibot S、Acevedo I、Gattis J、Quigley L等人，(2009)TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associatedhemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans.J ClinInvest 119:1489-1501)。US20130029921 A1揭示TLT-1及TLT-1衍生的肽通过特异性抑制TREM-1活性展现抗发炎性质。最近，Derive等人展示sTLT-1可结合至可溶性TREM-1配体，从而干扰白血球活化(Derive M、Bouazza Y、Sennoun N、Marchionni S、Quigley L等人，(2012)Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation andcontrols microbial sepsis.J Immunol 188:5585-5592)。总之，sTLT-1的这些临床及活体外研究表明其可具有双重效应，在血小板凝聚中起作用且在败血症期间调介白血球功能。

因此，仍需要开发用于调控免疫反应的药剂或疗法。

发明内容

本发明提供调控免疫反应的方法，其包括使TREM样转录物1(TLT-1)多肽结合至免疫细胞，其中TLT-1多肽至免疫细胞的结合抑制免疫反应。在一实施例中，TLT-1多肽至免疫细胞的结合治疗及/或预防与免疫高反应性相关的疾病；优选地，所述疾病是自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥或移植物抗宿主病症。在一些实施例中，TLT-1多肽是下文所述的彼等。

本发明亦提供多肽，其包括包含SEQ ID NO:1、2或42的至少5个氨基酸或与SEQ IDNO:1、2或42具有至少约50％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列或其生物活性片段或变体。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO:1、2或42中所述的氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列；优选地，多肽包括SEQ ID NO:1、2或42中所述的氨基酸序列。在一实施例中，所述多肽是重组多肽或合成多肽。

在一些实施例中，多肽经聚乙二醇化或与组织靶标分子、白蛋白或血清白蛋白结合肽偶联。在一些实施例中，多肽与组织靶标分子、白蛋白或血清白蛋白结合肽融合。

本发明进一步提供包括本发明的TLT-1多肽及医药上可接受的载剂的组合物。本发明亦提供治疗及/或预防与免疫高反应性相关的疾病的方法，其包括向个体投与本发明的TLT-1多肽或包括TLT-1多肽的组合物。

本发明进一步提供TLT-1融合蛋白，其包括与一或多个异质多肽或本发明的其他TLT-1多肽融合的本发明的TLT-1多肽。

本发明进一步提供经聚乙二醇化的TLT-1多肽，其包括一或多个可操作地连接至本发明的TLT-1多肽的N-末端的至少一个氨基酸残基的聚乙二醇(PEG)分子。

本发明进一步提供TLT-1多肽偶联物，其包括偶联至免疫抑制剂的本发明的TLT-1多肽。

图式简单说明

图1显示TLT-1与白血球间的相互作用。将PBMC与rsTLT-1一起培育1小时并用生物素-山羊抗TLT-1抗体APC-抗生物素蛋白染色以检测TLT-1的表面结合。(A)绘示各种白血球在TLT-1处理存在或不存在下的代表性FACS直方图。单核球、PMN及淋巴球是基于其FSC/SSC性质设门(粗线直方图，经rsTLT-1处理的细胞；虚线直方图，未经处理的细胞；细虚线直方图，适当同种型对照)。TLT-1与单核球及PMN结合，但不与淋巴球结合。(B)绘示不同浓度的rsTLT-1至单核球及PMN的结合。PMN及单核球能够以剂量依赖方式结合rsTLT-1。数值表示为来自3次独立实验的平均值±SEM。

图2显示sTLT-1对单核球中HLA-DR及PD-L1分子的表面表达的效应。(A)将单核球与rsTLT-1(10μg/ml)一起培育3天。在指示时间点处，收获细胞且使用流式细胞术分析HLA-DR及PD-L1分子。利用rsTLT-1处理导致下调HLA-DR表达的趋势。与此相比，rsTLT-1初免上调PD-L1于单核球上的表达量。(B)将单核球与不同浓度的rsTLT-1一起培育2天。然后收获细胞且使用流式细胞术分析HLA-DR及PD-L1分子。表面分子表达呈现为相对于利用对照培养基处理的细胞(虚线)的每一天的平均荧光强度(MFI)。数值表示为来自3次独立实验的平均值±SEM。

图3显示TLT-1多肽对单核球中PD-L1分子的表面表达的效应。(A)绘示TLT-1的细胞外结构域及所设计TLT-1多肽的结构特征。(B)显示将单核球与不同长度的TLT-1多肽(10μg/ml)及10μg/ml的rsTLT-1一起培育1天。然后收获细胞且使用流式细胞术分析PD-L1分子。表面分子表达呈现为相对于利用培养基对照处理的细胞(虚线)的每一天的MFI。

图4显示TLT-1 15-63多肽对单核球中HLA-DR分子的表面表达的效应。将单核球与10μg/ml的TLT-1 15-63多肽及10μg/ml rsTLT-1一起培育2天。然后收获细胞且使用流式细胞术分析HLA-DR分子。表面分子表达呈现为相对于利用培养基对照处理细胞(虚线)的每一天的MFI。

具体实施方式

在阐述本发明组合物、方法及分离方法前，应理解，本发明并不限于此，此乃因此等组合物、方法及条件可有所变化。亦应理解，本文所用的术语仅出于阐述特定实施例的目的，且并非意欲限制，此乃因本发明的范围将仅受限于随附申请专利范围。

本发明意外发现TLT-1直接结合至免疫细胞并触发细胞以表达免疫抑制表型；即通过结合下调HLA-DR并上调PD-L1。通过TLT-1或TLT-1多肽诱导PD-L1并减少HLA-DR可因此用于治疗与免疫高反应性相关的疾病，例如自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥及移植物抗宿主病症。

定义

除非另外定义，否则本文所用全部技术及科学术语均具有与熟习本发明所属技术领域者通常所了解含义相同的含义。任何与本文所述类似或等效的方法及材料均可用于本发明的实践或测试中，此乃因应了解修改及变化涵盖于本发明的精神及范围内。

除非另有说明，否则“一(a或an)”意指一或多个。

如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙胺酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬胺酸(Asp；D)、精胺酸(Arg；R)、半胱胺酸(Cys；C)、麸胺酸(Glu；E)、麸酰胺酸(Gln；Q)、甘胺酸(Gly；G)、组胺酸(His；H)、异白胺酸(Ile；I)、白胺酸(Leu；L)、离胺酸(Lys；K)、甲硫胺酸(Met；M)、***酸(Phe；F)、脯胺酸(Pro；P)、丝胺酸(Ser；S)、苏胺酸(Thr；T)、色胺酸(Trp；W)、酪胺酸(Tyr；Y)及缬胺酸(Val；V)。

如本文所用，术语“PD-L1”是指程序化死亡配体1(PD-L1)、分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。PD-L1是40kDa 1型跨膜蛋白，其在诸如怀孕、自体免疫性疾病、癌症、败血症及其他传染病(例如结核分枝杆菌、巨细胞病毒及肝炎)的特定事件期间在抑制免疫***中起主要作用。

如本文所用，术语“单核球”亦称为单核白血球，其属涉及一线防御机制的一类白血球且公认为能够分化成树突细胞或巨噬细胞前体。单核球通常在血液***中移动。因应于外部刺激信号，单核球分泌许多免疫调节细胞因子，移动至组织中的感染位点并分化成巨噬细胞。

如本文所用，术语“调控”包含与对照相比通常以统计学上显著或生理学上显著的量“增加”或“刺激”以及“减少”或“降低”。

如本文所用，“一致性”是指两个或两个以上多肽或蛋白质序列间的关系，如通过比较序列所测定。在业内，“一致性”亦是指多肽或蛋白质间的序列相关程度，如通过此等序列串间的匹配所测定。“一致性”可容易地通过已知生物信息方法计算。两个多肽或两个多肽序列的“一致性％”是通过使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package,版本10.3的一部分)使用其预设参数比较序列来测定。

如本文所用，术语“生物活性片段”意指本发明所涵盖多肽的氨基酸片段，所述片段亦具有本文所述多肽的效能。

如本文所用，术语“变体”是指野生型或已通过取代、***、交叉、缺失及/或其他遗传操作改变的氨基酸序列。出于本发明的目的，变体并不受限于生成所述变体的特定方法。在一些实施例中，变体序列与亲代序列相比可具有增加、减少或实质上类似的活性或性质。在一些实施例中，多肽与野生型多肽的氨基酸序列相比可含有一或多个已突变的氨基酸残基。在一些实施例中，在构成大多数的变体多肽中，多肽的一或多个氨基酸残基与亲代多肽相比可保持恒定、不变或未经取代。在一些实施例中，亲代多肽是作为生成具有经改良的稳健性或其他性质的变体的基础。变体亦可在二级结构、四级结构及折迭程度中的至少一者方面中不同。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”各自是指包括两个或两个以上通过肽键彼此连结的氨基酸残基的分子。这些术语涵盖(例如)天然及人工蛋白质、蛋白质片段及蛋白质序列的多肽类似物(例如变体及融合蛋白)以及翻译后修饰或以其他方式共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白质可是单体或聚合物。

如本文所用，术语“多肽片段”是指与相应全长蛋白质相比，胺基末端及/或羧基末端缺失的多肽。片段亦可由蛋白水解(或其他)处理产生，所述处理(例如)导致一至五个氨基酸的胺基及/或羧基末端与所预计相比有所变化。片段可进一步在其末端的一或两者处包括一或多个额外氨基酸，例如来自不同的天然蛋白质的氨基酸序列或人工氨基酸序列(例如，人工连接体序列或标签蛋白)。

如本文所用，术语“医药上可接受的载剂”是指医药调配物中除活性成份外对个体无毒的成份。医药上可接受的载剂包含但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，术语“个体”是指脊椎动物、优选地哺乳动物、更佳地人类。哺乳动物包含(但不限于)人类、农场动物、运动动物及宠物。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或期望的临床结果的量。有效量可以一或多次投与来投与。出于本发明的目的，有效量是足以诊断、减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟疾病状态的进展的量。

如本文所用，术语“治疗”(“treatment”、“treating”、“treat”)及诸如此类通常是指获得期望的药理学及/或生理学效应。所述效应在完全或部分预防疾病或其症状方面可为预防性的，及/或在部分或完全稳定或治愈疾病及/或可归因于所述疾病的不良效应方面可为治疗性的。本文所用“治疗(treatment)”涵盖哺乳动物、特定而言人类的疾病的任何治疗，且包括：(a)防止疾病或症状在易患所述疾病或症状但尚未诊断出患有所述疾病或症状的个体中发生；(b)抑制疾病症状，即遏止其发展；或(c)缓解疾病症状，即使所述疾病或症状消退。

本文所用术语“预防”是指阻止疾病状态或病况在患者或个体中发生的预防性(preventative或prophylactic)措施。预防亦可包含降低疾病状态或病况在患者或个体中发生的可能性及阻碍或遏止所述疾病状态或病况的发作。

在提供值的范围的情形中，则应了解，所述范围的上限与下限之间的每一中间值(除非上下文另有明确指示，否则精确至下限的单位的十分之一)及所述范围中的任何其他所述或中间值均涵盖于本发明内。这些较小范围的上限及下限可独立地包含于这些较小范围中且亦涵盖于本发明内，受限于所述范围中任何具体排除的限值。在所述范围包含限值的一或二者的情形中，本发明中亦包含排除彼等所包含限值的任一或二者的范围。

免疫反应的调控

本发明意外发现TLT-1至免疫细胞的直接结合触发细胞以藉助下调HLA-DR及上调PD-L1表现免疫抑制表型。

在一态样中，本发明提供调控免疫反应的方法，其包括使TREM样转录物1(TLT-1)多肽结合至免疫细胞，其中TLT-1多肽至免疫细胞的结合抑制免疫反应。在一实施例中，TLT-1多肽是下文所述的彼等。

在一实施例中，本发明提供治疗及/或预防与免疫高反应性相关的疾病的方法，其包括向个体投与有效量的TLT-1多肽。在一些实施例中，疾病包含(但不限于)自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥及移植物抗宿主病症。

通过TLT-1多肽结合至单核球可诱导PD-L1的表达且可减少HLA-DR，由此治疗与免疫高反应性相关的疾病。能够结合至免疫细胞的任何TLT-1多肽(包含全长TLT-1及其多肽片段)可达成上述对PD-L1及HLA-DR的调控。

TLT-1多肽

本发明惊奇地发现TLT-1细胞外结构域的序列负责至免疫细胞的结合；优选地，包括至少30个氨基酸的序列(TLT-1 34-63)、包括至少49个氨基酸的序列(TLT-1 15-63)或包括至少147个氨基酸的序列(TLT-1 16-162)。通过使TLT-1多肽接合于免疫细胞上可诱导PD-L1的表达且可减少HLA-DR，此表明通过TLT-1或TLT-1多肽的PD-L1的诱导及HLA-DR的减少可因此用于治疗与免疫高反应性相关的疾病，例如自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥及移植物抗宿主病症。

在另一态样中，本发明提供多肽，其包括包含SEQ ID NO:1的至少5个氨基酸或与SEQ ID NO:1具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

ILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLV(SEQ ID NO:1)

在一些实施例中，多肽与SEQ ID NO:1具有至少80％(例如，至少80％、85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的氨基酸序列一致性。

在一实施例中，多肽包括包含SEQ ID NO:2的5个氨基酸或与SEQ ID NO:2中所述氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

GQGIVGSLPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLV(SEQ ID NO:2)

在一些实施例中，多肽与SEQ ID NO:2具有至少80％(例如，至少80％、85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的氨基酸序列一致性。

在一实施例中，多肽包括包含SEQ ID NO:3的5个氨基酸或与SEQ ID NO:42中所述氨基酸序列具有至少约70％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

QGIVGSLPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLVSSAVDRRAPAGRRTFLTDLGGGLLQVEMVTLQEEDAGEYGCMVDGARGPQILHRVSLNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIP(SEQ IDNO:3)

在一些实施例中，多肽与SEQ ID NO:3具有至少70％(例如，至少70％、80％、85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的氨基酸序列一致性。

在一些实施例中，本发明提供多肽，其包括在本文所述的TLT-1氨基酸序列的任一者中的一或多个***、取代及/或缺失。优选地，TLT-1氨基酸序列是SEQ ID NO:1、2或3。

多肽可经由重组方法及化学合成产生。此外，可使用功能上等效的多肽，其中这些效的多肽可含有导致沉默变化的氨基酸残基的缺失、添加或取代，从而产生在路径基因产物上差异性表达的功能等效物。氨基酸取代可基于所涉及残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性及/或两亲性特性方面中的类似性来进行。如本文所用“功能上等效”是指能够展现实质上类似的活体内活性的蛋白质。

可使用此项技术熟知的技术通过重组DNA技术或合成技术产生多肽。熟习此项技术者熟知的方法可用于构筑含有编码序列及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包含(例如)活体外重组DNA技术、合成技术及活体内重组/遗传重组。或者，可化学合成能够编码所关注多肽的RNA。

通常，将编码序列置于在期望宿主细胞中起作用的启动子控制下来产生相对大量的基因产物。熟知种类极多的启动子且可端视特定应用而定用于本发明的表达载体中。一般地，所选择的启动子取决于所述启动子在其中具有活性的细胞。亦视情况包含其他表达控制序列，例如核糖体结合位点、转录终止位点及诸如此类。包含这些控制序列中的一或多者的构筑体称为“表达盒”。表达可利用适于特定宿主细胞的启动子及其他调节剂在原核及真核细胞中达成。实例性宿主细胞包含(但不限于)大肠杆菌(E.coli)、其他细菌宿主、酵母及各种高等真核细胞，例如COS、CHO及HeLa细胞系及骨髓瘤细胞系。

一旦表达，重组多肽可根据业内的标准程序来纯化，包含硫酸铵沈淀、亲和管柱、离子交换及/或粒径排阻层析、凝胶电泳及诸如此类(通常参见R.Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.(1982),Deutscher,Methods in Enzymology第182卷:Guide to Protein Purification.,Academic Press,Inc.N.Y.(1990))。

作为重组方法的替代，多肽可以化学方式合成。此等方法通常包含固态途径，但亦可利用基于溶液的化学方法及组合或固态与溶液途径的组合。用于合成蛋白的固态方法的实例由Merrifield(1964)J.Am.Chem.Soc.85:2149；及Houghton(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.,82:5132阐述。可合成本发明蛋白质的多肽片段且然后连结在一起。实施此等反应的方法由Grant(1992)Synthetic Peptides:A User Guide,W.H.Freemanand Co.,N.Y.及“Principles of Peptide Synthesis,”(Bodansky及Trost编辑),Springer-Verlag,Inc.N.Y.,(1993)中阐述。

在另一态样中，本发明提供TLT-1融合蛋白，其包括与一或多个异质多肽或本发明的其他TLT-1多肽融合的本发明的TLT-1多肽。TLT-1多肽直接或经由氨基酸连接体共价连接至一或多个异质多肽或本发明的另一TLT-1多肽。形成融合蛋白的多肽通常C末端连接至N末端，但其亦可C末端连接至C末端、N末端连接至N末端、N末端连接至C末端。融合蛋白的多肽可呈任一顺序且可包含组成多肽中的任一或两者中的多于一者。异质多肽的实例包含(但不限于)白蛋白、血清白蛋白结合肽、细胞穿透肽(CPP)、组织靶标分子及免疫抑制肽。优选地，异质多肽是白蛋白或血清白蛋白结合肽。

本发明亦提供经聚乙二醇化的TLT-1多肽，其包括一或多个可操作地连接至本发明TLT-1多肽的N-末端的至少一个氨基酸残基的聚乙二醇(PEG)分子。分子的聚乙二醇化可根据(例如)在Youngster等人，Curr Pharm Des(2002),8:2139中所述的方法来实施。任一类型的聚乙二醇均适于本发明，前提是PEG-多肽仍具有可根据此项技术已知的方法分析的功能活性。优选地，本发明的聚乙二醇是PEG 1000、PEG 2000、PEG 3000、PEG 5000、PEG10000、PEG 15000、PEG 20000、PEG 30000、PEG 40000或PEG 50000。在一实例中，经聚乙二醇化的TLT-1多肽包括单体TLT-1多肽。在另一实例中，经聚乙二醇化的分子包括寡聚TLT-1多肽。在又一实例中，经聚乙二醇化的TLT-1多肽包括多臂PEG，其中一或多个单体TLT-1多肽可操作地连接至多臂PEG。

本发明亦包括TLT-1多肽偶联物，其包括偶联至免疫抑制剂、组织靶标分子、白蛋白或血清白蛋白结合肽的本发明的TLT-1多肽。

本发明多肽的组合物

在另一态样中，本发明提供包括本发明的TLT-1多肽的组合物。在一些实施例中，此等组合物可投与个体。在一些实施例中，本发明的TLT-1多肽可提供于包括一或多种其他组份的组合物中，这些组份包含(但不限于)医药上可接受的载剂、佐剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂及/或适于组合物预期用途的任何其他组份。此等组合物可采取溶液、悬浮液、乳液及诸如此类的形式。术语“医药上可接受的载剂”包含各种稀释剂、赋形剂及/或媒剂，本发明的TLT-1多肽、蛋白质及/或蛋白质复合物可提供于其中或与其一起提供。医药上可接受的载剂包含(但不限于)以下载剂：已知对于递送至人类及/或其他动物个体安全、及/或由联邦或州政府的管理机构批准、及/或列示于美国药典(U.S.Pharmacopeia)及/或其他公认药典中、及/或自一或多个公认管理机构获得用于人类及/或其他动物中的特定或个别批准。此等医药上可接受的载剂包含(但不限于)水、水溶液(例如盐水溶液、缓冲剂及诸如此类)、有机溶剂(例如某些醇及油，包含石油、动物、植物或合成来源者，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油)及诸如此类。

在一实施例中，本发明的TLT-1多肽可提供于包括一或多种额外活性组份(例如一或多种额外免疫抑制剂)的组合物中。免疫抑制剂包含(但不限于)糖皮质激素、细胞抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、放线菌素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素、抗CD20抗体、莫罗单抗(muromonab)-CD3、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、环孢素、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、干扰素、类***、TNF结合蛋白、麦考酚酯(mycophenolate)、芬戈莫德(fingolimod)及多球壳菌素(myriocin)。

在一些实施例中，本发明的组合物包括“有效量”的本发明的TLT-1多肽。“有效量”是达成期望最终结果所需的量。有效达成期望最终结果的本发明TLT-1多肽的量将取决于各种因素，包含(但不限于)预期个体的物种(例如人类或一些其他动物物种)、预期个体的年龄及/或性别、计划投与途径、计划投药方案、任何持续性疾病或病况的严重程度及诸如此类。有效量(其可为有效量的范围)可无需任何过多实验而通过标准技术测定，例如在预期个体物种或任何适宜动物模型物种中使用活体外分析及/或活体内分析。适宜分析包含(但不限于)涉及自剂量-反应曲线及/或源生自活体外及/或活体内模型***的其他数据外推的彼等。在一些实施例中，有效量可根据医师或兽医从业人员基于特定情况的判断来确定。

在一实施例中，TLT-1多肽的有效量在每次投与约0.0002mg/kg体重至约20mg/kg体重间的范围内。

投与方法

在一些实施例中，本发明提供包括向个体投与本发明的TLT-1多肽的方法。此等方法可包括用于治疗患有与免疫高反应性相关的疾病的个体的方法，所述疾病例如自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥及移植物抗宿主病症。

可投与本发明的TLT-1多肽、或包含此TLT-1多肽的组合物(例如在治疗方法的期间)的个体包含任何及全部动物物种。在一些实施例中，个体是哺乳动物物种。哺乳动物个体包含(但不限于)人类、非人类灵长类、啮齿类动物、兔及雪貂。

此项技术已知各种递送***且可使用任何适宜递送***以将本发明组合物投与个体。此等递送***包含(但不限于)皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口递送***。本发明的组合物可通过任一方便途径投与，例如通过输注或浓注、通过经上皮或皮肤黏膜衬里(例如，口腔黏膜、直肠及肠黏膜等)吸收，且可与其他生物活性剂一起投与。投与可为全身性或局部。

在一些此等实施例中，优选投与单一剂量。然而，在其他实施例中，可通过相同或不同途径投与额外剂量以达成期望效应。在一些实施例中，投药方案可包括单一投与。在其他实施例中，投药方案可包括多次投与。

实例

以下实例所用的材料及方法阐述于下文中。

人类细胞分离及细胞培养

来自健康志愿者的白血球浓缩物是自台湾血液基金会(Taiwan Blood ServiceFoundation)(台湾台北市(Taipei,Taiwan))获得。获得关于参与此研究的书面知情同意书，所述研究是由马偕纪念医院人体试验委员会(Institutional Review Board of theMacKay Memorial Hospital)批准。如前所述分离人类单核球。简言之，使用Ficoll-PaquePlus(GE Healthcare)梯度离心分离末梢血单核细胞(PBMC)。使用CD14MACS微珠粒(Miltenyi Biotec)通过实施CD14选择进一步纯化单核球。使用流式细胞术分析确认的单核球纯度为约90％。

重组可溶性TLT-1及TLT-1多肽的生成

为生成重组可溶性TLT-1(rsTLT-1)，使用大肠杆菌表达编码N末端具有聚组胺酸标签的人类TLT-1细胞外结构域(Glu16-Pro162)的pET28a(+)-rsTLT-1并使用Ni-NTA管柱(Novagen)将其纯化。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定且使用考马斯蓝(coomassie blue)染色可视化的重组蛋白的纯度为>95％。使用LAL分析(QCL-1000)检查经纯化蛋白质的内毒素污染。所有蛋白质均是无菌的且内毒素浓度低于检测限值(<0.1EU/μg蛋白质)。TLT-1多肽是由Kelowna International Scientific Inc.(台湾台北市)化学合成。

流式细胞分析对于TLT-1结合实验，将PBMC在37℃下在5％CO₂的加湿气氛中于AIM-V培养基(Life Technologies)中培育过夜，以允许血小板自细胞表面脱落。为筛选用于特异性结合TLT-1的白血球，将经分离PBMC与不同浓度TLT-1及竞争肽一起在37℃培育1小时。然后洗涤细胞并用经生物素偶联的山羊抗TLT-1抗体(R&D Systems)染色。单核球、多型核白血球(PMN)及淋巴球是基于其FSC/SSC性质设门。为分析经TLT-1或TLT-1多肽初免的单核球的表面表型，将细胞于冰上黑暗中与以下稀释于含有1％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的mAbs一起培育30分钟：HLA-DR-PE、PD-L1-FITC、CD14-PerCP(BD Biosciences)。使用FACS Calibur检测荧光，且使用FCS Express version 3(De Novo Software)实施数据分析。

统计学分析

数据是使用Prism 6.0(GraphPad)分析并表示为平均值±SEM。使用司徒顿t测试(Student’s t test)实施群组间比较。使用皮尔森相关系数(Pearson’s correlationcoefficient)测定相关性。P值<0.05视为显著。

实例1 TLT-1与白血球间的相互作用

为测定TLT-1是否结合至白血球，将白血球与10μg/ml rsTLT-1一起培育1小时且然后通过使用流式细胞术检测TLT-1的细胞表面结合。如图1A所示，检测到rsTLT-1与PMN及单核球结合，但未与淋巴球结合。此外，观察到PMN及单核球结合rsTLT-1的结合是剂量依赖性的(图1B)。这些结果表明TLT-1的受体存在于人类PMN及单核球上。

实例2 TLT-1改变HLA-DR及PD-L1分子在单核球中的表面表达

为研究sTLT-1的存在是否可调控HLA-DR及PD-L1在单核球上的表达，首先将人类单核球与rsTLT-1(10μg/ml)一起培育并连续3天检查HLA-DR及PD-L1的表达。如图3A(左)所示，在第一个24小时内，HLA-DR因rsTLT-1显著上调，之后在稍后时间点其表达快速下调。PD-L1的表达在24小时内亦显著增加但在整个随后3天实验中保持上调(图2A，右)。其次，研究sTLT-1对HLA-DR及PD-L1的表达的剂量效应。图2B(左)显示在与rsTLT-1一起培育48小时时，HLA-DR在单核球上的表达减少，且所述下调与增加的rsTLT-1浓度显著相关。相比下，PD-L1的表达随着增加的rsTLT-1浓度显著上调(图2B，右)。总之，数据表明由rsTLT-1刺激的单核球具有免疫抑制表型。

实例3 TLT-1 15-63多肽改变PD-L1及HLA-DR分子在单核球中的表面表达

TLT-1具有单一细胞外Ig可变(Ig V)结构域，所述结构域含有9条β链，这些β链形成2个通过链B及链F间的保守二硫键锁定在一起的反平行β片层。此外，TLT-1具有另一二硫桥以稳定其C-C’β发夹。为筛选sTLT-1的功能结构域，根据其V-型Ig结构合成不同长度的多肽(图3A)。多肽序列显示于表I中。将人类单核球与不同多肽(10μg/ml)一起培育并检查PD-L1的表达达24小时。如图3B中所示，在经TLT-1 15-63肽处理的单核球中，PD-L1在24小时内表达显著增加。此外，利用TLT-1 34-63肽处理亦诱导PD-L1表达。在与TLT-1 15-63肽一起培育48小时时，HLA-DR在单核球上的表达亦减少(图4)。因此，TLT-1 15-63可用作治疗剂以藉助上调PD-L1表达并下调HLA-DR表达治疗高免疫相关疾病。

表I：本发明的TLT-1多肽是仿真其细胞外结构域的不同部分而设计

序列表

<110> 财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院

<120> 调控免疫反应的方法及多肽

<130> L88340/CN24524

<160> 26

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重组多肽

<400> 1

Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val

20 25 30

<210> 2

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重组多肽

<400> 2

Gly Gln Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys

20 25 30

Ala Gln Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu

35 40 45

Val

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重组多肽

<400> 3

Gln Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala

20 25 30

Gln Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val

35 40 45

Ser Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu

50 55 60

Thr Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln

65 70 75 80

Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly

85 90 95

Pro Gln Ile Leu His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro Glu Glu

100 105 110

Glu Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser

115 120 125

Asp Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys

130 135 140

Ser Ile Pro

145

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名称: TLT-1 20-39

<400> 4

Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser Ser Ile Leu

1 5 10 15

Val Gln Cys His

20

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名称: TLT-1 15-46

<400> 5

Gly Gln Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys

20 25 30

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名称: TLT-1 15-53

<400> 6

Gly Gln Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys

20 25 30

Ala Gln Lys Val Trp Cys Arg

35

<210> 7

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名称: TLT-1 15-63

<400> 7

Gly Gln Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys

20 25 30

Ala Gln Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu

35 40 45

Val

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名称: TLT-1 40-63

<400> 8

Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu

1 5 10 15

Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val

20

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名称: TLT-1 34-63

<400> 9

Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val

20 25 30

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 10

Arg Tyr Asn Gly Gln Val Cys Gly Gly Pro Gly Arg Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 11

Lys Val Thr Tyr Asp Ser Phe Cys Ser Asn Gly Val Thr His Arg Asn

1 5 10 15

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 12

Lys Leu Ala Glu Asn Asn Ile Gln Pro Ile Phe Ala Val Thr Ser Arg

1 5 10 15

Met

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 13

Arg Ser Asn Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val Gly Gln Leu Ala His Lys

1 5 10 15

Leu

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 14

Lys Val Thr Ala Thr Glu Cys Ile Gln Glu Gln Ser Phe Val Ile Arg

1 5 10 15

Ala

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 15

Arg Gly Asp Cys Asp Gly Val Gln Ile Asn Val Pro Ile Thr Phe Gln

1 5 10 15

Val Lys Val

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素 beta2 (CD18)

<400> 16

Lys Val Thr Tyr Asp Ser Phe Cys Ser Asn Gly Val Thr His Arg Asn

1 5 10 15

Gln Pro Arg Gly

20

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素-alphaM (CD11b)

<400> 17

Arg Ser Gln Arg Ser Trp Arg Leu

1 5

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素-alphaM (CD11b)

<400> 18

Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe Arg Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-整合素-alphaM (CD11b)

<400> 19

Arg Ser Leu Pro Ile Ser Leu Val Phe Leu Val Pro Val Arg Leu

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-CD33

<400> 20

Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

1 5 10 15

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-CD33

<400> 21

Lys Leu Asp Gln Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe

1 5 10

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-CD33

<400> 22

Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro

1 5 10 15

Lys Ile

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-HSP90

<400> 23

Lys Tyr Ile Asp Gln Glu Glu Leu Asn Lys Thr

1 5 10

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-HSP90

<400> 24

Lys Glu Gln Val Ala Asn Ser Ala Phe Val Glu Arg Val

1 5 10

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-HSP90

<400> 25

Arg Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro Leu Asn Ile Ser Arg Glu

1 5 10 15

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串联分析辨识的肽-HSP90

<400> 26

Arg Asn Pro Asp Asp Ile Thr Gln Glu Glu Tyr Gly Glu Phe Tyr Lys

1 5 10 15

Ser

Claims

1.一种调控免疫反应的方法，其包括使TREM样转录物1(TLT-1)多肽结合至免疫细胞，其中所述TLT-1多肽至所述免疫细胞的结合抑制免疫反应。

2.如权利要求1的方法，其中TLT-1多肽至所述免疫细胞的所述结合治疗及/或预防与免疫高反应性相关的疾病。

3.如权利要求2的方法，其中与免疫高反应性相关的所述疾病是自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥或移植物抗宿主病症。

4.如权利要求1或2的方法，其中所述免疫细胞是单核球或嗜中性球。

5.如权利要求1、2或3的方法，其中所述TLT-1多肽是包括包含SEQ ID NO:1的至少5个氨基酸或与SEQ ID NO:1具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体的多肽。

6.如权利要求5的方法，其中所述多肽包括包含SEQ ID NO:2的至少5个氨基酸或与SEQID NO:2中所述的氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

7.如权利要求5的方法，其中所述多肽包括包含SEQ ID NO:3的至少5个氨基酸或与SEQID NO:3中所述氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

8.如权利要求5、6或7的方法，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1、2或3中所述的氨基酸序列。

9.一种多肽，其包括包含SEQ ID NO:1的至少5个氨基酸或与SEQ ID NO:1具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

10.如权利要求9的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列。

11.一种多肽，其包括包含SEQ ID NO:2的至少5个氨基酸或与SEQ ID NO:2具有至少约80％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

12.如权利要求11的重组多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列。

13.一种多肽，其包括包含SEQ ID NO:3的至少5个氨基酸或与SEQ ID NO:3具有至少约70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列、或其生物活性片段或变体。

14.如权利要求13的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:3中所述的氨基酸序列。

15.如权利要求9至14中任一项的多肽，其中所述多肽经聚乙二醇化或与组织靶标分子、白蛋白或血清白蛋白结合肽偶联。

16.如权利要求9至14中任一项的多肽，其中所述多肽与组织靶标分子、白蛋白或血清白蛋白结合肽融合。

17.一种组合物，其包括如权利要求9至16中任一项的TLT-1多肽及医药上可接受的载剂。

18.如权利要求17的组合物，其进一步包括一或多种额外免疫抑制剂。

19.如权利要求18的组合物，其中所述免疫抑制剂是糖皮质激素、细胞抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、放线菌素、蒽环类、丝裂霉素C(mitomycinC)、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素(mithramycin)、抗-CD20抗体、莫罗单抗(muromonab)-CD3、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、环孢素、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、干扰素、类***、TNF结合蛋白、麦考酚酯(mycophenolate)、芬戈莫德(fingolimod)或多球壳菌素(myriocin)。

20.一种治疗及/或预防与免疫高反应性相关的疾病的方法，其包括向个体投与如权利要求9至16中任一项的TLT-1多肽或如权利要求17至19中任一项的组合物。

21.如权利要求20的方法，其中所述疾病是自体免疫性疾病、过敏反应、移植排斥或移植物抗宿主病症。